यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसके साथ Drosophila सीखने और स्मृति के संदर्भ में पूर्व और/या postsynaptic कैल्शियम कल्पना की जा सकती है. vivo कैल्शियम इमेजिंग में synaptically स्थानीयकृत कैल्शियम सेंसर का उपयोग कर एक शास्त्रीय घ्राण कंडीशनिंग प्रतिमान इस तरह है कि synaptic प्लास्टिक साहचर्य सीखने के इस प्रकार अंतर्निहित निर्धारित किया जा सकता है के साथ संयुक्त है.
कई मॉडल जीवों में अनुसंधान के दशकों synaptic प्लास्टिक की वर्तमान अवधारणा के लिए नेतृत्व किया है सीखने और स्मृति गठन अंतर्निहित. synaptic संचरण में सीखने प्रेरित परिवर्तन अक्सर कई न्यूरॉन्स और मस्तिष्क में प्रसंस्करण के स्तर में वितरित कर रहे हैं. इसलिए, न्यूरॉन्स भर में सीखने पर निर्भर synaptic प्लास्टिक कल्पना करने के लिए तरीकों की जरूरत है. फल मक्खी Drosophila मेलेनोगैस्टर एक विशेष रूप से अनुकूल मॉडल जीव न्यूरॉन सर्किट अंतर्निहित सीखने का अध्ययन करने के लिए प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक तरीका है जिसमें साहचर्य घ्राण यादों के गठन अंतर्निहित प्रक्रियाओं को दर्शाता है, यानी, synaptic गतिविधि और उनके परिवर्तन, vivo में नजर रखी जा सकती है. Drosophilaमें उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की व्यापक सरणी का उपयोग करना, यह विशेष रूप से निर्धारित सेल आबादी और यहां तक कि एकल कोशिकाओं में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों व्यक्त करने के लिए संभव है. जगह में एक मक्खी फिक्सिंग, और सिर कैप्सूल खोलने से, यह घ्राण उत्तेजनाओं पहुंचाने whilst इन कोशिकाओं में कैल्शियम गतिशीलता कल्पना करने के लिए संभव है. इसके अतिरिक्त, हम एक सेट-अप प्रदर्शित करते हैं जिसमें मक्खी को एक साथ शरीर में बिजली के झटके के अधीन किया जा सकता है। यह एक प्रणाली है जिसमें मक्खियों शास्त्रीय घ्राण कंडीशनिंग से गुजरना कर सकते हैं प्रदान करता है – जिससे एक पहले भोले गंध बिजली के झटके सजा के साथ जुड़े होना सीखा है – इस गंध के प्रतिनिधित्व के रूप में एक ही समय में (और अन्य अप्रशिक्षित गंध) है दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मस्तिष्क में मनाया जाता है। हमारी प्रयोगशाला पहले synaptically स्थानीयकृत कैल्शियम सेंसर की पीढ़ी की सूचना दी है, जो एक पूर्व या postsynaptic डिब्बों के लिए फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतों को सीमित करने के लिए सक्षम बनाता है. दो-फोटोमाइक्रोस्कोपी स्थानिक रूप से ठीक संरचनाओं को हल करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है। हम मशरूम शरीर, कीट मस्तिष्क के एक उच्च आदेश केंद्र से जानकारी को एकीकृत न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित करके इस उदाहरण. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स जिनकी गतिविधि घ्राण सीखने का एक परिणाम के रूप में संग्राहक है के बीच synaptic कनेक्शन की जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करता है.
सीखने के माध्यम से मस्तिष्क में जानकारी कहाँ और कैसे प्राप्त की जाती है और बाद में स्मृति के रूप में संग्रहीत करने से तंत्रिका विज्ञान1में सबसे चुनौतीपूर्ण कार्यों में से एक का गठन होता है . तंत्रिका वैज्ञानिक अनुसंधान ने संग्रथित संचरण में परिवर्तन की अवधारणा को तंत्रिका उपस्तर के रूप में अभिनन्दन के रूप में लिया है जो सीखने और स्मृति निर्माण2,3को रेखांकित करता है . यह hypothesized है कि, सीखने के दौरान, न्यूरोनल पहनावा है कि एक उत्तेजना की धारणा के दौरान सक्रिय हैं के बीच synaptic कनेक्शन इस तरह संशोधित हो गया है कि उनके संयुक्त गतिविधि पैटर्न स्मृति याद के दौरान प्राप्त किया जा सकता है, जिससे निर्देश भविष्य व्यवहार कार्रवाई4| ये “एनग्राम कोशिकाओं” और उनके synapses अक्सर मस्तिष्क क्षेत्रों और प्रसंस्करण के स्तर में वितरित कर रहे हैं, जो यह मुश्किल एक कार्य या एक उत्तेजना के सीखने के लिए synaptic संचरण में मनाया परिवर्तन आवंटित करने के लिए बनाता है. स्थानीयऔर उन synaptic परिवर्तन है कि कारण एक विशिष्ट सीखने के कार्य से जुड़े हुए हैं कल्पना करने के लिए एक एक उचित मॉडल प्रणाली है कि ठीक उन synapses सीमित करने के लिए अनुमति देता है की जरूरत है.
इस तरह के एक प्रयास के लिए, Drosophila melanogaster विशेष रूप से उपयुक्त है क्योंकि यह रिश्तेदार मस्तिष्क सादगी, व्यवहार समृद्धि, और प्रयोगात्मक पहुंच को जोड़ती है. अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीवों में, Drosophila सूत्रकृमि सी elegans और आनुवंशिक रूप से पथ्य स्तनधारियों के बीच न्यूरोनल जटिलता के संदर्भ में चूहों की तरह स्थित है. न्यूरॉन्स की स्टीरियोटाइप संख्या ($300) और सीमित व्यवहार प्रदर्शनों की सूची सी एलिगोंमें मनाया जाता है। Mammals, दूसरी ओर, न्यूरॉन्स और चौंका देने वाला व्यवहार जटिलता के लाखों है. फल मक्खी के मस्तिष्क है, इसके साथ $100,000, न्यूरॉन्स काफी सबसे कशेरुकियों के दिमाग की तुलना में छोटे, और न्यूरॉन्स के कई व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य हैं5. फिर भी, Drosophila जटिल व्यवहार की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का प्रदर्शन, मजबूत साहचर्य घ्राण सीखने और स्मृति गठन प्रदर्शन करने की क्षमता सहित, पहले 40 साल पहले6पर वर्णित . इस शास्त्रीय कंडीशनिंग प्रक्रिया के दौरान, मक्खियों के समूहों को वातानुकूलित उद्दीपक (सीएस+) के रूप में गंध के अधीन किया जाता है, जबकि उन्हें अप्रतिबंधित उद्दीपक (यूएस) के रूप में एक दण्डित विद्युत आघात प्राप्त होता है। एक दूसरी गंध (सीएस–) तो किसी भी सजा के बिना प्रस्तुत किया जाता है. इस तरह, जानवरों को सजा है, जो दो odors, सीएस+ और सीएस–के बीच एक बाद की पसंद की स्थिति में परीक्षण किया जा सकता है के साथ जुड़े गंध से बचने के लिए सीख लो. Drosophila में इस व्यवहार अंतर्निहित न्यूरॉन सब्सट्रेट विच्छेदन पर काम “एनग्राम”7,8,9,10 के प्राथमिक साइट के रूप में मशरूम निकायों (एमबी) की पहचान की है और, इसलिए, इस मस्तिष्क क्षेत्र के circuitry था और गहन अनुसंधान का विषय है जिसके द्वारा एक स्मृति engram अधिग्रहण और संग्रहीत है तर्क को उजागर करने के लिए (हाल ही में11में समीक्षा की,12).
Drosophila एमबी गोलार्द्ध प्रति 2,000 आंतरिक न्यूरॉन्स (Kenyon कोशिकाओं) के होते हैं, समानांतर axonal अनुमानों13में आयोजित . घ्राण प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के Axons पार्श्व protocerebra करने के लिए और एमबी calyces करने के लिए बढ़ा रहे हैं, एमबी के मुख्य डेन्ड्रिटिक इनपुट साइट और एंटीनाल लोब से घ्राण इनपुट प्राप्त करते हैं. केनियन कोशिकाओं का लंबा, समानांतर एक्सॉन बंडल पेंडकल और लोब का गठन करता है। अधिकांश केनिऑन कोशिकाएँ मस्तिष्क की मध्य रेखा की ओर एक संपार्श्विक का विस्तार करके क्षैतिज र्ण्ड/-लोब बनाने में विभाजित होती हैं, तथा पृष्ठीय-पूर्व दिशा में दूसरी संपार्श्विक प्रक्षेपित करके ऊर्ध्वाधर र्/ केनयॉन कोशिकाओं का अन्य समूह एमबी के क्षैतिज – लोब13 का निर्माण करता है जहां अधिगम प्रक्रिया और बाद में अल्पकालिक स्मृति निर्माण कोस्थानीयकृतकिया जा सकता है। एमबी लोबों में अफर इनपुट प्राप्त होता है और उत्कश निर्गत प्रदान करता है, दोनों आम तौर पर केनियन सेल एक्सॉन14,15,16के साथ अलग-अलग कंपार्टमेंटल उप-क्षेत्रों तक सीमित होते हैं। विशेष रूप से, afferent dopaminergic एमबी इनपुट न्यूरॉन्स मूल्य आधारित मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है, उदाहरण के लिए, दंडात्मक, साहचर्य घ्राण सीखने में प्रभाव मजबूत15,17. मशरूम शरीर lobes से त्रिविशात्मक और व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य efferent एमबी उत्पादन न्यूरॉन्स Kenyon कोशिकाओं की बड़ी संख्या में जानकारी एकीकृत, लक्ष्य विविध मस्तिष्क क्षेत्रों और भालू व्यवहार-अनुदेशक appetitive या versive जानकारी15 . इस न्यूरॉन वास्तुकला साहचर्य engram के संगठन की एक अवधारणा के लिए नेतृत्व किया गया है. Odors अपेक्षाकृत ठीक Kenyon कोशिकाओं के विरल सक्रिय पहनावा द्वारा इनकोडिंग कर रहे हैं. इन Kenyon सेल पहनावा और डोपामाइन की रिहाई की संयोग गतिविधि – उत्तेजनाओं को दंडित करके पैदा – MB उत्पादन न्यूरॉन्स पर Kenyon सेल presynapses से संचरण modulates इस तरह है कि जानवरों को बाद में इस विशेष गंध से बचना होगा10 ,12. हम यह बल्कि ठीक से परिभाषित और एक प्रतिमानात्मक मामले के रूप में स्थानीयकृत engram का उपयोग करने के लिए वर्णन कैसे synaptic गतिविधि में इन सीखने पर निर्भर परिवर्तन निर्धारित किया जा सकता है और निगरानी.
एक मॉडल प्रणाली के रूप में Drosophila का मूल्य एक की पहचान करने के लिए transgenes व्यक्त करने की अनुमति देता है बेजोड़ आनुवंशिक उपकरण बॉक्स पर दृढ़ता से निर्भर करता है, निगरानी, और जटिल सर्किट के भीतर एकल न्यूरॉन्स को नियंत्रित18. न्यूरॉन गतिविधि निगरानी के लिए तकनीक के आगमन – जैसे कैल्शियम इमेजिंग, यहाँ चर्चा – एक विशिष्ट उत्तेजना के जवाब में न्यूरॉन गतिविधि पैटर्न के निर्धारण के लिए अनुमति दी है. घ्राण उत्तेजना के साथ आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों (GECIs) की विशिष्ट Gal4-चालित अभिव्यक्ति के संयोजन से, एक ब्याज19के न्यूरॉन्स की गंध-evoked कैल्शियम गतिशीलता कल्पना कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, यह दिखाया गया है कि आगे एक शास्त्रीय कंडीशनिंग प्रतिमान के साथ इस तकनीक युग्मन द्वारा, यह सीखने के संदर्भ में इन घ्राण प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए संभव है. सीखने प्रेरित plasticity आगे GECIs कि न केवल एक विशिष्ट न्यूरॉन के लिए स्थानीयकृत कर रहे हैं का उपयोग कर विच्छेदन किया जा सकता है, लेकिन यह भी एक न्यूरॉन के विशिष्ट subcompartments के लिए. Pech एट अल20 उपकरण है कि वास्तव में यह अनुमति की एक चयन की स्थापना की. GCaMP321 को लक्षित करके या तो पूर्व या postsynapse के लिए – कशेरुकी Synaptophysin या डीहोमर के लिए लिंकेज के माध्यम से, क्रमशः20– इन साइटों के अंतर मॉडुलन प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इस स्थानीयकरण प्रदान करता है, इस संदर्भ में, सबसे GECIs है कि cytosol भर में सर्वव्यापी मौजूद हैं पर एक लाभ – उदाहरण के लिए, GCaMP22, GCaMP321, या GCaMP623 – क्योंकि इसका मतलब है कि पूर्व और पदों ynaptic परिवर्तनों हो सकता है समग्र एकीकृत कैल्शियम प्रवाह है कि न्यूरॉन सक्रियण का एक परिणाम के रूप में होता है से प्रतिष्ठित. यह स्थान और plasticity के प्रकार है कि का एक परिणाम के रूप में होते हैं या कि सीखने और स्मृति गठन के कारण के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं. एक उदाहरण के रूप में, यहाँ प्रदान की प्रोटोकॉल केवल postsynapse करने के लिए कैल्शियम सेंसर की अभिव्यक्ति को लक्षित करके घ्राण साहचर्य सीखने के दौरान एमबी उत्पादन न्यूरॉन्स के मॉडुलन को समझने में इस उपकरण के मूल्य से पता चलता है. निगरानी करके, एक व्यक्ति मक्खी के भीतर, गंध से पहले और घ्राण कंडीशनिंग के बाद गतिविधि evoked एक सीधा तुलना एक भोले गंध प्रतिक्रिया और एक सीखा गंध प्रतिक्रिया के बीच तैयार किया जा सकता है. एक ही इमेजिंग कक्ष में तय Whilst, मक्खियों odors के चयन के संपर्क में हैं. फिर, वे एक प्रतिकूल साहचर्य कंडीशनिंग प्रोटोकॉल जिसमें इन odors में से एक बिजली के झटके के साथ जोड़ा जाता है प्राप्त (सीएस+बनने ) और एक और गंध सुदृढीकरण के बिना प्रस्तुत किया जाता है (सीएसबनने -). अंत में, मक्खियों फिर से पहले कदम में के रूप में एक ही odors को उजागर कर रहे हैं. कैल्शियम गतिशीलता दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया जाता है।
तंत्रिका circuitry अंतर्निहित सीखने और स्मृति के विच्छेदन तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक प्रमुख लक्ष्य है. Drosophila की आनुवंशिक पहुंच और व्यापकता और व्यवहार परीक्षण की आसानी इस तरह की घटनाओं की जांच करन?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र SFB 889 के माध्यम से जर्मन अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था “संवेदी प्रसंस्करण के तंत्र” और अनुसंधान इकाई के लिए 2705 “एक मस्तिष्क सर्किट के विच्छेदन: संरचना, प्लास्टिक और व्यवहार समारोह के Drosophila मशरूम शरीर”.
1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
Hypodermic needle | Sterican – B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |