Summary
Her beskriver vi den metode, vi anvendte til at afbilde meget motile sædceller dendritiske filopodia i en levende forberedelse af Drosophila larve hjernen, og den protokol, vi udviklede til at kvantificere tidsforskudt 3D imaging datasæt for kvantitative vurderinger af dendrit dynamik i udviklingen af neuroner.
Abstract
Meget motile sædceller dendritiske filopodia er bredt til stede i neuroner på tidlige udviklingsmæssige stadier. Disse sonderende dynamiske grene prøve det omgivende miljø og indlede kontakter med potentielle synaptiske partnere. Selv om forbindelsen mellem dendritiske gren dynamik og synaptogenesis er veletableret, hvordan udviklingsmæssige og aktivitets afhængige processer regulerer dendritiske gren dynamik er ikke godt forstået. Dette skyldes til dels de tekniske vanskeligheder i forbindelse med levende billeddannelse og kvantitative analyser af disse fine strukturer ved hjælp af et in vivo-system. Vi etablerede en metode til at studere dendrit dynamik ved hjælp af Drosophila larve ventrale laterale neuroner (lnvs), som kan være individuelt mærket ved hjælp af genetiske tilgange og er tilgængelige for levende billeddannelse. Drage fordel af dette system, vi udviklet protokoller til at fange gren dynamik i hele dendritiske Arbor af en enkelt mærket lnv gennem time-lapse Live imaging. Derefter udførte vi post-processing for at forbedre billedkvaliteten gennem drift korrektion og dekoncentrering, efterfulgt af at analysere gren dynamik på single-Branch niveau ved at kommentere rumlige positioner af alle gren terminaler. Endelig har vi udviklet R scripts (supplerende fil) og specifikke parametre for at kvantificere gren dynamik ved hjælp af koordinat oplysninger genereret af Terminal tracing. Kollektivt, denne protokol giver os mulighed for at opnå en detaljeret kvantitativ beskrivelse af gren dynamik af neuronal dendritiske Arbor med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. De metoder, vi udviklede, gælder generelt for tyndt mærkede neuroner i både in vitro-og in vivo-tilstande.
Introduction
Dendritter er specialiserede neuronal rum, der modtager og behandler sensorisk og synaptisk input. Den komplekse og stereotype struktur af dendritiske Dorne har været under intens efterforskning siden deres opdagelse. En række modelsystemer, herunder Xenopus Optic tectal neuroner, chick retinal ganglion celler og dendritiske arborization (da) neuroner i Drosophila systemet, er blevet etableret for at studere udvikling, remodeling og plasticitet af neuronal dendritter1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuroner (lnvs) er en gruppe af visuelle projektion neuroner oprindeligt identificeret for deres vigtige funktioner i døgn regulering af flyve adfærd5. Undersøgelser afslørede også larve lnvs rolle som det direkte postsynaptiske mål for larve foto (PRS)6,7. Det er vigtigt, at dyrkning af larver i forskellige lysregimer i høj grad påvirker størrelsen af LNvs ' dendritiske Arbors, hvilket viser, at LNvs er egnet som en ny model til undersøgelse af dendritiske plasticitet7. Det seneste arbejde fra vores gruppe viser endvidere, at både størrelsen af lnv dendrit og den dynamiske opførsel af dendritiske grene viser erfarings afhængig plasticitet8,9. Som en del af dette arbejde, udviklede vi en ny live Imaging og kvantificering protokol til at udføre analyse på dendrit dynamik af LNvs fra 2nd eller 3Rd INSTAR larver.
Den gennemsigtige natur af Drosophila larve hjernen gør den ideel til levende billeddannelse. Men de dendritiske Dorne af lnvs er beliggende i den tætbefolkede larve optisk neuropil (Lon) i midten af larve hjernen lobe6. For at fange billeder af fine dendrit grene og filopodia i intakt hjernevæv, bruger vi to-foton mikroskopi, hvilket øger dybden af lys penetration og reducerer fototoksicitet under levende billeddannelse eksperimenter10. Ved hjælp af denne opsætning, vi med succes udført Live imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uden at observere indlysende morfologiske forringelse af neuron. Hertil kommer, at genetiske manipulationer ved hjælp af flip-out teknik gjorde det muligt for os at mærke de enkelte lnvs med en membran Tagged gfp, som også er afgørende for overvågning af bevægelser af de enkelte grene11,12,13 .
For at fange den dynamiske opførsel af alle grene på lnv dendritiske Arbor med optimal optisk opløsning, udførte vi time-lapse 3D imaging på frisk dissekeret larve Brain bruskeksplantater med en høj rumlig opløsning på 1 min pr frame for 10 til 30 min. udvikling af lnv dendritter er meget dynamiske, med en stor procentdel af grenene viser observerbare ændringer inden for 10 min vindue. Dette fører til en af de vigtigste tekniske udfordringer i at studere dendrit dynamik, kvantificere gren adfærd baseret på 4D-billed datasæt. Tidligere etablerede metoder har forskellige begrænsninger, herunder manglende nøjagtighed og overdreven tid krav. Derfor udviklede vi en halvautomatisk metode, der kombinerer billed efterbehandling, manuel markering af afdelings terminalerne og automatisk 4D-spot sporing ved hjælp af en billed anmærknings software. Vi beregner bevægelserne af afdelings terminaler på forskellige tidspunkter baseret på 3D-koordinaterne for pletterne. Dataene eksporteres og analyseres derefter for at producere kvantitative målinger af gren dynamikken. Denne metode præcist vurderer varigheden og omfanget af udvidelse og tilbagetrækning begivenheder af eksisterende filialer, samt dannelsen af nye grene, så vi kan overvåge dendrit dynamik i et stort antal neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Denne protokol omfatter brug af klasse IV lasere og vil kræve passende uddannelse og sikkerhed retningslinjer, der skal følges. Undgå eksponering af øjne eller hud for direkte eller spredt laserlys.
Bemærk: Protokollen indeholder seks trin. Arbejdsprocessen vises i figur 1A.
1. mærkning individuelle neuroner ved hjælp af flip-out teknik
Bemærk: Den enkelte mærkning af LNvs opnås ved at udtrykke mCD8:: GFP i single LNvs ved hjælp af flippase-medieret stokastisk mærkning. Den genotype af flue linjen er: HS-FLP; PDF-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8:: gfp11,12,13. Hyppigheden af at opnå en enkelt mærket LNv er omkring 10%. Flyve bestandene vedligeholdes i standard mediet i cirkadiske-og fugtigheds kontrollerede 25 °C-inkubatorer.
- Saml 100-200 æg inden for en 2 h vindue post befrugtning på en druesaft plade med gær supplement. Embryonerne inkubates ved 25 °C i 24 timer, og nyklækkede første INSTAR larver opsamles til næste trin.
- Varmechok den nyligt klækkede første INSTAR larver ved 37,5 °C for 40 min to gange, med en 40 min restitutionsperiode i mellem.
- Kultur larverne ved 25 °C med cirkadiske og fugtigheds kontroller til den ønskede udviklingsfase (r).
2. dissekting og montering af larve hjernens Explants
- Dissekere larve hjerner i den fysiologiske eksterne saltvandsopløsning (120 mm NaCl, 4 mm mgcl2,3mm KCl, 10 mm NaHCO3, 10 mm glucose, 10 mm saccharose, 5 mm ter, 10 mm Hepes, 2 mm ca2 +, pH 7,2) under et dissektion mikroskop (4,5 x forstørrelse strøm) med to par #5 standard spids dissektion pincet (11 cm). Brug et par pincet til at holde larve legemet på plads og den anden til omhyggeligt at dissekere hjernen. Bevar øjen diskene, hjerne lapper og den ventrale nerveledning. Fjern vedlagte muskler for at minimere prøve bevægelser under billeddannelse.
- Forbered en glas rutsjebane (25 x 75 x 1,0 mm3) og brug en sprøjte til at tegne et firkantet kammer med vakuum fedt.
- Tilsæt 20 μL ekstern saltvandsopløsning til det firkantede kammer med fedt barrierer.
- Overfør dissekeret larve hjerner ind i kammeret på glas diaset ved hjælp af pincet. Juster hjernens position under dissektions området for at sikre, at Rygsiden vender opad.
- Dæk kammeret med en glas dækseddel (22 x 22 x 0,15 mm3). Larve hjernen er nu monteret på diaset i et kammer fyldt med den eksterne saltvandsopløsning (figur 1B).
Bemærk: Hvis du trykker forsigtigt på dæksedlen, begrænser du hjernen og reducerer prøve drivningen i den efterfølgende billedbehandlings session.
3. tidsforskudt Live imaging
Bemærk: Vi udfører tidsforskudt billedbehandling eksperimenter ved hjælp af en confokal mikroskop udstyret med en multiphoton laser. Anskaffelses parametrene skal justeres for andre billedbehandlings opsætninger.
- Identificer hjerne bruskeksplantater, der indeholder individuelt mærkede neuroner ved hjælp af en 40x vand nedsænkning mål (na 1,3) og en epifluorescerende lyskilde. Til billedsamling skal du bruge en to-foton-laser, der er indstillet til 920 nm og en ikke-nedsænket (NDD) detektor.
- Indsaml billeder ved 512 x 512 pixels pr. ramme og 1 min pr. Z-stak i 10 min. Juster den optiske og digitale zoom for at opnå en tilstrækkelig x-y-Z-opløsning, samtidig med at den dækker hele dendritiske lysthus inden for 1 min. (figur 2, supplerende video 1). indstillingerne genererer billeder med en typisk x-y-z-opløsning på 0,11 x 0,11 x 0,25 μm3.
- Saml timelapse-billedserien inden for 30 minutter af hjerne dissektion. Data med overdreven afdrift eller åbenlyse morfologiske forringelser bør udelukkes fra efter behandling og kvantificering.
4. drift korrektion og dekoncentrering
Bemærk: Afhængigt af billedkvaliteten er begge trin valgfrie, men anbefales kraftigt.
- Åbn en erhvervet billedfil med en drift korrektion software. Rediger mikroskopiske parametre, så de svarer til dem, der bruges til eksperimentet. For softwaren (Se tabel over materialer), klik på Rediger | Rediger mikroskopiske parametre. Indstil mikroskop type som widefield for to-foton billeder, hvis der ikke er to-photon option og følg arbejdsprocessen defineret af softwaren. For eksempel, åbne fanen devolution | Objekt stabilisator, og vælg stabiliserer tidsrammer.
- Åbn det afdrift-korrigerede billede i devolution-softwaren, og følg arbejdsforløbet. For softwaren (Se tabel over materialer) skal du vælge det stabiliserede billede og derefter klikke på dekoncentrering | Devolution Express. For at få et bedre resultat, finjustere parametrene ved hjælp af devolution Wizard.
- Gem det devolverede billede i en filtype, der understøttes af den efterfølgende billed anmærknings software, som kan analysere 4D-data og rapportere de geografiske koordinater for definerede pletter i billedet (Se tabel over materialer).
5. anmærkning af billede
- Åbn det devolverede billede i billed anmærknings softwaren. Undersøg og Markér afdelings tips på alle tidspunkter i 3D. Billed anmærknings softwaren rapporterer og gemmer de rumlige og tidsmæssige koordinater for de markerede forgrenings spidser. Eksporter koordinat oplysningerne som en. csv-fil til efterfølgende beregninger.
Bemærk: De følgende to trin er specifikke for den anmærknings software, vi brugte (Se tabel over materialer). Arbejdsprocessen kan være anderledes for anden software. - Inden for pletter modul, klik "Spring automatisk oprettelse, redigere manuelt" og tjek den nederste "Auto-forbinde til valgte spot" afkrydsningsfeltet (figur 3A). Gå over rammerne i tidsserien, og vælg en gren til anmærkning. Hold Skift nede, og klik på spidsen af afdelings terminalen for at tilføje et sted. Klik gennem alle tidspunkter.
Bemærk: Billed anmærknings softwaren forbinder pletterne mellem rammer og genererer automatisk en bane. De rumlige og tidsmæssige oplysninger om grenen tips er nu forbundet med markerede pletter. Gentag disse trin, indtil alle forgrenings spidser er kommenteret (figur 3B). - I modulet pletter skal du klikke på fanen statistik , vælge detaljeret og vælge bestemte værdier | Position. De registrerede rumlige og tidsmæssige koordinat oplysninger vil blive vist. Klik på Gem nederst for at eksportere disse oplysninger som en. csv-fil (figur 3C).
6. beregning af dendritiske gren dynamik
Bemærk: Ved hjælp af koordinat oplysninger, kan forskydning af grenen tips i 3D let beregnes. I vores undersøgelse, alle dendritiske gren bevægelser er kategoriseret som forlængelse eller tilbagetrækning. Trinnene nedenfor beskriver, hvordan du behandler. csv-filerne ved hjælp af brugerdefinerede R-scripts (supplerende fil) og ved at tilføje retningsoplysninger via manuel redigering.
- Åbn. csv-filen som et regneark. Vælg kolonnen spor-id , klik på indstillingen Sortér mindst til størst , og Accepter Udvid Markeringen. Efter sortering identificerer track ID hver unik dendritisk gren, og pletter fra samme gren deler det samme spor-ID. Kolonnen tid indeholder oplysninger om forskellige tidsrammer.
- Tilføj en afstands kolonne i regnearket. Beregn afstanden for hver to temporalt tilstødende pletter ved hjælp af deres koordinater og sætte værdierne i afstands kolonnen (figur 4A).
- Mindre bevægelser på det enkelte voxel-niveau. Baseret på billedbehandlings indstillingerne er 0,3 μm som regel artefakter fra ukorrigeret drifting eller ufuldkommen billed anmærkning. Filtrer disse bevægelser ud ved at nulstille alle afstands værdier, som er mindre end 0,3 μm til 0. Behandle flere. csv-filer manuelt eller bruge vores R script batch kolonnefiltre ring. R (supplerende fil).
- Generer en ny kolonne med navnet forskydning i regnearket manuelt. Kopiér værdierne fra kolonnen afstand til forskydning . Tildel udvidelsen og tilbagetrækning af hændelser for hver forgrenings spids manuelt. Hvis det er en udvidelse, skal du lade forskydnings værdien være uændret, hvilket er en positiv værdi. Hvis det er en tilbagetrækning, skal du ændre den tilsvarende forskydnings værdi til en negativ værdi (f. eks. 0,35 til-0,35) (figur 4B).
- Generer en ny kolonne, der hedder Event. I denne kolonne summeres forskydnings værdierne manuelt for individuelle forlængelses-og retraktions hændelser (figur 4B).
- Behandl det redigerede regneark, og Kvantificer udvidelsen og optræk hændelserne baseret på deres forskydningsværdier ved hjælp af R-script batch kolonne summen. R (supplerende fil). Outputparametrene omfatter antallet af forlængelses hændelser, antallet af tilbagetrækning begivenheder, kumulative længde forlænget, kumulative længde tilbagetrukket, netto længde ændret, og samlede længde rejste .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den Live imaging-protokol, der er beskrevet ovenfor, optager vi billedstakke med høj opløsning til de efterfølgende analyser og kvantificering. Supplerende video 1 viser den beregnede maksimale INTENSITET (MIP) billedserie indsamlet fra en repræsentant individuelt mærket Lnv. figur 2B viser den tilsvarende montage af otte billeder af billedserien. I begge paneler markerer pilespidser tilbagetrækning af hændelser og pile markerer forlængelses hændelser.
Derefter udfører vi semi-automatiseret 4D-sporing af afdelings terminalerne ved hjælp af en billed anmærknings software (tabel over materialer). Figur 3 B viser anmærkninger af de dynamiske gren terminaler fra en repræsentant, der er mærket lnv. ved hjælp af denne software, vi visualisere billedet stakke i 3D, manuelt markere alle filial terminaler og bruge pletter modul til at spore terminalerne ' bevægelser gennem tiden. Denne software genererer tidsstemplede forløbskurver for hver kommenteret filial terminal, der tjener som visuelle repræsentationer af de dynamiske begivenheder på dendritiske Arbor.
Vi bruger derefter koordinat oplysningerne fra annoterede afdelings tips til at beregne retningen og afstanden for forgrenings bevægelser på hvert tidspunkt. Screenshots i figur 4A, B vise, hvordan dette opnås. De behandlede regneark genererer output filer, som vi bruger til at kvantificere dendrit dynamik med fire parametre, herunder procentdel af dynamiske grene, antal nye grene, kumulativ tilbagelagt distance og antallet af forgrenings hændelser. Figur 4 C viser sammenligninger af dendritiske gren dynamik for individuelt mærkede lnvs fra forskellige udviklingsmæssige stadier. I overensstemmelse med resultaterne i pattedyrs neuroner og Zebra tectal celler er lnv dendrit dynamikken udviklingsmæssigt reguleret14,15. LNv dendritter i yngre larver, 48-72 h efter æglægning (AEL), er betydeligt mere dynamiske sammenlignet med dem i ældre larver, 96-120 h AEL, målt ved alle fire parametre, og den udviklingsmæssige overgang fra den dynamiske til stabile tilstand opstår mellem 72 til 96 h AEL8.
Figur 1: arbejdsgang for dendrit Dynamics Imaging og kvantificerings protokol. A) protokollen indeholder seks trin, der omfatter prøveforberedelse, billedindsamling, billedbehandling og halvautomatiseret kvantificering af dendrit dynamik. B) et skematisk diagram, der illustrerer et billed kammer med en larve hjerne-forklarer monteret med Rygsiden opad. Hjernen explant har en individuelt mærket LNv i hver lap og er nedsænket i den eksterne saltvandsopløsning. Vakuum fedt barriererne understøtter vægten af dæksedlen og danner et lille kammer, der forhindrer hjernen i at bevæge sig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: tidsforskudt billeddannelse af dendritiske gren dynamik i 3D. A) den dendritiske Arbor af en individuelt mærket lnv fra en 3Rd INSTAR Larva. B) det tilsvarende Montage billede af a), der illustrerer de repræsentative forgrenings bevægelser. Arrowheads (grøn) Mark tilbagetrækning begivenheder; pile (rød) markerer forlængelses hændelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: manuel anmærkning og automatisk sporing af dendritiske gren terminaler i en billed anmærknings software. (A) et skærmbillede viser indstillingerne for sporing af afdelings terminaler ved hjælp af spots-modulet. Den røde oval skitserer den manuelle sporings indstilling. (B) repræsentative tidsstemplede forløbskurver for anmærkede gren terminaler (gule pletter) genereret af billed anmærknings softwaren i en individuelt mærket Lnv. Scale bar = 5 μm. (C) et skærmbillede viser grænsefladen for visning og eksporterer koordinat oplysningerne fra spots-modulet. Figur 3b er blevet modificeret fra Sheng, C. et al. 20188. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvantificering af dendritiske gren dynamik ved hjælp af koordinat oplysningerne for gren terminalerne. (A) et skærmbillede viser det regneark, der indeholder X-, Y-og Z-koordinaterne, spor-id'er og formler, der bruges til at beregne forskydning af pletter i de tilstødende rammer. (B) et screenshot viser repræsentative resultater opnået fra sporing af en gren. De mindre bevægelser (< 0,3 μm) blev filtreret ud. Trækninger er markeret ved at tildele deres værdi til negativ (distance kolonne). Ved at opsummere tilstødende positive/negative værdier beregnes forskydningen af hver biologisk udvidelse/tilbagetrækning (kolonnen events). C) repræsentativ kvantificering af resultater, der viser den udviklingsmæssige regulering af dendrit dynamik. Data præsenteres som et felt plot (boks, 25-75%; midterlinje, median) overlagt med et prik plot (individuelle datapunkter). Figur 4c er ændret fra Sheng, C. et al. 20188. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: ti billeder med maksimal intensitet-projektion (MIP), der afspilles med en hastighed på 2 billeder pr. sekund. Hele dendritiske Arbor blev afbildet på 1 min per Z-stak. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Supplerende fil 1: batch kolonne filtrering. R script. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Supplerende fil 2: batch kolonne sum. R script. Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokol, vi har udviklet til at registrere og kvantificere den dynamiske opførsel af dendritiske grene i individuelt mærkede neuroner i Drosophila larve hjerner. Især vores Live imaging protokol indeholder specifikke parametre, der gør det muligt for os at fange hele dendritiske Arbor af en larve lnv og give et globalt billede af den dynamiske tilstand af dens dendrit grene. Men fordi vores kvantificeringsmetoder er stærkt afhængige af anmærkningen af afdelings terminaler, er neuroner med komplekse dendritiske strukturer og kondenserede arborizationer ikke egnede emner til denne analyse.
Prøveforberedelse, billed erhvervelse og efter behandling er de kritiske trin i denne protokol. Højkvalitets RAW-billeder af enkelt LNvs er afgørende for nøjagtig kvantificering af dendrit dynamik. Vores data indikerer, at lnv dendrit morfologi og dens fysiologiske respons er velbevaret i en omhyggeligt forberedt larve Brain explant inden for 30 minutter af dissektion. Prøver med observerbare hjernevæv forringelse, aflange dendritiske Dorne og gren brud bør ikke anvendes til billeddannelse og kvantificering. Selvom det er valgfrit for datasæt med lav baggrund og ingen observerbare bevægelser, anbefaler vi kraftigt, at du medtager drift korrektion og dekoncentrering trin for at forbedre billedkvaliteten, hvilket er vigtigt for anmærkningen af afdelings terminaler og automatisk spot tracking. Ud over den kommercielle software, der anvendes i vores studier, ImageJ/Fiji korrekt 3D drift (plugins | Tilmelding | Korrekt 3D-drift) også fungerer godt for drift korrektion.
En af de store forskelle mellem vores protokol og eksisterende metoder er, at vi sporer bevægelser af individuelle gren tips, men ikke hele dendritiske Arbor. Genopbygning af hele dendritiske Arbors, selvom det er nyttigt til måling af den totale dendritiske længde og arkitektur, er ikke ideel til dynamiske studier ved hjælp af 3D imaging datasæt. For fortløbende Z-stak skiver genererer automatiske sporingsprogrammer ofte forskellige kombinationer af "grene" og rekonstruerer det dendritiske lysthus forskelligt, hvilket gør sammenligningen på det enkelte forgrenings niveau mellem forskellige tidspunkter, især Vanskeligt. Ud over at sammenligne med at spore hele dendritiske Arbor, reducerer Terminal tracking betydeligt behandlingstiden og kravene til beregningskraften.
Flere modifikationer kan potentielt forbedre effektiviteten og analytiske funktioner i vores metode. Hvis du vil udtrække kvantitative positionsoplysninger fra time-lapse-billedserien, er nøjagtig Annotation af afdelings tips på alle tidspunkter af afgørende betydning. Dette trin udføres i øjeblikket manuelt, hvilket ikke kun er tidskrævende, men også introducerer variation. Nye udviklinger i open source 3D-visualiseringssoftware kan potentielt adressere aktuelle tekniske begrænsninger og gøre automatisering af dette kritiske trin muligt. Flere nyligt udviklede softwareværktøjer giver automatisk kvantificerings funktion for undersøgelser af filopodia16,17,18,19,20,21 og kan muligvis afprøvet og vedtaget til undersøgelser af dendrit gren dynamik.
Et andet trin, der i øjeblikket udføres manuelt, er identifikationen af udvidelse vs. tilbagetrækning begivenheder. Automatisering af dette trin kræver 3D-koordinater af filial bifurcation sites. Ved at sammenligne afstande til forgrenings stedet på to tidspunkter, kan en brugerdefineret pung taske udvikles til at tildele direktionaliteten af Terminal forskydninger. Efter den samme logik kan yderligere 3D-koordinater langs grenen også bruges til at analysere forlængelsen og tilbagetrækning begivenheder, der forekommer i grenen. Disse add-ons vil ikke kun optimere arbejdsgangen i vores protokol, men også øge informationsindholdet vedrørende de strukturelle ændringer af dendritiske Dorne på forskellige tidsmæssige skalaer.
Sammenfattende har vi til støtte for vores studier af oplevelses afhængig dendrit plasticitet udviklet tidsforskudt Live imaging protokoller og semi-automatiserede kvantificeringsmetoder til at udføre vurderinger af hurtig gren dynamik i udviklingen af neuroner. Baseret på resultaterne genereret af de metoder, der er beskrevet her, vores undersøgelse identificeret meget motile sædceller dendritiske filopodia i Drosophila centrale neuroner og afslørede en udviklingsmæssige koordination mellem forhøjet dendrit dynamik og synaptogenesis. Fremtidige forbedringer på billedet erhvervelse og automatisering niveau vil i høj grad øge potentialet i denne protokol og lette undersøgelser af dendrit dynamik og strukturel plasticitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af det Intramural forsknings program af National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde, National Institutes of Health. Projektnummer 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
