Summary
在这里，我们描述了我们用于在果蝇幼虫脑活制备中成像高度多瓣树突状丝虫的方法，以及我们为量化延时三维成像数据集用于对树突进行定量评估的协议发展神经元的动态。
Abstract
在早期发育阶段的神经元中广泛存在高莫性树突状纤维化。这些探索性动态分支对周围环境进行采样，并启动与潜在突触伙伴的接触。虽然树突状分支动力学和突触发生之间的联系已经确立，但发育和活动依赖过程如何调节树突状分支动力学还没有得到很好的理解。这部分是由于使用体内系统对这些精细结构进行实时成像和定量分析相关的技术困难。我们建立了一种使用果蝇幼虫幼虫腹侧神经元（LNvs）研究树突动力学的方法，这种神经元可以使用遗传方法单独标记，并可用于活成像。利用这个系统，我们开发了协议，通过延时实时成像捕获单个标记 LNv 的整个树突状树突动力学。然后，我们执行后处理，通过漂移校正和递减来提高图像质量，然后通过批注所有分支终端的空间位置来分析单分支级别的分支动力学。最后，我们开发了R脚本（补充文件）和特定参数，利用终端跟踪生成的坐标信息量化分支动力学。总体而言，该协议允许我们实现具有高时空分辨率的神经元树突状树突动力学的详细定量描述。我们开发的方法通常适用于体外和体内条件下标记稀疏的神经元。
Introduction
树突是接收和处理感觉和突触输入的专用神经元隔间。树突状树丛的复杂和定型结构自发现以来一直在进行紧张的研究。已经建立了许多模型系统，包括Xenopus视性神经神经元、小鸡视网膜神经细胞和果蝇体内的树突化（da）神经元，以研究Drosophila系统的发育、重塑和可塑性。神经元树突1，2，3，4 。果蝇腹腔侧神经元（LNvs）是一组视觉投影神经元，最初被确定为在昼夜调节苍蝇行为5中的重要功能。研究还表明，幼虫LNvs作为幼虫光受体（PRs）6、7的直接后发贴靶点的作用。重要的是，培养不同光基培养的幼虫会强烈地影响LNvs的树突状树突状树突的大小，表明LNvs作为研究树突可塑性的新模型是适宜的。我们小组最近的工作进一步表明，LNv树突的大小和树突分支的动态行为都表现出经验依赖性的可塑性8，9。作为这项工作的一部分，我们开发了一种新的活成像和定量协议，以对从星幼虫的第2或第3代LNvs的树突动力学进行分析。
果蝇幼虫大脑的透明特性使其成为活成像的理想选择。然而，LNvs的树突状树干位于幼虫脑叶6中心密集内垂的幼虫光神经桩（LON）。为了捕捉完好的脑组织中细的树突分支和丝波多迪亚的图像，我们采用双光子显微镜，在活成像实验中增加光穿透深度，降低光毒性。利用此设置，我们在 LNvs 上成功进行了超过 30 分钟的实时成像实验，但没有观察到神经元的明显形态恶化。此外，使用翻转技术进行的基因操作使我们能够用标有GFP的膜标记单个LNvs，这对于监测单个分支11、12、13的运动也至关重要。.
为了以最佳的光学分辨率捕捉 LNv 树突状树突上所有分支的动态行为，我们对刚解剖的幼虫脑外移进行了延时 3D 成像，每帧 1 分钟，空间分辨率高，为 10 到 30 分钟。树突是高度动态的，在 10 分钟窗口内，很大一部分分支显示可观察到的变化。这导致在研究树突动力学方面面临的主要技术挑战之一，根据 4D 图像数据集量化分支行为。以前建立的方法存在各种限制，包括缺乏准确性和时间要求过高。因此，我们开发了一种半自动方法，结合图像后处理、分支终端的手动标记和图像注释软件的自动4D点跟踪。我们根据点的 3D 坐标计算分支终端在不同时间点的移动。然后导出和分析数据，以生成分支动力学的定量测量。该方法准确评估现有分支的扩展和回缩事件的持续时间和范围，以及新分支的形成，使我们能够监测大量神经元的树突动力学。
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Protocol
警告：该协议涉及IV类激光的使用，需要遵循适当的培训和安全准则。避免眼睛或皮肤暴露在直接或分散的激光下。
注：该协议包括六个步骤。工作流如图 1 A所示。
1. 使用翻转技术标记单个神经元
注：LNvs 的单标记是通过使用翻转酶介导随机标记在单个 LNv 中表示 mCD8：：GFP 来实现的。苍蝇线的基因型是：hs-flp;Pdf-Gal4;UAS-FRT-CD2-停止-FRT-mCD8：：GFP11，12，13 。获得单个标记的 LNv 的频率约为 10%。在昼夜和湿度控制的25°C培养箱中，苍蝇储存在标准介质中。
- 收集100-200个鸡蛋在2小时窗口后受精在葡萄汁板与酵母补充剂。在25°C孵育胚胎24小时，并收集新孵化的第一个星幼虫，为下一步。
- 热休克新孵化的第一个在37.5°C星幼虫40分钟两次，中间有40分钟的恢复期。
- 在25°C培养幼虫，同时将昼夜和湿度控制在所需的发育阶段。
2. 解剖和安装幼虫脑外泄
- 在生理外盐水溶液中解剖幼虫脑（120 mM NaCl， 4 mM MgCl2，3 mM KCl， 10 mM NaHCO3， 10 mM 葡萄糖， 10 mM 蔗糖， 5 mM TES， 10 mM HEPES， 2 mM Ca2+，PH 7.2） 在解剖显微镜下 （4.5 倍放大倍率）电源）与两对#5标准尖端解剖钳（11厘米）。使用一对钳子将幼虫身体抱在原位，另一对用钳子仔细解剖大脑。保留眼盘、脑叶和腹神经线。去除附着的肌肉，以尽量减少成像过程中的样品运动。
- 准备玻璃滑块 （25 x 75 x 1.0 mm3），并使用注射器用真空润滑脂绘制方形腔室。
- 在方形腔室中加入 20 μL 的外部盐水溶液，并带有润滑脂屏障。
- 使用钳子将解剖的幼虫大脑转移到玻璃滑道上的腔室中。调整大脑在解剖范围下的位置，以确保背侧朝上。
- 用玻璃盖滑盖盖住造型室（22 x 22 x 0.15 mm3）。幼虫脑现在安装在充满外部盐水溶液的腔室中的幻灯片上（图1B）。
注：轻轻按压盖玻片会限制大脑，并在接下来的成像会话中减少样品漂移。
3. 延时实时成像
注：我们使用配备多光子激光的共聚焦显微镜进行延时成像实验。采集参数需要针对其他成像设置进行调整。
- 使用 40X 水浸光物 （NA 1.3） 和表观荧光光源识别包含单独标记神经元的大脑外部。对于图像收集，请使用调谐到 920 nm 的双光子激光器和非除扫描 （NDD） 探测器。
- 以每帧 512 x 512 像素和每张 Z 堆栈 1 分钟的速度收集图像，10 分钟。 调整光学和数字变焦以达到足够的 x-y-z 分辨率，同时确保在 1 分钟内覆盖整个树突树轴（图 2，补充视频）1） 这些设置生成具有典型 x-y-z 分辨率为 0.11 x 0.11 x 0.25 μm3的图像。
- 在大脑解剖的 30 分钟内收集时差图像系列。具有过度漂移或明显形态恶化的数据应排除在处理后和定量之外。
4. 漂移校正和去向
注：根据图像质量，这两个步骤都是可选的，但强烈建议执行。
- 使用漂移校正软件打开获取的图像文件。编辑微观参数以匹配用于实验的参数。对于软件（请参阅材料表），单击"编辑" |编辑微观参数。如果没有双光子选项，将显微镜类型设置为双光子图像的宽场，并遵循软件定义的工作流。例如，打开选项卡"递减" |对象稳定器，并选择稳定时间范围。
- 在去卷积软件中打开漂移校正图像，并遵循其工作流。对于软件（请参阅材料表），选择稳定图像，然后单击"去卷积"去卷积快车。为了得到更好的结果，请使用"去卷积向导"微调参数。
- 将去伏化图像保存在后续图像注释软件支持的文件类型中，该软件能够分析 4D 数据并报告图像中已定义点的空间坐标（参见材料表）。
5. 图像注释
- 在图像注释软件中打开去卷图像。在 3D 的所有时间点检查和标记分支提示。图像注释软件报告并存储标记的分支提示的空间和时间坐标。将坐标信息导出为 .csv 文件以进行后续计算。
注：以下两个步骤特定于我们使用的注释软件（参见材料表）。对于其他软件，工作流可能不同。 - 在"点"模块中，单击"跳过自动创建，手动编辑"，并选中底部"自动连接到选定的污点"复选框（图3A）。翻过时间序列中的帧并选择用于注释的分支。按住 Shift 键并单击分支终端提示以添加点。单击所有时间点。
注：图像注释软件连接帧之间的斑点并自动生成轨迹。分支提示的空间和时间信息现在与标记点相关联。重复这些步骤，直到所有分支提示都得到标记 （图 3B）。 - 在"点"模块中，单击"统计"选项卡，选择"详细"并选择"特定值" |位置。将显示记录的空间和时间坐标信息。单击"保存底部"以将该信息导出为 .csv 文件 （图 3C）。
6. 计算丹德林分动力学
注：使用坐标信息，可以轻松计算 3D 中分支提示的位移。在我们的研究中，所有的树突状分支运动都分类为延伸或撤回。以下步骤描述了如何使用自定义编写的 R 脚本 （补充文件）处理 .csv 文件，以及如何通过手动编辑添加方向信息。
- 将 .csv 文件作为电子表格打开。选择"跟踪 ID"列，单击"从最小到最大排序"选项并接受展开选择。排序后，Track ID 标识每个唯一树突分支，同一分支中的点共享相同的跟踪 ID。时间列存储不同时间范围的信息。
- 在电子表格中，添加"距离"列。使用坐标计算每两个时间相邻点的距离，并将值放在"距离"列中（图4A）。
- 单体素级别的轻微运动。根据成像设置，0.3 μm 通常是来自未校正的漂移或不完美的图像注释的伪影。通过将小于 0.3 μm 的所有距离值重置为 0 来过滤这些移动。手动处理多个 .csv 文件或使用我们的 R 脚本批处理列筛选。R （补充文件）
- 在电子表格中手动生成名为"置换"的新列。将值从"距离"列复制到"置换"列。手动为每个分支提示分配扩展和撤回事件。如果是扩展，则保留置换值不变，这是一个正值。如果是回缩，则将相应的位移值更改为负值（例如 0.35 到 -0.35）（图 4B）。
- 生成名为事件的新列。在本列中，手动求和单个扩展和回缩事件的置换值（图4B）。
- 使用 R 脚本批处理列总和处理修改后的电子表格，并根据扩展和撤回事件的值量化其位移值。R （补充文件）输出参数包括扩展事件数、撤回事件数、扩展累积长度、缩回累积长度、净长度更改和行驶总长度.
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Representative Results
使用上述实时成像协议，我们捕获高分辨率图像堆栈，以便进行后续分析和定量。补充视频 1显示了从具有代表性的单独标记的 LNv 中收集的最大强度投影 （MIP） 图像系列。 图 2B显示了图像序列的八帧的相应蒙太奇。在两个面板中，箭头标记回缩事件，箭头标记扩展事件。
接下来，我们使用图像注释软件（材料表）对分支终端进行半自动 4D 跟踪。图 3B显示具有代表性的单独标记的 LNv 的动态分支终端的注释。 使用该软件，我们以 3D 形式可视化图像堆栈，手动标记所有分支终端，并使用 Spots 模块跟踪终端的移动通过时间。该软件为每个带批号分支终端生成时间戳的轨迹，作为树突上动态事件的视觉表示。
然后，我们使用来自批过分支提示的坐标信息来计算分支在每个时间点的方向和距离。图 4A，B中的屏幕截图显示了如何实现此目的。处理过的电子表格生成输出文件，我们使用四个参数量化树突动态，包括动态分支的百分比、新分支的数量、行驶的累积距离和分支移动事件的数量。图 4C显示不同发育阶段单独标记的 LNv 的树突状分支动力学的比较。与哺乳动物神经元和斑马鱼的发现一致，LNv树突动力学在发育调节14，15。幼幼幼虫的LNv树突，产卵后48-72小时（AEL），与较老的幼虫相比，动态性明显增强，按照所有四个参数测量，96-120 h AEL，从动态状态到稳定状态的发展过渡发生在72至96之间h AEL8.
图1：树突动力学成像和定量协议的工作流。（A） 协议包含六个步骤，包括样品制备、图像采集、图像处理和树突动力学的半自动定量。（B） 一个示意图，说明一个成像室，其中含有一个幼虫脑外具，上面安装着背侧。大脑外泄在每个叶中都有单独标记的LNv，并浸入外部盐水溶液中。真空润滑脂屏障支持盖玻片的重量，形成一个小室，防止大脑移动。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：3D中树突状分支动力学的延时成像。（A）从星幼虫中单独标记的LNv的树突状树突状树突。（B） （A） 的相应蒙太奇图像，说明代表分支运动。箭头（绿色）标记回缩事件;箭头（红色）标记扩展事件。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：图像注释软件中树突分支终端的手动注释和自动跟踪。（A） 屏幕截图显示了使用"斑点"模块进行分支终端跟踪的设置。红色椭圆形勾勒出手动跟踪选项。（B） 图像注释软件在单独标记的 LNv. 比例尺 = 5 μm（C ） 中生成的带注释的分支终端（黄色斑点）的代表性时间戳轨迹从"斑点"模块导出坐标信息。图3B已由盛、C、20188修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：利用分支终端的坐标信息对树突分支动力学进行量化。（A） 截图显示电子表格，其中包含用于计算相邻帧中斑点位移的 X、Y 和 Z 坐标、轨道 D 和公式。（B） 截图显示从跟踪一个分支中获得的代表性结果。小运动（<0.3 μm）被过滤掉。回缩的标记是将其值分配给负数（距离列）。通过汇总相邻的正/负值，计算每个生物延伸/回缩的位移（事件列）。（C） 显示树突动力学发展规律的结果的代表性量化.数据以框图（框，25-75%;中心线，中位数）表示，并叠加点图（单个数据点）。图4C已由盛，C.等人修改20188。请点击此处查看此图的较大版本。
补充视频 1：以每秒 2 帧的速度播放 10 个最大强度投影 （MIP） 图像。整个树突树柱成像在1分钟每个Z堆栈。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。
补充文件 1：批处理列筛选.R 脚本。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
补充文件 2：批处理列总和.R 脚本。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Discussion
在这里，我们描述了我们开发的一个协议，用于记录和量化树突状分支在果蝇幼虫大脑中单独标记的神经元的动态行为。值得注意的是，我们的实时成像协议包含特定的参数，使我们能够捕获幼虫LNv的整个树突状树突，并提供其树突分支动态状态的全局视图。然而，由于我们的定量方法严重依赖分支终端的注释，具有复杂树突结构和浓缩树的神经元不适合进行这种分析。
样品制备、图像采集和后处理是该协议的关键步骤。单个 LNv 的高质量原始图像对于准确量化树突动力学至关重要。我们的数据表明，LNv树突形态及其生理反应在解剖后30分钟内在精心准备的幼虫脑中保存完好。可观察到的脑组织退化、细长树突状树干和分支破损的样本不应用于成像和定量。尽管对于背景低且无可观测运动的数据集而言是可选的，但我们强烈建议包括漂移校正和去卷积步骤，以提高图像质量，这对分支终端的注释和自动现场跟踪。除了我们研究中使用的商业软件，ImageJ/Fiji的正确 3D 漂移（插件|注册|更正 3D 漂移）也适用于漂移校正。
我们的协议和现有方法之间的主要区别之一是，我们跟踪单个分支提示的运动，而不是整个树突状的树干。重建整个树突状树干，虽然可用于测量总树突长度和结构，但对于使用 3D 成像数据集的动态研究来说并不理想。对于连续的 Z 堆栈切片，自动跟踪程序通常生成不同的"分支"组合，并以不同的方式重建树突状轴，使不同时间点之间的单分支级别进行比较尤为严重困难。此外，与跟踪整个树突树干相比，终端跟踪可显著减少处理时间和对计算能力的要求。
几个修改可以潜在地提高我们方法的效率和分析功能。为了从延时图像系列中提取定量位置信息，在所有时间点上准确注释分支提示至关重要。此步骤当前是手动执行的，这不仅非常耗时，而且还引入了可变性。开源 3D 可视化软件的新开发有可能解决当前技术限制，并使这一关键步骤的自动化成为可能。几种最近开发的软件工具为研究filopodia 16、17、18、19、20、21提供自动定量功能，可以可能测试和采用的树突分支动力学研究。
当前手动执行的另一个步骤是标识扩展事件与撤回事件。此步骤的自动化需要分支分叉站点的 3D 坐标。通过将距离与两个时间点的分支站点进行比较，可以开发自定义编写的 scrip 来分配终端位移的方向性。遵循相同的逻辑，分支上的其他 3D 坐标也可用于分析分支内发生的扩展和撤回事件。这些附加组件不仅将优化我们协议的工作流程，而且还会增加不同时间尺度上树突状树突结构变化的信息内容。
总之，为了支持我们对依赖经验的树突可塑性的研究，我们开发了延时活成像协议和半自动定量方法，以执行对发育神经元中快速分支动力学的评估。根据本文所述方法得出的结果，我们的研究确定了果蝇中心神经元中高度多变的树突状纤维化，并揭示了高树突动力学和突触发生之间的发育协调。图像采集和自动化级别的改进将大大增强该协议的潜力，并有助于对树突动力学和结构可塑性的研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院神经疾病和中风研究所内部研究计划的支持。项目编号 1ZIANS003137。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
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