Summary
Her beskriver vi metoden vi brukte for å avbilde svært aktive dendrittiske filopodia i en live forberedelse av Drosophila larvestadiet hjernen, og protokollen vi utviklet for å kvantifisere tidsforløp 3D bildedata sett for kvantitative vurderinger av dendrit dynamikk i å utvikle neurons.
Abstract
Svært aktive dendrittiske filopodia er allment tilstede i neurons på tidlige utviklingsmessige stadier. Disse undersøkende dynamiske grener prøve det omkringliggende miljøet og initiere kontakter med potensielle Synaptic partnere. Selv om forbindelsen mellom dendrittiske gren dynamikk og synaptogenesis er godt etablert, hvordan utviklingsmessige og aktivitet-avhengige prosesser regulere dendrittiske grenen dynamikk er ikke godt forstått. Dette skyldes delvis tekniske problemer knyttet til live Imaging og kvantitative analyser av disse fine strukturene ved hjelp av et in vivo-system. Vi etablerte en metode for å studere dendrit dynamikk ved hjelp av Drosophila larvestadiet ventrale lateral neurons (LNvs), som kan være individuelt merket ved hjelp av genetiske tilnærminger og er tilgjengelig for Live Imaging. Utnytter dette systemet, utviklet vi protokoller for å fange grenen dynamikk av hele dendrittiske Arbor av en enkelt merket LNv gjennom time-lapse Live Imaging. Vi deretter utførte etterbehandling for å forbedre bildekvaliteten gjennom drift korreksjon og deconvolution, etterfulgt av analysere gren dynamikk på single-grenen nivå ved å kommentere romlige posisjoner på alle gren terminaler. Til slutt utviklet vi R-skript (tilleggsfil) og spesifikke parametre for å kvantifisere gren dynamikk ved hjelp av koordinat informasjonen som genereres av Terminal sporingen. Kollektivt, denne protokollen tillater oss å oppnå en detaljert kvantitativ beskrivelse av grenen dynamikk av neuronal dendrittiske Arbor med høy Temporal og romlig oppløsning. Metodene vi utviklet er generelt gjelder for tynt merket neurons i både in vitro og in vivo forhold.
Introduction
Dendrites er spesialisert neuronal rom som mottar og behandler sensorisk og Synaptic innspill. Den komplekse og stereotype strukturen av dendrittiske arbors har vært under intens etterforskning siden oppdagelsen deres. En rekke modellsystemer, inkludert Xenopus optikk tectal neurons, chick retinal Ganglion celler, og dendrittiske arborization (da) neurons i Drosophila systemet, har blitt etablert for å studere utvikling, remodeling og plastisitet av neuronal dendrites1,2,3,4. Drosophila ventrale lateral neurons (LNvs) er en gruppe av visuell projeksjon neurons utgangspunktet identifisert for deres viktige funksjoner i døgn regulering av fly atferd5. Studier avslørte også rollen som larvestadiet LNvs som direkte postsynaptic målet for larvestadiet fotoreseptorene (PRs)6,7. Viktigere, dyrking utvikle larver i ulike lys regimer sterkt påvirker størrelsen på LNvs ' dendrittiske arbors, demonstrere egnetheten av LNvs som en ny modell for å studere dendrittiske plastisitet7. Nyere arbeid fra vår gruppe videre indikerer at både størrelsen på LNv dendrit og den dynamiske atferden til dendrittiske grener displayet Experience-avhengige plastisitet8,9. Som en del av dette arbeidet, utviklet vi en ny Live Imaging og kvantifisering protokoll for å utføre analyser på dendrit dynamikken i LNvs fra 2nd eller 3Rd skikkelsen larver.
Den gjennomsiktige natur Drosophila larvestadiet hjernen gjør det ideelt for Live Imaging. Imidlertid er den dendrittiske arbors av LNvs ligger i tett innervated larvestadiet optikk neuropil (LON) i sentrum av larvestadiet hjerne flik6. For å ta bilder av fine dendrit grener og filopodia i intakt hjernevev, bruker vi to-Foton mikroskopi, noe som øker dybden av lys penetrasjon og reduserer Phototoksisitet under Live Imaging eksperimenter10. Ved hjelp av dette oppsettet, vi vellykket utført Live Imaging eksperimenter på LNvs for over 30 min uten å observere åpenbare morfologiske forverring av Nevron. I tillegg genetisk manipulasjoner ved hjelp av flip-out teknikken gjorde oss i stand til å merke den enkelte LNvs med en membran merket GFP, som også er avgjørende for å overvåke bevegelsene til enkelte grener11,12,13 .
For å fange den dynamiske atferden til alle grener på LNv dendrittiske Arbor med optimal optisk oppløsning, utførte vi time-lapse 3D Imaging på fersk dissekert larvestadiet hjernen explants med en høy romlig oppløsning på 1 min per ramme for 10 til 30 min. utvikle LNv dendrites er svært dynamiske, med en stor prosentandel av grenene som viser merkbare endringer innenfor 10 min vinduet. Dette fører til en av de viktigste tekniske utfordringene i å studere dendrit dynamikk, kvantifisere gren atferd basert på 4D bildedata settene. Tidligere etablerte metoder har ulike begrensninger, inkludert mangel på nøyaktighet og overdreven tid kravet. Derfor har vi utviklet en semi-automatisk metode som kombinerer bilde etterbehandling, manuell merking av grenen terminaler, og automatisk 4D flekk sporing ved hjelp av et bilde merknad programvare. Vi beregner bevegelsene til gren terminaler på forskjellige tidspunkter basert på 3D-koordinatene til flekkene. Dataene eksporteres deretter og analyseres for å gi kvantitative målinger av gren dynamikken. Denne metoden vurderer nøyaktig varigheten og omfanget av forlengelse og tilbaketrekking hendelser av eksisterende grener, samt dannelsen av nye grener, slik at vi kan overvåke dendrit dynamikk i et stort antall neurons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsiktig: Denne protokollen innebærer bruk av klasse IV lasere og vil kreve riktig opplæring og sikkerhetsretningslinjer som skal følges. Unngå øye-eller hud eksponering for direkte eller spredt laser lys.
Merk: Protokollen inneholder seks trinn. Arbeidsflyten vises i figur 1A.
1. merking individuelle neurons bruke flip-out teknikk
Merk: Singelen merking av LNvs oppnås ved å uttrykke mCD8:: GFP i enkelt LNvs bruker flippase-mediert Stokastisk merking. Genotype av fly linjen er: HS-FLP; PDF-Gal4; UAS-frt-CD2-Stop-frt-mCD8:: GFP11,12,13. Hyppigheten av å få en enkelt merket LNv er rundt 10%. Fly bestandene opprettholdes i standard medium i døgn-og luft fuktighets styrte inkubatorer 25 ° c.
- Samle 100-200 egg i en 2 h vindu innlegg befruktning på en drue juice plate med gjær supplement. Ruge embryo ved 25 ° c for 24 h og samle nylig klekket første skikkelsen larver for neste trinn.
- Heat sjokk den nylig klekket første skikkelsen larver ved 37,5 ° c for 40 min to ganger, med en 40 min utvinning periode i mellom.
- Kultur Larvene ved 25 ° c med døgn-og luftfuktighet kontroller til ønsket utviklingstrinn (er).
2. dissekere og montering larvestadiet Brain Explants
- Analysere larvestadiet hjerner i den fysiologiske ekstern saltvannsoppløsning (120 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 3 mm KCl, 10 mm NaHCO3, 10 mM glukose, 10 mM SUKROSE, 5 mM tes, 10 mM HEPES, 2 mm ca2 +, pH 7,2) under et disseksjon mikroskop (4,5 x forstørrelse strøm) med to par #5 standard spissen disseksjon tang (11 cm). Bruk ett par tang for å holde larvestadiet kroppen på plass og den andre til å nøye analysere ut hjernen. Bevar øyet disker, hjerne fliker og ventrale nerve ledningen. Fjern vedlagte muskler for å minimere prøve bevegelser under bildebehandling.
- Forbered et glass Slide (25 x 75 x 1,0 mm3) og bruk en sprøyte for å tegne et firkantet kammer med vakuum fett.
- Tilsett 20 μL av ekstern saltvannsoppløsning i kvadrat kammeret med fett barrierer.
- Overfør dissekert larvestadiet hjernen inn i kammeret på glasset lysbildet ved hjelp av tang. Juster posisjonen til hjernen under disseksjon omfang for å sikre at rygg siden vender opp.
- Dekk kammeret med et glass deksel slip (22 x 22 x 0,15 mm3). Den larvestadiet hjernen er nå montert på lysbildet i et kammer fylt med den eksterne saltvann løsningen (figur 1B).
Merk: Ved å trykke forsiktig på dekkglass rammer hjernen og reduserer prøve drivende i den påfølgende bildebehandlings økten.
3. tidsforløp Live Imaging
Merk: Vi utfører tidsforløp bilde forsøk ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop utstyrt med en multiphoton laser. Anskaffelses parametrene må justeres for andre bildeoppsett.
- Identifiser hjernen explants inneholder individuelt merket neurons bruker en 40X vann nedsenking objektiv (NA 1,3) og en epifluorescent lyskilde. For bildesamling, bruk en to-Foton laser innstilt til 920 NM og en ikke-descanned (NDD) detektor.
- Samle bilder på 512 x 512 piksler per bilde og 1 min per Z-stack i 10 min. Juster den optiske og digitale zoomen for å oppnå en tilstrekkelig x-y-Z-oppløsning, samtidig som det sikrer dekningen av hele dendrittiske Arbor innen 1 min (figur 2, supplerende video 1). innstillingene genererer bilder med en typisk x-y-z-oppløsning på 0,11 x 0,11 x 0,25 μm3.
- Samle tiden forfalle bildeserien innen 30 min av hjernen disseksjon. Data med overdreven drift eller åpenbar morfologiske forringelse bør utelukkes fra etterbehandling og kvantifisering.
4. drift korreksjon og deconvolution
Merk: Avhengig av bildekvaliteten er begge trinnene valgfrie, men anbefales på det sterkeste.
- Åpne en ervervet bildefil med en drift korreksjon programvare. Rediger mikroskopiske parametere slik at de samsvarer med de som brukes for eksperimentet. For programvaren (se tabell over materialer), klikk på Rediger | Rediger mikroskopiske parametere. Angi mikroskop type som widefield for to-Foton bilder hvis det ikke er to-Foton alternativet og følg arbeidsflyten definert av programvaren. For eksempel åpne kategorien deconvolution | Objekt stabilisator, og velg stabilisere tidsrammer.
- Åpne den drift-korrigert bildet i deconvolution programvare og følge sin arbeidsflyt. For programvaren (se tabell over materialer), Velg stabilisert bilde, og klikk deretter deconvolution | Deconvolution. For å få et bedre resultat, Finjuster parametrene ved hjelp av deconvolution Wizard.
- Lagre det deconvolved bildet i en filtype som støttes av den påfølgende bilde merknads programvaren som kan analysere 4D-data og rapportere romlige koordinater for definerte prikker i bildet (se tabell over materialer).
5. bilde merknad
- Åpne det deconvolved bildet i programvaren for bilde merknaden. Undersøk og Merk gren tips på alle tidspunkter i 3D. Bildet merknad programvarerapporter og lagrer romlige og timelige koordinatene til den markerte grenen tips. Eksporter koordinat informasjonen som en CSV-fil for etterfølgende beregninger.
Merk: Følgende to trinn er spesifikke for merknads programvaren vi brukte (se tabell over materialer). Arbeidsflyten kan være forskjellig for annenprogramvare. - Innenfor spots modulen, klikk "skip automatisk opprettelse, redigere manuelt" og sjekk den nederste "Auto-koble til valgte spot" avkrysningsruten (Figur 3A). Gå over rammene i tidsserien, og velg en gren for merknader. Hold nede SKIFT-tasten, og klikk gren Terminal spissen for å legge til et sted. Klikk gjennom alle tids punkt.
Merk: Bilde merknads programvaren kobler sammen flekkene mellom rammene og genererer en bane automatisk. Den romlige og timelige informasjonen i grenen tipsene er nå forbundet med markerte flekker. Gjenta disse trinnene til alle gren tipsene er kommentert (Figur 3B). - I spots-modulen klikker du på statistikk -fanen, velger detaljert og velger spesifikke verdier | Posisjon. Den registrerte romlige og timelige koordinat informasjonen vil bli vist. Klikk på Lagre nederst for å eksportere informasjonen som en CSV-fil (Figur 3C).
6. beregne dendrittiske Branch Dynamics
Merk: Ved hjelp av koordinat informasjonen kan forskyvning av gren tipsene i 3D enkelt beregnes. I studien vår er alle dendrittiske gren bevegelser kategorisert som utvidelse eller tilbake trekking. Trinnene nedenfor beskriver hvordan du behandler CSV-filene ved hjelp av egendefinerte, skrevne R-skript (tilleggsfil) og ved å legge til retningsinformasjon gjennom manuell redigering.
- Åpne CSV-filen som et regneark. Velg spor-ID- kolonnen, klikk på Sorter minst til største alternativet og godta utvide valget. Etter sortering identifiserer spor-ID hver unike dendrittiske gren, og punkter fra samme gren deler samme spor-ID. Tids Kol onnen lagrer informasjonen for forskjellige tidsrammer.
- Legg til en avstand -kolonne i regnearket. Beregn avstanden mellom to tilstøtende plasser ved hjelp av koordinatene og sette verdiene i kolonnen avstand (Figur 4A).
- Mindre bevegelser på single Voxel nivå. Basert på bildeinnstillingene er 0,3 μm vanligvis artefakter fra uncorrected Drifting eller ufullkommen bilde merknad. Filtrer ut disse bevegelsene ved å tilbakestille alle avstands verdier som er mindre enn 0,3 μm til 0. Behandle flere. CSV-filer manuelt eller bruk vår R script batch Kol onne filtrering. R (tilleggsfil).
- Generer manuelt en ny kolonne med navnet forskyvning i regnearket. Kopier verdiene fra avstand kolonne til forskyvning kolonne. Tilordne hendelser for utvidelse og tilbaketrekking manuelt for hver gren tips. Hvis det er en utvidelse, lar du Forskyvnings verdien være uendret, som er en positiv verdi. Hvis det er en tilbaketrekking, endrer du den tilsvarende Forskyvnings verdien til en negativ verdi (f.eks. 0,35 til-0,35) (Figur 4B).
- Generer en ny kolonne kalt hendelse. I denne kolonnen summerer du Forskyvnings verdiene manuelt for individuelle Utvidelses-og uttrekks hendelser (Figur 4B).
- Behandle endret regneark og kvantifisere forlengelsen og tilbaketrekking hendelser basert på deres forskyvning verdier ved hjelp av R script batch kolonne sum. R (tilleggsfil). Utdataene parametrene omfatter antall forlengelse hendelser, antall tilbake trekking hendelser, Kumulativ lengde utvidet, Kumulativ lengde trukkettilbake, netto lengde endret, og Total lengde reist .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av Live Imaging-protokollen beskrevet ovenfor, fanger vi opp bilde stabler med høy oppløsning for de påfølgende analysene og kvantifisering. Supplerende video 1 viser den maksimale intensiteten anslått (MIP) bildeserie Hentet fra en representant individuelt merket LNv. figur 2B viser tilsvarende montasje av åtte bilder i bildeserien. I begge panelene markerer pilspisser for hendelser og Utvidelses hendelser for piler.
Deretter utfører vi semi-automatisert 4D sporing av gren terminalene ved hjelp av en bilde merknad programvare (tabell av materialer). Figur 3 B viser merknader om de dynamiske gren terminalene fra en representant som er individuelt merket LNv. ved hjelp av denne programvaren, visualisere vi bildet stabler i 3D, manuelt merke alle gren terminaler og bruke spots modulen for å spore terminalene ' bevegelser gjennom tiden. Denne programvaren genererer tidsstemplet baner for hver kommentert gren Terminal, som fungerer som visuelle representasjoner av dynamiske hendelser på dendrittiske Arbor.
Vi bruker deretter koordinat informasjonen fra kommenterte gren tips for å beregne retningen og avstanden for gren bevegelser på hvert tidspunkt. Skjermbilder i Figur 4A, B viser hvordan dette oppnås. Den behandlede regneark generere output filer som vi bruker til å kvantifisere dendrit dynamikk med fire parametere, inkludert prosentandel av dynamiske grener, antall nye grener, Kumulativ distanse reist, og antall gren bevegelse hendelser. Figur 4 C viser sammenligninger av dendrittiske gren dynamikk for individuelt merket LNvs fra ulike utviklingstrinn. I samsvar med funnene i pattedyr neurons og sebrafisk tectal celler, LNv dendrit dynamikk er developmentally regulert14,15. LNv dendrites i yngre larver, 48-72 h etter egglegging (AEL), er betydelig mer dynamisk i forhold til de i eldre larver, 96-120 h AEL, målt ved alle fire parametre, og den utviklingsmessige overgangen fra dynamiske til stabil tilstand oppstår mellom 72 til 96 h AEL8.
Figur 1: arbeidsflyt for dendrit-og kvantifisering-protokollen. (A) protokollen inneholder seks trinn som dekker sample forberedelse, bildesamling, bildebehandling og semi-automatisert kvantifisering av dendrit dynamikk. (B) et skjematisk diagram som illustrerer et bilde kammer som inneholder en larvestadiet hjerne explant montert med rygg side opp. Hjernen explant har en individuelt merket LNv i hver flik og er nedsenket i den eksterne saltvann løsningen. Vakuumet fett barrierene støtter vekten av dekkglass og danner et lite kammer som hindrer hjernen i å bevege seg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: tidsforløp avbildning av dendrittiske gren dynamikk i 3D. (A) dendrittiske Arbor av en individuelt merket LNv fra en 3Rd skikkelsen Larven. (B) tilsvarende montasje bilde av (A) illustrerer den representative grenen bevegelser. Pilspisser (grønn) merke uttrekk hendelser; piler (rød) markerer Utvidelses hendelser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: manuell Merknad og automatisk sporing av dendrittiske gren terminaler i et bilde merknads program. (A) et skjermbilde viser innstillingene for gren Terminal sporing ved hjelp av spots-modulen. Den røde oval skisserer alternativet manuell sporing . (B) representative tid-stemplet baner av kommenterte gren terminaler (gule flekker) generert av bildet merknads programvare i en individuelt merket LNv. Scale bar = 5 μm. (C) et skjermbilde viser grensesnittet for visning og å eksportere koordinat informasjonen fra spots-modulen. Figur 3b har blitt modifisert fra Sheng, C. et al. 20188. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvantifisering av dendrittiske gren dynamikk ved hjelp av koordinat informasjonen til gren terminalene. (A) et skjermbilde viser regnearket som inneholder X-, Y-og Z-koordinatene, spor-IDer og formelen som brukes til å beregne forskyvning av flekker i de tilstøtende rammene. (B) et skjermbilde viser representative resultater fra sporing av en gren. De mindre bevegelsene (< 0,3 μm) ble filtrert ut. Retractions merkes ved å tilordne verdien til negativ (avstands Kol onnen). Ved å summere opp tilstøtende positive/negative verdier, beregnes forskyvningen av hver biologiske utvidelse/tilbaketrekking (hendelser-kolonnen). (C) representative kvantifisering av resultater som viser utviklingsmessige regulering av dendrit dynamikk. Data presenteres som et boks plott (boks, 25-75%; midtlinje, median) overlappet med et prikk plott (individuelle datapunkter). Figur 4c er endret fra Sheng, C. et al. 20188. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende video 1: ti maksimum-intensitet-projeksjon (MIP) bilder spilt med en hastighet på 2 bilder per sekund. Hele dendrittiske Arbor ble avbildet på 1 min per Z-stack. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 1: satsvis kolonne filtrering. R-skript. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 2: satsvis kolonne sum. R-skript. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll vi utviklet for å spille inn og kvantifisere den dynamiske atferden til dendrittiske grener i individuelt merket neurons i Drosophila larvestadiet hjerner. Spesielt vår Live Imaging protokollen inneholder spesifikke parametre som gjør oss i stand til å fange hele dendrittiske Arbor av en larvestadiet LNv og gi en global visning av den dynamiske tilstanden til sine dendrit grener. Men, fordi våre kvantifisering metoder tungt avhengige av merknaden om gren terminaler, neurons med komplekse dendrittiske strukturer og kondensert arborizations er ikke egnet for denne analysen.
Prøve forberedelser, bildeoppkjøp og etterbehandling er de kritiske trinnene i denne protokollen. Høy kvalitet rå bilder av enkelt LNvs er avgjørende for nøyaktig kvantifisering av dendrit dynamikk. Våre data tyder på at LNv dendrit morfologi og dens fysiologiske reaksjoner er godt bevart i en nøye forberedt larvestadiet hjernen explant innen 30 min av disseksjon. Prøver med Observer hjernevev forringelse, forlenget dendrittiske arbors og gren brudd bør ikke brukes til bildebehandling og kvantifisering. Selv om det er valgfritt for datasett med lav bakgrunn og ingen merkbare bevegelser, anbefaler vi på det sterkeste å inkludere drift korreksjon og deconvolution trinn for å forbedre bildekvaliteten, noe som er viktig for merknaden om gren terminaler og automatisk flekk sporing. I tillegg til kommersiell programvare som brukes i våre studier, ImageJ/Fiji er riktig 3D drift (plugins | Registrering | Riktig 3D-drift) fungerer også godt for drift korreksjon.
En av de store forskjellene mellom vår protokoll og eksisterende metoder er at vi sporer bevegelsene til enkelte gren tips, men ikke hele dendrittiske Arbor. Rekonstruksjon av hele dendrittiske arbors, men nyttig for å måle den totale dendrittiske lengde og arkitektur, er ikke ideelt for dynamiske studier med 3D Imaging datasett. For påfølgende Z-stabel skiver, automatisk sporing programmer genererer ofte ulike kombinasjoner av "grener" og rekonstruere dendrittiske Arbor annerledes, slik at sammenligningen på én gren nivå mellom ulike tidspunkt poeng spesielt Vanskelig. I tillegg sammenligner å spore hele dendrittiske Arbor, Terminal sporing reduserer behandlingstiden og kravene til beregning makt.
Flere modifikasjoner kan potensielt forbedre effektiviteten og analytiske funksjoner i vår metode. For å trekke ut kvantitativ posisjonsinformasjon fra bildeserien med tidsforløp, er nøyaktig merknad av gren tips på alle tidspunkter kritisk viktig. Dette trinnet er for tiden utføres manuelt, som ikke bare er tidkrevende, men også introduserer variasjon. Ny utviklingen inne åpen kilde 3D visualisering programvare kunne muligheter henvende seg aktuelle teknisk begrensninger og lage automatisering av denne betenkelig steg mulig. Flere nylig utviklede programvareverktøy gir automatisk kvantifisering funksjon for studier på filopodia16,17,18,19,20,21 og kan bli potensielt testet og vedtatt for studier på dendrit gren dynamikk.
Et annet trinn som er utført manuelt er identifikasjonen av utvidelse kontra tilbaketrekking hendelser. Automatisering av dette trinnet krever 3D-koordinatene for gren bifurkasjonen områder. Ved å sammenligne avstander til forgrening området på to tidspunkt, en Custom-skrevet skrifttyper kan utvikles for å tildele retningen av terminalen forskyvninger. Etter den samme logikken, kan ytterligere 3D-koordinater langs grenen også brukes til å analysere forlengelsen og tilbaketrekking hendelser som oppstår i grenen. Disse tilleggene vil ikke bare optimere arbeidsflyten i vår protokoll, men også øke informasjonsinnholdet om de strukturelle endringene i dendrittiske arbors ved ulike timelige skalaer.
Oppsummert, for å støtte våre studier på erfaring-avhengige dendrit plastisitet, utviklet vi tidsforløp Live Imaging protokoller og semi-automatiserte kvantifisering metoder for å utføre vurderinger av rask gren dynamikk i å utvikle neurons. Basert på resultatene generert av metodene som er beskrevet her, vår studie identifiserte svært aktive dendrittiske filopodia i Drosophila sentrale neurons og avslørte en utviklingsmessige koordinering mellom økt dendrit dynamikk og synaptogenesis. Fremtidige forbedringer på bildet oppkjøpet og automatisering nivå vil i stor grad øke potensialet i denne protokollen og tilrettelegge studier på dendrit dynamikk og strukturelle plastisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av intramural Research program of National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health. Prosjektnummer 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
