Summary
Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare Candida albicans forma cellulare e localizzazione nel tratto gastrointestinale dei mammiferi.
Abstract
Candida albicans è una componente fungina del microbiota intestinale negli esseri umani e in molti altri mammiferi. Anche se C. albicans non causa sintomi nella maggior parte degli ospiti colonizzati, il serbatoio commensale serve come deposito per le malattie infettive e la presenza di alti titori fungini nell'intestino è associata a malattie infiammatorie intestinali. Qui, descriviamo un metodo per visualizzare la morfologia cellulare c. albicans e la localizzazione in un modello murino di colonizzazione gastrointestinale stabile. La colonizzazione è stabilita utilizzando una singola dose di C. albicans in animali che sono stati trattati con antibiotici orali. Segmenti di tessuto intestinale sono fissati in un modo che conserva l'architettura del contenuto luminale (microrganismi e muco) così come la mucosa ospite. Infine, l'ibridazione fluorescente in situ viene eseguita utilizzando sonde contro rRNA fungino per macchiare C. albicans e hyphae. Un vantaggio chiave di questo protocollo è che permette l'osservazione simultanea della morfologia cellulare di C. albicans e la sua associazione spaziale con le strutture ospiti durante la colonizzazione gastrointestinale.
Introduction
Candida albicans è un commensale fungino e un agente patogeno umano opportunistico. Questo lievito manca di una nicchia ambientale definita e invece si propaga all'interno del tratto gastrointestinale (GI), della pelle e del tratto genitourinario di esseri umani e altri mammiferi1. Mentre le prime ricerche sugli albicani C. albicans si sono concentrate principalmente sul suo potenziale di virulenza, diverse relazioni recenti suggeriscono che propagare proporzionalmente gli organismi all'interno dell'intestino può svolgere un ruolo importante nella salute normale, compreso lo sviluppo immunitario del l'ospite2,3,4. Per facilitare le indagini sul commensalismo di C. albicans all'interno dell'intestino dei mammiferi, abbiamo sviluppato un modello murino di colonizzazione GI stabile e un metodo a base di fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) per visualizzare le cellule di lievito fungino e le ife lumen intestinali.
Con alcune eccezioni5, topi allevati in laboratorio presentano in genere resistenza alla colonizzazione fungina del tratto digestivo. Si ritiene che la resistenza alla colonizzazione sia mediata da specifiche specie batteriche; tuttavia, questo può essere superato dal trattamento degli animali con antibiotici6,7 o l'uso di una dieta chimicamente definita che presumibilmente altera la composizione delle specie batteriche8,9. Allo stesso modo, nell'uomo, l'uso di antibiotici ad ampio spettro è stato associato a C. albicans overgrowth and dissemon10. Il nostro modello di colonizzazione murina utilizza antibiotici ad ampio spettro per stabilire la colonizzazione C. albicans di topi immunocompetenti allevati convenzionalmente. La penicillina e la streptomicina sono fornite nell'acqua potabile degli animali per una settimana prima della gavage con 108 unità formanti colonia (CFU) di C. albicans. Finché l'acqua infuso di antibiotici continuerà, C. albicans si propagherà attraverso il tratto GI, raggiungendo titolini fecali di 106x 108 CFU/g. Nonostante l'alto livello di colonizzazione fungina, gli animali rimangono sani e aumento di peso allo stesso tasso dei controlli non infetti. Questo modello è stato utilizzato con successo per vagliare e caratterizzare più C. albicans commensalism factors11,12.
Come altri membri del regno fungino, C. albicans è in grado di enorme plasticità morfologica13. In condizioni in vitro, è stato indicato per la transizione tra almeno sei tipi di cellule di lievito unicellulari, così come hyphae multicellulari e pseudohyphae. La transizione lievito-ipfa è uno dei suoi attributi di virulenza meglio caratterizzati, e hyphae e pseudohyphae predominano nella maggior parte dei modelli di malattia dei mammiferi, così come nei tessuti umani infetti. Per determinare la localizzazione di C. albicans e la morfologia cellulare all'interno del tratto digestivo murino, abbiamo sviluppato una tecnica FISH per colorare lieviti e ife in sezioni istologiche fisse. Le sonde sono costituite da oligonucleotidi di DNA etichettati fluorescenti che si ibridano all'RNA ribosomico 23S fungino (rRNA), che viene distribuito in tutto il citoplasma fungino. Poiché i tessuti ospiti sono fissati in un modo che conserva l'architettura tridimensionale dell'intestino, tra cui la mucosa ospite, il materiale digestivo, il microbiota batterico e il muco all'interno del lume intestinale, questa tecnica consente la localizzazione di funghi cellule rispetto a questi punti di riferimento quando macchiato. La tecnica FISH si confronta favorevolmente con le macchie istologiche tradizionali per i funghi, come Periodic Acid Schiff (PAS) o Gomori's Methenamine-Silver (GMS), così come gli anticorpi antifungini disponibili in commercio, perché questi reagenti non sono specifici per C. albicans. Inoltre, fissativi standard rimuovono lo strato di muco e interrompono altri contenuti del lume intestinale14,15.
In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate per stabilire la colonizzazione di alto grado C. albicans del tratto GI del topo, per la dissezione del tratto digestivo da animali eutanasia, per la fissazione dei tessuti in un modo che conserva il luminale l'architettura, e per il rilevamento di C. albicans all'interno dei tessuti ospiti utilizzando FISH. Oltre ai ceppi di tipo selvatico e mutanti di C. albicans, la tecnica di gavage può essere utilizzata per fornire altri microrganismi. La tecnica di fissazione sarebbe utile per qualsiasi studio in cui si desidera la conservazione del contenuto intestinale. La procedura FISH può essere completata entro un giorno e può essere utilizzata per localizzare più specie fungine utilizzando più sonde etichettate in modo differenziale.
Protocol
I passaggi descritti di seguito sono stati approvati dall'UCSF Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Colonizzazione gastrointestinale di topi con C. albicans Using Oral Gavage
- Fornire alloggi per 18-21 g di topi maschi o femmine (8-10 settimane) come approvato dall'IACUC locale. Utilizzare cibo e acqua autoclaved a partire dal primo giorno.
NOT: L'uso di gabbie sterilizzate, biancheria da letto, cibo e acqua riduce il rischio di contaminazione con batteri ambientali resistenti agli antibiotici che possono potenzialmente spingere C. albicans dall'intestino. Inoltre, a seconda della questione sperimentale, l'alloggiamento individuale degli animali dovrebbe essere considerato perché i topi sono coprofagici e il contenuto intestinale sarà condiviso tra gli animali cohoused. - Il giorno seguente, sostituire l'acqua potabile autoclavecontra con acqua autoclaved contenente 5% glucosio, 1.500 U/mL penicillina G e 2 mg/mL streptomycin.
- Per comodità, preparare in anticipo le soluzioni 200x per lo stock di antibiotici (Tabella 1), sterilizzare il filtro e congelare a -20 gradi centigradi.
- Mantenere gli animali con antibiotici per una settimana.
- Nei giorni 3 e 6 dopo l'avvio degli antibiotici, valutare le feci di ogni animale per la contaminazione con batteri aerobici resistenti agli antibiotici. Tenendo un animale con una mano, posizionare un tubo di microfuge non tappato vicino all'ano e raccogliere almeno un pellet fecale.
- Risospendere ogni pellet fecale in 1 mL di acqua sterile e piastra 100 -L su brodo di Luria (LB), estratto di lievito peptone dextrose (YEPD), o infusione di cuore cerebrale (BHI) più piastre di agar di sangue. Incubare le piastre durante la notte in un'incubatrice standard (non anaerobica) a 37 gradi centigradi e valutare la crescita batterica.
NOT: Le piastre dovrebbero presentare una crescita minima (0-20 colonie). Se >20 colonie di batteri vengono recuperate da animali trattati con penicillina e streptomicina, allora è improbabile che venga stabilita una colonizzazione di alto livello con C. albicans e l'esperimento debba essere interrotto.
- Tre giorni prima del gavage, striscia C. albicans da scorte di glicerolo congelati a YEPD - 2% piastre di agar e incubare a 30 s per 2 giorni.
- Un giorno prima della gavage, inoculare una colonia di ogni ceppo C. albicans da testare in 5 mL di YEPD liquido. Incubare a 30 gradi durante la notte con agitazione.
- La mattina del gavage, diluire la cultura satura di C. albicans ad una densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,1 in 100 mL di YEPD preriscaldato a 30 gradi centigradi. Agitare in uno shaker orbitale a 200 giri/min a 30 gradi centigradi per un valore compreso tra 4 h e 5 h fino a quando l'OD600 raggiunge 1 (crescita media del log).
- Trasferire ogni coltura di 100 mL a due tubi conici da 50 mL e centrifugare a 3.000 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT).
NOTA: C. albicans propaga relativamente lentamente a RT. Se si adatta questo protocollo per un'altra specie, potrebbe essere necessario mantenere l'inocula sul ghiaccio per evitare una crescita continua. - Scartare il supernatante, rimettere in sospensione le cellule pelletinate in 20 mL di salina sterile per 50 mL di coltura, e raggruppare i pellet duplicati risospesi in singoli tubi conici. Centrifuga a 3.000 x g per 5 min.
- Scartare il supernatante e risospendere in 20 mL di salina sterile. Vortice brevemente e rimuovere 20 L per la misurazione OD600. Diluire 1:50 in salina normale sterile. Centrifugare le cellule rimanenti risospese a 3.000 x g per 5 min.
- Scartare il super-attardato. Per una dimensione inoculum di 1 x 108 CFU, risospendere le cellule pelletate a circa 5 x 108 CCU/mL in salina normale sterile in base alla concentrazione stimata determinata dalla misurazione OD600.
NOT: Tipicamente, un OD600 di 1 corrisponde a 1 x 107 cellule lievito / mL. Questo valore può variare in base a spettrometro e deve essere verificato. Se si desidera un cambiamento di concentrazione per le infezioni con un microrganismo diverso, pianificare un volume di inoculo di 10 usd per ridurre al minimo il disagio per l'animale. - Verificare la concentrazione dell'inoculo contando una diluizione 1:1.000 con un emocitometro. Regolare il volume delle cellule in base alla concentrazione determinata utilizzando l'emocitometro.
- Utilizzando un ago per l'alimentazione animale(Figura 1A), gavage ogni animale con il volume calcolato di un dato inoculo. Per la procedura di gavage, vedere i passaggi da 1.13.1.13.8.
NOTA: la formazione per il gavage deve essere ottenuta da un professionista esperto e la procedura deve essere praticata in anticipo. Una procedura di successo per un singolo animale in genere non richiede più di 1 min.- Fissare un ago di alimentazione animale autoclaved a una siringa da 1 mL e riempire la siringa con un volume di gavage, rimuovendo eventuali bolle d'aria per evitare una dose imprecisa. Posizionare su una superficie sterile.
- Fissare l'animale per gavage. Tenere l'animale alla base della coda con la mano dominante e far scorrere la mano non dominante sulla schiena dell'animale alla pelle sciolta appena dietro le orecchie.
- Usando l'indice e il pollice della mano non dominante, raccogliere saldamente la pelle sciolta; questo è lo "scruff". Raccogliere l'animale con la sua ciuffo e loop piccolo dito della stessa mano (non dominante) intorno alla coda per immobilizzare l'animale contro il palmo della mano. Estendere delicatamente la testa dell'animale in modo che la testa e il corpo (e quindi il collo e l'esofago) siano in linea retta.
NOT: Tentare una gavage mentre il corpo dell'animale è piegato o contorto può provocare complicazioni come la perforazione esofagea e la morte dell'animale. - Raccogliere la siringa con la mano dominante e tenere perpendicolare all'animale, con l'ago curvo rivolto verso il basso (Figura 1B). Utilizzando la palla dell'ago, agganciare delicatamente un angolo interno della bocca, far avanzare delicatamente l'ago lungo il lato della bocca alla parte posteriore della gola e infine spostare l'ago al centro.
NOT: L'introduzione dell'ago lungo un percorso laterale aiuta a evitare la resistenza dai denti e dalla lingua dell'animale. - Una volta che la palla dell'ago è nella parte posteriore della gola, inclinare l'ago in modo che sia parallelo con la linea del corpo dell'animale (Figura 1C).
NOT: A questo punto, l'animale esporrà un riflesso bavaglio. Questo è un buon segno che indica che l'ago è posizionato correttamente e il movimento di bavaglio aiuta a guidare l'ago lungo l'esofago. Se non c'è riflesso bavaglio, l'ago può essere nella trachea piuttosto che nell'esofago. Ritirare delicatamente l'ago e procedere al punto 1.13.1. - Lasciare che l'animale inghiottisca l'inoculo fino a quando rimangono visibili solo pochi millimetri(Figura 1D). Far avanzare l'ago senza problemi.
NOT: Se l'ago non avanza, evitare di usare la forza, che può danneggiare l'esofago. A volte avanzare l'ultimo mezzo centimetro richiederà un bavaglio extra-grande dall'animale. Se l'ago sembra essere bloccato, ritirarlo lentamente e riprovare dal passaggio 1.13.4. - Verificare che la palla d'ago sia nella posizione corretta (stomaco) facendo avanzare delicatamente lo stantuffo. Se non c'è resistenza, continuare a fornire l'inoculo. Una volta somministrato l'inoculum, ritirare lentamente l'ago.
- Sostituire l'animale nella sua gabbia e continuare a monitorare l'animale per 5-10 min per segni di respirazione affannosa o angoscia. Verificare che l'animale riprenda la normale attività subito dopo la gavage.
- Se lo stesso inoculum verrà utilizzato con l'animale successivo, pulire l'ago con una salvietta alcolica. Procedere al passaggio 1.13.1. Se verrà utilizzato un inoculum diverso, utilizzare un nuovo ago e tornare al passaggio 1.13.1.
NOT: È importante ispezionare gli animali il giorno dopo la gavage. Gli animali che presentano segni di disagio (ad esempio, postura curva, respirazione affannosa) dovrebbero essere umanamente eutanasia, in quanto hanno probabilmente subito rotture esofagee, danni ai polmoni o un'altra lesione interna da cui è improbabile il recupero.
- Dopo la gavage degli animali, diluizioni di piastra dell'inoculoa per la verifica della dose.
- Preparare diluizioni seriali di 10 volte fino a 1:105. Piastra uno volume gavage del 1:105 diluizione su una piastra da 100 mm di Sabouraud dextrose agar.
- Incubare la piastra per 2 giorni a 30 gradi centigradi. Contare le FFU per confermare la dose di inoculo.
2. Preparazione dei tessuti gastrointestinali per l'istologia
NOT: Questa sezione del protocollo è adattata da Johansson e Hansson16.
- Preparare 500 mL di soluzione di methacarn (60% metanolo, 30% cloroformio, 10% di acido acetico glaciale) in un grande barattolo di plastica a vite per ogni 2 animali sezionati.
ATTENZIONE: Metanolo e cloroformio sono dannosi se inalati e devono essere manipolati in una cappa chimica. L'acido acetico glaciale può essere corrosivo e deve essere maneggiato con le adeguate attrezzature protettive personali. Metanolo, cloroformio e acido acetico glaciale devono essere scartati come rifiuti pericolosi. - All'endpoint sperimentale, eutanasia gli animali umanamente secondo un protocollo approvato dall'IACUC locale.
NOT: Negli animali trattati con antibiotici, la colonizzazione degli albicani C. varia in genere da 106 CFU/g il giorno 5 fino a 5 x 107 CFU/g entro il giorno 25. - Sterilizzare gli strumenti di dissezione con il 10% di candeggina e risciacquare con il 70% di etanolo.
- Fissare ogni animale su una superficie di dissezione, con lato ventrale rivolto verso l'alto. Utilizzare 30 G aghi per fissare gli arti alla superficie di dissezione (Figura 2A). Spruzzare l'animale con il 70% di etanolo per pulire la pelliccia e ridurre al minimo l'attaccamento agli strumenti.
- Utilizzando pinze con terminazione smussata, pizzicare una sezione di pelle addominale con mano non dominante. Utilizzando forbici con mano dominante, incise la pelle e fascia sottostante vicino alla base del bacino. Estendere l'incisione in una forma a U lungo ogni lato della cavità peritoneale e fino alla gabbia toracica. Sollevare la pelle fuori strada.
- Utilizzando una matita, preetichettare le cassette di istologia per i segmenti IG da valutare. Ad esempio, per ogni animale, etichettare cassette separate come "stomaco", "intestino piccolo prossimale", "intestino minore medio", "intestino tenue distale", "cecum" e "intestino crasso". Posizionare un cuscinetto di schiuma sul fondo di ogni cassetta (Figura 2A).
NOTA: Figura 2B delinea le sezioni suggerite da posizionare nelle cassette. - Utilizzando pinze con la torfine smussata, estrarre delicatamente il cecum dalla cavità peritoneale. Utilizzare le forbici per recidere le connessioni tra il cecum e l'intestino piccolo e grande.
NOT: Il tessuto cecale è molto delicato e facile da rompersi. Fare attenzione durante la manipolazione. - Posizionare l'intero cecum in una cassetta di istologia in modo che sia distorto e si diffonda piatta (Figura 2C). Posizionare un secondo cuscinetto di schiuma sulla parte superiore e chiudere la cassetta. Collocare la cassetta in un barattolo a vite contenente methacarn.
- Accisa una sezione dell'intestino crasso che contiene pellet fecali di 1/2, con una lunghezza inferiore a quella della cassetta.
- Posizionare la sezione del tessuto nella cassetta, mantenendo il tessuto piatto e non attorcigliato. Sovrapporre con un secondo pad di schiuma e chiudere la cassetta. Posizionare la cassetta in methacarn.
- Per ogni sezione dell'intestino tenue da campionare, accise un segmento di 1-2 cm che contiene del materiale digestivo.
- Posizionare il segmento in una cassetta di istologia, mantenendo il tessuto piatto e non attorcigliato. Sovrapporre con un secondo pad di schiuma e chiudere la cassetta. Posizionare la cassetta in methacarn.
- Per lo stomaco, recidere le connessioni all'esofago e all'intestino tenue. Mettere in una cassetta, mantenendo il tessuto piatto e untwisted. Sovrapporre con un secondo pad di schiuma e chiudere la cassetta. Posizionare la cassetta in methacarn.
- Lasciare le cassette in soluzione di methacarn a RT per almeno 3 ore e meno di 2 settimane.
NOT: Ci sono diversi punti durante i quali i segmenti igidi fissi possono essere trasferiti a un servizio di istologia commerciale. Questi tessuti possono essere difficili da sezionere senza interruzione del contenuto luminale, e risultati ottimali saranno ottenuti da un tecnico esperto. Se il servizio commerciale è disposto a eseguire fusti prima di incorporare i tessuti in paraffina, le cassette possono essere inviate in questa fase insieme alle istruzioni per il passaggio 2.16. - Iniziare a fondere abbastanza cera di paraffina per coprire tutte le cassette di tessuto in un grande bicchiere in un forno di ibridazione preriscaldato a 70 gradi centigradi.
- Dopo la fissazione, rimuovere i cuscinetti di schiuma e restituire ogni sezione di tessuto intatta nella sua cassetta. Lavare i tessuti con le seguenti soluzioni a RT con agitazione: due volte per 35 min in 100% metanolo, due volte per 25 min in 100% etanolo, due volte per 20 min in xilene.
ATTENZIONE: Xylene è infiammabile, tossico e può causare danni se inalato. Utilizzare in una cappa chimica con una protezione adeguata. Smaltire lo xilene mediante procedure di rifiuti pericolosi. - Asciugare le cassette su un tovagliolo di carta e metterle in cera di paraffina prefusa per 2 h a 70 gradi centigradi in un forno di ibridazione. Assicurarsi che le cassette siano riempite con paraffina e non rimangano bolle.
NOT: Questo passaggio consente alla cera di infiltrarsi nel segmento GI e stabilizzare il tessuto e il contenuto. - Rimuovere le cassette dalla cera, lasciare che la cera in eccesso per drenare, e conservare a RT fino a quando non sono incorporati in blocchi di cera. Scartare la cera contenente tracce di xileni come rifiuti pericolosi.
NOT: Il Noble Lab utilizza un servizio di istologia commerciale per l'incorporamento e la sezionamento dei tessuti. Per la visualizzazione standard di lieviti C. albicans e hyphae, vengono utilizzate 4 sezioni m. Per valutare la connettività dei segmenti di hyphal, che in genere si estendono attraverso più piani, è possibile utilizzare 8 sezioni m. A seconda della capacità delle sonde FISH di penetrare nel campione, potrebbe essere possibile utilizzare sezioni ancora più spesse.
3. Convalida delle sonde di nuova progettazione
NOT: Il seguente protocollo per la convalida delle sonde C. albicans è stato adattato da Swidsinski etal.
- Streak C. albicans SC5314 e specie comparatori strettamente correlate (ad esempio, Candida dubliniensis, Candida tropicalis) a YEPD - 2% piastre di agar. Incubare per 1/2 giorni a 30 gradi centigradi.
- Inoculare 5 mL di liquido YEPD medio con una singola colonia.
- Pipetta 1 mL delle cellule sospese in un tubo di microcentrifuga e centrifuga a 3.000 x g per 5 min.
- Risospendere il pellet in 100 gradi l di salina con buffer fosfato (PBS).
- Pipette 5/10 - di celle risospese e punto su uno scivolo di vetro. Stendere in un cerchio più grande e lasciare asciugare.
NOT: Se le cellule non sono aderenti, utilizzare vetrini rivestiti poli-L-lisina. - Circolare il punto cellulare con una penna PAP e una copertura con 50 : L del 2,5% di paraformaldeide (PFA) in PBS. Incubare a RT per 10 min.
ATTENZIONE: La PFA è infiammabile e può causare problemi di salute se inalata o a contatto con la pelle. Gli articoli contaminati da PFA devono essere scartati come rifiuti pericolosi. - Lavare 3x con PBS. Toccare il liquido su un tovagliolo di carta e coprire con 100 gradi di PBS. Ripetere due volte. Eliminare il lavaggio finale.
-
Preparare i vetrini per l'archiviazione di più giorni. Se si esegue FISH nello stesso giorno, procedere al passaggio 3.9 senza i passaggi descritti in questa sezione.
NOTA: È preferibile eseguire immediatamente l'ibridazione, ma se a corto di tempo seguire il passaggio 3.8 prima della memorizzazione. Le diapositive possono essere conservate per diversi giorni a 4 gradi centigradi.- Coprire il punto con il 60% di etanolo. Incubare a RT per 3 min. Scartare la soluzione.
- Coprire il punto con l'80% di etanolo. Incubare a RT per 3 min. Scartare la soluzione.
- Coprire il punto con 100% etanolo. Incubare a RT per 3 min. Scartare la soluzione. Procedere al passaggio 3.9.
- Posizionare i vetrini scoperti in un forno di ibridazione a 50 gradi centigradi per 1 ora. Se il passaggio 3.8 è stato seguito, conservare le diapositive a 4 gradi centigradi. In caso contrario, procedere al passaggio 4.2 per eseguire il protocollo di ibridazione.
4. FISH Sstaining in tessuti del tratto GI
- Sezioni istologiche incorporate in paraffina di decera.
- In un forno di ibridazione preriscaldare un barattolo Coplin ripieno di xilene a 60 gradi centigradi.
- Inserire le diapositive nel barattolo pieno di xylene. Scartare a 60 gradi per 10 min. Tenere i vetrini nel barattolo e versare lo xilene in un contenitore di rifiuti.
- Versare lo xilene fresco nel barattolo e incubare a 60 gradi per 10 min.
- Riempire il barattolo con 100% etanolo e incubare a RT per 5 min. Rimuovere i vetrini dal vaso e asciugare all'aria.
- Impostare il forno di ibridazione a 50 gradi centigradi per i passi nella sezione 4.2.
- Stain C. albicans con la sonda FISH.
- Preparare 1 mL di soluzione di ibridazione fresca (20 mM Tris–HCl, pH 7.4, 0,9 M NaCl, 0,1% solfato di solfato di sodio al sodio [SDS], 1% formamide in acqua senza RNase). Vedere la Tabella 1 per i calcoli di esempio.
- Mescolare 50 l di soluzione di ibridazione con 1 L di sonda C. albicans (5' Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3'; 50 g/mL in acqua senza RNase) per una quantità finale di sonda di 0,5 g per diapositiva.
NOT: Molti topi allevati in laboratorio non contengono funghi tra i loro microbiota. In questo caso, è possibile sostituire una sonda panfungina (5' Cy3-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC 3') che riconosce 23S rRNA della maggior parte delle specie fungine, non solo C. albicans. Nell'esperienza degli autori, la sonda panfungina produce una colorazione più luminosa rispetto alla sonda specifica di C. albicans. - Proteggere la soluzione dalla luce e preriscaldare a 50 gradi centigradi.
- Utilizzando una penna PAP, disegnare un cerchio intorno alla sezione del tessuto dalla sezione 4.1.
- Pipette 50 - L di soluzione di ibridazione contenente sonda sul tessuto fisso e si sviluppa delicatamente sulla sezione del tessuto con una punta di pipetta. Sovrapporre il liquido con una coverslip ibridazione assicurandosi di prevenire le bolle.
- Sigilla i vetrini in una camera di ibridazione a tenuta stagna e incuba le sezioni per 3 h a 50 gradi centigradi al buio in un forno di ibridazione.
- Nel frattempo, preparare 50 mL di soluzione di lavaggio FISH (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl in acqua senza RNase). Vedere la Tabella 1 per i calcoli di esempio.
- Spostare la soluzione di lavaggio a 50 gradi centigradi per preriscaldare.
- Dopo 3 h, aggiungere la soluzione di lavaggio a un barattolo Coplin. Quindi, rimuovere con attenzione il coperchio dal vetrino con pinze e posizionare il vetrino nella soluzione di lavaggio.
- Coprire il barattolo con un foglio di alluminio e incubare a 50 gradi centigradi per 20 min.
- Durante questa incubazione, preparare la soluzione di colorazione mucina-nuclei (20 ng/mL 4,6-diamidino-2-fenylindole [DAPI], 1,6 g/mL fluorescein isothiocyanate [FITC]-lectine in PBS). Vedere la Tabella 1 per i calcoli di esempio. Per lo stomaco e l'intestino crasso, utilizzare fitC-Ulex europaeus agglutinina 1 (UEA-1). Per l'intestino tenue e il cecum, utilizzare una combinazione di agglutininina germe del grano FITC-UEA-1 e FITC (WGA).
NOT: Le lectine di specie diverse riconoscono diverse modifiche dello zucchero delle glicoproteine come la mucina. Le combinazioni di lectina raccomandate qui sono state determinate empiricamente per una colorazione ottimale del muco in diversi compartimenti di GI. - Lavare i vetrini versando la soluzione di lavaggio FISH e riempiendo il barattolo con RT PBS. Versare immediatamente il PBS e ricaricare con PBS. Versare il PBS per un totale di 2 lavamenti.
- Wick via il PBS con un delicato tessuto tergicristallo compito e cerchiare la sezione del tessuto intestinale con una penna PAP. Collocare i vetrini in un contenitore di plastica opaco e aggiungere 50 l di soluzione di colorazione mucina-nuclei alla sezione del tessuto. Coprire il contenitore con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Incubare a 4 gradi centigradi per 45 min.
- Mettere i vetrini in un barattolo Coplin e lavare rapidamente due volte in PBS a RT.
- Toccare l'eccesso PBS su un tovagliolo di carta, e poi stoppino via le gocce finali di PBS con un tessuto.
- Posizionare una goccia di supporto di montaggio su ogni sezione e sovrapporli con una vetrina di vetro, evitando bolle. Lasciare che il supporto di montaggio si diffonda sotto l'intero coperchio. Per l'imaging immediato, ancorare il coperchio in posizione con smalto agli angoli. Per la conservazione a lungo termine, sigillare intorno alla coverslip con smalto.
- Immagini delle diapositive con un microscopio fluorescente.
Representative Results
Seguendo le istruzioni fornite, il risultato di questa tecnica sarà l'etichettatura fluorescente dei nuclei nell'epitelio ospite, nel muco e nel C. albicans nei tessuti GI sezionati. Le cellule albicani di tipo selvaggio Candida dovrebbero apparire come cellule di lievito rotonde e unicellulari o come cellule di lievito altamente allungate, a volte ramificate, iphae multicellulari (le divisioni cellulari non saranno evidenti nelle ife). I mutanti di C. albicans possono inoltre apparire come lieviti "grigi" più piccoli, leggermente allungati o come lieviti "GUT" leggermente allungati o "opachi".
Figura 1 raffigura l'ago di alimentazione utilizzato per gavage orale, così come le posizioni chiave dell'ago durante la procedura di gavage. Figura 2 fornisce una configurazione tipica utilizzata per la dissezione degli organi e l'aspetto di segmenti di Gi del mouse.
Figura 3 Mostra la colorazione FISH di diversi tipi di cellule C. albicans dopo la propagazione in vitro e all'interno del modello di mouse. Figura 3A mostra la fluorescenza e le immagini di fase di iphae fisso, permeabilizzato, in ottiato in vitro. La formazione di Hypha è stata indotta con il mezzo liquido di Lee18 con il 2% N-acetylglucosamina, pH 6,8 a 37 gradi centigradi. La figura 3B mostra la fluorescenza e le immagini di fase di cellule di lievito fisse, permeapilizzate e propagate in vitro. Figura 3C,D mostra fisso, permeabilizzato, in cellule GUT in vitro propagate e cellule opache, rispettivamente. I tipi di cellule GUT e opachi sono morfologicamente indistinguibili tranne quando vengono visualizzati mediante microscopia elettronica a scansione. Si prega di notare che la colorazione FISH delle cellule in vitro propagate sarà non ottimale se le cellule non sono ben permeabilizzate. Un esempio di colorazione debole e diffusa è illustrato nella Figura 3C. Per ottenere i migliori risultati, la fissazione delle cellule e le condizioni di permeabilizzazione devono essere determinate empiricamente per ogni tipo di cellula e specie da studiare. Fortunatamente, il protocollo consigliato per la visualizzazione di C. albicans nei tessuti sezionati produce una permeabilizzazione più coerente.
Figura 3E-G raffigura C. albicans in intestino crasso del topo, macchiato con la sonda c. albicans-specifica (Figura 3E) o la sonda panfungina (Figura 3F,G). C. albicans appare rosso in queste immagini, i nuclei cellulari ospiti sono blu e lo strato di muco è verde. Entrambi i lieviti rotondi e le iphae altamente allungate (punte di freccia bianca) si verificano nell'intestino crasso. Si prega di notare che la colorazione è più luminosa con la sonda panfungina. Figura 3G raffigura un mutante ume6 nello stesso compartimento, macchiato con la sonda panfungina. Ume6 codifica un fattore di trascrizione che è necessario per la formazione di ifa in condizioni in vitro19 . È interessante notare che il fenotipo bloccato dal lievito visualizzato da questo mutante in condizioni in vitro non viene riepilogato all'interno dell'intestino, suggerendo che un fattore ridondante deve essere attivato all'interno dell'ospite12. Figura 4 raffigura l'aspetto di wild tipo C. albicans in diversi segmenti del tratto gi murno, comprese le regioni immediatamente adiacenti alla mucosa ospite e regioni più centrali del lume intestino.
Figura 1: Posizioni chiave dell'ago di alimentazione durante la gavage. (A)Aghi di alimentazione. (B) Alimentazione palla d'ago inserita sul lato della lingua. (C) Aghi di alimentazione in posizione eretta con inserimento nell'esofago. (D) Aghi di alimentazione inseriti nello stomaco con pochi millimetri visibili sopra il naso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di layout di svincolo. (A) Dissezione pad e strumenti. (B) Tratto iGi eccitato. Proximal (esofago) a sezioni discrepanti (ano): I. Stomaco. II. Intestino piccolo prossimale. III. Medial intestino tenue. IV. Disl intestino tenue. V. Cecum. VI. Intestino crasso. Le caselle di bordo tratteggiate rosa indicano i tessuti da fissare. (C)Tessuti posizionati in cassette. I numeri romani sono gli stessi del pannello B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative di C. albicanscolor FISH. (A) FISH di C. albicans hyphae coltivate nei media liquidi di Lee18 con 2% N-acetylglucosamine, pH 6,8. (B) FISH di C. albicans cellule di lievito rotonde coltivate su YEPD - 2% piastre di agar. (C) FISH di C. albicans cellule GUT (ySN1045) coltivate su YEPD - 2% piastre di agar. (D) FISH di C. albicans cellule opache coltivate su YEPD - 2% piastre di agar. (E) Tipo selvaggio C. albicans (ySN250) nell'intestino crasso, macchiato con la sonda specifica C. albicans-. (F) Wild tipo C. albicans in intestino crasso, macchiato con la sonda panfungine. (G) Ume6 mutante (ySN1479) nell'intestino crasso, macchiato con la sonda panfungina: rosso è C. albicans, blu è nuclei epiteliali ospiti, e il verde è la mucina. Le teste di freccia indicano hyphae. Le frecce indicano il lievito. Le barre della scala sono adattate da Witchley et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Aspetto di C. albicans macchiati di FISH in diversi compartimenti intestinali. Il tipo selvaggio C. albicans è mostrato nei segmenti indicati del tratto GI del mouse. All'interno di ogni scompartimento, le immagini raffigurano l'area adiacente alla mucosa ospite e la regione centrale del lume intestinale. La colorazione è stata eseguita con la sonda panfungina. Barra della scala - 20 m. Le immagini sono adattate da Witchley etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Scorte di antibiotici (200x) | |||
| Penicillina G | 181 mg/mL | ||
| Streptomicina | 400 mg/l | ||
| Methacarn | |||
| merce | Concentrazione finale | volume | Unità |
| metanolo | 60% | 300 | Ml |
| Cloroformio | 30% | 150 | Ml |
| Acido acetico glaciale | 10% | 50 | Ml |
| Soluzione di ibridazione | |||
| merce | Concentrazione finale | volume | Unità |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 20 | Μl |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 180 | Μl |
| 10% SDS | 0.10% | 10 | Μl |
| Formamide al 100% | 1.00% | 10 | L (mantenuto in piccole aliquote a -20 gradi centigradi tra gli usi) |
| Acqua senza RNani | 780 | Μl | |
| Soluzione di lavaggio FISH | |||
| 1 M Tris-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 1 | Ml |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 9 | Ml |
| Acqua senza RNani | 40 | Ml | |
| Soluzione di colorazione mucini-nuclei | |||
| DAPI, 10 g/mL | 20 ng/mL | 2 | Μl |
| lectina, 40 g/mL | 1,6 g/mL | 40 | Μl |
| PBS, pH 7,4 | 958 | Μl | |
Tabella 1: Volumi tipici e concentrazioni di soluzioni utilizzate in questo protocollo.
Discussion
Il metodo qui descritto consente la visualizzazione di lieviti E iphae C. albicans nei tratti GI di topi colonizzati commensalmente di qualsiasi sesso o ceppo. La sonda FISH si ibrida al rRNA 23S, che viene distribuito in tutto il citoplasma fungino. Il nostro metodo è stato adattato da un protocollo precedentemente riportato per la visualizzazione dei batteri intestinali20. Poiché C. albicans cambia la sua morfologia all'interno dell'ospite, il metodo è utile per monitorare la forma delle cellule fungine e la localizzazione. Per esempio, abbiamo usato questo metodo per confutare l'ipotesi che i lieviti predominano in tutto il tratto digestivo e per esporre discrepanze tra i fenotipi in vivo e in vitro di alcuni mutanti "filamentazione-difettosi"12.
Esistono diversi modelli murini per La colonizzazione commensale di C. albicans. Il microbiota dei topi di laboratorio e degli esseri umani sono distinti e, nei topi, l'uso di antibiotici o una dieta specializzata è necessaria per stabilire una colonizzazione stabile. Il trattamento con antibiotici migliora anche la colonizzazione C. albicans degli esseri umani ed è un importante fattore di rischio per la malattia diffusa10. Gli antibiotici utilizzati in questo studio sono relativamente economici e producono diminuzioni affidabili nel microbiota batterico. Si noti che gli antibiotici vengono utilizzati per diminuire il carico delle specie batteriche antagoniste, non per eliminare tutti i batteri dagli animali. Se i ricercatori desiderano studiare C. albicans - interazionicon l'ospite in assenza di batteri o evitare l'uso di antibiotici o una dieta speciale, gli animali privi di germi possono essere sostituiti con animali allevati convenzionalmente; tuttavia, i topi gnotobiotici presentano alcune anomalie immunitarie e anatomiche e pertanto potrebbero non essere adatti a tutti gli scopi.
Diversi passaggi sono importanti per il successo della colorazione FISH: il metodo di fissazione raccomandato è fondamentale per preservare l'integrità strutturale dei tessuti GI, in particolare il fragile contenuto del lume intestinale, come lo strato di muco e il tridimensionale organizzazione di funghi e batteri16. Si prega di notare che molte soluzioni di fissaggio comunemente utilizzate che contengono acqua sono altamente dannose per l'architettura luminosa. I fissativi e le soluzioni per gli idrati di post-fissazione consigliati in questo protocollo non contengono acqua ed è importante evitare la contaminazione con acqua. Un altro passo critico è la fase di ibridazione, dove è importante evitare l'evaporazione della soluzione di ibridazione durante l'incubazione di vetrini nel forno di ibridazione. Si consiglia di posizionare i vetrini in un contenitore a tenuta stagna per evitare questo problema. In alternativa, è possibile utilizzare camere di ibridazione a tenuta stagna come quelle originariamente utilizzate per l'ibridazione dei microarray.
In questo protocollo è descritta una sonda FISH specifica di C. albicans. Tuttavia, poiché molti topi allevati in laboratorio non contengono C. albicans o altri funghi come parte del loro microbiota intestinale naturale, una sonda panfungina può specificamente macchiare C. albicans in animali colonizzati sperimentalmente. La sostituzione di una sonda panfungina può essere auspicabile a causa delle sue caratteristiche di ibridazione superiori e del più alto rapporto segnale-rumore. Se la sonda panfungina viene utilizzata come sonda pseudospecifica per C. albicans, è importante documentare una mancanza di colorazione negli animali non infetti (cioè, trattata con antibiotici ma non Con C. albicans). La colorazione di un animale di controllo non colonizzato è utile anche per valutare la colorazione di fondo che può derivare dall'aderenza delle sonde FISH al particolato alimentare. Nel complesso, l'uso di sonde FISH offre una maggiore specificità rispetto alla maggior parte degli altri metodi di colorazione dei funghi, come il Calcofluor bianco (che macchia la chitina, un componente della parete cellulare che può variare tra i tipi di cellule), GMS o anticorpi antifungini disponibili in commercio. Inoltre, la colorazione FISH consente la costamento di più organismi utilizzando sonde FISH etichettate in modo differenziale per rRNA specifici delle specie.
Un avvertimento di questa tecnica è che alcuni tipi di cellule lievito C. albicans appaiono molto simili da FISH (ad esempio, i tipi di cellule opache e GUT). Per distinguere tra questi tipi di cellule, sarebbe utile sviluppare sonde di ibridazione a mRNA fungini specifici del tipo di cellula. Tuttavia, nella sua forma attuale, la tecnica FISH ha già rivelato sorprendenti discrepanze tra i comportamenti in vivo e in vitro dei mutanti C. albicans valutati in entrambe le condizioni12, indicando interazioni complesse nel ambiente commensale naturale che non sono adeguatamente imitati dai saggi in vitro esistenti. Ulteriori studi su diversi C. albicans macchie in ulteriore tipo selvaggio e ospiti mutanti probabilmente produrrà ulteriori approfondimenti sulle interazioni fungino-ospite. In particolare, sarà istruttivo profilare C. albicans in modelli di malattia infiammatoria intestinale, che è associata ad alti titolanti di C. albicans in esseri umani21, e altri modelli di C. albicans sovracrescita e malattia. La tecnica FISH può anche essere combinata con l'immunosofita per macchiare specifiche cellule ospiti. Nel complesso, il metodo qui presentato fornisce un mezzo ragionevolmente rapido e affidabile per determinare la localizzazione e la morfologia di C. albicans all'interno del tratto GI dei mammiferi.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg e KC Huang per una guida nello sviluppo della tecnica FISH. Teresa O'Meara ha fornito commenti utili sul manoscritto, e Miriam Levy ha assistito con la fotografia. Questo lavoro è stato sostenuto da concessioni NIH R01AI108992, R01DK113788, e un Premio di benvenuto Burroughs nella patogenesi delle malattie infettive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
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