Summary
Здесь мы описываем метод, который мы использовали для изображения высокоподвижной дендритной филоподии в живой подготовке личиночного мозга Дрозофилы, и протокол, который мы разработали для количественной оценки наборов данных 3D-изображений для количественных оценок дендрита динамики в развивающихся нейронах.
Abstract
Высокоподвижной дендритной филоподии широко присутствуют в нейронах на ранних стадиях развития. Эти исследовательские динамические ветви пробуйте окружающую среду и инициируют контакты с потенциальными синаптическими партнерами. Хотя связь между дендритной динамикой ветви и синаптогенезом хорошо известна, то как процессы, зависящие от развития и активности, регулируют динамику дендритных ветвей, не очень хорошо поняты. Отчасти это объясняется техническими трудностями, связанными с живой визуализацией и количественным анализом этих тонких структур с использованием системы in vivo. Мы создали метод для изучения динамики дендрита с использованием drosophila личинки ventral боковые нейроны (LNvs), которые могут быть индивидуально помечены с использованием генетических подходов и доступны для живой визуализации. Воспользовавшись этой системой, мы разработали протоколы для захвата отраслевой динамики всей дендритной беседки одной помеченной LNv с помощью замедленной живой визуализации. Затем мы выполнили пост-обработку для улучшения качества изображения за счет коррекции дрейфа и деконволуциации, а затем анализировали динамику филиалов на уровне одной ветви, аннотируя пространственные позиции всех ветвей терминалов. Наконец, мы разработали R-скрипты(дополнительный файл)и конкретные параметры для количественной оценки динамики ветвей с использованием информации о координатах, генерируемой трассировкой терминала. В совокупности этот протокол позволяет нам достичь детального количественного описания отраслевой динамики нейрональной дендритной беседки с высоким временным и пространственным разрешением. Методы, которые мы разработали, как правило, применимы к редко помечены нейронов как в пробирке и в условиях vivo.
Introduction
Дендриты являются специализированными нейронными отсеками, которые принимают и обрабатывают сенсорный и синаптический вход. Сложная и стереотипная структура дендритных беседок с момента их обнаружения подвергалась интенсивному исследованию. Ряд типовых систем, в том числе Xenopus оптических тектальных нейронов, цыпленка клетки ганглия, и дендритной беседки (да) нейронов в системе Drosophila, были созданы для изучения развития, реконструкции и пластичности нейронные дендриты1,2,3,4. Drosophila ventral боковые нейроны (LNvs) представляют собой группу визуальных нейронов проекции первоначально определены для их важных функций в циркадной регуляции летать поведения5. Исследования также показали роль личинок LNvs в качестве прямой postsynaptic цель личинок фоторецепторов (PRs)6,7. Важно отметить, что культивирование развивающихся личинок в различных световых режимах сильно влияет на размер дендритных беседок LNvs, демонстрируя пригодность LNvs как новой модели для изучения дендритной пластичности7. Последние работы нашей группы также указывает на то, что как размер lNv дендрита и динамическое поведение дендритных ветвей отображают опыт-зависимую пластичность8,9. В рамках этой работы мы разработали новый живой протокол визуализации и количественной оценки для проведения анализа динамики дендрита LNvs от2-го или3-го инстаровых личинок.
Прозрачный характер личиночного мозга Дрозофилы делает его идеальным для живой визуализации. Тем не менее, дендритные беседки LNvs расположены в плотно иннервированных личиночной оптической нейропил (LON) в центре личинки доли мозга6. Для захвата изображений тонких ветвей дендритов и филоподии в нетронутой ткани мозга, мы используем двухфотонную микроскопию, которая увеличивает глубину проникновения света и снижает фототоксичность во время живых экспериментов изображений10. Используя эту установку, мы успешно провели живые эксперименты изображения на LNvs в течение более 30 минут, не наблюдая очевидного морфологического ухудшения нейрона. Кроме того, генетические манипуляции с использованием flip-out техники позволили нам маркировать отдельные LNvs с мембраной помечены GFP, который также имеет решающее значение для мониторинга движений отдельных ветвей11,12,13 .
Чтобы зафиксировать динамичное поведение всех ветвей на дендритной беседке LNv с оптимальным оптическим разрешением, мы выполнили замедленное 3D-изображение на свежерассеченных личиночных вылазках мозга с высоким пространственным разрешением при 1 мин на рамку в течение 10-30 мин. Разработка LNv дендриты очень динамичны, при этом большой процент ветвей отображает наблюдаемые изменения в окне 10 мин. Это приводит к одной из основных технических задач в изучении динамики дендрита, количественной оценке поведения ветвей на основе наборов данных 4D-изображений. Ранее установленные методы имеют различные ограничения, включая отсутствие точности и чрезмерные временные требования. Поэтому мы разработали полуавтоматический метод, который сочетает в себе изображение после обработки, ручная маркировка ветвей терминалов и автоматическое отслеживание 4D-точек с помощью программного обеспечения для аннотации изображений. Мы вычисляем движения ветвей терминалов в разных точках времени на основе 3D-координат пятен. Затем данные экспортируются и анализируются для получения количественных измерений динамики отрасли. Этот метод точно оценивает продолжительность и масштабы расширения и опрокидки событий существующих ветвей, а также формирование новых ветвей, что позволяет отслеживать динамику дендрита в большом количестве нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРЕДЕКТО: Этот протокол включает в себя использование лазеров класса IV и потребует надлежащей подготовки и безопасности руководящих принципов, которые должны соблюдаться. Избегайте воздействия прямого или рассеянного лазерного света на глаза или кожу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол включает в себя шесть шагов. Рабочий процесс отображается на рисунке 1A.
1. Маркировка отдельных нейронов с использованием Flip-аут Техника
ПРИМЕЧАНИЕ: Единая маркировка LNvs достигается путем выражения mCD8::GFP в одном LNvs с использованием flippase-опосредошной стохастической маркировки. Генотип линии мухи: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-стоп-FRT-mCD8::GFP11,12,13. Частота получения одной маркированной LNv составляет около 10%. Запасы мухи поддерживаются в стандартной среде в циркадных и влажных инкубаторах с контролем 25 градусов по Цельсию.
- Соберите 100-200 яиц в течение 2 ч оконного после оплодотворения на тарелке виноградного сока с дрожжевой добавкой. Инкубировать эмбрионы при 25 градусах по Цельсию в течение 24 ч и собирать недавно вылупившихся первых личинок instar для следующего шага.
- Теплошок вновь вылупились первые личинки instar на 37,5 градусов по Цельсию в течение 40 минут в два раза, с 40 мин периода восстановления между ними.
- Культура личинок при 25 градусах Цельсия с циркадным и контролем влажности до желаемой стадии развития (ы).
2. Рассекать и монтаж Larval мозг explants
- Рассекать личиночные мозги в физиологическом внешнем солей (120 мм NaCl, 4 мМ MgCl2, 3 мМ KCl, 10 мм NaHCO3, 10 мм Глюкоза, 10 мм сахароза, 5 мМ TES, 10 мм HEPES, 2 мМ Ca2 ",PH 7.2) под дисесарико (4,5 х х magn мощность) с двумя парами #5 стандартных щипцированных наконечников (11 см). Используйте одну пару щипц для удержания личиночного тела на месте, а другой, чтобы тщательно вскрыть мозг. Сохранить глазные диски, доли мозга и брюшной нервный шнур. Удалите прикрепленные мышцы, чтобы свести к минимуму движения образцов во время визуализации.
- Подготовьте стеклянную горку (25 x 75 x 1,0 мм3)и используйте шприц, чтобы нарисовать квадратную камеру с вакуумной смазкой.
- Добавьте 20 зл внешнего сосудистого раствора в квадратную камеру с барьерами смазки.
- Передача расчлененных личинок мозга в камеру на стеклянной горке с помощью щипцы. Отрегулируйте положение мозгов под областью вскрытия, чтобы обеспечить сторону дона.
- Накройте камеру стеклом (22 x 22 x 0,15 мм3). Личительный мозг теперь установлен на слайде в камере, наполненной внешним сольственный раствор(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкое нажатие на крышку ограничивает мозг и уменьшает дрейфующий образец в последующем сеансе визуализации.
3. Покадровая живая визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы проводим эксперименты по визуализации покадровой работы с помощью конфокального микроскопа, оснащенного мультифотонным лазером. Параметры приобретения должны быть скорректированы для других насевий.
- Определите экзатсы мозга, содержащие индивидуально помеченные нейроны, используя цель погружения воды 40X (NA 1.3) и эпифлуоресцентный источник света. Для сбора изображений используйте двухфотонный лазер, настроенный на 920 нм, и недесканированный (NDD) детектор.
- Сбор изображений на 512 х 512 пикселей на кадр и 1 мин на 1-стек в течение 10 минут. Отрегулируйте оптический и цифровой зум для достижения достаточного разрешения x-y-z, обеспечивая при этом покрытие всей дендритной беседки в течение 1 мин (Рисунок 2, Дополнительное видео 1). Настройки генерируют изображения с типичным разрешением x-y-z 0.11 x 0.11 x 0.25 мкм3.
- Соберите промежуток времени серии изображений в течение 30 минут от вскрытия мозга. Данные с чрезмерным дрейфом или очевидным морфологическим ухудшением должны быть исключены из постобработки и количественной оценки.
4. Коррекция дрейфа и деконволюция
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от качества изображения, оба шага являются необязательными, но настоятельно рекомендуется.
- Откройте приобретенный файл изображения с помощью программного обеспечения коррекции дрейфа. Отобразите микроскопические параметры в соответствии с теми, которые использовались для эксперимента. Для программного обеспечения (см. Таблица материалов),нажмите Edit Отобразить микроскопические параметры. Установите тип микроскопа как широкое поле для двухфотонных изображений, если нет двухфотонный вариант и следуйте рабочему процессу, определенному программным обеспечением. Например, откройте вкладку Deconvolution Объект Стабилизатор, и выбрать Стабилизировать временные рамки.
- Откройте исправленное изображение в программном обеспечении деконволюции и следуйте его рабочему процессу. Для программного обеспечения (см. Таблицу Материалов),выберите стабилизированное изображение, а затем нажмите Deconvolution Деконволюция Экспресс. Чтобы получить лучший результат, отточить параметры с помощью Deconvolution Wizard.
- Сохранить деконволведное изображение в типе файла, который поддерживается последующим программным обеспечением аннотации изображений, способным анализировать 4D данные и сообщать о пространственных координатах определенных пятен на изображении (см. Таблицу Материалов).
5. Аннотация изображения
- Откройте деконволведное изображение в программном обеспечении аннотации изображений. Изучите и отметьте ветви советы во все моменты 3D. Программное обеспечение аннотации изображения сообщает и хранит пространственные и временные координаты отмеченных наконечников ветвей. Экспорт информации о координатах в виде файла .csv для последующих вычислений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие два шага специфичны для используемого программного обеспечения для аннотации (см. таблицу материалов). Рабочий процесс может отличаться для другого программного обеспечения. - В модуле Spots нажмитекнопку «Пропустить автоматическое творение, отобрадите вручную»и проверьте дно «Авто-подключайтесь к выбранному чекбоксу Spot»(рисунок 3A). Перейдите кадры в серии таймеров и выберите ветку для аннотации. Держите клавишу Shift и щелкните наконечником ветки терминала, чтобы добавить место. Нажмите через все точки времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для аннотации изображения соединяет пятна между кадрами и автоматически генерирует траекторию. Пространственная и временная информация о наконечниках ветви теперь ассоциируется с отмеченными пятнами. Повторите эти шаги до тех пор, пока все ветви советы аннотированы(Рисунок 3B). - В модуле Spots щелкните вкладку Статистика, выберите подробные и выберите конкретные значения Позиция. Записанная информация о пространственных и временных координатах будет отображаться. Нажмите Сохранить дно экспортировать эту информацию в виде файла .csv(Рисунок 3C).
6. Расчет динамики дендритной ветви
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя информацию о координатах, можно легко рассчитать смещение наконечников ветки в 3D. В нашем исследовании все дендритные движения ветви классифицируются как расширение или опрокидываемый. Приведенные ниже шаги описывают, как обрабатывать файлы .csv с помощью пользовательских R-скриптов(Дополнительный файл)и путем добавления направленной информации с помощью ручного редактирования.
- Откройте файл .csv в виде электронной таблицы. Выберите столбец Track ID, щелкните Sort Smallest to Largest и примите расширение выбора. После сортировки Track ID идентифицирует каждую уникальную дендритную ветвь, а пятна из одной и той же ветви имеют один и тот же идентификатор Track ID. Колонка Time хранит информацию о различных временных рамках.
- В таблицу добавьте столбец Расстояния. Рассчитайте расстояние каждых двух временно прилегающих пятен, используя их координаты, и поместите значения в столбец Расстояния (рисунок 4A).
- Незначительные движения на уровне одного вокселя. Основываясь на настройках изображения, 0,3 мкм, как правило, артефакты из неисправленных дрейфующих или несовершенных аннотации изображения. Отфильтруйте эти движения, сбросив все значения расстояния меньше 0,3 мкм до 0. Обработка нескольких файлов .csv вручную или использовать нашу r-скриптовый пакетный столбец фильтрации. R (Дополнительный файл).
- Вручную создайте новый столбец под названием Перемещение в таблице. Копирование значений от столбца расстояния до столбца смещения. Вручную назначаем события расширения и опровержения для каждой кончики ветки. Если это расширение, оставьте значение Перемещения без изменений, что является положительным значением. Если это опровержение, измените соответствующее значение Перемещения на отрицательное значение (например, от 0,35 до -0,35)(рисунок 4B).
- Создание нового столбца под названием Событие. В этой колонке вручную суммируют значения перемещения для отдельных событий расширения и опровержения(рисунок 4B).
- Обработка измененной таблицы и количественное обоснование событий расширения и опровержения на основе значений их перемещения с использованием суммы пакетного столбца R-скрипта. R (Дополнительный файл). Параметры вывода включают Количество событий расширения, Количество событий опровержения, Суммарная длина расширена, Совокупная длина убраны, Чистая длина изменена,и общая длина путешествовала .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя описанный выше протокол живого изображения, мы фиксирует стеки изображений с высоким разрешением для последующего анализа и количественной оценки. Дополнительное видео 1 показывает максимальную интенсивность проецируемой (MIP) серии изображений, собранных от представителя индивидуально помечены LNv. Рисунок 2B показывает соответствующий монтаж из восьми кадров серии изображений. В обеих панелях наконечники стрел отмечают события опровержения, а стрелки отмечают события расширения.
Далее мы выполняем полуавтоматическое 4D-отслеживание ветвей терминалов с помощью программного обеспечения для аннотации изображений(Таблица материалов). Рисунок 3 B показывает аннотации динамических ветвей терминалов от представителя индивидуально помечены LNv. Используя это программное обеспечение, мы визуализировать изображения стеки в 3D, вручную пометить все ветви терминалов и использовать модуль пятна для отслеживания движений терминалов во времени. Это программное обеспечение генерирует время штамп траектории для каждого аннотированного терминала ветви, выступающей в качестве визуальных представлений динамических событий на дендритной беседке.
Затем мы используем информацию о координатах из аннотированных советов ветви для расчета направления и расстояния движений ветки в каждой временной точке. Скриншоты на рисунке 4A,B показывают, как это достигается. Обработанные электронные таблицы генерируют выходные файлы, которые мы используем для количественной оценки динамики дендрита с четырьмя параметрами, включая процент динамических ветвей, количество новых ветвей, пройденное общее расстояние и количество событий движения ветвей. Рисунок 4 C показывает сравнения динамики дендритных ветвей для индивидуально обозначенных LNvs с разных стадий развития. В соответствии с выводами в млекопитающих нейронов и зебрафиш тектальных клеток, LNv дендрит динамики отсечения развития регулируется14,15. LNv дендриты в младших личинок, 48-72 ч после откладки яиц (AEL), значительно более динамичны по сравнению с теми, в старых личинок, 96-120 ч AEL, как измеряется по всем четырем параметрам, и развитие перехода от динамического к стабильному состоянию происходят между 72 до 96 h AEL8.
Рисунок 1: Рабочий процесс протокола визуализации и количественной оценки динамики дендрита. (A) Протокол содержит шесть этапов, охватывающих подготовку образца, сбор изображений, обработку изображений и полуавтоматизированную количественную оценку динамики дендрита. (B) Схемаическая диаграмма, иллюстрирующая камеру изображения, содержащую личиночного мозга explant установлен с дорсальной стороной вверх. Головной explant имеет индивидуально помечены LNv в каждой доле и погружается во внешний соленовый раствор. Барьеры вакуумной смазки поддерживают вес coverslip и образуют малую камеру которая предотвращает мозг от двигать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Замедленное изображение динамики дендритной ветви в 3D. (A) Дендритическая беседка индивидуально помечены LNv от3-й instar личинки. (B) Соответствующее изображение монтажа (A), иллюстрирующее репрезентативные движения ветви. Arrowheads (Зеленый) знак опровержения событий; стрелки (красные) отмечают события расширения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Ручная аннотация и автоматическое отслеживание дендритных ветвей терминалов в программном обеспечении для аннотации изображений. (A) Скриншот показывает настройки для отслеживания терминала филиала с помощью модуля Spots. Красный овал описывает опцию ручного слежения. (B) Представитель времени штамп траектории аннотированных терминалов ветви (желтые пятна), порожденных программного обеспечения аннотации изображения в индивидуально помечены LNv. Шкала бар 5 мкм. (C) Скриншот показывает интерфейс для просмотра и экспорт информации о координатах из модуля Spots. Рисунок 3B был изменен из Sheng, C. et al. 20188. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Количественная оценка динамики дендритной ветви с использованием информации о координатах отраслевых терминалов. (A) На скриншоте показана электронная таблица, содержащая координаты X, Y и No, идентиматы трека и формула, используемая для расчета смещения пятен в смежных кадрах. (B) Скриншот показывает репрезентативные результаты, полученные от отслеживания одной ветви. Незначительные движения (0,3 мкм) были отфильтрочены. Опровержения отмечены присвоением их значения отрицательному (столбец расстояния). Подводя итоги смежных положительных/отрицательных значений, вычисляется смещение каждого биологического расширения/опровержения (столбец событий). (C) Представитель количественной оценки результатов, показывающих регулирование развития динамики дендрита. Данные представлены как участок коробки (коробка, 25-75%; центральная линия, медиана), наложенная точечным участком (индивидуальные точки данных). Рисунок 4C был изменен из Sheng, C. et al. 20188. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительное видео 1: Десять изображений максимальной интенсивности (MIP), воспроизведенных со скоростью 2 кадра в секунду. Вся дендритная беседка была изображена на 1 мин на й-стек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 1: Пакетная колонка Фильтрация.R Сценарий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 2: Пакет колонки Sum.R Сценарий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протокол, разработанный нами для записи и количественной оценки динамического поведения дендритных ветвей в индивидуально помеченных нейронах в личинках дрозофилов. Примечательно, что наш живой протокол визуализации содержит специфические параметры, которые позволяют нам захватить всю дендритную беседку личиночного LNv и обеспечить глобальное представление о динамическом состоянии его дендритных ветвей. Однако, поскольку наши методы количественной оценки в значительной степени полагаются на аннотацию отраслевых терминалов, нейроны со сложными дендритными структурами и сжатой беседкой не подходят для этого анализа.
Подготовка образцов, приобретение изображений и постобработка являются важнейшими шагами в этом протоколе. Высокое качество сырых изображений одного LNvs имеют важное значение для точной количественной оценки динамики дендрита. Наши данные показывают, что морфология дендритов LNv и ее физиологические реакции хорошо сохранились в тщательно подготовленном личиночном мозге в течение 30 минут от вскрытия. Образцы с наблюдаемым ухудшением тканей мозга, удлиненные дендритные беседки и разрыв ветвки не должны использоваться для визуализации и количественной оценки. Хотя необязательные для наборов данных с низким фоном и без наблюдаемых движений, мы настоятельно рекомендуем включить коррекцию дрейфа и деконволюцию для улучшения качества изображения, что важно для аннотации отраслевых терминалов и автоматического спот отслеживания. Помимо коммерческого программного обеспечения, используемого в наших исследованиях, ImageJ / Фиджи Правильный 3D дрейф (Плагины Регистрация (ru) Правильный 3D дрейф) также хорошо работает для коррекции дрейфа.
Одним из основных различий между нашим протоколом и существующими методами является то, что мы отслеживаем движения отдельных ветвей, но не всей дендритной беседки. Реконструкция целых дендритных беседок, хотя и полезна для измерения общей дендритной длины и архитектуры, не идеально подходит для динамических исследований с использованием наборов данных 3D-изображений. Для последовательных срезов стека автоматические программы трассировки часто генерируют различные комбинации «ветвей» и по-разному реконструируют дендритную беседку, делая сравнение на уровне одной ветви между различными точками времени особенно Трудно. Кроме того, по сравнению с отслеживанием всей дендритной беседки, отслеживание терминалов значительно сокращает время обработки и требования к вычислительной мощности.
Несколько модификаций потенциально могут повысить эффективность и аналитические особенности нашего метода. Для извлечения количественной позиционной информации из серии изображений замедленного времени критическая аннотация ветвей в любое время имеет решающее значение. Этот шаг в настоящее время выполняется вручную, что не только отнимает много времени, но и вводит изменчивость. Новые разработки в области 3D-визуализации с открытым исходным кодом потенциально могут устранить текущие технические ограничения и сделать возможной автоматизацию этого важного шага. Несколько недавно разработанных программных средств обеспечивают автоматическую функцию количественной оценки для исследований на филоподии16,17,18,19,20,21 и может быть потенциально протестированы и приняты для исследований по динамике дендритной отрасли.
Еще одним шагом, который в настоящее время выполняется вручную, является определение событий расширения и опровержения. Автоматизация этого шага требует 3D-координат участков бифуркации филиалов. Сравнивая расстояния с местом ветвления в двух временных точках, можно разработать специально написанное scrip для присвоения направления смещения терминала. Следуя той же логике, дополнительные 3D-координаты вдоль ветви могут также использоваться для анализа событий расширения и опровержения, происходящих в ветке. Эти дополнения не только оптимизируют рабочий процесс нашего протокола, но и увеличивают содержание информации о структурных изменениях дендритных беседок в различных временных масштабах.
Таким образом, для поддержки наших исследований по опыт-зависимой пластичности дендритов, мы разработали замедленного живого протокола изображения и полуавтоматические методы количественной оценки для выполнения оценки быстрой динамики отрасли в развивающихся нейронов. Основываясь на результатах, полученных в результате описанных здесь методов, наше исследование выявило высокоподвижное дендритное филоподия в центральных нейронах Дрозофилы и выявило координацию развития между повышенной динамикой дендритов и синаптогенезом. Будущие улучшения на уровне приобретения и автоматизации изображения значительно расширят потенциал этого протокола и облегчат исследования по динамике дендрита и структурной пластичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Интрамуральной исследовательской программой Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальных институтов здравоохранения. Проект No 1 "IANS003137".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
