Summary
यहाँ, हम विधि हम Drosophila लार्वा मस्तिष्क की एक जीवित तैयारी में अत्यधिक गतिशील डेन्ड्रिटिक filopodia छवि के लिए कार्यरत का वर्णन है, और प्रोटोकॉल हम dendrite के मात्रात्मक आकलन के लिए समय चूक 3 डी इमेजिंग डेटासेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित न्यूरॉन्स के विकास में गतिशीलता.
Abstract
अत्यधिक गतिशील डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया प्रारंभिक विकास चरणों में न्यूरॉन्स में व्यापक रूप से मौजूद हैं। ये अन्वेषणात्मक गतिशील शाखाएं आस-पास के वातावरण का नमूना देती हैं और संभावित synaptic भागीदारों के साथ संपर्क आरंभ करती हैं। हालांकि डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता और synaptogenesis के बीच संबंध अच्छी तरह से स्थापित है, कैसे विकास और गतिविधि पर निर्भर प्रक्रियाओं डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता को विनियमित अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है. यह आंशिक रूप से इन ठीक संरचनाओं के लाइव इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों के कारण है एक में vivo प्रणाली का उपयोग कर. हम Drosophila लार्वा अधर पार्श्व न्यूरॉन्स (LNvs), जो व्यक्तिगत आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है और लाइव इमेजिंग के लिए सुलभ हैं का उपयोग कर डेन्ड्राइट गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक विधि की स्थापना की। इस प्रणाली का लाभ उठाते हुए, हमने समय चूक लाइव इमेजिंग के माध्यम से एक एकल लेबल वाले एलएनवी के पूरे डेन्ड्रिटिक आर्बर की शाखा गतिशीलता को पकड़ने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। हम तो बहाव सुधार और deconvolution के माध्यम से छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए पोस्ट प्रसंस्करण प्रदर्शन किया, सभी शाखा टर्मिनलों के स्थानिक पदों annotating द्वारा एकल शाखा स्तर पर शाखा गतिशीलता का विश्लेषण करके पीछा किया। अंत में, हमने टर्मिनल अनुरेखण द्वारा उत्पन्न निर्देशांक सूचना का उपयोग करके शाखा गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए आर स्क्रिप्ट(पूरक फाइल) और विशिष्ट पैरामीटर विकसित किए। सामूहिक रूप से, इस प्रोटोकॉल हमें उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरॉन डेन्ड्रिटिक वृक्ष की शाखा गतिशीलता की एक विस्तृत मात्रात्मक विवरण प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. हमारे द्वारा विकसित की गई विधियाँ आम तौर पर इन विट्रो और विवो स्थितियों दोनों में विरल लेबल न्यूरॉन्स पर लागू होती हैं।
Introduction
Dendrites विशेष न्यूरोनल डिब्बों कि प्राप्त करते हैं और संवेदी और synaptic इनपुट प्रक्रिया कर रहे हैं. डेन्ड्रिटिक आर्बोर्स की जटिल और रूढ़ संरचना की खोज के बाद से गहन जांच की जा रही है। डीओसोफिला प्रणाली में Xenopus ऑप्टिक tectal न्यूरॉन्स, चिक रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं, और डेन्ड्रिटिक arborization (डा) न्यूरॉन्स सहित मॉडल सिस्टम की एक संख्या, विकास का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया है, remodeling और प्लास्टिक की तंत्रिका डेंड्राइट1,2,3,4. Drosophila अधर पार्श्व न्यूरॉन्स (LNvs) दृश्य प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के एक समूह शुरू में मक्खी व्यवहार के circadian विनियमन में अपने महत्वपूर्ण कार्यों के लिए पहचान कर रहे हैं5. अध्ययनों से यह भी पता चला है कि लार्वा फोटोरिसेप्टर्स (पीआर)6,7के प्रत्यक्ष पदों के लक्ष्य के रूप में लार्वा LNvs की भूमिका का पता चला है . महत्वपूर्ण बात यह है कि विभिन्न प्रकाश व्यवस्थाओं में लार्वा विकसित करने से एलएनवीएस के डेन्ड्रिटिक आर्बोजरों के आकार पर दृढ़ता से प्रभाव पड़ता है, जो डेन्ड्रिटिक प्लास्टिक7के अध्ययन के लिए एक नए मॉडल के रूप में एलएनवी एस की उपयुक्तता का प्रदर्शन करता है। हमारे समूह के हाल के कार्य से यह भी पता चलता है कि एलएनवी डेन्ड्राइट का आकार और डेन्ड्रिटिक शाखाओं का गतिशील व्यवहार अनुभव पर निर्भरप्लास्टिक8,9 को प्रदर्शित करताहै। इस काम के भाग के रूप में, हमने 2एन डी या 3rd इनस्टार लार्वा से LNvs की डेन्ड्राइट गतिशीलता पर विश्लेषण करने के लिए एक नया लाइव इमेजिंग और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल विकसित किया है।
Drosophila लार्वा मस्तिष्क की पारदर्शी प्रकृति यह लाइव इमेजिंग के लिए आदर्श बनाता है. तथापि, एलएनव्स के डेन्ड्रिटिक वृक्ष लार्वा ब्रेन लोब6के केंद्र में घनी आंतरिक लार्वा ऑप्टिक न्यूरोपिल (लंदन) में स्थित हैं। बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों में ठीक डेन्ड्रेट शाखाओं और filopodia की छवियों पर कब्जा करने के लिए, हम दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी का उपयोग, जो प्रकाश प्रवेश की गहराई बढ़ जाती है और लाइव इमेजिंग प्रयोगों के दौरान phototoxicity कम कर देता है10. इस सेटअप का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक न्यूरॉन के स्पष्ट रूपात्मक गिरावट को देख के बिना 30 मिनट से अधिक के लिए LNvs पर लाइव इमेजिंग प्रयोगों का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, फ्लिप-आउट तकनीक का उपयोग आनुवंशिक जोड़तोड़ हमें एक झिल्ली टैग GFP के साथ व्यक्तिगत LNvs लेबल करने के लिए सक्षम है, जो भी व्यक्तिगत शाखाओं के आंदोलनों की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है11,12,13 .
इष्टतम ऑप्टिक संकल्प के साथ LNv डेन्ड्रिटिक वृक्ष पर सभी शाखाओं के गतिशील व्यवहार पर कब्जा करने के लिए, हम नए सिरे से विच्छेदन लार्वा मस्तिष्क explants पर समय चूक 3 डी इमेजिंग प्रदर्शन किया 10 से 30 मिनट के लिए फ्रेम प्रति 1 मिनट पर एक उच्च स्थानिक संकल्प के साथ LNv. LNv का विकास dendrites अत्यधिक गतिशील हैं, शाखाओं का एक बड़ा प्रतिशत के साथ 10 मिनट खिड़की के भीतर प्रेक्षणीय परिवर्तन प्रदर्शित. यह dendrite गतिशीलता का अध्ययन करने में मुख्य तकनीकी चुनौतियों में से एक की ओर जाता है, 4D छवि डेटा सेट के आधार पर शाखा व्यवहार की मात्रा निर्धारित. पहले स्थापित तरीकों सटीकता और अत्यधिक समय की आवश्यकता की कमी सहित विभिन्न सीमाएं हैं। इसलिए, हमने एक अर्द्ध-स्वचालित विधि विकसित की है जो छवि के बाद प्रसंस्करण, शाखा टर्मिनलों के मैनुअल अंकन, और एक छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित 4D स्पॉट ट्रेसिंग को जोड़ती है। हम स्थानों के 3 डी निर्देशांक के आधार पर अलग अलग समय बिंदुओं पर शाखा टर्मिनलों के आंदोलनों की गणना. डेटा तो निर्यात और शाखा गतिशीलता की मात्रात्मक माप का उत्पादन करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. इस विधि सही अवधि और मौजूदा शाखाओं के विस्तार और वापसी की घटनाओं की सीमा का आकलन, साथ ही नई शाखाओं के गठन, हमें न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या में dendrite गतिशीलता की निगरानी करने के लिए अनुमति देता है.
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Protocol
चेतावनी: इस प्रोटोकॉल चतुर्थ श्रेणी लेज़रों का उपयोग शामिल है और उचित प्रशिक्षण और सुरक्षा के दिशा निर्देशों का पालन किया जा करने की आवश्यकता होगी. प्रत्यक्ष या बिखरे हुए लेजर प्रकाश के लिए आंख या त्वचा जोखिम से बचें।
नोट: प्रोटोकॉल छह कदम शामिल हैं. कार्यप्रवाह चित्र 1Aमें दिखाया गया है.
1. फ्लिप-आउट तकनीक का उपयोग करके व्यक्तिगत न्यूरोन लेबल करना
नोट: LNvs की एकल लेबलिंग mCD8 व्यक्त करके हासिल की है::GFP एकल LNvs में flippase -mediated stochastic लेबलिंग का उपयोग कर. मक्खी लाइन के जीनोटाइप है: एच एस-फ्लप; पीडीएफ-Gal4; UAS-FRT-CD2-स्टॉप-FRT-mCD8::GFP11,12,13| एक एकल लेबल LNv प्राप्त करने की आवृत्ति के आसपास है 10%. फ्लाई स्टॉक को सर्कैडियन- और आर्द्रता-नियंत्रित 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मानक माध्यम में बनाए रखा जाता है।
- खमीर के पूरक के साथ एक अंगूर का रस प्लेट पर एक 2 एच खिड़की पोस्ट निषेचन के भीतर 100-200 अंडे ले लीजिए. 24 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को इनक्यूबेट करें और अगले चरण के लिए नए पैदा हुए पहले इनस्टार लार्वा एकत्र करें।
- गर्मी के बीच में 40 मिनट की वसूली की अवधि के साथ, 40 मिनट दो बार के लिए 37.5 डिग्री सेल्सियस पर नए से पैदा हुए पहले इनस्टार लार्वा को झटका।
- circadian और आर्द्रता के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर लार्वा संस्कृति वांछित विकास ात्मक चरण (ओं) को नियंत्रित करता है।
2. विच्छेदन और बढ़ते Larval मस्तिष्क एक्सप्लांट्स
- शारीरिक बाह्य लवणीय घोल (120 एमएम नैकल, 4 एमएम एमजीसीएल2,3 एमएम केसीएल, 10 एमएम नैहको3,10 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम सुक्रोज, 5 एमएम टीईएस, 10 एमएम एचईपी, 2 एमएम सीए2+, पीएच 7.2) में लार्वा दिमाग को अलग करें। शक्ति) #5 मानक टिप विच्छेदन बलके (11 सेमी) के दो जोड़े के साथ. लार्वा शरीर को रखने के लिए एक जोड़ी संदंश का प्रयोग करें और दूसरा मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक अलग करने के लिए। आंख डिस्क, मस्तिष्क lobes और अधर तंत्रिका कॉर्ड की रक्षा. इमेजिंग के दौरान नमूना आंदोलनों को कम करने के लिए संलग्न मांसपेशियों को निकालें।
- एक ग्लास स्लाइड (25 x 75 x 1.0 मिमी3) तैयार करें और वैक्यूम तेल के साथ एक वर्ग कक्ष आकर्षित करने के लिए सिरिंज का उपयोग करें।
- तेल अवरोधों के साथ वर्ग कक्ष के लिए बाहरी लवण समाधान के 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
- संदंश का उपयोग करते हुए कांच की स्लाइड पर कक्ष में विच्छेदित लार्वा दिमाग स्थानांतरित करें। विच्छेदन गुंजाइश के तहत दिमाग की स्थिति को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ता है.
- एक गिलास कवर पर्ची (22 x 22 x 0.15 मिमी3) के साथ कक्ष को कवर करें। लार्वा मस्तिष्क को अब स्लाइड पर बाह्य लवणीय विलयन से भरे कक्ष में रखा जाता है (चित्र 1ठ)।
नोट: कवरस्लिप पर धीरे से दबाने से दिमाग सीमित हो जाता है और बाद के इमेजिंग सत्र में नमूना बहती कम हो जाता है।
3. समय चूक लाइव इमेजिंग
नोट: हम एक multiphoton लेजर से लैस एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर समय चूक इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं. अधिग्रहण मापदंडों अन्य इमेजिंग setups के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है.
- एक 40X पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर व्यक्तिगत लेबल न्यूरॉन्स युक्त मस्तिष्क explants की पहचान (NA 1.3) और एक epifluorescent प्रकाश स्रोत. छवि संग्रह के लिए, एक दो-फोटोन लेजर 920 एनएम और एक गैर स्कैन (NDD) डिटेक्टर के लिए देखते का उपयोग करें.
- प्रति फ्रेम 512 x 512 पिक्सेल और 10 मिनट के लिए 1 मिनट प्रति $-स्टैक पर छवियों को एकत्र करें. ऑप्टिकल और डिजिटल ज़ूम को समायोजित करें एक पर्याप्त x-y-z रिज़ रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, जबकि पूरे डेन्ड्रिटिक आर्बर की कवरेज सुनिश्चित करना 1 मिनट के भीतर(चित्र 2, अनुपूरक वीडियो 1) सेटिंग्स 0.11 x 0.11 x 0.11 x 0.25 $m3की एक ठेठ x-y-z संकल्प के साथ छवियों उत्पन्न करते हैं।
- मस्तिष्क विच्छेदन के 30 मिनट के भीतर समय चूक छवि श्रृंखला ले लीजिए. अत्यधिक बहाव या स्पष्ट रूपात्मक गिरावट के साथ डेटा पोस्ट प्रसंस्करण और परिमाणीकरण से बाहर रखा जाना चाहिए.
4. बहाव सुधार और Deconvolution
नोट: छवि गुणवत्ता के आधार पर, दोनों चरणों वैकल्पिक लेकिन दृढ़ता से सिफारिश की है.
- एक बहाव सुधार सॉफ्टवेयर के साथ एक अधिग्रहीत छवि फ़ाइल खोलें. प्रयोग के लिए उपयोग किए गए पैरामीटरों से मिलान करने के लिए सूक्ष्म पैरामीटर संपादित करें. सॉफ़्टवेयर के लिए (सामग्री तालिकादेखें ), संपादित करें क्लिक करें | सूक्ष्म मापदंडोंको संपादित करें | दो-फोटोन छवियों के लिए वाइडफील्ड के रूप में माइक्रोस्कोप प्रकार सेट करें यदि कोई दो-फोटोन विकल्प नहीं है और सॉफ्टवेयर द्वारा परिभाषित कार्यप्रवाह का पालन करें। उदाहरण के लिए, टैब Deconvolution खोलें | वस्तु स्थिरता,और स्थिर समय फ्रेमका चयन करें।
- deconvolution सॉफ्टवेयर में बहाव-सुधारित छवि खोलें और इसके कार्यप्रवाह का पालन करें। सॉफ़्टवेयर के लिए (सामग्री तालिकादेखें), स्थिर छवि का चयन करें और फिर Deconvolution क्लिक करें | डेक्कनएक्सप्रेस| एक बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए, Deconvolution जादूगरका उपयोग कर मानकों ठीक धुन.
- 4D डेटा का विश्लेषण करने और छवि में परिभाषित स्थानों के स्थानिक निर्देशांक रिपोर्टिंग करने में सक्षम बाद में छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर द्वारा समर्थित है कि एक फ़ाइल प्रकार में deconvolved छवि सहेजें (सामग्री की तालिकादेखें).
5. छवि एनोटेशन
- छवि एनोटेशन सॉफ़्टवेयर में deconvolved छवि खोलें। जांच और 3 डी में सभी समय अंक पर शाखा युक्तियाँ चिह्नित करें। छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर रिपोर्ट और चिह्नित शाखा सुझावों के स्थानिक और लौकिक निर्देशांक संग्रहीत करता है। बाद की गणनाओं के लिए समन्वय जानकारी को .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करें.
नोट: निम्नलिखित दो चरण हमारे द्वारा प्रयुक्त एनोटेशन सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट हैं (सामग्री की सारणीदेखें ) वर्कफ़्लो अन्य सॉफ़्टवेयर के लिए भिन्न हो सकता है. - स्पॉट मॉड्यूल के भीतर, क्लिक करें "स्वत: निर्माण छोड़ें, मैन्युअल रूप से संपादितकरें " और नीचे की जाँच करें "चयनित स्पॉट के लिए स्वत: कनेक्ट" चेकबॉक्स ( चित्र3एक)। समय श्रृंखला में फ़्रेम पर जाएँ और एनोटेशन के लिए एक शाखा का चयन करें. शिफ्ट कुंजी पकड़ो और एक जगह जोड़ने के लिए शाखा टर्मिनल टिप पर क्लिक करें। सभी समय अंक के माध्यम से क्लिक करें.
नोट: छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर फ्रेम के बीच धब्बे जोड़ता है और स्वचालित रूप से एक प्रक्षेप वक्र उत्पन्न करता है. शाखा सुझावों के स्थानिक और लौकिक जानकारी अब चिह्नित स्थानों के साथ जुड़ा हुआ है. इन चरणों को तब तक दोहराएँ जब तक कि सभी शाखा युक्तियाँ अनुनय न हो जाएँ (चित्र 3ठ) । - स्पॉट मॉड्यूल के भीतर, सांख्यिकी टैब पर क्लिक करें, विस्तृत चुनें और विशिष्ट मानका चयन करें | स्थिति| दर्ज स्थानिक और लौकिक समन्वय जानकारी प्रदर्शन पर होगा. उस जानकारी को .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करने के लिए नीचे सहेजें क्लिक करें (चित्र 3C).
6. डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता की गणना
नोट: समन्वय जानकारी का उपयोग करना, 3 डी में शाखा सुझावों के विस्थापन आसानी से गणना की जा सकती है. हमारे अध्ययन में, सभी डेन्ड्रिटिक शाखा आंदोलनों विस्तार या वापसीके रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. नीचे दिए गए चरण कस्टम-लिखित R स्क्रिप्ट(पूरक फ़ाइल) का उपयोग करके और मैन्युअल संपादन के माध्यम से दिशात्मक जानकारी जोड़कर .csv फ़ाइलों को संसाधित करने के तरीके का वर्णन करते हैं.
- .csv फ़ाइल को स्प्रेडशीट के रूप में खोलें. ID ट्रैक करें स्तंभ का चयन करें, सबसे बड़ा करने के लिए सबसे छोटा सॉर्ट करें क्लिक करें और चयन विस्तृत करें स्वीकार करें. छँटाई के बाद, ट्रैक आईडी प्रत्येक अद्वितीय डेन्ड्रिटिक शाखा की पहचान करता है, और एक ही शाखा से स्पॉट एक ही ट्रैक आईडी साझा करते हैं। समय स्तंभ विभिन्न समय फ़्रेम की जानकारी संग्रहीत करता है।
- स्प्रैडशीट में, दूरी स्तंभ जोड़ें. उनके निर्देशांकों का उपयोग करके प्रत्येक दो अस्थायी सन्निकट स्थानों की दूरी की गणना कीजिए तथा मूल्यों को दूरी स्तंभ में रखीं(चित्र 4क)।
- एकल voxel स्तर पर मामूली आंदोलनों. इमेजिंग सेटिंग्स के आधार पर, 0.3 डिग्री मीटर आमतौर पर गलत बहती या अपूर्ण छवि एनोटेशन से कलाकृतियों रहे हैं। इन गतिविधियों को 0.3 डिग्री से 0 तक छोटे सभी दूरस्थ मान रीसेट करके फ़िल्टर करें. एकाधिक .csv फ़ाइलों को मैन्युअल रूप से संसाधित करें या हमारे R स्क्रिप्ट बैच स्तंभ फ़िल्टरिंग का उपयोग करें. R (अनुपूरक फाइल).
- मैन्युअल रूप से स्प्रेडशीट में विस्थापन नामक एक नया स्तंभ जनरेट करें। दूरी स्तंभ से विस्थापन स्तंभ तक मानों की प्रतिलिपि बनाएँ. मैन्युअल रूप से प्रत्येक शाखा टिप के लिए एक्सटेंशन और वापसी ईवेंट असाइन करें। यदि यह एक विस्तार है, विस्थापन मान अपरिवर्तित छोड़ दें, जो एक सकारात्मक मान है. यदि यह एक प्रत्याकर्षण है, तो संगत विस्थापन मान को ऋणात्मक मान में परिवर्तित करें (उदा., 0ण्35 से -0ण्35)(चित्र 4ठ)।
- ईवेंट नाम का एक नया स्तंभ जनरेट करें. इस स्तंभ में, अलग-अलग विस्तार और वापसी घटनाओं के लिए विस्थापन मानों का मैन्युअल रूप से योग करता है (चित्र 4B).
- संशोधित स्प्रेडशीट संसाधित करें और R स्क्रिप्ट बैच स्तंभ योग का उपयोग करके उनके विस्थापन मानों के आधार पर एक्सटेंशन और वापसी ईवेंट्स की मात्रा निर्धारित करें. R (अनुपूरक फाइल). आउटपुट पैरामीटर में एक्सटेंशन इवेंट्स की संख्या, वापसी की घटनाओं की संख्या, संचयी लंबाई बढ़ाई गई, संचयी लंबाई वापस ली गई, नेट लंबाई बदलीगई , और कुल लंबाई यात्रा की गई .
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Representative Results
ऊपर वर्णित लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम बाद के विश्लेषणों और परिमाणीकरण के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन छवि स्टैक कैप्चर करते हैं. अनुपूरक वीडियो 1 एक प्रतिनिधि से एकत्रित अधिकतम तीव्रता (एमआईपी) छवि श्रृंखला को व्यक्तिगत रूप से लेबल किया गया LNv. चित्र 2B छवि श्रृंखला के आठ फ्रेमों की संगत असेंबल को दर्शाता है। दोनों पैनलों में, arrowheads वापसी घटनाओं को चिह्नित करते हैं और तीर एक्सटेंशन ईवेंट ्स-वे को चिह्नित करते हैं.
इसके बाद, हम एक छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर (सामग्री कीतालिका)का उपयोग करके शाखा टर्मिनलों की अर्द्ध-स्वचालित 4D ट्रैकिंग करते हैं। चित्र 3 बी एक प्रतिनिधि से गतिशील शाखा टर्मिनलों के एनोटेशन से पता चलता है व्यक्तिगत रूप से लेबल LNv. इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, हम 3 डी में छवि ढेर कल्पना, मैन्युअल रूप से सभी शाखा टर्मिनलों निशान और स्पॉट मॉड्यूल का उपयोग करने के लिए टर्मिनलों के आंदोलनों को ट्रैक समय के माध्यम से. इस सॉफ्टवेयर को हर एनोटेट शाखा टर्मिनल के लिए समय-स्टैम्प्ड tradictories उत्पन्न करता है, डेन्ड्रिटिक arbor पर गतिशील घटनाओं के दृश्य प्रतिनिधित्व के रूप में सेवारत.
फिर हम प्रत्येक समय बिंदु पर शाखा आंदोलनों की दिशा और दूरी की गणना करने के लिए एनोटेट शाखा युक्तियों से निर्देशांक जानकारी का उपयोग करते हैं। चित्र 4A,B में स्क्रीनशॉट दिखाते हैं कि यह कैसे हासिल किया जाता है। संसाधित स्प्रेडशीट आउटपुट फ़ाइलें है कि हम गतिशील शाखाओं का प्रतिशत, नई शाखाओं की संख्या, संचयी दूरी कूच, और शाखा आंदोलन की घटनाओं की संख्या सहित चार मापदंडों के साथ dendrite गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग उत्पन्न करते हैं. चित्र 4 सी अलग-अलग विकासात्मक चरणों से व्यक्तिगत रूप से लेबल LNvs के लिए डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता की तुलना से पता चलता है। स्तनधारी न्यूरॉन्स और जेब्राफ़िश टेकटल कोशिकाओं में निष्कर्षों के अनुरूप, LNv डेन्ट्री गतिशीलता विकास विनियमित कर रहे हैं14,15. छोटे लार्वा में LNv dendrites, 48-72 एच अंडे बिछाने के बाद (एईएल), पुराने लार्वा में उन लोगों की तुलना में काफी अधिक गतिशील हैं, 96-120 एच एईएल, के रूप में सभी चार मापदंडों द्वारा मापा, और गतिशील से स्थिर राज्य के लिए विकासात्मक संक्रमण 72 से 96 के बीच होते हैं ज एईएल8|
चित्र 1: डेन्ट्री गतिशीलता इमेजिंग और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह। (क)प्रोटोकॉल में नमूना तैयारी, छवि संग्रह, छवि प्रक्रमण और डेन्ट्री गतिशीलता के अर्द्ध-स्वत: परिमाणीकरण को शामिल करते हुए छह चरण शामिल हैं। (ख)एक योजनाबद्ध आरेख जिसमें एक इमेजिंग चैम्बर का चित्रण किया गया है जिसमें एक लार्वा ब्रेन एक्सप्लांट होता है जो पृष्ठीय पक्ष के ऊपर लगाया जाता है। मस्तिष्क explant प्रत्येक पालि में एक व्यक्तिगत लेबल LNv है और बाहरी नमकीन समाधान में डूब जाता है. वैक्यूम तेल बाधाओं coverslip के वजन का समर्थन और एक छोटा सा कक्ष है कि मस्तिष्क को आगे बढ़ने से रोकता रूपों. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: 3 डी में डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता के समय चूक इमेजिंग। (ए) एक व्यक्तिगत रूप से एक 3rd instar लार्वा से LNv लेबल के डेन्ड्रिटिक वृक्ष. (ख)(क) की संगत असेंबल छवि प्रतिनिधि शाखा आंदोलनों का चित्रण। ऐरोहेड्स (ग्रीन) मार्क वापसी ईवेंट; तीर (लाल) चिह्न विस्तार घटनाओं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: मैनुअल एनोटेशन और एक छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर में डेन्ड्रिटिक शाखा टर्मिनलों के स्वत: ट्रैकिंग. (ए)एक स्क्रीनशॉट स्पॉट मॉड्यूल का उपयोग कर शाखा टर्मिनल ट्रैकिंग के लिए सेटिंग्स से पता चलता है. लाल अंडाकार मैनुअल ट्रैकिंग विकल्प रूपरेखा. (ख) प्रतिनिधि समय-स्टैम्प्ड त्रासदियों एनोटेट शाखा टर्मिनलों (पीले धब्बे) छवि एनोटेशन सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न एक व्यक्तिगत लेबल LNv. स्केल बार में $ 5 m. (सी) एक स्क्रीनशॉट देखने के लिए इंटरफेस से पता चलता है और स्पॉट मॉड्यूल से समन्वय जानकारी निर्यात. चित्र 3B शेंग, सी एट अल से संशोधित किया गया है 20188. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: शाखा टर्मिनलों के निर्देशांक जानकारी का उपयोग करते हुए डेन्ड्रिटिक शाखा गतिशीलता का परिमाणीकरण। (ए)एक स्क्रीनशॉट एक्स, वाई और जेड निर्देशांक, ट्रैक आईडी और आसन्न फ्रेम में धब्बे के विस्थापन की गणना के लिए इस्तेमाल सूत्र युक्त स्प्रेडशीट से पता चलता है. (बी)स्क्रीनशॉट एक शाखा को ट्रैक करने से प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों को दिखाता है. मामूली आंदोलनों (और lt;0.3 डिग्री) बाहर फ़िल्टर किए गए थे. वापसी नकारात्मक (दूरी स्तंभ) के लिए उनके मान असाइन करके चिह्नित किए जाते हैं। आसन्न धनात्मक/ऋणात्मक मानों को संक्षेप में, प्रत्येक जैविक विस्तार/प्रतिकर्षण के विस्थापन की गणना की जाती है (घटना स्तंभ)। (ग)डेन्ड्रेट गतिशीलता के विकासात्मक विनियमन को दर्शाने वाले परिणामों का प्रतिनिधि परिमाणीकरण। डेटा को बॉक्स प्लॉट (बॉक्स, 25-75%; केंद्र रेखा, माध्यिका) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जिसे डॉट प्लॉट (व्यक्तिगत डेटा पॉइंट) के साथ मढ़ा जाता है. चित्र 4C शेंग, सी एट अल से संशोधित किया गया है 20188. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक वीडियो 1: दस अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (MIP) छवियों प्रति सेकंड 2 फ्रेम की गति से खेला. पूरे डेन्ड्रिटिक आर्बर को प्रति 1 मिनट की दर से छवि दी गई थी। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).
अनुपूरक फ़ाइल 1: बैच स्तंभ फ़िल्टरिंग.R स्क्रिप्ट. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).
अनुपूरक फ़ाइल 2: बैच स्तंभ Sum.R स्क्रिप्ट. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).
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Discussion
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल हम रिकॉर्ड और Drosophila लार्वा दिमाग में व्यक्तिगत रूप से लेबल न्यूरॉन्स में डेन्ड्रिटिक शाखाओं के गतिशील व्यवहार की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित का वर्णन. विशेष रूप से, हमारे लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल विशिष्ट पैरामीटर है कि हमें एक लार्वा LNv के पूरे डेन्ड्रिटिक arbor पर कब्जा करने के लिए और अपनी dendrite शाखाओं के गतिशील राज्य के एक वैश्विक दृश्य प्रदान करने के लिए सक्षम होते हैं. हालांकि, क्योंकि हमारे परिमाणीकरण तरीकों भारी शाखा टर्मिनलों के एनोटेशन पर भरोसा करते हैं, जटिल डेन्ड्रिटिक संरचनाओं और संघनित arborizations के साथ न्यूरॉन्स इस विश्लेषण के लिए उपयुक्त विषय नहीं हैं.
नमूना तैयारी, छवि अधिग्रहण और बाद प्रसंस्करण इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं. एकल LNvs के उच्च गुणवत्ता वाले कच्चे छवियों dendrite गतिशीलता का सही परिमाणीकरण के लिए आवश्यक हैं. हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि LNv डेन्ड्रेट आकारिकी और इसकी शारीरिक प्रतिक्रियाओं को विच्छेदन के 30 मिनट के भीतर एक सावधानी से तैयार लार्वा मस्तिष्क एक्सप्लांट में अच्छी तरह से संरक्षित कर रहे हैं। अवलोकनीय मस्तिष्क ऊतक गिरावट के साथ नमूने, लम्बी डेन्ड्रिटिक arbors और शाखा टूटना इमेजिंग और परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए. हालांकि कम पृष्ठभूमि और कोई प्रेक्षणीय आंदोलनों के साथ डेटासेट के लिए वैकल्पिक, हम दृढ़ता से शाखा टर्मिनलों और स्वत: के एनोटेशन के लिए महत्वपूर्ण है जो छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए बहाव सुधार और deconvolution कदम सहित सलाह देते हैं जगह पर नज़र रखने. वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर हमारे अध्ययन में इस्तेमाल के अलावा, ImageJ/Fifi सही 3 डी बहाव (Plugins ] पंजीकरण ] सही 3 डी बहाव) भी बहाव सुधार के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
हमारे प्रोटोकॉल और मौजूदा तरीकों के बीच प्रमुख मतभेदों में से एक यह है कि हम व्यक्तिगत शाखा सुझावों के आंदोलनों पर नज़र रखने के लिए नहीं बल्कि पूरे dendritic arbor. पूरे डेन्ड्रिटिक arbors के पुनर्निर्माण, हालांकि कुल डेन्ड्रिटिक लंबाई और वास्तुकला को मापने के लिए उपयोगी है, 3 डी इमेजिंग डेटासेट का उपयोग कर गतिशील अध्ययन के लिए आदर्श नहीं है. लगातार जेड-स्टैक स्लाइस के लिए, स्वचालित अनुरेखण प्रोग्राम अक्सर "शाखाओं" के विभिन्न संयोजनों को उत्पन्न करते हैं और डेन्ड्रिटिक आर्बर को अलग-अलग तरीके से पुनर्निर्माण करते हैं, जिससे विशेष रूप से अलग-अलग समय बिंदुओं के बीच एकल शाखा स्तर पर तुलना की जाती है मुश्किल. इसके अलावा, पूरे डेन्ड्रिटिक वृक्ष अनुरेखण करने के लिए तुलना, टर्मिनल ट्रैकिंग काफी प्रसंस्करण समय और गणना शक्ति पर आवश्यकताओं को कम कर देता है.
कई संशोधनों संभवतः दक्षता और हमारी विधि की विश्लेषणात्मक सुविधाओं में सुधार कर सकते हैं. समय चूक छवि श्रृंखला से मात्रात्मक स्थिति पर सूचना निकालने के लिए, सभी समय बिंदुओं पर शाखा सुझावों का सटीक एनोटेशन गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। यह चरण वर्तमान में मैन्युअल रूप से किया जाता है, जो न केवल समय लेने वाला है, बल्कि परिवर्तनशीलता का परिचय भी देता है. खुला स्रोत 3 डी दृश्य सॉफ्टवेयर में नए घटनाक्रम संभावित वर्तमान तकनीकी सीमाओं को संबोधित और इस महत्वपूर्ण कदम संभव के स्वचालन कर सकता है. हाल ही में विकसित कई सॉफ्टवेयर उपकरण फिलोपोडिया16, 17,18,19,20,21 पर अध्ययन के लिए स्वत: परिमाणीकरण समारोह प्रदान करते हैं और हो सकता है संभावित परीक्षण किया और डेन्राइट शाखा गतिशीलता पर अध्ययन के लिए अपनाया.
एक और कदम है कि वर्तमान में मैन्युअल रूप से किया जाता है विस्तार बनाम वापसी घटनाओं की पहचान है. इस चरण के स्वचालन के लिए शाखा विभाजन स्थलों के 3D निर्देशांकों की आवश्यकता होती है। दो समय बिंदुओं पर शाखास्थल से दूरी की तुलना करके, टर्मिनल विस्थापनों की दिशात्मकता प्रदान करने के लिए एक कस्टम-लिखित स्क्रिप विकसित की जा सकती है। इसी तर्क के बाद, शाखा के साथ अतिरिक्त 3D निर्देशांकों का उपयोग शाखा के भीतर होने वाले विस्तार और वापसी ईवेंट का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है. ये ऐड-ऑन न केवल हमारे प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह का अनुकूलन करेंगे, बल्कि विभिन्न अस्थायी पैमाने पर डेन्ड्रिटिक arbors के संरचनात्मक परिवर्तन के बारे में जानकारी सामग्री में वृद्धि करेगा।
सारांश में, अनुभव पर निर्भर dendrite plasticity पर हमारे अध्ययन का समर्थन करने के लिए, हम समय चूक लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल और अर्द्ध स्वचालित परिमाणीकरण तरीकों न्यूरॉन्स के विकास में तेजी से शाखा गतिशीलता का आकलन करने के लिए विकसित की है. यहाँ वर्णित तरीकों द्वारा उत्पन्न परिणामों के आधार पर, हमारे अध्ययन Drosophila केंद्रीय न्यूरॉन्स में अत्यधिक गतिशील डेन्ड्रिटिक filopodia की पहचान की और बढ़ dendrite गतिशीलता और synaptogenesis के बीच एक विकासात्मक समन्वय से पता चला. छवि अधिग्रहण और स्वचालन के स्तर पर भविष्य में सुधार बहुत इस प्रोटोकॉल की क्षमता में वृद्धि होगी और dendrite गतिशीलता और संरचनात्मक plasticity पर अध्ययन की सुविधा.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह कार्य राष्ट्रीय तंत्रिका संबंधी विकार और स्ट्रोक संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के इंट्रामरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है। परियोजना संख्या 1$IANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
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