Summary
Здесь мы представляем протокол, с которым до и / или postsynaptic кальция могут быть визуализированы в контексте drosophila обучения и памяти. In vivo изображения кальция с использованием синапитично локализованных датчиков кальция в сочетании с классической обонятельной парадигмы кондиционирования, таким образом, что синаптической пластичности, лежащей в основе этого типа ассоциативного обучения может быть определена.
Abstract
Десятилетия исследований во многих модельных организмах привели к нынешней концепции синаптической пластичности, лежащей в основе обучения и формирования памяти. Обучение индуцированных изменений в синаптической передачи часто распространяются по многим нейронам и уровни обработки в головном мозге. Таким образом, методы визуализации обучения зависимых синаптической пластичности через нейроны необходимы. Плодовая муха Drosophila melanogaster представляет собой особенно благоприятный модельный организм для изучения нейрональных схем, лежащих в основе обучения. Представленный здесь протокол демонстрирует, каким образом процессы, лежащие в основе формирования ассоциативных обонятельных воспоминаний, т.е. синаптической активности и их изменений, могут контролироваться in vivo. Используя широкий спектр генетических инструментов, доступных в Drosophila, можно специально выразить генетически закодированные показатели кальция в определенных популяций клеток и даже одиночных клеток. Фиксируя муху на месте, и открытие капсулы головы, можно визуализировать динамику кальция в этих клетках, обеспечивая обонятельные стимулы. Кроме того, мы демонстрируем настройку, в которой муха может быть подвергнута, одновременно, электрическим током к телу. Это обеспечивает систему, в которой мухи могут пройти классический обонятельный кондиционирования - в котором ранее наивный запах научился быть связаны с электрическим током наказания - в то же время, как представление этого запаха (и другие неподготовленные запахи) является наблюдается в головном мозге с помощью двухфотонной микроскопии. Наша лаборатория ранее сообщала о генерации синаптически локализованных датчиков кальция, что позволяет ограничить флуоресцентные сигналы кальция до или постсинаптические отсеки. Двухфотонная микроскопия позволяет пространственно разрешать мелкие конструкции. Мы иллюстрируем это, сосредоточив внимание на нейронах, интегрирующих информацию из грибного тела, центра высшего порядка мозга насекомых. В целом, этот протокол предоставляет метод для изучения синапических связей между нейронами, активность которых модулируется в результате обонятельного обучения.
Introduction
Расшифровка того, где и как информация приобретается в мозге путем обучения и впоследствии хранится в качестве памяти представляет собой одну из самых сложных задач в неврологии1. Нейронаучные исследования привели к концепции изменения в синаптической передачи в качестве нейронального субстрата, который лежит в основе обучения и формирования памяти2,3. Предполагается, что во время обучения синаптические связи между нейрональными ансамблями, которые активны во время восприятия стимула, становятся модифицированными такимобразом, что их комбинированная активность может быть извлечена во время отзыва памяти, тем самым инструктируя будущее поведенческое действие4. Эти "энграммные клетки" и их синапсы часто распределены по регионам мозга и уровням обработки, что затрудняет присвоение наблюдаемых изменений в синаптической передаче изучению задачи или стимула. Для локализации и визуализации тех синапических изменений, которые причинно связаны с конкретной задачей обучения, нужна соответствующая модельная система, позволяющая точно сограничировать эти синапсы.
Для такого начинания, Drosophila melanogaster особенно подходит, потому что он сочетает в себе относительную простоту мозга, поведенческое богатство, и экспериментальной доступности. Среди устоявшихся модельных организмов, Drosophila находится между нематод C. elegans и генетически tractable млекопитающих, как мыши с точки зрения нейронной сложности. Стереотипное количество нейронов (300 евро) и ограниченный поведенческий репертуар наблюдаются в C. elegans. Млекопитающие, с другой стороны, имеют миллионы нейронов и ошеломляющей поведенческой сложности. Мозг плодовой мухи, с его 100000 фунтов, нейроны значительно меньше, чем мозг большинства позвоночных, и многие из нейронов индивидуально идентифицируемых5. Тем не менее, Drosophila продемонстрировать широкий спектр сложных моделей поведения, в том числе способность проявлять надежное ассоциативное обонятельное обучение и формирование памяти, впервые описано более 40 лет назад6. В ходе этой классической процедуры кондиционирования, группы мух подвергаются запаху в качестве условного стимула (CS)в то время как они получают наказание электрическим током, как безусловный стимул (США). Второй запах (CS- )затем представлен без какого-либо наказания. Таким образом, животные учатся избегать запаха, связанного с наказанием, которое может быть проверено в последующей ситуации выбора между двумя запахами, CSи CS-. Работа по вскрытию нейронального субстрата, лежащего в основе такого поведения в Дрософиле, выявила грибные тела (МБ) в качестве основного места "энграммы"7,8,9,10 и, следовательно, схема этой области мозга была и является предметом интенсивных исследований, с тем чтобы раскрыть логику, с помощью которой энграмма памяти приобретается и хранится (недавно рассмотрены в11,12).
Дрозофила МБ состоит из 2000 внутренних нейронов (клеток Кеньона) на полушарие, организованных в параллельных аксональных проекциях13. Аксоны обонятельных проекционных нейронов распространяются на боковые протоцеребры и мБ калеки, основной дендритный вхоломестоц МБ и получают обонятельный вход из антенных долей. Длинный параллельный аксоны пучок клеток Кеньон составляют peduncle и долей. Большинство клеток Кеньона раздвоените, образуя горизонтальные доли, расширяя одно обеспечение к средней линии мозга, и вертикальные доли, расширяя второе второе секондирование в направлении дорсал-переднего. Другая группа клеток Кеньона образует горизонтальные доли13 МБ, где процесс обучения и последующее кратковременное формирование памяти могут быть локализованы10. МБ доли получают afferent входив и обеспечивают efferent выход, оба из которых типично ограничены к отдельно расчастью sub-области вдоль аксонов клетки Kenyon14,15,16. В частности, афферентные дофаминергические mb входные нейроны были показаны посредничать на основе стоимости, например, карательные, усиливающие эффекты в ассоциативном обонятельном обучении15,17. Стереотипные и индивидуально идентифицируемые эфферентные нейроны выхода МБ из долей грибного тела интегрируют информацию в большом количестве клеток Кеньона, нацелены на различные области мозга и несут поведение-поучительную аппетитную или аверсивную информацию15 . Эта нейрональная архитектура привела к концепции организации ассоциативной энграммы. Одоры относительно точно кодируются редко активированными ансамблями клеток Кеньона. Совпадение деятельности этих кеньон клеточных ансамблей и выпуск допамина - вызванные наказанием стимулов - модулирует передачу из Кеньон клетки presynapses на выброс нейронов МБ таким образом, что животные будут впоследствии избежать этого конкретногозапаха 10 ,12. Мы используем эту довольно точно определенную и локализованную энграмму в качестве парадигматического случая, чтобы проиллюстрировать, как можно определить и контролировать эти обучающие изменения в синаптической активности.
Значение Drosophila как модельная система сильно опирается на непревзойденный генетический инструментарий, который позволяет выразить трансгенов для выявления, мониторинга и контроля отдельных нейронов в сложных схемах18. Появление методов мониторинга нейронной активности - таких, как изображения кальция, обсуждается здесь - позволили для определения нейронной активности моделей в ответ на конкретный стимул. Комбинируя специфические Gal4-управляемые выражения генетически закодированных индикаторов кальция (GECIs) с обонятельной стимуляцией, можно визуализировать вызванную запахом динамику кальция нейронов, представляющих интерес19. В этом протоколе показано, что путем дальнейшего соединения этой техники с классической парадигмой кондиционирования, можно изучить эти обонятельные ответы в контексте обучения. Обучение индуцированной пластичности может быть дополнительно вскрыты с помощью GECIs, которые не только локализованы для одного конкретного нейрона, но и для конкретных subcompartments нейрона. Pech et al.20 создали подборку инструментов, которые позволяют именно это. Ориентируясь gCaMP321 либо до или postsynapse - через связь с позвоночных Synaptophysin или dГомер, соответственно20- дифференциальной модуляции этих сайтов можно отличить. Эта локализация предоставляет, в этом контексте, преимущество перед большинством GECIs, которые повсеместно присутствуют во всем цитозоле - например, GCaMP22, GCaMP321, или GCaMP623 - потому что это означает, что до и постсинаптических переходных может быть отличается от общего интегрированного притока кальция, который происходит в результате активации нейронов. Это может дать подсказки о местоположении и типах пластичности, которые возникают в результате или которые вызывают обучение и формирование памяти. В качестве примера, протокол, представленный здесь показывает значение этого инструмента в расшифровке модуляции МБ выходных нейронов во время обонятельного ассоциативного обучения, ориентируясь на выражение датчика кальция только postsynapse. Путем контролировать, внутри индивидуальная муха, запах-вызванная деятельность перед и после обонятельного кондиционирования сразу сравнение можно нарисовать между наивным реакцией запаха и выученным реакцией запаха. В то время как фиксированные в той же камере изображения, мухи подвергаются выбор запахов. Затем они получают аверсивный ассоциативный протокол кондиционирования, в котором один из этих запахов в паре с электрическим током (становясь CS)и другой запах представлен без подкрепления (становится CS-). Наконец, мухи снова подвергаются тем же запахам, что и на первом этапе. Динамика кальция наблюдается с помощью двухфотонной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансгенные плодовые мушки, Drosophila melanogaster
- Крест женских девственниц и самцов мух (поднятые при 25 градусах Цельсия при 60% относительной влажности на 12 ч светло/темный цикл), несущих желаемый Gal4 и UAS строит25, соответственно, для производства мух, в которых конкретные нейроны, представляющие интерес, выражают генетически закодированный индикатор кальция.
- Возраст женского потомства выше креста, пока они находятся в диапазоне 3-6 дней после эклориии. Самки мух предпочтительнее из-за их немного большего размера.
2. Подготовка плодовой мухи для визуализации кальция in vivo
- Выберите одну самку мухи и анестезируйте на льду не более 5 мин.
- Используя тонкие щипц, поместите муху в камеру изображения (продемонстрировано на рисунке 1c). Убедитесь, что грудная клетка и ноги находятся в контакте с электрическими проводами в нижней части камеры и что голова лежит плашмя. Закрепите положение мухи прозрачной клейкой лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует специально построенной камеры, в которой мухи фиксируются, с головой капсулы доступны для открытия, и мухи в состоянии получить как запах стимуляции антенн и электрическим током для грудной клетки и ног (Рисунок 1). - Используя хирургическое лезвие скальпеля, закрепленное на скальпеле (см. Таблица Материалов),вырежьте окно в ленте вокруг головы мухи, оставляя антенны покрытыми и только переднюю большую часть грудной клетки подвергается.
- Окружите бока и затылок сине-световым лечащий клей, тщательно манипулируют с помощью булавки с насекомыми, удерживаемыми вогнутыми выпуклой челюстями. Установите клей с помощью синей светоизлучающей светодиодной лампы.
- Убедитесь, что клей полностью установлен и очистить любой остаточный незакаленный клей из торцевой поверхности мухи головы.
- Нанесите каплю раствора Ringer24 (см. таблицу материалов),чтобы покрыть открытые кутикулы головы.
- Используя очень тонколопастный нож, прорежьте кутикулу. Для наиболее эффективного удаления кутикулы, сначала вырезать через заднюю часть головы с помощью ocelli в качестве отправной точки. Затем, разрезать каждую сторону, медианный к глазам, чтобы сформировать лоскут кутикулы, которые могут быть легко оторваны с помощью щипцы.
- Удалите избыток кутикулы, которые могут блокировать область мозга интерес.
- Тщательно очистить тонкую поверхность любой трахеи с помощью тонких щипцы, избегая нарушения ткани мозга себя. Удалите и освежите решение Ringer24 (см. Таблица материалов),как это необходимо для очистки области тканевого мусора.
- Поместите иглу доставки подкожного запаха в положении, примерно 1 см от головы мухи. Убедитесь, что нет ничего, что может помешать доставке запаха к антеннам.
- На микроскоп, подключить камеру изображения к системе доставки запаха через подкожный запах доставки иглы.
- Чтобы позволить мухе полностью восстановиться после анестезии и хирургического вмешательства, а также адаптироваться к воздушному потоку, на данном этапе внедрить 10-минутный период отдыха.
3. In vivo изображения кальция
- Используйте мультифотонный микроскоп, оснащенный инфракрасным лазером и целью погружения воды (см. Таблица Материалов),установленный на вибрационно-изолированном столе. Для визуализации индикаторов кальция на основе GFP настройте лазер на длину волн 920 нм и установите фильтр диапазона GFP.
- Используя грубую ручку регулировки, сканировать через ось мозга и найти область мозга, представляющих интерес. Используйте функцию урожая, чтобы сфокусировать сканирование только на этой области, чтобы свести к минимуму время сканирования, и повернуть вид сканирования таким образом, чтобы передняя часть головы обращена вниз.
- Отрегулируйте размер кадра до 512 х 512 px, скорость сканирования до 4 Гц, и область сканирования (в измерении Y), так что нейроны, представляющие интерес покрыты.
4. Визуализация запаха вызванных кальция переходных через обонятельные кондиционирования
- Используйте систему доставки запаха19,26, которые могут доставить несколько стимулов запаха в временно точной манере.
- Используйте дополнительный компьютер для управления устройством, а также для связи с микроскопом изображений программного обеспечения для координации запаха стимуляции с захватом изображения во время экспериментов.
- Инициировать запрограммированный макропакет, способный увязывать программное обеспечение для приобретения изображений и программу доставки запаха (например, макропакет VBA, установленный в программном обеспечении для управления микроскопом, см. Таблица материалов),который реагирует на внешний входный триггер, предоставляемый инициационным протоколом доставки запаха в отдельной программе).
- Начните измерение путем мониторинга "предварительной подготовки" / наивный запах-вызванных кальция переходных с разрешением 512 х 512 р-н и частота кадров 4 Гц. Доставьте 2,5 s запах стимулом в окружении дополнительного приобретения изображения для 6,25 с предшествующим запахом начала (для создания F 0 базового значения) и 12,5 с после смещения запаха. Повторите это со вторым запахом, а затем с третьим запахом.
- Продолжить 3 мин после этого измерения с классическим кондиционирования ("обучение") летать.
- Выберите один из запахов, представленных в "предварительной подготовки" фазы, чтобы стать CSзапах, а другой, чтобы стать CS- запах. Представляем CSи запах с помощью управляемой компьютером системы доставки запаха для 60 с наряду с двенадцатью 90 V электрическим током.
- После 60-х годов перерыва, представить CS- запах только для 60 s. Использование в качестве одорантов 4-метилциклокексанол и 3-октанол. Не презентуйте третий одорант (например, 1-октен-3-ол) во время этого обучения, так как он используется в качестве контроля только до (шаг 4.2.) и после (шаг 4.4) фазы обучения.
- Измерьте "пост-обучение" запах вызвал кальция переходных снова, повторяя "предварительной подготовки" протокол стимуляции запаха (шаг 4.2.) 3 мин после окончания этапа обучения (шаг 4.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки этого шага должны отражать время интереса после формирования памяти (например, выполнить этот шаг 3-4 мин после шага кондиционирования для исследования кратковременной памяти). Как правило, мухи могут выжить в течение нескольких часов в этом препарате. - Сохранение файлов изображений в соответствующем формате (например, Tiff) для последующего анализа изображений.
5. Анализ изображений
- Для анализа изображений откройте Файлы Tiff (или аналогичные) в программном обеспечении для анализа изображений, таких как Fiji27.
- Выравнивать стеки с помощью алгоритма коррекции движения, чтобы обеспечить минимальное движение в направлениях X и Y. Откажитесь от любых записей, которые показывают сильное движение в оси.
- Выберите инструмент программного обеспечения, используемого для обозначения региона, интересуемого (ROI) вокруг области, которая должна быть изучена. Это должно быть максимально точным, чтобы ограничить влияние фоновой флуоресценции.
- Используйте соответствующий инструмент программного обеспечения для извлечения данных интенсивности височной флуоресценции в качестве файлов данных из выбранной рентабельности инвестиций, таким образом, что значение генерируется для каждого кадра записи.
- Откройте данные с помощью программы анализа данных для расчета значений QF/F0 для каждого следа запаха. F0 - средняя флуоресценция в 2 с до начала запаха. Разница между сырой флуоресценцией в данной раме и F0. Из этих значений вычислите значение F/F0 для каждого кадра, которое может быть построено на основе времени, чтобы отразить относительную флуоресценцию на протяжении всего периода стимулирования запаха.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример изображений, полученных с помощью вышеуказанного протокола, можно увидеть на рисунке 2. г Гомер-GCaMP3 выражается в МБ выход ногой нейрон, дендриты которого inendvate отсек 1 из MB-lobe (нейрон называется MVP228,29) и генетически ориентирована с помощью сплит-Gal4 линии MB1112C16. Также продемонстрирована разница в субклеточной локализации цитосолика и постсинаптически локализованного индикатора кальция. При сравнении рисунков 2a и Рисунок 2f, можно четко наблюдать специфическое, разобщенное выражение датчика dHomer-GCaMP314 - без выражения в аксональных отсеках нейрона, и пунктуированный сигнал видимый в дендритном отсеке. Ясно - хотя нижняя амплитуда - запах ответы можно увидеть в мух, выражающих dГомер-GCaMP3(Рисунок 2, нижние панели), по сравнению с мухами, выражающими цитосоликG GCaMP6f23 (Рисунок 2, верхние панели). Это свидетельствует о том, что инструмент эффективен для визуализации обонятельных реакций на уровне постсинапса, и, следовательно, обеспечивает дополнительную специфичность к изучению нейронных цепей, лежащих в основе, в данном случае, кодирования запаха и обонятельное обучение.
Пример последнего можно увидеть на рисунке 3. В этом эксперименте, dГомер-GCaMP3 выражается как на рисунке 2 - в грибном теле выход нейрона MVP2. Это нейрон, как известно, модулируется через обонятельное обучение таким образом, что пресинаптические депрессии в результате аверсивных обонятельных кондиционирования находит свое отражение в умерших postsynaptic ответ на обученный запах28,29 и здесь подтверждение этого результата показано с помощью этого протокола визуализации кальция in vivo. Следы кальция, показанные на рисунке 3, представляют собой образцовые данные одной отдельной мухи. Обратите внимание, что уровень шума и амплитуды могут варьироваться между отдельными препаратами (например, сравнить Рисунок 2e и рисунок 3c-e). Таким образом, внутри животных сравнение до- против после обучения обеспечивает способ учета межличностной изменчивости. Конечно, протокол подходит для передачи на визуализацию других нейронов, представляющих интерес.
Рисунок 1: Строительство монтажной камеры и подготовка мухи для визуализации. () Шаги для строительства летающей монтажной камеры. Основание состоит из стандартного слайда микроскопа (1), покрытого тонкой пластиковой сеткой (2). Два электрических провода, несущие противоположные заряды (3), приклеены к слайду с обеих сторон. Провода раздели и согнуты, чтобы пересечь слайд (4), идущий параллельно друг с другом, но не в контакте. Слои прозрачной клейкой ленты (5) добавляются до достижения высоты мухи (примерно 1 мм). Канал прорезается через ленту вертикально (6), примерно 1 мм в ширину, чтобы соответствовать ширине мухи. Повышенная платформа из прозрачной клейкой ленты (7) построена чуть выше электрических проводов, чтобы сформировать подушку для головы мухи в то время как грудная клетка находится на верхней части проводов. (б)Схематическая иллюстрация мухи, расположенной под двухфотоническим микроскопом. Стимуляция запаха достигается через подкожную иглу, расположенную перед головой мухи (вставляется через канал в ленте (6) и на верхней части платформы (7), чтобы направить запахи к антеннам). (c)-(h) Фиксация и открытие головки мухи. (с)Муха фиксированной внутри камеры изображения, внутри канала (Шкала бар 1 мм) и удерживается на месте свежий кусок ясноклейкой лентой в течение всей мухи. (d)Увеличенный вид мухи в положении. Шкала бар 0,1 мм. (e) Окно разрезается на ленту вокруг головы мухи. (f) Голова дополнительно фиксируется синим светло-лечащий клей. (g)Головная капсула покрыта раствором Ringer и открыта. (h)Завершена подготовка мозга с избытком ткани и трахеи (белая ткань, видимая в(г)удалена). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Постсинаптически локализованный кальций, визуализированный с помощью dHomer-GCaMP3. () Конфокальная микроскопия изображения, показывающие выражение цитосолически локализованных GCaMP6f (i) и постсинаптически локализованы dГомер-GCaMP3 (ii) в МБ выход нейрона MVP2. Зеленая стрелка указывает на субрегион No1 МБ и лоб. Шкала баров No 15 мкм. (б)-(д) Изображения, снятые с помощью двухфотон экзитации микроскопии генотипов выше, показывая in vivo флуоресценции соответствующих датчиков кальция. (b)F0 (базовая флуоресценция) изображения, продемонстрированный как средняя проекция интенсивности 2 s перед нарастанием запаха. Шкала баров 10 мкм.(с) Fзапах изображения (флуоресценция во время стимуляции запаха), продемонстрировали в качестве средней проекции интенсивности в течение периода реакции запаха (2,5 с). (г) Изображения, созданные путем вычитания изображения F0 из изображенияЗапаха F, чтобы показать фактический сигнал реакции запаха. (e) qF/F0 следы от вышеуказанных мух соответственно генотипов через стимуляцию запаха (серый адвокатский сословие). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обучение индуцированной postsynaptic пластичность визуализированы через dГомер-GCaMP3. ()Схема кондиционирования протоколов, используемых в этих экспериментах. Наивные реакции запаха, перед кондиционированием ("pre") измеряются в первую очередь. Затем каждая муха испытывает один из трех возможных протоколов кондиционирования: "Парный", где один запах (CS)в паре с электрическим током (США), а другой (CS- )не усиливается; "Odors только", где только запахи представлены, как без подкрепления, для контроля за запах воздействия эффектов; и "Только шоки", где только электрическим током представлены без каких-либо стимулов запаха, для контроля для воздействия шока эффектов. После этой фазы кондиционирования, мухи затем подвергаются "Pre" запахи снова для проверки на измененный запах вызванных деятельности ("Пост"). (b) Пример модуляции реакции запаха в результате парной презентации запаха/шока. Сильное подавление реакции на запах CSи можно увидеть в субрегионе No1 (пунктирная линия). (c)-(e) Следы реакции Odor от такой же мухи как в(b),показывая что это влияние подавления только наблюдается в случае натренированного запаха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вскрытие нейронной схемы, лежащей в основе обучения и памяти, является важной целью в области неврологии. Генетическая доступность дрозофилы и широта и простота поведенческого тестирования делают это идеальным инструментом для исследования таких явлений. Здесь представлен метод, с помощью которого можно визуализировать в пределах отдельных мух модуляцию, которая происходит на субклеточном уровне в результате обонятельного кондиционирования. Проводя как предтренировоую, так и послеобучаемую визуализацию динамики кальция, вызванной запахом, впервые установленной нашей группой17,можно провести прямое, внутриживотное сравнение между наивными и выученными реакциями запаха и, следовательно, изучить пластичность нейронов, представляющих интерес. Это дает преимущество этому протоколу по сравнению с массовыми оценками (используется в классическом обонятельном кондиционировании), поскольку состояния до и после обучения могут быть количественно оценены для отдельных лиц, что позволяет определить межличностные Изменчивость. Кроме того, процедура обучения, выполняемая непосредственно под микроскопом, во многом эквивалентна классической обонятельной парадигме, обычно используемой в поведенческих экспериментах, и не предполагает искусственной оптогенетической стимуляции нейронов. Конечно, обработка малых мух и тщательное открытие головной капсулы, не повреждая ткани мозга, сохраняя при этом органы чувств нетронутыми требует уровня знаний, которые могут быть получены путем тщательного и повторного обучения, не в отличие от степени видели в физиологические оценки, такие как электрофизиология.
Кроме того, продемонстрирована возможность использования локализованных индикаторов кальция для изучения пластичности на уровне одного нейрона, что добавляет большую точность рассечению нейрональной цепи. Это является примером, показывая обучение индуцированной депрессии postsynaptic ответ в хорошо расследованных МБ выход нейрона28,29. Дрозофилы штаммов, выражающих различные синаптически локализованных датчиков флуоресценции под контролем UAS доступны, например, выражая пресинаптически локализованный датчик Synaptophysin-GCaMP3 или красный флуоресцентный датчик синаптики передача Синаптофизическизин-pHTomato20. Конечно, разнообразие белков датчика флуоресценции может быть реализовано с помощью протокола, описанного выше.
Методы оптической визуализации в целом ограничены временным и пространственным разрешением системы приобретения микроскопических изображений (например, двухфотонным микроскопом) и временным разрешением самого датчика (например, кинетикой датчика кальция). Электрофизиологические записи, например, с использованием патч зажима электрофизиологии от соматы нейронов в мозге Дрозофилы, по-прежнему предлагают непревзойденное временное разрешение, но без предоставления какой-либо пространственной точности. Из-за специфичности экспрессии гена в интересующих нейронах нейронах в сочетании с субклеточной локализацией датчика, методы оптической визуализации потенциально могут дополнять электрофизиологические методы, чтобы раскрыть нейрональную пластичность, лежащую в основе обучения и формирования памяти. Непрерывный прогресс в развитии датчиков флуоресценции, возможно, даст возможность сплавить сенсорные белки с более быстрыми кинетиками или более высокими соотношениями сигнала к шуму (например, варианты GCaMP623) с синаптически локализованными белками как гГомер. Кроме того, последние достижения в создании микроскопических методов с более быстрыми темпами приобретения или более высокое пространственное разрешение окажется бесценным в дальнейшей тонкой настройки нашего подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Германским исследовательским советом через Совместный исследовательский центр SFB 889 "Механизмы сенсорной обработки" и научно-исследовательский отдел для 2705 "Рассечение цепи мозга: структура, пластичность и поведенческая функция Дрозофила Грибное тело»...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
- Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
- Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
- de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
- Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
- Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
- Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
- Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
- Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
- Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
- Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
