Summary
ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳の生体調における高刺激性樹状フィロポディアの画像化に用いた方法と、デンドライトの定量的評価のためのタイムラプス3Dイメージングデータセットを定量化するために開発したプロトコルについて説明します。ニューロンの発達におけるダイナミクス。
Abstract
高運動性樹状フィロポディアは、発達初期のニューロンに広く存在する。これらの探索的動的ブランチは、周囲の環境をサンプリングし、潜在的なシナプスパートナーとの接触を開始します。樹状分岐ダイナミクスとシナプトジェネシスとの関係は十分に確立されているが、発達過程と活性依存的なプロセスが樹状分岐ダイナミクスをどのように調節するかはよく理解されていない。これは、インビボシステムを使用してこれらの微細構造のライブイメージングおよび定量分析に関連する技術的な困難が原因の一部です。我々は、遺伝的アプローチを用いて個別に標識することができ、ライブイメージングのためにアクセス可能であるショウジョウバエ幼虫の心室腹部横ニューロン(LNvs)を用いてデンドライトダイナミクスを研究する方法を確立した。このシステムを利用して、タイムラプスライブイメージングを通じて、単一のラベル付きLNvの樹状樹木全体の分岐ダイナミクスを捕捉するプロトコルを開発しました。その後、ドリフト補正やデコンボリューションによる画質向上を目的とした後処理を行い、その後、全ての分岐端子の空間位置にアニズを付け、単一分岐レベルで分岐ダイナミクスを解析しました。最後に、端末トレースによって生成された座標情報を使用して分岐ダイナミクスを定量化するためのRスクリプト(補足ファイル)と特定のパラメータを開発しました。まとめると、このプロトコルは、高い時間的および空間分解能を有する神経樹状樹木樹の分岐ダイナミクスの詳細な定量的記述を達成することを可能にする。我々が開発した方法は、一般的にインビトロとインビボ条件の両方でまばらに標識されたニューロンに適用可能である。
Introduction
デンドライトは、感覚入力とシナプス入力を受け取り、処理する特殊なニューロンコンパートメントです。樹状樹木の複雑でステレオタイプ化された構造は、発見以来、厳しい調査を受けています。脱視管系におけるキセノプス光学系ニューロン、ひよこ甲状腺細胞、樹状樹盤形成(da)ニューロンを含む多くのモデルシステムが、その発達、改造、可塑性を研究するために確立されている。神経デンドライト1,2,3,4.ショウジョウバエ腹部横ニューロン(LNvs)は、ハエ行動の概日調節における重要な機能について最初に同定された視覚投影ニューロンのグループである5。研究はまた、幼虫光受容体(PR)6、7の直接ポストナプティックターゲットとしての幼虫LNvsの役割を明らかにした。重要なことに、異なる光系で幼虫を発達させる培養は、LNvsの樹状樹木の樹木の大きさに強く影響を与え、樹状可塑性7を研究するための新しいモデルとしてLNvsの適合性を実証する。我々のグループからの最近の研究は、LNvデンドライトのサイズと樹状枝の動的挙動の両方が経験に依存する可塑性8、9を示すことをさらに示している。この研究の一環として、我々は新しいライブイメージングおよび定量プロトコルを開発し、2番目または3番目の幼虫からLNvsのデンドライトダイナミクスに関する分析を行った。
ショウジョウバエ幼虫脳の透明な性質は、ライブイメージングに最適です。しかし、LNvsの樹状樹木は、幼虫脳葉6の中心にある密に内来性の幼虫視神経ピル(LON)に位置している。無傷の脳組織内の微細なデンドライトの枝とフィロポディアの画像をキャプチャするために、我々は光の浸透の深さを増加させ、ライブイメージング実験10の間に光毒性を減少させる2光子顕微鏡を利用する。このセットアップを用いて、ニューロンの明らかな形態学的劣化を観察することなく、30分以上のLNvsでライブイメージング実験を行いました。さらに、フリップアウト技術を用いた遺伝子操作により、個々のLNvsにGFPというタグが付けられた膜でラベルを付け、個々の枝の動きを監視するためにも重要です11,12,13.
最適な光学分解能を持つLNv樹状樹木の全ての枝の動的挙動を捉えるために、新たに解剖された幼虫脳移植所でタイムラプス3Dイメージングを行い、フレームあたり1分間1分の高い空間分解能を10~30分間行いました。デンドライトは非常に動的であり、ブランチの大部分は10分のウィンドウ内で観察可能な変化を表示します。これは、4D画像データセットに基づいて分岐動作を定量化するデンドライトダイナミクスを研究する際の主な技術的課題の1つにつながります。以前に確立された方法には、精度の欠如や過剰な時間要件など、さまざまな制限があります。そこで、画像後処理、分岐端子の手動マーキング、画像アニテーションソフトを用いて自動4Dスポットトレースを組み合わせた半自動方式を開発しました。スポットの3D座標に基づいて、異なる時点での分岐端子の動きを計算します。その後、データがエクスポートおよび分析され、分岐ダイナミクスの定量的測定値が生成されます。この方法は、既存の分岐の延長および引き込みイベントの持続時間と範囲、および新しい分岐の形成を正確に評価し、多数のニューロンでデンドライトダイナミクスを監視することを可能にします。
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Protocol
注意:このプロトコルは、クラスIVレーザーの使用を含み、従うべき適切な訓練と安全ガイドラインを必要とします。直接的または散乱したレーザー光への眼や皮膚への露出を避けてください。
注:プロトコルには 6 つの手順が含まれています。ワークフローを図 1Aに示します。
1. フリップアウト技術を用いて個々のニューロンを標識する
注:LNvsの単一ラベリングは、フリップパーゼ媒介確率ラベリングを使用して単一LNvsでmCD8::GFPを表現することによって達成される。フライラインの遺伝子型は次のとおりです。 Pdf-Gal4;UAS-FRT-CD2ストップ-FRT-mCD8::GFP11、12、13.単一の標識LNvを得る頻度は約10%である。フライストックは、概日および湿度制御された25°Cインキュベーターの標準媒体で維持されます。
- 酵母サプリメントとブドウジュースプレート上の2時間の窓ポスト受精内に100-200卵を収集します。胚を25°Cで24時間インキュベートし、次のステップのために新たに孵化した最初の幼虫を採取する。
- ヒートショックは、新たに孵化した最初の幼虫を37.5°Cで40分間2回、その間に40分の回復期間を持つ。
- 幼虫を25°Cで培養し、概日および湿度制御を所望の発達段階に制御する。
2. 幼虫脳移植の解剖と取り付け
- 生理的外食生食液(120mM NaCl、4 mM MgCl2、3mM KCl、10mM NaHCO 3、10mMスクロース、5mM TES、10mM HEPES、2 mM Ca 2+、PH 7.2)を解剖下で解剖する(4mM Ca2+、PH7.2)#5の標準的な先端の解剖の鉗子(11 cm)の2つのペアが付いている力)。一対の鉗子を使って幼虫の体を所定の位置に保持し、もう一方を脳を慎重に解剖する。眼球、脳葉、心室神経コードを保存します。取り付けられた筋肉を取り除き、イメージング中のサンプルの動きを最小限に抑えます。
- ガラススライド(25 x 75 x 1.0 mm3)を準備し、真空グリースで正方形のチャンバーを描画するために注射器を使用します。
- グリースバリア付きの正方形チャンバーに20μLの外部生理塩分溶液を追加します。
- 解剖された幼虫の脳を鉗子を使用してガラススライドの部屋に移す。解剖スコープの下で脳の位置を調整し、後部側が上を向いていることを確認します。
- ガラスカバースリップ(22 x 22 x 0.15 mm 3)でチャンバをカバーします。幼虫の脳は、外部生理食液で満たされたチャンバー内のスライドに取り付けられるようになりました(図1B)。
注:カバースリップを軽く押すと脳が閉じ込められ、その後のイメージングセッションでサンプルの漂流が減少します。
3. タイムラプスライブイメージング
注:マルチフォトンレーザーを搭載した共焦点顕微鏡を用いたタイムラプスイメージング実験を行います。取得パラメータは、他のイメージング設定用に調整する必要があります。
- 40X水浸漬目的(NA1.3)とエピ蛍光光光源を用いて、個別に標識されたニューロンを含む脳の移植を同定する。画像収集には、920 nm にチューニングされた 2 光子レーザーと、非デスキャン (NDD) 検出器を使用します。
- 10分間で512 x 512ピクセル、Zスタックあたり1分で画像を収集し、10分間の光学ズームとデジタルズームを調整し、十分なx-y-z解像度を達成しながら、1分以内に樹樹木アーバー全体のカバレッジを確保します(図2、補足ビデオ)1)設定は、0.11 x 0.11 x 0.25 μm3の一般的な x-y-z 解像度の画像を生成します。
- 脳解剖の30分以内にタイムラプス画像シリーズを収集します。過度のドリフトまたは明らかな形態的劣化を伴うデータは、後処理および定量から除外する必要があります。
4. ドリフト補正とデコンボリューション
注:画質に応じて、どちらの手順もオプションですが、強くお勧めします。
- 取得したイメージ ファイルをドリフト補正ソフトウェアで開きます。実験に使用したパラメータと一致するように顕微鏡パラメータを編集します。ソフトウェアについては(「材料の表」を参照)、[編集] |顕微鏡パラメータを編集します。2 フォトン オプションがない場合は、顕微鏡タイプを 2 フォトン 画像のワイドフィールドとして設定し、ソフトウェアで定義されたワークフローに従います。たとえば、タブのデコンボリューションを開く |オブジェクトスタビライザーを選択し、時間枠を安定化します。
- デコンボリューション ソフトウェアでドリフト補正画像を開き、そのワークフローに従います。ソフトウェア(「材料の表」を参照)では、安定した画像を選択し、[デコンボリューション]をクリックします。デコンボリューションエクスプレス.より良い結果を得るには、デコンボリューション ウィザードを使用してパラメータを微調整します。
- デコンボルブされたイメージは、4D データを分析し、イメージ内の定義済みスポットの空間座標を報告できる後続のイメージ アテーション ソフトウェアでサポートされているファイルタイプに保存します (材料の表を参照)。
5. 画像アニテーション
- イメージ アニテーション ソフトウェアでデコンボルブされたイメージを開きます。3D のすべての時点で分岐のヒントを調べてマークします。イメージ アテーション ソフトウェアは、マークされた分岐のヒントの空間座標と時間座標をレポートして格納します。後続の計算のために座標情報を .csv ファイルとしてエクスポートします。
注:次の 2 つの手順は、使用した注釈ソフトウェアに固有です (材料の表を参照)。ワークフローは、他のソフトウェアとは異なる場合があります。 - [スポット] モジュールで、[自動作成をスキップし、手動で編集する] をクリックし、下部の [選択したスポットに自動接続する] チェックボックスをオンにします (図 3A)。時系列のフレームを移動し、アテーション用の分岐を選択します。Shift キーを押したまま、分岐端子の先端をクリックしてスポットを追加します。すべての時間ポイントをクリックします。
注:画像アタテーションソフトウェアは、フレーム間のスポットを接続し、自動的に軌道を生成します。分岐のヒントの空間情報と時間情報が、マークされたスポットに関連付けられつになりました。すべての分岐チップにアヌ記が表示されるまで、これらの手順を繰り返します (図 3B)。 - [スポット] モジュールで [統計]タブをクリックし、[詳細]を選択し、[特定の値]を選択します |位置:記録された空間座標と時間座標情報が表示されます。下部の保存をクリックして、その情報を .csv ファイルとしてエクスポートします (図 3C)。
6. 樹状分岐ダイナミクスの計算
注:座標情報を使用して、3D での分岐先端の変位を簡単に計算できます。我々の研究では、すべての樹状枝の動きは延長または引き込みとして分類される。次の手順では、カスタム記述された R スクリプト (補足ファイル)を使用して .csv ファイルを処理する方法と、手動編集を通じて方向情報を追加する方法について説明します。
- .csv ファイルをスプレッドシートとして開きます。[トラック ID]列を選択し、[最小から最大に並べ替え]オプションをクリックし、選択範囲の展開を受け入れます。並べ替え後、トラック ID は各固有の樹状ブランチを識別し、同じブランチのスポットが同じトラック ID を共有します。Time列には、異なる時間枠の情報が格納されます。
- スプレッドシートで、[距離]列を追加します。座標を使用して 2 つの時間的に隣接するスポットの距離を計算し、[距離]列に値を配置します (図 4A)。
- 単一のボクセルレベルでのマイナーな動き。イメージング設定に基づいて、0.3 μmは通常、未修正のドリフトまたは不完全な画像アノーテーションからのアーティファクトです。0.3 μm から 0 より小さいすべての距離値をリセットして、これらの動きをフィルタリングします。複数の .csv ファイルを手動で処理するか、R スクリプトバッチ列フィルタリングを使用します。R (補足ファイル)。
- スプレッドシートにディスプレイスメントという名前の新しい列を手動で生成します。[距離]列から[移動]列に値をコピーします。各分岐チップの拡張イベントと取り消しイベントを手動で割り当てます。拡張子の場合は、[変位]の値は変更しないままにします。取り消しの場合は、対応する変位値を負の値に変更します (例: 0.35 から -0.35) (図 4B)。
- Eventという名前の新しい列を生成します。この列では、個々の拡張イベントとリトラクション イベントの変位値を手動で合計します (図 4B)。
- 変更されたスプレッドシートを処理し、R スクリプト バッチ列合計を使用して、その変位値に基づいて拡張イベントとリトラクション イベントを定量化します。R (補足ファイル)。出力パラメータには、拡張イベントの数、リトラクション イベントの数、累積長伸長、累積長引き込み、正味長の変更、および移動時間の合計が含まれます。.
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Representative Results
上記のライブイメージングプロトコルを使用して、その後の解析と定量化のための高解像度画像スタックをキャプチャします。補足ビデオ1は、LNv.図2Bの代表から収集された最大強度投影(MIP)画像シリーズを示し、画像シリーズの8フレームの対応するモンタージュを示す。どちらのパネルでも、矢印はリトラクション イベントをマークし、矢印は拡張イベントをマークします。
次に、画像アニテーションソフトウェア(材料の表)を使用して分岐端子の半自動4Dトラッキングを行います。図 3Bは、LNvというラベルの代表者からの動的分岐端子のアポイントを示し、このソフトウェアを使用して、3Dで画像スタックを視覚化し、手動ですべての分岐端子をマークし、Spotsモジュールを使用して端末の動きを追跡します。時間を通して。このソフトウェアは、樹状のアーバー上の動的イベントの視覚的な表現として機能し、すべてのアノテンドブランチターミナルのためのタイムスタンプ付きの軌道を生成します。
次に、アポイントされた分岐先端の座標情報を使用して、各時点における分岐移動の方向と距離を計算します。図 4A のスクリーンショット、Bは、この方法を示しています。処理されたスプレッドシートは、動的ブランチのパーセンテージ、新しいブランチの数、累積移動距離、ブランチ移動イベントの数など、4 つのパラメータを使用してデンドライト ダイナミクスを定量化するために使用する出力ファイルを生成します。図 4Cは、異なる発達段階から個別に標識されたLNvsの樹状分岐ダイナミクスの比較を示す。哺乳類ニューロンおよびゼブラフィッシュテクター細胞の所見と一致して、LNvデンドライトダイナミクスは発達的に調節される14,15である。若い幼虫のLNvデンドライトは、卵を産んだ後の48〜72h(AEL)、古い幼虫のそれらに比べて有意に動的であり、96-120 h AELは、すべての4つのパラメータによって測定され、動的から安定した状態への発達的な移行は72〜96の間に起こる。h AEL8.
図1:デンドライトダイナミクスイメージングおよび定量プロトコルのワークフロー。(A)プロトコルには、サンプル調製、画像収集、画像処理、およびデンドライトダイナミクスの半自動定量をカバーする6つのステップが含まれています。(B)後側を上に取り付けた幼虫脳の駆除を含む画像化室を示す概略図。脳の駆除は、各ローブに個別にラベル付けされたLNvを有し、外部生理食液に浸漬される。真空グリースの障壁はカバースリップの重量を支え、脳が動くのを防ぐ小さい部屋を形成する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:樹状枝ダイナミクスのタイムラプスイメージングを3Dで行う。(A)3rdの幼虫から個別にラベル付けされたLNvの樹状樹木園。(B)代表的な枝の動きを示す(A)の対応するモンタージュ画像。矢印 (緑) は引き込みイベントをマークします。矢印 (赤) は拡張イベントをマークします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:画像アニテーションソフトウェアにおける樹状分岐端子の手動アニテーションと自動トラッキング。(A)スクリーンショットは、Spots モジュールを使用したブランチ 端末トラッキングの設定を示しています。赤い楕円は、手動追跡オプションの概要を説明します。(B)個別にラベル付けされたLNv. Scale bar = 5 μm (C)スクリーンショットは、画像アノテーションソフトウェアによって生成されたアノテーション付き分岐端子(黄色の斑点)の代表的なタイムスタンプ付きの軌跡を示し、スクリーンショットは表示用のインターフェースを示し、スポットモジュールから座標情報をエクスポートします。図 3Bは、Sheng, C. et al. 20188から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:分岐端子の座標情報を用いた樹状分岐ダイナミクスの定量化(A)スクリーンショットは、隣接するフレーム内のスポットの変位を計算するために使用される X、Y、Z 座標、トラックの点と数式を含むスプレッドシートを示しています。(B)スクリーンショットは、1つのブランチの追跡から得られた代表的な結果を示しています。マイナーな動き(<0.3 μm)をフィルタリングしました。取り消しは、値を負 (距離列) に割り当てることによってマークされます。隣接する正/負の値を合計すると、各生物学的伸び/引き込みの変位が計算されます(イベント列)。(C)デンドライトダイナミクスの発達調節を示す結果の代表的な定量化データは、ドットプロット(個々のデータポイント)でオーバーレイされたボックスプロット(ボックス、25~75%、中心線、中央値)として表示されます。図 4Cは、Sheng, C. et al. 20188から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ 1: 10 最大強度投影 (MIP) 画像は、毎秒 2 フレームの速度で再生されます。樹状樹木全体をZスタック当たり1分で画像化した。このビデオを見るにはここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
補足ファイル 1: バッチ列フィルタリング.R スクリプト。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
補足ファイル 2: バッチ列 Sum.R スクリプト。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳における個別に標識されたニューロンにおける樹状枝の動的挙動を記録し定量するために開発したプロトコルについて述べた。特に、私たちのライブイメージングプロトコルは、幼虫LNvの樹状樹木全体をキャプチャし、そのデンドライト分岐の動的状態のグローバルビューを提供することを可能にする特定のパラメータが含まれています。しかし、我々の定量法は分岐末端のアノテーションに大きく依存しているため、複雑な樹状構造と凝縮樹木細化を有するニューロンは、この分析には適さない。
サンプルの調製、画像の取得、および後処理は、このプロトコルの重要な手順です。単一LNvsの高品質の生画像は、デンドライトダイナミクスの正確な定量化に不可欠です。我々のデータは、LNvデンドライト形態とその生理学的応答が解剖の30分以内に慎重に準備された幼虫の脳の駆除でよく保存されていることを示している。観察可能な脳組織の劣化、細長い樹状樹木や枝の破損を持つサンプルは、画像化および定量に使用しないでください。背景が低く、動きが見えないデータセットにはオプションですが、ブランチターミナルや自動のアノテーションに重要な画質を向上させるために、ドリフト補正やデボリューションステップを含むことを強くお勧めします。スポットトラッキング。私たちの研究で使用される商用ソフトウェアに加えて、ImageJ/フィジーの正しい3Dドリフト(プラグイン|登録|正しい3Dドリフト)また、ドリフト補正に適しています。
私たちのプロトコルと既存の方法の主な違いの1つは、個々の分岐のヒントの動きを追跡しますが、樹状のアーバー全体を追跡しないことです。樹状樹木全体の再構築は、樹状の長さとアーキテクチャの合計を測定するのに役立ちますが、3D イメージング データセットを使用した動的な研究には適していません。連続する Z スタック スライスの場合、自動トレース プログラムは、多くの場合、"分岐" の異なる組み合わせを生成し、樹状樹木を再構築し、特に異なるタイム ポイント間の単一分岐レベルでの比較を行います。困難。さらに、樹状樹木全体をトレースするのと比較して、端末トラッキングは処理時間と計算能力の要件を大幅に削減します。
いくつかの変更は、潜在的に我々の方法の効率と分析機能を向上させることができる。タイムラプス画像シリーズから定量的な位置情報を抽出するには、すべての時点における分岐チップの正確なアニテーションが非常に重要です。この手順は現在手動で実行されますが、時間がかかるだけでなく、変動性も生じさせます。オープンソースの3D可視化ソフトウェアの新しい開発は、現在の技術的な制限に対処し、この重要なステップの自動化を可能にする可能性があります。いくつかの最近開発されたソフトウェアツールは、フィロポディア16、17、18、19、20、21の研究のための自動定量機能を提供し、 デンドライト分岐ダイナミクスに関する研究のために潜在的にテストされ、採用されています。
現在手動で実行されているもう 1 つの手順は、拡張イベントと取り消しイベントの識別です。このステップを自動化するには、分岐分岐部位の 3D 座標が必要です。分岐部と 2 つの時点で距離を比較することにより、カスタム書き込みスクリプトを開発して、端子変位の方向を割り当てることができます。同じロジックに従って、ブランチに沿った追加の 3D 座標を使用して、ブランチ内で発生する拡張イベントとリトラクション イベントを分析することもできます。これらのアドオンは、プロトコルのワークフローを最適化するだけでなく、異なる時間スケールで樹状樹木の構造変化に関する情報内容を増やします。
要約すると、経験に依存するデンドライト可塑性に関する研究を支援するために、タイムラプスライブイメージングプロトコルと半自動定量法を開発し、ニューロンの開発における高速分岐ダイナミクスの評価を行いました。本研究では、ここで説明した方法によって生成された結果に基づいて、ショウジョウバエ中枢ニューロンの高運動性樹状フィロポディアを同定し、高められたデンドライトダイナミクスとシナプトジェネシスとの発達的協調を明らかにした。画像の取得と自動化レベルでの将来の改善は、このプロトコルの可能性を大幅に高め、デンドライトダイナミクスと構造可塑性に関する研究を容易にします。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、国立神経障害・脳卒中研究所の内壁研究プログラム(国立衛生研究所)によって支援されています。プロジェクト番号 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
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