Summary
该协议的目的是可视化念珠菌的细胞形状和定位在哺乳动物胃肠道。
Abstract
念珠菌是人类和许多其他哺乳动物肠道微生物群的真菌成分。虽然C.白化病在大多数结肠宿主中不会引起症状，但共和储层确实是传染病的储存库，肠道中高真菌牙酸盐的存在与炎症性肠病有关。在这里，我们描述了一种在稳定的胃肠道殖民化小鼠模型中可视化C.白化病细胞形态和定位的方法。在用口服抗生素治疗的动物中，使用单剂量的C.白化素建立殖民化。肠道组织段固定的方式，保留发光成分（微生物和粘液）以及宿主粘膜的结构。最后，利用对真菌rRNA的探针进行荧光原位杂交，以染色C.白化病和hyphae。该协议的一个关键优点是，它允许同时观察C.白化病细胞形态及其在胃肠道殖民化期间与宿主结构的空间关联。
Introduction
念珠菌是一种真菌性合成，也是一种机会性人类病原体。这种酵母缺乏一个明确的环境利基，而是在人类和其他哺乳动物的胃肠道（GI）道内传播，皮肤和泌尿生殖道1。虽然早期对白化球菌的研究主要侧重于其毒性潜力，但最近的几份报告表明，肠道内繁殖的生物体在正常健康中可能起重要作用，包括肠道的免疫发育。主机2，3，4。为了便于研究哺乳动物肠道内的C.白化病共性，我们开发了一种稳定的GI殖民化小鼠模型和基于原位杂交（FISH）的荧光杂交（FISH）方法，以可视化真菌酵母细胞和hyphae肠道流明。
除了一些例外5，实验室培育的小鼠通常表现出对消化道真菌殖民化的抵抗力。殖民化抵抗被认为是由特定的细菌物种介导的;然而，这可以通过用抗生素6、7治疗动物，或者使用化学定义的饮食来克服，这种饮食大概会改变细菌物种组成8、9。同样，在人类中，广谱抗生素的使用与白化动物的过度生长和传播有关10。我们的鼠殖民化模型使用广谱抗生素建立C.白化菌对免疫能力，常规饲养小鼠的殖民化。青霉素和链霉素在动物的饮用水中提供一周，在排泄前有108个菌群形成单位（CCFUs）。 只要继续注入抗生素的水，C. 白化菌就会通过胃肠道传播，达到10 6×108 CIFUs/g的粪便。尽管真菌殖民化程度很高，但动物仍然健康，体重增加的速度与未感染的对照相同。该模型已经成功地用于筛选和描述多种C.白化病共性因子11，12。
像真菌王国的其他成员一样，C.白化病具有巨大的形态可塑性13。在体外条件下，它已被证明在至少六个单细胞酵母细胞类型之间过渡，以及多细胞hyphae和伪海。酵母到催眠的转化是其最具特征的毒性属性之一，在大多数哺乳动物疾病模型中，以及受感染的人体组织中，hyphae和伪海菌占主导地位。为了确定甲酸白细胞在鼠消化道内的定位和细胞形态，我们开发了一种FISH技术，用于在固定组织学部分染色酵母和hyphae。探针由荧光标记的DNA寡核苷酸组成，该蛋白石杂交至真菌23S核糖体RNA（rRNA），分布在真菌细胞质中。由于宿主组织固定的方式，保留肠道的三维结构，包括宿主黏膜，消化材料，细菌微生物群，和粘液在肠道流明，这种技术允许真菌的定位细胞相对于这些地标染色。FISH 技术可与传统真菌组织染色相比，如周期性酸希夫 （PAS） 或 Gomori 的 Methenamine-Silver （GMS）以及市售的抗真菌抗体，因为这些试剂不特定于C. 白化。此外，标准固定剂去除粘液层，并破坏肠道流明14、15的其他内容物。
在本文中，我们提供了详细的说明，以建立高级C.白化菌殖民小鼠胃肠道，从安乐死动物的消化道解剖，组织固定的方式，保持发光架构，以及使用FISH检测宿主组织内的C.白化动物。除了野生型和突变菌株的C.白化，加维奇技术可用于提供其他微生物。固定技术对于任何需要保存肠道内容的研究都很有用。FISH 程序可在一天内完成，并可用于使用多个有差异标记的探针来本地化多个真菌物种。
Protocol
下面描述的步骤已获得 UCSF 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 使用口服加瓦奇的C.白化病小鼠的胃肠道殖民化
- 经当地IACUC批准，为18~21克雄性或雌性小鼠（8~10周大）提供住房。从第一天开始，使用高压灭它的食物和水。
注：使用消毒的笼子、床上用品、食物和水可降低抗生素耐药环境细菌的污染风险，这些细菌可能会从肠道中取代C. 白化病。此外，根据实验问题，应考虑动物的个别住房，因为小鼠是共体动物，肠道内的物品将在共同居住的动物之间共享。 - 第二天，用含有5%葡萄糖、1，500 U/mL青霉素G和2毫克/mL链霉素的灭菌水代替灭菌饮用水。
- 为方便起见，请提前制备200x抗生素库存溶液（表1），过滤灭菌，并在-20°C冷冻。
- 保持动物使用抗生素一周。
- 在抗生素开始后的第3天和第6天，评估每种动物的粪便有无抗生素有氧细菌的污染。用一只手握住动物，在肛门附近放置一个未盖盖的微熔管，并收集至少一个粪便颗粒。
- 将每个粪便颗粒重新悬浮在1 mL的无菌水和100 μL的板Luria汤（LB），酵母提取物肽dextrose（YEPD），或脑心脏输注（BHI）加血琼片。在37°C的标准培养箱（非无氧）中孵育板过夜，并评估细菌生长。
注：板块应表现出最小的增长（0~20个菌落）。如果从用青霉素和链霉素处理的动物身上恢复20个细菌菌落，那么不太可能建立与C.白化病的高水平殖民化，并中止实验。
- 在加维奇前三天，从冷冻甘油库存到YEPD + 2%琼脂板的条纹C.白化糖，在30°C孵育2天。
- 在加维奇前一天，接种每个C.白化菌菌株的一个菌群，以测试成5mL的液体YEPD。在30°C孵育过夜，摇动。
- 加瓦奇的早晨，将C.白化素的饱和培养，稀释到600nm（OD600）的光学密度，在YEPD的100 mL中0.1的光学密度，预热至30°C。在 30°C 下 200 rpm 的轨道摇床中摇动 4 小时到 5 小时，直到 OD600达到 1（中日志增长）。
- 将每个 100 mL 培养液转移到两个 50 mL 锥形管中，并在 3，000 x g下以离心机进行 5 分钟，在室温 （RT） 下。
注： C. 白化在RT 传播相对缓慢。如果将该协议适应其他物种，可能需要将接种器保存在冰上，以防止持续生长。 - 丢弃上清液，将颗粒细胞重新悬浮在每50 mL培养物无菌盐水20 mL中，并将重复的再悬浮颗粒集中到单个锥形管中。在 3，000 x g下离心 5 分钟。
- 丢弃上清液，重新悬浮在20 mL无菌盐水中。涡旋短暂，并删除 20 μL 的 OD600测量。在无菌正常盐水中稀释 1：50。将剩余的再悬浮细胞在3，000 x g下离心5分钟。
- 丢弃上清液。对于 1 x 108 CFU 的接种量，根据 OD600测量中确定的估计浓度，在无菌正常盐水中重新将颗粒细胞重新悬浮到大约 5 x 108 CCF/mL。
注：通常，OD600的 1 对应于 +1 x 107酵母细胞/mL。此值可能因分光光度计而异，应加以验证。如果不同微生物的感染需要浓度变化，请计划接种量为±10 μL/g的小鼠，以尽量减少对动物的不适。 - 使用血液细胞计计算 1：1，000 稀释，验证接种的浓度。根据使用血细胞计测定的浓度，调整要加盖的细胞体积。
- 使用动物喂食针（图1A），用给定接种液的计算体积对每只动物进行加盖。有关加夫奇过程，请参阅步骤 1.13.1_1.13.8。
注：应事先从有经验的执业者那里获得格法训练，并提前掌握程序。单个动物的成功手术通常不超过 1 分钟。- 将灭武动物喂养针连接到 1 mL 注射器，并在注射器中填充一个 gavage 体积，去除任何气泡以避免剂量不准确。放置在无菌表面上。
- 保护动物的饲养。用显性手将动物握在尾巴底部，将非主导手滑到动物的背部，回到耳朵后面的松弛皮肤。
- 使用非主导手的食指和拇指，将松弛的皮肤紧紧地聚集在一起;这就是"擦伤"。用同样（非主导）的手在尾巴周围捡起动物的绒毛和环小手指，使动物固定在手掌上。轻轻地伸展动物的头部，使其头部和身体（因此颈部和食道）处于一条直线上。
注：在动物身体弯曲或扭曲时尝试食道穿孔和动物死亡等并发症。 - 用显性手拿起注射器，并垂直于动物，用弯曲的针朝下（图1B）。使用针头的球，轻轻地钩住口腔内角，轻轻地将针头沿着嘴边推进到喉咙后面，最后将针头移到中心。
注：沿着横向路径引入针头有助于避免动物牙齿和舌头的阻力。 - 一旦针头的球位于喉咙后面，将针头向上倾斜，使其与动物的身体线平行（图1C）。
注：在这一点上，动物将表现出一个咽反射。这是一个好兆头，表明针的位置正确，并且唠叨运动有助于引导针向下食道。如果没有咽反射，针头可能在气管中，而不是食道。轻轻拔下针头，然后继续回到步骤 1.13.1。 - 允许动物吞咽接种，直到只有几毫米保持可见（图1D）。平稳推进针头。
注：如果针头不前进，避免用力，以免损坏食道。有时推进最后半厘米将需要从动物的超大型gag。如果针头似乎卡住，慢慢取出它，然后从步骤 1.13.4 重试。 - 通过轻轻推进柱塞，测试针球是否位于正确位置（胃）。如果没有阻力，请继续提供接种。一旦接种了，慢慢取出针头。
- 更换笼子里的动物，继续监测动物5-10分钟，是否有呼吸困难或痛苦的迹象。验证动物在觅食后是否恢复正常活动。
- 如果与下一个动物使用同样的接种液，用酒精擦拭清洁针头。继续返回步骤 1.13.1。如果使用不同的接种，请使用新针，然后返回步骤 1.13.1。
注：在动物节后的第二天检查动物是很重要的。出现痛苦迹象的动物（例如驼背姿势、劳力呼吸）应人道地安乐死，因为它们可能遭受食管破裂、肺部损伤或另一种内伤，因此不太可能恢复。
- 动物的食样化后，对接种的板稀释用于剂量验证。
- 准备 10 倍串行稀释至 1：105。板一加气体积的1：105稀释到100毫米板的Sabouraud dextrose琼脂。
- 在30°C下孵育板2天。计数 CCF，以确认接种剂量。
2. 组织学胃肠组织的准备
注：协议的这一部分是改编自约翰森和汉森16。
- 在每2只动物解剖的大螺帽塑料罐中制备500mL的甲壳素溶液（60%甲醇、30%氯仿、10%冰川醋酸）。
警告：甲醇和氯仿如果被吸入是有害的，应在化学罩中操作。冰醋酸具有腐蚀性，应使用适当的个人防护设备进行处理。甲醇、氯仿和冰川醋酸应作为危险废物丢弃。 - 在实验终点，根据当地IACUC批准的协议，人道地对动物实施安乐死。
注：在抗生素治疗的动物中，白化杆菌的殖民化通常范围从第5天106 CCFUs/g到第25天5×107 CCFUs/g。 - 用10%漂白剂消毒解剖工具，用70%乙醇冲洗。
- 将每只动物固定在解剖表面，腹腔面朝上。使用 30 G 针头将四肢固定到解剖表面（图 2A）。向动物喷洒70%乙醇，以清洁毛皮，尽量减少粘在工具上。
- 使用钝端钳子，用非主导手捏一段腹部皮肤。使用剪刀与显性手，切口皮肤和底部筋膜附近的骨盆底部。沿着围肠腔的每一侧，向上延伸到肋骨保持架，以 U 形延伸切口。提起皮肤的方式。
- 使用铅笔为要评估的 GI 片段预标记成文磁带。例如，对于每只动物，将单独的盒式磁带标记为"胃部"、"近端小肠"、"中小肠"、"远端小肠"、"小肠"和"大肠"。在每个盒的底部放置一个泡沫垫（图2A）。
注：图2B概述了建议放入盒式磁带的部分。 - 使用钝端钳，轻轻地从围肠腔中提取cecum。使用剪刀切断小肠和小肠之间的连接。
注：切卡组织非常微妙，容易破裂。操作时请小心。 - 将整个cecum放入组织学盒中，使其未扭曲并平放（图2C）。将第二个泡沫垫放在顶部并关闭盒式磁带。将盒式磁带放入装有甲子的螺丝帽罐中。
- 切除含有1⁄2个粪便颗粒的大肠部分，长度小于盒式粒。
- 将组织部分放入盒中，保持组织扁平且未扭曲。用第二个泡沫垫覆盖并关闭盒式磁带。将盒式磁带放入美达卡。
- 对于要取样的小肠的每个部分，切除含有一些消化物质的1⁄2厘米段。
- 将片段放入组织学盒中，保持组织扁平且未扭曲。用第二个泡沫垫覆盖并关闭盒式磁带。将盒式磁带放入美达卡。
- 对于胃，切断与食道和小肠的连接。放入盒式磁带中，保持组织扁平且未扭曲。用第二个泡沫垫覆盖并关闭盒式磁带。将盒式磁带放入美达卡。
- 将盒式磁带留在 RT 中的美达卡溶液中至少 3 小时和少于 2 周。
注：有几个点可以将固定的 GI 段转移到商业机构学服务。这些组织在不干扰发光物的情况下很难分割，并且由经验丰富的技术人员获得最佳结果。如果商业部门愿意在将组织嵌入石蜡之前进行处理，则在此阶段可以发送磁带以及步骤 2.16 的说明。 - 开始熔化足够的石蜡，以覆盖预热的 70°C 杂交炉中大烧杯中的所有组织盒。
- 固定后，取出泡沫垫，并将每个完好的组织部分放回盒式磁带中。在RT用以下溶液摇动洗涤组织：在100%甲醇中两次，35分钟，在100%乙醇中两次25分钟，在二甲苯中两次20分钟。
警告：二甲苯是易燃的，有毒的，如果吸入，可能会造成损坏。在具有适当保护的化学罩中使用。通过危险废物程序处理二甲苯。 - 将盒子擦干在纸巾上，在70°C的杂交炉中放入预熔石蜡中2小时。确保盒装中充满石蜡，并且没有气泡。
注：此步骤允许蜡渗透到 GI 段，并稳定组织和内容。 - 从蜡中取出盒，让多余的蜡排出，并储存在RT处，直到它们嵌入蜡块中。丢弃含有微量二甲苯的蜡作为危险废物。
注：诺贝尔实验室使用商业组织学服务来嵌入和分割组织。对于C. 白化菌酵母和 hyphae 的标准可视化，使用 4 μm 部分。要评估通常通过多个平面延伸的截道段的连接性，可以使用 8 μm 截面。根据 FISH 探头穿透试样的能力，可以使用更厚的部分。
3. 新设计的探头验证
注：以下验证C.白化素探针的协议改编自Swidsinski等人17。
- Streak C. 白化病SC5314 和密切相关的比较物种 （例如，坎迪达·杜布林西斯， 坎迪达热带） 到 YEPD = 2% 琼脂板.在30°C下孵育1⁄2天。
- 用单个菌落接种5 mL的液体YEPD介质。
- 将悬浮细胞的移液1 mL移至微离心管，并在3000 x g下离心5分钟。丢弃上清液。
- 在100μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重新悬浮颗粒。
- 移液器 5⁄10 μL 的重新悬浮细胞，并点在玻璃滑块上。扩散成一个更大的圆圈，并允许干燥。
注：如果细胞不是粘附的，请使用聚-L-流膜涂层幻灯片。 - 用PAP笔圈住细胞点，在PBS中用50μL的2.5%甲醛（PFA）覆盖。在 RT 孵育 10 分钟。
警告：PFA 是易燃的，如果吸入或与皮肤接触，可能会导致健康问题。受PFA污染的物品应作为危险废物丢弃。 - 用 PBS 洗涤 3 次。将液体从纸巾上敲开，并盖上 100 μL 的 PBS。重复两次。丢弃最终洗涤。
-
为多日存储准备幻灯片。如果在同一天执行 FISH，则继续执行步骤 3.9，而不执行本节中的步骤。
注：最好立即执行杂交，但如果时间短，请遵循步骤 3.8，然后再存储。幻灯片可在 4°C 下存储数天。- 用60%乙醇覆盖现场。在 RT 孵育 3 分钟，丢弃溶液。
- 用80%乙醇覆盖现场。在 RT 孵育 3 分钟，丢弃溶液。
- 用100%乙醇覆盖现场。在 RT 孵育 3 分钟，丢弃溶液。继续步骤 3.9。
- 将未覆盖的幻灯片置于 50°C 的杂交炉中 1 小时。如果遵循步骤 3.8，则将幻灯片存储在 4°C。如果没有，请继续执行步骤 4.2 以执行混合化协议。
4. 在胃肠道组织中进行鱼污
- 去蜡石蜡嵌入组织学部分。
- 在杂交烤箱中，将装有二甲苯的科普林罐预热至60°C。
- 将幻灯片插入填充的二甲苯罐中。在60°C下放置10分钟，丢弃二甲苯洗涤。将滑梯放在罐子里，然后倒入二甲苯，倒入一个废物容器中。
- 将新鲜的RT二甲苯倒入罐中，在60°C孵育10分钟。丢弃第二次二甲苯洗涤。
- 将 100% 乙醇填充罐子，在 RT 孵育 5 分钟。从罐子中取出滑片并晾干。
- 将杂交烤箱设置为 50°C，以执行第 4.2 节中的步骤。
- 用FISH探头染色C.白化。
- 制备 1 mL 新鲜杂交溶液（20 mM Tris_HCl，pH 7.4，0.9 M NaCl，0.1% 硫酸二钠 [SDS]，无 RNase 水中的 1% 形式酰胺）。有关示例计算，请参阅表 1。
- 将 50 μL 的杂交溶液与 1 μL 的C. 白化剂探针（5' Cy3- ACAGCGaAGCCGCC 3';无RNase水中的50 μg/mL）混合，每张幻灯片的最终探针量为0.5 μg。
注：许多实验室培育的小鼠的微生物群中不含任何真菌。在这种情况下，有可能替代泛真菌探针（5'Cy3-CTCTCTCTCTATATTC 3'），识别大多数真菌物种的23S rRNA，而不仅仅是C.白化菌。根据作者的经验，泛真菌探针比C.白化菌特异性探针产生更亮的染色。 - 保护溶液免受光和预热至50°C。
- 使用 PAP 笔，从第 4.1 节中在组织部分周围画一个圆圈。
- 含探针的杂交溶液的移液器50μL到固定组织上，用移液器尖端轻轻铺在组织部分上。用杂交盖玻片覆盖液体，确保防止气泡。
- 密封在防水杂交室中滑动，在50°C的黑暗中，在混合炉中孵育3小时。
- 同时，制备 50 mL 的 FISH 洗涤溶液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.9 M NaCl，不含RNase水）。有关示例计算，请参阅表 1。
- 将洗涤溶液移到 50°C 预热。
- 3小时后，将洗涤溶液加入科普林罐中。然后，小心地用钳子从滑轨上取下盖玻片，然后将滑片放在洗涤溶液中。
- 用铝箔盖住罐子，在50°C下孵育20分钟。
- 在此孵育过程中，制备粘蛋白核染色溶液（20纳克/mL 4°，6-二酰胺-2-苯酚[DAPI]，1.6微克/mL氟苷等分酸[FITC]-在PBS中。有关示例计算，请参阅表 1。对于胃和大肠，使用FITC-Ulex欧罗巴谷蛋白1（UEA-1）。对于小肠和小肠，使用 FITC-UEA-1 和 FITC-小麦胚芽凝乳素 （WGA） 的组合。
注：来自不同物种的叶酸能识别糖蛋白（如粘蛋白）的不同糖修饰。这里推荐的叶酸组合是经验确定的，以优化不同GI腔室粘液的染色。 - 通过倒出 FISH 洗涤溶液，用 RT PBS 重新加注罐子，清洗滑轨。立即倒出 PBS 并重新填充 PBS。倒出 PBS 共 2 次。
- 用精细的任务雨刷组织离开PBS，用PAP笔圈绕肠组织部分。将幻灯片放入不透明的塑料容器中，并在组织部分添加 50 μL 的粘蛋白核染色溶液。用铝箔盖住容器，以防光线照射。在4°C孵育45分钟。
- 将幻灯片放入科普林罐中，在 RT 的 PBS 中快速冲洗两次。
- 轻触纸巾上多余的PBS，然后用纸巾敲打PBS的最后一滴。
- 在每个部分放置一滴安装介质，并用玻璃盖玻片覆盖，防止气泡。让安装介质扩散到整个盖玻片下。为了立即成像，将盖玻片固定在正确的角落，在拐角处使用指甲油。对于长期存储，用指甲油密封盖玻片周围。
- 使用荧光显微镜对幻灯片进行成像。
Representative Results
按照所提供的说明，该技术的结果将是在分段GI组织中，在宿主上皮、粘液和C.白化糖中核的荧光标记。野生型念珠菌细胞应显示为圆形、单细胞酵母细胞或高度拉长、有时分枝、多细胞的子宫内（细胞分裂在子宫内不会明显）。C. 白化病的突变物可能另外显示为更小、略长的"灰色"酵母或更大、略长的"GUT"（胃肠道诱导过渡）或"不透明"酵母。
图 1描述了用于口腔口的喂食针，以及在加法过程中针的关键位置。图 2提供了用于器官解剖和鼠标 GI 段外观的典型设置。
图3显示了在体外和小鼠模型中传播后不同C.白化细胞类型的FISH染色。图3A显示了固定、渗透、体外传播的hyphae的荧光和相位图像。诱导水合形成与液体李的介质18与2%N-乙酰葡萄糖胺，pH 6.8在37°C。图3B显示了固定、渗透、体外传播的酵母细胞的荧光和相位图像。图3C，D分别显示了固定的、渗透的、体外传播的GUT细胞和不透明细胞。GUT和不透明细胞类型在形态上无法区分，除非通过扫描电子显微镜进行可视化。请注意，如果细胞不能很好地渗透，体外繁殖细胞的FISH染色将次优。图3C显示了弱和漫反射染色的例子。为了获得最佳结果，细胞固定和渗透条件应根据经验确定要调查的每个细胞类型和物种。幸运的是，推荐的在切片组织中可视化C. 白化菌的协议会产生更一致的渗透。
图3E-G描绘了小鼠大肠中的C.白化杆菌，与C.白化杆菌特异性探头（图3E）或泛真菌探针（图3F，G）染色。C. 白化在图像中呈红色，宿主细胞核为蓝色，粘液层为绿色。圆形酵母和高度长的hyphae（白色箭头）都发生在大肠中。请注意，泛真菌探头的染色更亮。图3G描绘了同一腔舱中的ume6突变体，与泛真菌探针染色。Ume6编码了体外条件下形成子宫体所需的转录因子19.有趣的是，这种突变体在体外条件下显示的酵母锁定表型不会在肠道内重述，这表明必须在宿主12内激活冗余因子。图 4描述了野生 C型白化菌在鼠胃肠道不同段的外观，包括紧邻宿主粘膜的区域和肠道流明的更中心区域。
图1：在加夫时关键喂食针的位置。（A） 喂食针.（B） 插入舌头侧面的喂食针球。（C） 以直立姿势喂食针头，插入食道。（D） 将喂食针插入胃中，鼻子上方可见几毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：剖面布局示例。（A） 解剖垫和工具.（B） 已切除的 GI 区。近视（食道）到远端（）部分： I . 胃。二. 近肠小肠。三. 中小肠。四. 远端小肠。五. 塞库姆。六. 大肠。粉红色虚线边框表示要修复的组织。（C） 定位在盒式磁带中的组织.罗马数字与面板 B 中相同。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：FISH染色的C.白化病的代表性图像.（A）在液体李的介质中生长的C.白化菌的FISH，2%N-乙酰葡萄糖胺，pH 6.8。（B） 在YEPD + 2%琼脂板上生长的C.albicans圆形酵母细胞的FISH。（C） 在 YEPD + 2% 琼脂板上生长的C. 白化古细胞 （ySN1045） 的 FISH。（D） 在 YEPD + 2% 琼脂板上生长的C. albican 不透明细胞的 FISH。（E） 大肠中的野生型C. 白化杆菌（ySN250）， 沾染了C. 白化杆菌特异性探针.（F） 大肠中的野生C型白化杆菌，沾染泛真菌探针。（G） Ume6突变 （ySN1479） 在大肠中，沾染泛真菌探针：红色是C. 白化杆菌，蓝色是宿主上皮核，绿色是粘液。箭头表示催眠。箭头表示酵母。比例尺 = 20 μm.图像 F 和 G 改编自威奇利等人12。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：不同肠道腔室中鱼染C.白化动物的出现。野生类型C. 白化在鼠标 GI 区域指示段中显示。在每个隔间内，图像描绘了与宿主黏液和肠道流明中心区域相邻的区域。使用泛真菌探针进行染色。比例尺 = 20 μm.图像改编自威奇利等人12。请点击此处查看此图的较大版本。
| 抗生素库存（200倍） | |||
| 青霉素 G | 181毫克/升 | ||
| 链霉素 | 400毫克/μL | ||
| 梅塔卡恩 | |||
| 股票 | 最终浓度 | 体积 | 单位 |
| 甲醇 | 60% | 300 | 毫升 |
| 氯仿 | 30% | 150 | 毫升 |
| 冰醋酸 | 10% | 50 | 毫升 |
| 杂交解决方案 | |||
| 股票 | 最终浓度 | 体积 | 单位 |
| 1 M Tris-HCl，pH 7.4 | 20 mM | 20 | μL |
| 5 M 纳Cl | 0.9米 | 180 | μL |
| 10% SDS | 0.10% | 10 | μL |
| 100% 形式酰胺 | 1.00% | 10 | μL（在两次使用之间在-20°C时保存在小等分中） |
| 无RNase水 | 780 | μL | |
| FISH 洗涤液 | |||
| 1 M Tris-HCl，pH 7.4 | 20 mM | 1 | 毫升 |
| 5 M 纳Cl | 0.9米 | 9 | 毫升 |
| 无RNase水 | 40 | 毫升 | |
| 粘液核染色溶液 | |||
| DAPI，10 μg/mL | 20 纳克/升 | 2 | μL |
| 丁酸， 40 μg/mL | 1.6 μg/mL | 40 | μL |
| PBS， pH 7.4 | 958 | μL | |
表1：该协议中使用的解决方案的典型体积和浓度。
Discussion
此处描述的方法允许在任何性别或菌株的共体殖民小鼠的胃肠道中可视化C. albicans酵母和 hyphae。FISH探针杂交到23S rRNA，分布在真菌细胞质中。我们的方法是从先前报道的用于可视化肠道细菌20的协议改编的。由于C.albican在宿主中改变其形态，因此该方法可用于监测真菌细胞形状以及定位。例如，我们使用这种方法反驳了酵母在整个消化道中占主导地位的假设，并揭示了某些"纤维缺陷"突变体12的体内表型和体外表型之间的差异。
几种小鼠模型存在C.白化碱的合成殖民化。实验鼠和人类的微生物群是截然不同的，在小鼠中，需要使用抗生素或专门饮食来建立稳定的殖民化。抗生素治疗也增强了人类的白化病殖民化，是传播疾病10的主要危险因素。本研究中使用的抗生素价格相对便宜，在细菌微生物群中可可靠降低。请注意，抗生素用于减轻对抗性细菌物种的负担，而不是消除动物中的所有细菌。如果研究人员希望研究无细菌的白化病宿主相互作用，或避免使用抗生素或特殊饮食，无细菌动物可以替代常规饲养的动物;然而，诺生物菌小鼠表现出某些免疫和解剖异常，因此可能并不适合所有目的。
有几个步骤对于成功的FISH染色非常重要：推荐的固定方法对于保持胃肠道组织的结构完整性至关重要，尤其是肠道流明的脆弱内容，如粘液层和三维真菌和细菌的组织16。请注意，许多常用的含有水的固定解决方案对灯具结构具有极大的破坏力。本议定书中推荐的固定后处理液的固定剂和解决方案不含水，避免水污染非常重要。另一个关键步骤是杂交步骤，在杂交炉中孵育幻灯片期间避免杂交溶液蒸发非常重要。我们建议将幻灯片放在防水容器中，以避免此问题。或者，可以使用防水杂交室，如最初用于微阵列杂交的腔室。
本协议描述了一种C.白化亚比加特异性FISH探头。然而，由于许多实验室饲养的小鼠不含C.白化菌或其他真菌作为其天然肠道微生物群的一部分，泛真菌探针可能特别在实验殖民动物中染色C.白化动物。由于其优越的杂交特性和较高的信噪比，替代泛真菌探针可能是可取的。如果泛真菌探针被用作C.白化病的伪特异性探针，重要的是要记录未感染的动物（即，用抗生素治疗，而不是使用C.白化病）中缺乏染色。非殖民控制动物的染色也有助于评估因FISH探头与食物颗粒粘附而导致的背景染色。总体而言，FISH探针的使用为大多数其他染色真菌方法提供了增强的特异性，例如钙素白（染色甲素，一种细胞类型可能不同细胞的细胞壁成分）、GMS或市售的抗真菌抗体。此外，FISH 染色允许使用不同标记的 FISH 探针对物种特定的 rRNA 进行多种生物的贴迹。
这种技术的一个警告是，某些C.albicans酵母细胞类型与FISH非常相似（例如，不透明和GUT细胞类型）。为了区分这些细胞类型，开发细胞类型特定的真菌mRNA的杂交探针将是有益的。然而，以目前的形式，FISH技术已经揭示了在这两种情况下评估的C.albican突变体的体内和体外行为之间的惊人差异，表明在自然的合成环境，没有充分模仿现有的体外测定。进一步研究其他野生和突变宿主中不同C.白化菌的污渍，可能会对真菌-宿主相互作用产生更多的见解。特别是，在炎症性肠病模型中分析C.白化病具有指导意义，这种病与人类21种甲酸大病的高酸点子以及其他Model的白化病过度生长和疾病有关。FISH技术也可以与免疫组织化学相结合，染色特定的宿主细胞。总体而言，这里介绍的方法提供了一种相当快速可靠的方法来确定C.白化病在哺乳动物胃肠道内的定位和形态。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢卡罗莱纳·特罗比尼、凯瑟琳·吴、贾斯汀·松南堡和KC Huang在开发FISH技术方面的指导。特蕾莎·奥米拉对手稿提供了有益的评论，米里亚姆·利维协助摄影。这项工作得到了NIH授予R01AI108992、R01DK113788和传染病发病机制欢迎奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
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