Summary
Formålet med denne protokol er at visualisere Candida albicans celle form og lokalisering i pattedyrs mave-tarmkanalen.
Abstract
Candida albicans er en svampe komponent i tarmen mikrobiota i mennesker og mange andre pattedyr. Selv om C. albicans ikke forårsager symptomer i de fleste koloniserede værter, den kommensal reservoir tjener som et opbevaringssted for smitsomme sygdomme, og tilstedeværelsen af høje svampe titre i tarmen er forbundet med inflammatorisk tarmsygdom. Her beskriver vi en metode til at visualisere C. albicans celle morfologi og lokalisering i en musemodel af stabil gastrointestinal kolonisering. Kolonisering er etableret ved hjælp af en enkelt dosis af C. albicans i dyr, der er blevet behandlet med orale antibiotika. Segmenter af tarm vævet er fastgjort på en måde, der bevarer arkitekturen af luminale indhold (mikroorganismer og slim) samt værten slimhinde. Endelig udføres fluorescerende in situ-hybridisering ved hjælp af sonder mod svampe-rRNA til farvning af C. albicans og hyphae. En vigtig fordel ved denne protokol er, at det giver mulighed for samtidig observation af C. albicans celle morfologi og dens rumlige Association med værtsstrukturer under gastrointestinal kolonisering.
Introduction
Candida albicans er en svampe-kommensal samt en opportunistisk Human patogen. Denne gær mangler en defineret miljømæssig niche og i stedet udbreder inden for mave-tarmkanalen, hud, og urogenitale tarmkanalen af mennesker og andre pattedyr1. Der henviser til, at tidlig forskning i C. albicans primært fokuserede på virulens potentiale, men flere nylige rapporter tyder på, at almindeligt formerings organismer i tarmen kan spille en vigtig rolle i den normale sundhed, herunder immun udviklingen af vært2,3,4. For at lette undersøgelser af C. albicans commensalism i pattedyr tarmen, vi udviklet en musemodel af stabile GI kolonisering og en fluorescens in situ hybridisering (fisk)-baserede metode til at visualisere svampe gærceller og hyfer i tarm lumen.
Med nogle undtagelser5, laboratorie-opdrættet mus typisk udviser resistens over for svampe kolonisering af fordøjelseskanalen. Koloniserings resistens menes at være medieret af specifikke bakteriearter; Men, dette kan overvindes ved behandlingaf dyrene med antibiotika6,7 eller brug af en kemisk defineret kost, der formentlig ændrer bakteriearter sammensætning8,9. På samme måde har brugen af bredspektrede antibiotika i mennesker været forbundet med C. albicans overvækst og udbredelse10. Vores murine koloniserings model bruger bredspektrede antibiotika til at etablere C. albicans kolonisering af immunkompetente, konventionelt opdrættede mus. Penicillin og streptomycin leveres i dyrenes drikkevand i en uge før sonde med 108 kolonidannende enheder (cfus) af C. albicans. Så længe det antibiotika-inbrugte vand fortsættes, C. albicans vil udbrede gennem mave-tarmkanalen, nå fækale titre af 106− 108 cfus/g. På trods af det høje niveau af svampe kolonisering, dyr forbliver sunde og tage på i vægt i samme tempo som ikke-inficerede kontroller. Denne model er blevet brugt med succes til at screene for og karakterisere flere C. albicans commensalism faktorer11,12.
Ligesom andre medlemmer af svamperiget, C. albicans er i stand til enorme morfologiske plasticitet13. Under in vitro betingelser, det har vist sig at overgangen mellem mindst seks unicellulære gær celletyper, samt multicellulære hyfer og pseudohyphae. Den gær-til-hypha overgang er en af sine bedst karakteriserede virulens attributter, og hyfer og pseudohyphae dominerer i de fleste pattedyr sygdomsmodeller, samt i inficerede humane væv. For at bestemme C. albicans lokalisering og celle morfologi i murine fordøjelseskanalen, udviklede vi en fisketeknik til farvning af gær og hyfer i faste histologiske sektioner. Sonderne består af fluorescently mærkede DNA-oligonukleotider, der hybridiserer til svampe-23S ribosomale RNA (rRNA), som fordeles i hele svampe-cytoplasmaet. Fordi Host væv er fastgjort på en måde, der bevarer den tredimensionale arkitektur af tarmen, herunder værten slimhinde, fordøjelsessystemet materiale, bakteriel mikrobiota, og slim i tarmen lumen, denne teknik tillader lokalisering af svampe celler med hensyn til disse landemærker, når de farves. FISKE teknikken sammenlignes positivt med traditionelle histologiske pletter for svampe, såsom periodiske syre Schiff (PAS) eller Gomoris Methenamin-sølv (GMS), samt kommercielt tilgængelige svampedræbende antistoffer, fordi disse reagenser ikke er specifikke for C. albicans. Desuden, standard fikater fjerne slim lag og forstyrre andre indhold af tarmen lumen14,15.
I denne artikel, vi giver detaljerede instruktioner til etablering af høj kvalitet C. albicans kolonisering af musen GI-kanalen, for dissektion af fordøjelseskanalen fra aflives dyr, for vævs fiksering på en måde, der bevarer luminale og til påvisning af C. albicans i værts vævet ved hjælp af fisk. Ud over vilde type og mutante stammer af C. albicans, kan sonde teknikken bruges til at levere andre mikroorganismer. Fikserings teknikken ville være nyttig for enhver undersøgelse, hvor bevarelse af tarmindholdet ønskes. FISKE proceduren kan gennemføres inden for en dag og kan bruges til at lokalisere flere svampearter ved hjælp af flere, differentielt mærkede sonder.
Protocol
De trin, der er beskrevet nedenfor, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC).
1. gastrointestinal kolonisering af mus med C. albicans med oral gavage
- Giv boliger til 18 − 21 g mandlige eller hunmus (8 − 10 uger gamle) som godkendt af den lokale IACUC. Brug autoklave mad og vand fra den første dag.
Bemærk: Brugen af steriliserede bure, strøelse, mad og vand reducerer risikoen for kontaminering med antibiotikaresistente miljø bakterier, der potentielt kan fortrænge C. albicans fra tarmen. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål bør individuel anbringelse af dyr overvejes, fordi mus er coprophagisk, og tarmindholdet vil blive delt blandt dyr, der huses. - Den følgende dag skal du udskifte det autoklave drikkevand med autoklaveres vand indeholdende 5% glucose, 1.500 U/ml penicillin G og 2 mg/ml streptomycin.
- For nemheds skyld, Forbered 200x antibiotika stamopløsninger (tabel 1) på forhånd, Filtrer sterilisering og fryse ved-20 °c.
- Opretholde dyr på antibiotika i en uge.
- På dag 3 og 6 efter antibiotika er blevet startet, vurdere hvert dyrs afføring for kontaminering med antibiotika-resistente aerobe bakterier. Holde et dyr med den ene hånd, placere en utæt mikrofuge rør nær anus og indsamle mindst én fækal pellet.
- Ophæng hver fækale pellet i 1 ml sterilt vand og plade 100 μl på Luria bouillon (lb), gærekstrakt pepton dextrose (yepd) eller hjernehjertets infusion (BHI) plus blod agar plader. Pladerne inkubates natten over i en standard inkubator (ikke anaerob) ved 37 °C og vurderes for bakterievækst.
Bemærk: Plader skal udvise minimal vækst (0 − 20 kolonier). Hvis > 20 kolonier af bakterier er genvundet fra dyr behandlet med penicillin og streptomycin, så er det usandsynligt, at højniveau kolonisering med C. albicans vil blive etableret, og forsøget skal afbrydes.
- Tre dage før sonde, streak C. albicans fra frosne glycerol bestande til YEPD + 2% agar plader og inkubere ved 30 °c i 2 dage.
- En dag før sonde, inokulere en koloni af hver C. albicans stamme, der skal testes i 5 ml flydende YEPD. Inkuber ved 30 °C natten over med rystelser.
- Om morgenen af sonde, fortynde den mættede kultur af C. albicans til en optisk tæthed ved 600 nm (OD600) af 0,1 i 100 ml yepd forvarmet til 30 °c. Ryst i en orbital shaker ved 200 rpm ved 30 °C i mellem 4 h og 5 timer indtil OD600 når 1 (Mid-log vækst).
- Hver 100 mL kultur overføres til 2 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 3.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: C. albicans propagerer relativt langsomt ved rt. Hvis denne protokol tilpasses til en anden art, kan det være nødvendigt at opbevare inocula på is for at forhindre fortsat vækst. - Supernatanten kasseres, resuspenderes de pelleteret celler i 20 mL sterilt saltvand pr. 50 mL kultur, og de dobbelte opslæmmede pellets opblandes i enkelt koniske rør. Centrifugeres ved 3.000 x g i 5 min.
- Supernatanten kasseres og resuspenderes i 20 mL sterilt saltvand. Vortex kortvarigt og fjern 20 μL for OD600 -måling. Fortyndes 1:50 i sterilt normalt saltvand. De resterende resuspenderede celler centrifugeres ved 3.000 x g i 5 minutter.
- Kassér supernatanten. For en inokulum størrelse på 1 x 108 CFU, resuspendere de pelleterede celler til ca 5 x 108 cfus/ml i steril normal saltvand baseret på den anslåede koncentration bestemmes fra OD600 måling.
Bemærk: Typisk, en OD600 af 1 svarer til ~ 1 x 107 gærceller/ml. Denne værdi kan variere afhængigt af spektrofotometeret og skal verificeres. Hvis en ændring i koncentrationen ønskes for infektioner med en anden mikroorganisme, skal du planlægge en inokulum volumen på ≤ 10 μL/g mus for at minimere ubehag for dyret. - Kontroller koncentrationen af inokulum ved at tælle en 1:1000 fortynding med et hemocytometer. Juster mængden af celler, der skal gavaged baseret på koncentrationen bestemmes ved hjælp af hemocytometer.
- Ved hjælp af en fodring nål (figur 1A), sonde hvert dyr med den beregnede volumen af en given inokulum. Se trin 1.13.1 − 1.13.8 for sonde proceduren.
Bemærk: træning til sonde skal indhentes fra en erfaren praktiserende læge, og proceduren bør beherskes på forhånd. En vellykket procedure for et enkelt dyr tager typisk ikke længere end 1 min.- Fastgør en autoklaveres dyrefodrings kanyle til en 1 ml sprøjte og fyld sprøjten med en sonde volumen, og fjern eventuelle luftbobler for at undgå en unøjagtig dosis. Sted på en steril overflade.
- Fastgør dyret til sonde. Hold dyret i bunden af halen med den dominerende hånd og skub ikke-dominerende hånd op dyrets tilbage til den løse hud lige bag ørerne.
- Ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren på den ikke-dominerende hånd samles den løse hud tæt sammen. Dette er "Scruff". Afhente dyret ved sin Scruff og loop lille finger af den samme (ikke-dominerende) hånd rundt om halen til at immobilisere dyr mod håndfladen. Forlæng forsigtigt dyrets hoved, så dets hoved og krop (og derfor hals og esophagus) er i en lige linje.
Bemærk: Forsøg på en sonde, mens dyrets krop er bøjet eller snoet kan resultere i komplikationer såsom esophageal perforering og død af dyret. - Tag sprøjten med den dominerende hånd og hold den vinkelret på dyret, med den buede nål pegende nedad (figur 1B). Brug bolden af nålen, forsigtigt krog et indvendigt hjørne af munden, forsigtigt forhånd nålen langs siden af munden til bagsiden af halsen, og endelig flytte nålen til midten.
Bemærk: Introduktion af nålen langs en lateral vej hjælper med at undgå modstand fra dyrets tænder og tunge. - Når kuglen af nålen er på bagsiden af halsen, vippe nålen op, så det er parallelt med dyrets krop linje (figur 1C).
Bemærk: På dette tidspunkt, dyret vil udvise en gag refleks. Dette er et godt tegn, der indikerer, at nålen er placeret korrekt, og gagging bevægelse hjælper med at guide nålen ned i spiserøret. Hvis der ikke er nogen gag refleks, nålen kan være i luftrør snarere end spiserøret. Træk forsigtigt nålen ud og Fortsæt tilbage til trin 1.13.1. - Lad dyret sluge inokulumet, indtil kun få millimeter er synligt (figur 1D). Nålen forsigtigt frem.
Bemærk: Hvis nålen ikke forhånd, undgå at bruge magt, som kan beskadige spiserøret. Undertiden fremskynde den sidste halvdel centimeter vil kræve en ekstra stor gag fra dyret. Hvis nålen synes at være fast, trække langsomt det og prøv igen fra trin 1.13.4. - Test, at nålen nål er i den korrekte placering (mave) ved forsigtigt at fremme stemplet. Hvis der ikke er modstand, Fortsæt med at levere inoculum. Når inokulum er blevet administreret, trækkes nålen langsomt tilbage.
- Udskift dyret i dets bur og Fortsæt med at overvåge dyret i 5 − 10 minutter for tegn på besværet vejrtrækning eller angst. Kontrollér, at dyret genoptager den normale aktivitet kort tid efter sonderingen.
- Hvis det samme inokulum vil blive brugt sammen med det næste dyr, skal du rengøre nålen med en spritserviet. Gå tilbage til trin 1.13.1. Hvis der skal anvendes et andet inokulum, skal du bruge en ny nål og gå tilbage til trin 1.13.1.
Bemærk: Det er vigtigt at inspicere dyrene dagen efter gavage. Dyr, der udviser tegn på angst (f. eks. jagtet kropsholdning, besværet vejrtrækning) bør være humant euthanized, da de sandsynligvis har lidt esophageal ruptur, beskadigelse af lungerne, eller en anden indre skade, hvorfra helbredelse er usandsynlig.
- Efter indgift af dyrene er inoculas plade fortyndinger for dosis verifikation.
- Forbered 10-dobbelte serielle fortyndinger op til 1:105. Plade en sonde volumen af 1:105 fortynding på en 100 mm plade af Sabouraud dextrose agar.
- Pladen inkubates i 2 dage ved 30 °C. Tæl CFUs for at bekræfte dosis af inokulum.
2. fremstilling af gastrointestinale væv til histologi
Bemærk: Denne del af protokollen er tilpasset fra Johansson og Hansson16.
- Forbered 500 mL methacarn-opløsning (60% methanol, 30% chloroform, 10% iseddike) i en stor skruehætte plastik krukke for hver 2 dyr dissekeret.
Forsigtig: Methanol og chloroform er skadelige ved indånding og bør manipuleres i en kemisk hætte. Iseddike kan være ætsende og bør håndteres med det rigtige personlige værnemidler. Methanol, chloroform og iseddike bør kasseres som farligt affald. - Ved det eksperimentelle endepunkt, aflive dyr humant i henhold til en protokol, der er godkendt af den lokale iacuc.
Bemærk: I antibiotika-behandlede dyr, C. albicans kolonisering typisk spænder fra ~ 106 cfus/g på dag 5 op til ~ 5 x 107 cfus/g ved dag 25. - Steriliser dissektions værktøjer med 10% blegemiddel og skyl med 70% ethanol.
- Fastgør hvert dyr til en dissektion overflade, med ventrale side opad. Brug 30 G nåle til at fastgøre lemmerne til dissektions overfladen (figur 2A). Spray dyret med 70% ethanol til at rense pels og minimere stikning til værktøjerne.
- Brug stumpede tang, Knib en del af abdominal hud med ikke-dominerende hånd. Ved hjælp af en saks med dominerende hånd, incise huden og underliggende fascia nær bunden af bækkenet. Udvid snittet i en U-form langs hver side af peritonealhulen og op til ribbenene. Løft huden ud af vejen.
- Ved hjælp af en blyant, prelabel histologi kassetter til de GI segmenter, der skal vurderes. For eksempel, for hvert dyr, mærke separate kassetter som "mave", "proksimale små tarme," "Mid Small tarme," "distale små tarme," "cecum," og "store tarme." Anbring en skum pude i bunden af hver kassette (figur 2a).
Bemærk: figur 2B skitserer foreslåede sektioner, som skal placeres i kassetter. - Ved hjælp af stumpede pincet ekstrahere forsigtigt cecum fra peritonealhulen. Brug en saks til at afbryde forbindelsen mellem cecum og de små og store tarme.
Bemærk: Cecal væv er meget delikat og let at ruptur. Vær forsigtig, når du manipulerer. - Anbring hele cecummet i en histologi kassette, så det er snoet og fladt (figur 2C). Placer en ekstra skum pude øverst og luk kassetten. Anbring kassetten i en skruehætte krukke, der indeholder methacarn.
- Punktafgifter en del af de store tarme, der indeholder 1 − 2 fækale pellets, med en længde mindre end kassetten.
- Placer vævs sektionen i kassetten, og hold vævet fladt og snoet. Overlejring med en ekstra skum pude, og luk kassetten. Anbring kassetten i methacarn.
- For hver del af de små tarme, der skal udtages prøver af, punkt et 1 − 2 cm segment, som indeholder noget fordøjelses materiale.
- Placer segmentet i en histologi kassette, holde vævet fladt og snoet. Overlejring med en ekstra skum pude, og luk kassetten. Anbring kassetten i methacarn.
- For maven, afbryde forbindelserne til spiserøret og små tarme. Placer i en kassette, holde vævet fladt og snoet. Overlejring med en ekstra skum pude, og luk kassetten. Anbring kassetten i methacarn.
- Kassetterne skal være i methacarn-opløsning ved RT i mindst 3 timer og mindre end 2 uger.
Bemærk: Der er flere punkter, hvor de faste GI-segmenter kan overføres til en kommerciel histologi tjeneste. Disse væv kan være svære at afsnit uden afbrydelse af luminale indhold, og optimale resultater vil blive opnået ved en erfaren tekniker. Hvis den kommercielle service er villig til at udføre skyller før indlejring af vævet i paraffin, kan kassetterne sendes på dette tidspunkt sammen med instruktioner til trin 2,16. - Begynd at smelte nok paraffinvoks til at dække alle vævs kassetter i et stort bægerglas i en forvarmet 70 °C hybridiseringsovn.
- Efter fiksering, fjerne skumpuder og returnere hver intakt væv sektion tilbage i sin kassette. Vævene vaskes med følgende opløsninger ved RT med rystelser: to gange for 35 min i 100% methanol, to gange for 25 min i 100% ethanol, to gange for 20 min i xylen.
Forsigtig: Xylen er brændbar, giftig og kan forårsage beskadigelse ved indånding. Brug i en kemisk hætte med korrekt beskyttelse. Bortskaf xylen via procedurer for farligt affald. - Pat kassetterne tørre på et papirhåndklæde og Placer i premelted paraffin i 2 timer ved 70 °C i en hybridiseringsovn. Sørg for, at kassetterne er fyldt med paraffin, og at der ikke er bobler tilbage.
Bemærk: Dette trin gør det muligt for voks at infiltrere GI-segmentet og at stabilisere vævet og indholdet. - Fjern kassetterne fra voks, lad den overskydende voks dræne, og opbevar på RT, indtil de er indlejret i voksblokke. Voks, der indeholder spormængder af xylener, kasseres som farligt affald.
Bemærk: Noble Lab bruger en kommerciel histologi service til indlejring og skæring af væv. For standardvisualisering af C. albicans gær og hyphae, 4 μm sektioner anvendes. For at evaluere forbindelsen mellem hyphal segmenter, som typisk strækker sig gennem flere planer, kan der anvendes 8 μm sektioner. Afhængigt af fiske prøvens evne til at trænge ind i prøven, kan det være muligt at bruge endnu tykkere sektioner.
3. validering af nydesignede sonder
Bemærk: Følgende protokol til validering af C. albicans sonder blev tilpasset fra swidsinski et al.17.
- Streak C. albicans SC5314 og nært beslægtede komparatorarter (f. eks. Candida dubliniensis, Candida tropicalis) til yepd + 2% agar plader. Inkuber i 1 − 2 dage ved 30 °C.
- Der inokuleres 5 mL flydende YEPD-medium med en enkelt koloni.
- 1 mL af de suspenderede celler afpipetteres i et mikrocentrifuge glas og centrifugeres ved 3.000 x g i 5 min. kassér supernatanten.
- Resuspension af pellet i 100 μL fosfat-bufferet saltvand (PBS).
- Afpipetteres 5 − 10 μL af resuspenderede celler og spot på et glas skred. Spredes i en større cirkel og tillader at tørre.
Bemærk: Hvis cellerne ikke er klækket, skal du bruge poly-L-lysin coatede slides. - Celle stedet cirkuler med en PAP-pen og dækkes med 50 μL 2,5% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. Inkuber ved RT i 10 min.
Forsigtig: PFA er brandfarlig og kan forårsage helbredsproblemer ved indånding eller ved kontakt med huden. Genstande, der er forurenet med PFA, bør kasseres som farligt affald. - Vask 3x med PBS. Tap væsken af på papirhåndklæde og dæk med 100 μL PBS. Gentag to gange. Kassér endelig vask.
-
Forbered dias til lagring i flere dage. Hvis du udfører fisk samme dag, skal du fortsætte til trin 3,9 uden trinnene i dette afsnit.
Bemærk: det er bedst at udføre hybridiseringen med det samme, men hvis kort tid følger trin 3,8 før opbevaring. Slides kan opbevares i flere dage ved 4 °C.- Dæk stedet med 60% ethanol. Incubate ved RT i 3 min. kassér opløsningen.
- Dæk stedet med 80% ethanol. Incubate ved RT i 3 min. kassér opløsningen.
- Dæk stedet med 100% ethanol. Incubate ved RT i 3 min. kassér opløsningen. Fortsæt til trin 3,9.
- Placer de slides, der er afdækket i en hybridiserings ovn ved 50 °C i 1 time. Hvis trin 3,8 blev fulgt, opbevares diasene ved 4 °C. Hvis ikke, skal du fortsætte til trin 4,2 for at udføre hybridiserings protokollen.
4. fisk, som svajer i mavetarmkanalen
- Devoks paraffin-indlejrede histologiske sektioner.
- I en hybridiseringsovn, prewarm en Coplin jar fyldt med xylen til 60 °C.
- Indsæt diasene i den xylen fyldte krukke. Sted ved 60 °C i 10 min. kassér xylen-vasken. Opbevar gliderne i glasset og hæld xylen i en affaldsbeholder.
- Hæld frisk RT xylen i glasset og Inkuber ved 60 °C i 10 min. kassér den anden xylen vask.
- Fyld glasset med 100% ethanol og Inkuber ved RT i 5 min. Fjern slidene fra krukken og lufttørre.
- Indstil hybridiserings ovnen til 50 °C for trin i afsnit 4,2.
- Plet C. albicans med fisk sonde.
- 1 mL frisk hybridiseringsvæske (20 mM Tris – HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS], 1% formamid i RNase-frit vand) forberedes. Se tabel 1 for stikprøve beregninger.
- Bland 50 μL hybridiserings opløsning med 1 μL C. albicans sonde (5 ' CY3-ACAGCAGAAGCCGTGCC 3 '; 50 μg/ml i RNase-frit vand) for en endelig sonde mængde på 0,5 μg pr. slide.
Bemærk: Mange laboratorie-opdrættet mus indeholder ingen svampe blandt deres mikrobiota. I dette tilfælde er det muligt at erstatte en pan-svampe sonde (5 ' Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3 '), der genkender 23S rRNA af de fleste svampearter, ikke kun C. albicans. I forfatterne ' erfaring, den panfungale sonde giver lysere farvning end den C. albicans-specifikke sonde. - Beskyt opløsningen mod lys og Forvarm til 50 °C.
- Brug en PAP-pen til at tegne en cirkel omkring vævs afsnittet fra afsnit 4,1.
- Pipetten 50 μL sonde-indeholdende hybridiseringsvæske på det faste væv, og spænd forsigtigt over vævs afsnittet med en pipettespids. Overlejret væsken med en hybridiserings dækseddel, der sørger for at forhindre bobler.
- Forsegl slides i et vandtæt hybridiserings kammer og Inkuber sektionerne i 3 timer ved 50 °C i mørket i en hybridiseringsovn.
- I mellemtiden, forberede 50 mL fisk vaskeopløsning (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl i RNase-fri vand). Se tabel 1 for stikprøve beregninger.
- Flyt Vaskeopløsningen til 50 °C for at forvarme.
- Efter 3 timer tilsættes Vaskeopløsningen til en Coplin-krukke. Fjern derefter forsigtigt dæksedlen fra diaset med pincet, og Placer diaset i Vaskeopløsningen.
- Dæk glasset med aluminiumsfolie og Inkuber ved 50 °C i 20 minutter.
- Under denne inkubation, forberede mucin-kerner farvning opløsning (20 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol [DAPI], 1,6 μg/mL fluorescein isothiocyanat [FITC]-Lectin i PBS). Se tabel 1 for stikprøve beregninger. Brug FITC-ulex Benved kold 1 (UEA-1) til mave og store tarme. For små tarme og cecum, brug en kombination af FITC-UEA-1 og FITC-hvedekim kold (WGA).
Bemærk: Lectins fra forskellige arter genkender forskellige sukker modifikationer af glycoproteiner såsom mucin. De lektin kombinationer, der anbefales her, blev fastlagt empirisk for optimal farvning af slim i forskellige GI-rum. - Vask slidene ved at hælde fiske Vaskeopløsningen af og fylde krukken med RT PBS. Hæld straks PBS i, og fyld med PBS. Hæld PBS for i alt 2 skyller.
- Wick væk PBS med en delikat opgave visker væv og cirkel tarm vævet sektion med en PAP pen. Placer diasene i en uigennemsigtig plastikbeholder, og tilsæt 50 μL mucin-nuklei farvningsopløsning til vævs afsnittet. Dæk beholderen med aluminiumsfolie for at beskytte mod lys. Inkuber ved 4 °C i 45 min.
- Placer slides i en Coplin jar og vask hurtigt to gange i PBS på RT.
- Tryk væk den overskydende PBS på et papir håndklæde, og derefter væge væk de endelige dråber PBS med et væv.
- Placer en dråbe af monterings mediet på hver sektion og overlejring med en glas dækseddel, der forhindrer bobler. Lad monterings mediet sprede sig under hele dæksedlen. Til øjeblikkelig billeddannelse forankre dæksedlen på plads med neglelak i hjørnerne. For langtidsopbevaring, forsegle omkring dækglas med neglelak.
- Afbilde diasene med et fluorescerende mikroskop.
Representative Results
Efter instruktionerne, vil resultatet af denne teknik være fluorescerende mærkning af kerner i værts Epitelet, slim, og C. albicans i SEKTIONERET GI-væv. Vilde type Candida albicans celler bør vises som enten runde, unicellulære gærceller eller stærkt aflange, undertiden forgrening, multicellulære hyfer (celle-celle divisioner vil ikke være synlige i hyfer). Mutanter af C. albicans kan desuden fremstå som mindre, lidt aflange "grå" gær eller som større, lidt AFLANG "Gut" (gastrointestinal-induceret overgang) eller "uigennemsigtige" gær.
Figur 1 viser den fodring nål, der anvendes til oral sonde, samt centrale positioner af nålen under sonde proceduren. Figur 2 giver en typisk opsætning, der anvendes til orgel dissektion og UDSEENDET af GI segmenter af musen.
Figur 3 viser fisk farvning af forskellige C. albicans celletyper efter formering in vitro og i musemodel. Figur 3A viser fluorescens og fase billeder af fast, permeabiliseret, in vitro-formeret hyphae. Hypha formation blev induceret med væske Lees medium18 med 2% N-acetylglucosamin, ph 6,8 ved 37 °c. Figur 3B viser fluorescens-og fase billeder af faste, permeabiliserede, in vitro-propagerede gærceller. Figur 3C, D viser henholdsvis faste, permeabiliserede, in vitro-propagerede tarmceller og uigennemsigtige celler. GUT og uigennemsigtige celletyper er morfologisk skelnes undtagen når visualiseret ved scanning elektronmikroskopi. Bemærk venligst, at fisk farvning af in vitro-opformeret celler vil være suboptimal, hvis cellerne ikke er godt permeabilized. Et eksempel på svag og diffus farvning er vist i figur 3C. For at sikre de bedste resultater bør celle fikserings-og permeabiliserings betingelserne bestemmes empirisk for hver celletype og art, der skal undersøges. Heldigvis, den anbefalede protokol til visualisering C. albicans i sektioneret væv producerer mere konsekvent permeabilization.
Figur 3e-G skildrer c. albicans i mus store tarme, farvet med c. albicans-specifikke sonde (figur 3E) eller panfungale sonde (figur 3F, G). C. albicans vises rødt i disse billeder, Host cellekerner er blå, og slim laget er grønt. Både rund gær og stærkt aflang hyfer (hvide pilespidser) forekommer i de store tarme. Bemærk venligst, at farvning er lysere med pande svampe sonden. Figur 3G skildrer en ume6 mutant i samme rum, farvet med pande svampe sonden. ume6 koder en transkriptionsfaktor, der kræves for hypha dannelse under in vitro-betingelser19 . Det er interessant, at den gærlåste fænotype, der vises af denne mutant under in vitro-betingelser, ikke gentages i tarmen, hvilket tyder på, at en redundant faktor skal aktiveres inden for værts12. Figur 4 skildrer udseendet af vilde type C. albicans i forskellige segmenter af murine GI-kanalen, herunder regionerne umiddelbart støder op til værten slimhinde og mere centrale regioner i tarmen lumen.
Figur 1: nøglen fodring nålepositioner under sonde. (A) fodring nål. (B) fodring nåle kugle indsat på siden af tungen. C) fodring af nålen i oprejst stilling med indsættelse i spiserøret. (D) fodring nål indsat i maven med et par millimeter synlige over næsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel på dissektions layout. A) dissektions blok og værktøj. B) EXCISERET GI-tarmkanalen. Proksimal (esophagus) til distale (anus) sektioner: I. maven. II. proksimale små tarme. III. mediale små tarme. IV. distale små tarme. V. cecum. VI. tyktarmen. Pink stiplede grænse felter angiver, hvilke væv der skal fastgøres. C) væv, som er anbragt i kassetter. Romertal er de samme som i panel B. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative billeder af fisk-farvede c. albicans. a) fisk af c. albicans hyfer dyrket i væske Lees medier18 med 2% N-acetylglucosamin, ph 6,8. B) fisk af C. albicans runde gærceller dyrket på yepd + 2% agar plader. C) fisk af c. albicans tarmceller (ySN1045) dyrket på yepd + 2% agar plader. D) fisk af C. albicans uigennemsigtige celler dyrket på yepd + 2% agar plader. E) vildtype c. albicans (ySN250) i store tarme, farvet med den C. albicans-specifikke sonde. F) vildtype C. albicans i store tarme, farvet med panfungale sonden. (G) Ume6 mutant (ySN1479) i store tarme, farvet med panfungale sonde: rød er C. albicans, blå er vært epitel kerner, og grøn er mucin. Arrowheads indikerer hyphae. Pilene indikerer gær. Skala stænger = 20 μm. billeder F og G er tilpasset fra Witchley et al.12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: udseende af fisk-farvede C. albicans i forskellige tarm rum. Wild type C. albicans er vist i de angivne segmenter af musen GI-kanalen. Inden for hvert rum skildrer billederne området ved siden af værts slimhinden og den centrale region i tarm lumen. Farvning blev udført med panfungale sonde. Scale bar = 20 μm. billeder er tilpasset fra Witchley et al.12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antibiotika lagre (200x) | |||
| Penicillin G | 181 mg/mL | ||
| Streptomycin | 400 mg/μL | ||
| Methacarn | |||
| Lager | Endelig koncentration | Volumen | Enheder |
| Methanol | 60% | 300 | Ml |
| Chloroform | 30 | 150 | Ml |
| Iseddike | 10 | 50 | Ml |
| Hybridiserings løsning | |||
| Lager | Endelig koncentration | Volumen | Enheder |
| 1 M Tris-HCl, pH 7,4 | 20 mM | 20 | Μl |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 180 | Μl |
| 10% SDS | 0,10% | 10 | Μl |
| 100% formamid | 1,00% | 10 | μL (holdes i små aliquoter ved-20 °C mellem anvendelser) |
| RNase-frit vand | 780 | Μl | |
| FISK vaskeopløsning | |||
| 1 M Tris-HCl, pH 7,4 | 20 mM | 1 | Ml |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 9 | Ml |
| RNase-frit vand | 40 | Ml | |
| Mucin-nuklei farvningsopløsning | |||
| DAPI, 10 μg/mL | 20 ng/mL | 2 | Μl |
| Lectin, 40 μg/mL | 1,6 μg/mL | 40 | Μl |
| PBS, pH 7,4 | 958 | Μl | |
Tabel 1: typiske mængder og koncentrationer af opløsninger, der anvendes i denne protokol.
Discussion
Den metode, der er beskrevet her, giver mulighed for visualisering af C. albicans gær og hyfer i GI-skrifter af commensally koloniseret mus af enhver køn eller stamme. FISKEN sonde hybridizes til 23S rRNA, som er fordelt i hele svampe cytoplasmaet. Vores metode blev tilpasset fra en tidligere rapporteret protokol til visualisering af Gut bakterier20. Fordi C. albicans ændrer sin morfologi i værten, metoden er nyttig til at overvåge svampe celle form samt lokalisering. For eksempel har vi brugt denne metode til at modbevise den hypotese, at gær dominerer i hele fordøjelseskanalen, og at afsløre uoverensstemmelser mellem in vivo og in vitro fænotyper af visse "filamentation-defekte" mutanter12.
Flere musemodeller findes for C. albicans kommensal kolonisering. Mikrobiota af laboratorie mus og mennesker er forskellige og, i mus, brug af antibiotika eller en specialiseret kost er forpligtet til at etablere stabile kolonisering. Behandling med antibiotika øger også C. albicans kolonisering af mennesker og er en stor risikofaktor for dissemineret sygdom10. De antibiotika, der anvendes i denne undersøgelse er relativt billige og give pålidelige fald i bakterien mikrobiota. Bemærk, at antibiotika bruges til at mindske byrden af antagonistiske bakteriearter, ikke at fjerne alle bakterier fra dyrene. Hvis forskerne ønsker at studere C. albicans-Host interaktioner i fravær af bakterier eller for at undgå brug af antibiotika eller en særlig diæt, kan kimfri dyr erstattes af konventionelt opdrættede dyr; gnotobiotiske mus udviser dog visse immun-og anatomiske abnormiteter og kan derfor ikke være egnede til alle formål.
Flere trin er vigtige for vellykket fisk farvning: den anbefalede fiksering metode er afgørende for at bevare den strukturelle integritet af GI-væv, især det skrøbelige indhold af tarm lumen, såsom slim lag og den tredimensionale organisering af svampe og bakterier16. Bemærk venligst, at mange almindeligt anvendte fikserings løsninger, der indeholder vand, er yderst skadelige for luminale arkitekturen. De fikseringsmidler og opløsninger til vask, der er anbefalet i denne protokol, indeholder ikke vand, og det er vigtigt at undgå kontaminering med vand. Et andet kritisk trin er hybridiserings trinnet, hvor det er vigtigt at undgå fordampning af hybridiserings opløsningen under inkubation af slides i hybridiseringsovn. Vi foreslår, at du placerer diasene i en vandtæt beholder for at undgå dette problem. Alternativt kan man bruge vandtætte hybridiserings kamre som dem, der oprindeligt blev brugt til hybridisering af mikroarrays.
En C. albicans-specifik fiske sonde er beskrevet i denne protokol. Men fordi mange laboratorie opdrættede mus ikke indeholder c. albicans eller andre svampe som en del af deres naturlige tarm mikrobiota, kan en pande svampe sonde specifikt bejdske c. albicans i eksperimentelt koloniseret dyr. Udskiftning af en pande svampe sonde kan være ønskelig på grund af dens overlegne hybridiserings egenskaber og højere signal-støj-forhold. Hvis pande svampe sonden anvendes som en pseudo specifik sonde til c. albicans, er det vigtigt at dokumentere en manglende farvning i ikke-inficerede dyr (dvs. behandlet med antibiotika, men ikke C. albicans). Farvning af et ikke-koloniseret kontrol dyr er også nyttigt til at vurdere baggrunds farvning, der kan opstå som følge af overholdelse af fiske provler til levnedsmiddel partikler. Samlet set, brugen af fisk sonder tilbyder øget specificitet over de fleste andre metoder til farvning af svampe, såsom Calcofluor hvid (som pletter chitin, en cellevæg komponent, der kan variere mellem celletyper), GMS, eller kommercielt tilgængelige svampedræbende antistoffer. Desuden gør fiske farvning det muligt at samfarende flere organismer ved hjælp af differentielt mærkede fiske sonder til artsspecifikke Rrna'er.
En advarsel af denne teknik er, at visse C. albicans gærcelle typer synes meget ens af fisk (for eksempel de uigennemsigtige og Gut celletyper). For at skelne mellem disse celletyper, ville det være nyttigt at udvikle hybridiserings sonder til celletype-specifikke svampe Mrnaer. Ikke desto mindre har fiske teknikken i sin nuværende form allerede afsløret overraskende uoverensstemmelser mellem in vivo og in vitro adfærd af C. albicans mutanter evalueret under begge betingelser12, hvilket indikerer komplekse interaktioner i naturligt kommensal miljø, der ikke er tilstrækkeligt efterfulgt af eksisterende in vitro-assays. Yderligere undersøgelser af forskellige C. albicans pletter i ekstra vildtype og mutant værter vil sandsynligvis give yderligere indsigt i svampe-vært interaktioner. Især vil det være lærerigt at profil C. albicans i modeller af inflammatorisk tarmsygdom, som er forbundet med høje titre af c. albicans i mennesker21, og andre modeller af c. albicans overvækst og sygdom. FISKE teknikken kan også kombineres med immun histokemi for at plette specifikke værtsceller. Samlet set den metode, der præsenteres her giver en rimelig hurtig og pålidelig måde at bestemme C. albicans lokalisering og morfologi i pattedyr mavetarmkanalen.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Carolina Tropini, Katharine ng, Justin Sonnenburg, og KC Huang for vejledning i udviklingen af fiske teknikken. Teresa O'Meara gav nyttige kommentarer til manuskriptet, og Miriam Levy hjalp med fotografering. Dette arbejde blev støttet af NIH Grants R01AI108992, R01DK113788, og en Burroughs velkomst pris i patogenesen af smitsomme sygdomme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
- Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
- Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
- Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
- Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
- Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
- Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
- Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
- Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
- Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
- Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
- Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
- Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
- Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Sokol, H., et al. Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD. Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).
