Summary
نقدم هنا البروتوكول الذي يمكن تصوره قبل و/أو الكالسيوم بعد المتشابك في سياق التعلم والذاكرة دروفيفيا . في صور الكالسيوم المجرية باستخدام حساسات الكالسيوم المترجمة بالمشبك يتم الجمع بينها وبين النموذج الكلاسيكي لتكييف حاسة الشم بحيث يمكن تحديد اللدونة المتشابكة الكامنة وراء هذا النوع من التعلم النقابي.
Abstract
عقود من البحوث في العديد من الكائنات الحية النموذجية أدت إلى المفهوم الحالي للدونة متشابك الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة. وغالبا ما يتم توزيع التغييرات الناجمة عن التعلم في انتقال متشابك عبر العديد من الخلايا العصبية ومستويات المعالجة في الدماغ. ولذلك ، هناك حاجه إلى أساليب لتصور اللدونة متشابك تعتمد علي التعلم عبر الخلايا العصبية. وتمثل ذبابه الفاكهة الصباغية الحية نموذجا مناسبا لدراسة الدوائر العصبية الكامنة وراء التعلم. البروتوكول المعروض هنا يوضح الطريقة التي العمليات الكامنة وراء تشكيل الذكريات الشميه النقابية ، اي النشاط متشابك وتغييراتها ، يمكن رصدها في الجسم المجري. باستخدام المجموعة الواسعة من الاداات الجينية المتوفرة في دروفيسيلا، من الممكن التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا في مجموعات الخلايا المحددة وحتى الخلايا المفردة. من خلال إصلاح ذبابه في مكان ، وفتح كبسوله الراس ، فمن الممكن لتصور ديناميات الكالسيوم في هذه الخلايا في حين تقديم المحفزات حاسة الشم. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نثبت وجود اعداد يمكن ان يتعرض فيه الذبابة ، في الوقت نفسه ، للصدمات الكهربائية في الجسم. وهذا يوفر نظام الذباب التي يمكن ان تخضع لتكييف حاسة الشم الكلاسيكية-حيث يتم تعلم رائحة ساذجه سابقا ان تترافق مع عقوبة الصدمة الكهربائية-في نفس الوقت مثل تمثيل هذه الرائحة (وغيرها من الروائح غير المدربة) هو لوحظ في الدماغ عن طريق المجهر اثنين من الفوتون. وقد ابلغ مختبرنا في السابق عن توليد أجهزه استشعار الكالسيوم المترجمة بالمشبك ، والتي تمكن المرء من حصر إشارات الكالسيوم الفلورية في مقصورات ما قبل أو بعد المتشابك. يوفر المجهر ثنائي الفوتون وسيله لحل الهياكل الدقيقة مكانيا. ونحن مثال علي ذلك من خلال التركيز علي الخلايا العصبية دمج المعلومات من الجسم الفطر, مركز النظام اعلي من الدماغ الحشرات. عموما ، يوفر هذا البروتوكول طريقه لفحص الاتصالات متشابك بين الخلايا العصبية التي يتم التضمين نشاطها نتيجة للتعلم حاسة الشم.
Introduction
فك رموز أين وكيف يتم الحصول علي المعلومات في الدماغ من خلال التعلم وتخزينها فيما بعد كذاكره تشكل واحده من المهام الأكثر تحديا في علم الأعصاب1. [نيوروسكينتيفيك] البحوث قد أدت إلى مفهوم التغيير في انتقال متشابك كما الركيزة العصبية التي تكمن وراء التعلم وتكوين الذاكرة2,3. ومن المفترض انه ، اثناء التعلم ، والاتصالات متشابك بين الفرق العصبية التي تنشط خلال التصور من التحفيز يصبح تعديلها بحيث يمكن استردادها نمط النشاط مجتمعه خلال استدعاء الذاكرة ، التالي يامر العمل السلوكي في المستقبل4. وغالبا ما يتم توزيع هذه "الخلايا engram" والمشابك العصبية الخاصة بهم عبر مناطق الدماغ ومستويات المعالجة ، مما يجعل من الصعب تعيين التغييرات الملحوظة في الإرسال المتشابك إلى تعلم مهمة أو محفز. لتعريب وتصور تلك التغييرات متشابك التي ترتبط بشكل سببي لمهمة تعليمية معينه واحده يحتاج إلى نظام النموذج المناسب الذي يسمح لحصر تلك الاشتباكات العصبية بدقه.
ولمثل هذا المسعى ، فان الوحمة الصباغية هي مناسبه بشكل خاص لأنها تجمع بين البساطة النسبية للدماغ ، والثراء السلوكي ، وامكانيه الوصول التجريبية. ومن بين الكائنات الحية النموذجية الراسخة ، تقع دروفيبيلا بين الديدان الخيطية c. ايلينيسيس والثدييات العريكته وراثيا مثل الفئران من حيث تعقيد الخلايا العصبية. لوحظ عدد نمطي من الخلايا العصبية (~ 300) والذخيرة السلوكية محدوده في c. اليجنس. الثدييات ، من ناحية أخرى ، لديها الملايين من الخلايا العصبية والتعقيد السلوكي المذهل. الدماغ من ذبابه الفاكهة هو ، مع لها ~ 100,000 ، الخلايا العصبية أصغر بكثير من أدمغه معظم الفقاريات ، والعديد من الخلايا العصبية التي يمكن التعرف عليها بشكل فردي5. ومع ذلك ، تعرض دروفيسيلا طيفا واسعا من السلوكيات المعقدة ، بما في ذلك القدرة علي إظهار التعلم الشمي النقابي القوي وتكوين الذاكرة ، والتي تم وصفها لأول مره منذ 40 سنه6. في سياق هذا الاجراء تكييف الكلاسيكية ، وتخضع مجموعات من الذباب إلى رائحة كما التحفيز المشروط (CS +) في حين انها تتلقي صدمه كهربائيه معاقبه كحافز غير مشروط (الولايات الامريكيه). ثم تعرض الرائحة الثانية (CS-) دون اي عقاب. التالي ، تعلم الحيوانية لتجنب رائحة المرتبطة العقاب ، والتي يمكن اختبارها في حاله اختيار اللاحقة بين الروائح اثنين ،cs + و cs-. العمل علي تشريح الركيزة العصبية الكامنة وراء هذا السلوك في دروكوفيلا وقد حددت جثث الفطر (MB) كموقع الرئيسي لل "engram"7,8,9,10 ولذلك ، كانت دوائر هذه المنطقة الدماغ وهو موضوع البحوث المكثفة من أجل الكشف عن المنطق الذي يتم الحصول علي الذاكرة انغرام وتخزينها (استعرضت مؤخرا في11،12).
تتكون المكونات من الخلايا العصبية الذاتية من 2,000 تقريبا (كريات كينيون) في نصف الكره الارضيه ، ويتم تنظيمها بالتوازي مع إسقاطات محواري13. يتم توسيع axons من الخلايا العصبية الإسقاط حاسة الشم إلى البروتوسيريبرا الجانبية والي calyces ميغابايت, موقع الإدخال الرئيسية الشجيرية من ميغابايت وتلقي المدخلات حاسة الشم من الفصوص الهوائية. تشكل المجموعة الطويلة والمتوازية من خلايا كينيون العم المتجول والفصوص. معظم خلايا كينيون تشكيل الأفقي β/الفصوص من خلال تمديد ضمان واحد نحو خط الوسط من الدماغ ، والعمودي α/α'-فصوص عن طريق تمديد الجانبية الثانية إسقاط في الاتجاه الظهري الامامي. يشكل الأخرى مجموعه من [كينيون] خلايا ال [γ-فصوص] أفقيه13 من ال [مب] حيث ال يعلم عمليه ولاحقه [شورت-ترم] ذاكره تشكيل استطاع كنت مترجمه10. الفصوص ميغابايت تلقي المدخلات الزبائ وتوفير الناتج افيرينت ، وكلاهما يقتصر عاده علي المناطق الفرعية مجزا متميزة علي طول الخلية كينيون محاور14،15،16. وعلي وجه الخصوص, وقد ثبت الخلايا العصبية الإدخال MB المدخلات التي تتوسط القيمة, علي سبيل المثال, العقابية, تعزيز الآثار في التعلم حاسة الشم النقابي15,17. نمطي والخلايا العصبية الناتجة افيرينت MB التي يمكن التعرف عليها بشكل فردي من فصوص الجسم الفطر دمج المعلومات عبر اعداد كبيره من الخلايا Kenyon ، واستهداف مناطق الدماغ المتنوعة وتحمل السلوك--مفيده المعلومات الايجابيه أو افئيه15 . وقد ادي هذا العمارة العصبية إلى مفهوم تنظيم engram النقابي. يتم ترميز الروائح بدقه نسبيا من قبل الفرق القليلة التنشيط من خلايا كينيون. النشاط المتزامن لهذه الفرق الخلية كينيون والإفراج عن الدوبامين التي اثارها معاقبه المحفزات-ينظم انتقال من الخلية كينيون presynapses علي الخلايا العصبية إخراج ميغابايت من هذا القبيل ان الكائنات سوف تجنب في وقت لاحق هذه الرائحة خاصه10 ،12. نحن نستخدم هذا بدقه محدده والمترجمة انغرام كحاله نموذجيه لتوضيح كيف يمكن تحديد هذه التغييرات المعتمدة علي التعلم في النشاط متشابك ورصدها.
تعتمد قيمه دروفيبيلا كنظام نموذجي بقوة علي الاداات الوراثية التي لا مثيل لها والتي تسمح لأحد بالتعبير عن الجينات للتعرف علي الخلايا العصبية الواحدة ومراقبتها والتحكم فيها داخل الدوائر المعقدة18. ظهور تقنيات لرصد نشاط الخلايا العصبية-مثل التصوير الكالسيوم ، وناقش هنا-وقد سمح لتحديد أنماط النشاط العصبية استجابه لتحفيز محدده. من خلال الجمع بين التعبير Gal4 محدده من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (جيكيس) مع التحفيز حاسة الشم ، يمكن للمرء ان تصور ديناميات الكالسيوم التي أثارت رائحة الخلايا العصبية من الفائدة19. في هذا البروتوكول ، يظهر انه من خلال اقتران هذه التقنية مع نموذج التكييف الكلاسيكي ، من الممكن فحص هذه الاستجابات الشميه في سياق التعلم. اللدونة التي يسببها التعلم يمكن تشريحها باستخدام جيكليس فقط المترجمة إلى الخلايا العصبية محدده واحده ، ولكن أيضا إلى مقصورات فرعيه معينه من الخلايا العصبية. Pech et al.20 إنشات مجموعه مختاره من الاداات التي تسمح بالبالضبط هذا. من خلال استهداف GCaMP321 اما قبل أو بعد المشبك-عن طريق الربط إلى فقاري سينابتوفيسين أو dهوميروس ، علي التوالي20-يمكن تمييز التحوير التفاضلي لهذه المواقع. هذا التعريب يضفي ، في هذا السياق ، ميزه علي معظم جيليس التي هي موجودة بشكل مطلق في جميع انحاء عصارة-علي سبيل المثال ، gcamp22، GCaMP321، أو GCaMP623 -لأنه يعني ان العابرين قبل و بوستسينابتيك يمكن ان يكون متميزة عن تدفق الكالسيوم المتكامل الشامل الذي يحدث نتيجة لتنشيط الخلايا العصبية. وهذا يمكن ان توفر أدله حول الموقع وأنواع اللدونة التي تحدث نتيجة أو التي تسبب التعلم وتكوين الذاكرة. علي سبيل المثال ، البروتوكول المقدم هنا يظهر قيمه هذه الاداه في فك رموز التحوير من الخلايا العصبية الناتج MB خلال التعلم النقابي حاسة الشم عن طريق استهداف التعبير من مستشعر الكالسيوم إلى ما بعد المشبك فقط. عن طريق الرصد ، داخل ذبابه الفردية ، والنشاط اثار رائحة قبل وبعد تكييف حاسة الشم يمكن رسمها مقارنه مباشره بين استجابه رائحة ساذجه واستجابه رائحة المستفادة. بينما الثابتة في نفس غرفه التصوير ، ويتعرض الذباب لمجموعه مختاره من الروائح. ثم ، فانها تتلقي بروتوكول تكييف النقابي مكره فيها واحده من هذه الروائح يقترن مع صدمه كهربائيه (تصبحcs +) ويتم تقديم رائحة أخرى دون تعزيز (تصبح cs-). وأخيرا ، يتعرض الذباب مره أخرى لنفس الروائح كما هو الحال في الخطوة الاولي. ويلاحظ ديناميات الكالسيوم باستخدام اثنين من الفوتون المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- ذبابه الفاكهة المحورة وراثيا
- عبور الإناث العذراء والذباب الذكور (التي أثيرت في 25 درجه مئوية في 60 ٪ الرطوبة النسبية علي 12 ساعة الضوء/الظلام) تحمل المطلوب Gal4 و UAS يبني25، علي التوالي ، لإنتاج الذباب التي الخلايا العصبية محدده من الفائدة التعبير عن المشفرة وراثيا مؤشر الكالسيوم.
- عمر النسل انثويه من ال أعلاه صليب حتى هم في المدى من 3-6 أيام [بوست-اكلوسيون]. الذباب الإناث هي الأفضل بسبب حجمها أكبر قليلا.
2. اعداد ذبابه الفاكهة لتصوير الكالسيوم في الجسم المجري
- اختيار ذبابه واحده الإناث وتخدير علي الجليد لمده لا تزيد عن 5 دقيقه.
- باستخدام ملقط دقيق ، ضع الذبابة في غرفه التصوير (الموضحة في الشكل 1ج). ضمان الصدر والساقيين علي اتصال مع الأسلاك الكهربائية في الجزء السفلي من الغرفة وان الراس يضع شقه. إصلاح موقف ذبابه باستخدام شريط لاصق واضح.
ملاحظه: يتطلب هذا البروتوكول غرفه مبنيه خصيصا حيث يتم إصلاح الذباب ، مع كبسوله الراس التي يمكن الوصول اليها لفتح ، والذباب قادره علي الحصول علي كل من التحفيز الروائح إلى الهوائيات والصدمات الكهربائية إلى الصدر والساقيين (الشكل 1). - باستخدام شفره مشرط الجراحية الثابتة علي مقبض مشرط (انظر جدول المواد) ، وقطع نافذه في الشريط حول راس ذبابه ، وترك الهوائيات مغطاه وفقط الجزء الامامي-معظم الصدر المكشوفة.
- تحيط الجانبين والظهر من الراس مع الغراء علاج الضوء الأزرق ، والتلاعب بعناية باستخدام دبوس الحشرات التي تحتفظ بها الفكين مقعر محدب. تعيين الغراء باستخدام مصباح LED الأزرق الباعث علي الضوء.
- تحقق من ان يتم تعيين الغراء تماما ومسح اي الغراء غير تصلب المتبقية من السطح الظهري للراس يطير.
- تطبيق قطره من الحل الرنين24 (انظر جدول المواد) لتغطيه اهاب المكشوفة من الراس.
- باستخدام سكين طعنه ناعمه جدا ، وقطع من خلال اهاب. لأزاله الأكثر كفاءه للبشرة ، أولا قطع عبر الخلفي من الراس باستخدام العنكبوتي كنقطه انطلاق. ثم ، وقطع كل جانب ، الإنسي إلى العينين ، لتشكيل رفرف من اهاب التي يمكن ان تمزق بسهوله قباله باستخدام ملقط.
- أزاله اي اهاب الزائدة التي قد تسد منطقه الدماغ من الفائدة.
- مسح بعناية السطح الظهري لأي القصبة الهوائية باستخدام ملقط غرامه ، وتجنب تعطيل انسجه المخ نفسها. أزاله وتحديث الحل الرنين24 (انظر جدول المواد) كما هو مطلوب لمسح منطقه الحطام الانسجه.
- ضع ابره تسليم الروائح الكريهة في الموضع ، حوالي 1 سم من راس الذبابة. تاكد من انه لا يوجد شيء يمكن ان يعيق تسليم الروائح إلى الهوائيات.
- في المجهر ، قم بتوصيل غرفه التصوير إلى نظام تسليم الروائح عن طريق ابره تسليم الرائحة تحت الجلد.
- للسماح للطيران للتعافي تماما من التخدير والجراحة ، والتكيف مع تدفق الهواء ، وتنفيذ 10 دقيقه فتره راحة في هذه المرحلة.
3. في الجسم الصور الكالسيوم
- استخدام مجهر متعدد الفوتونات مجهزه ليزر الاشعه تحت الحمراء والغمر المياه الهدف (انظر جدول المواد) ، المثبتة علي طاوله الاهتزاز معزولة. لتصور مؤشرات الكالسيوم المستندة إلى GFP ، اضبط الليزر علي موجه أثاره من 920 نانومتر وقم بتثبيت فلتر تمرير النطاق GFP.
- باستخدام مقبض التعديل Z الخشنة ، والمسح الضوئي من خلال محور Z من الدماغ وتحديد منطقه الدماغ من الفائدة. استخدم وظيفة الاقتصاص للتركيز علي المسح الضوئي علي هذه المنطقة فقط لتقليل وقت المسح الضوئي ، ولتدوير عرض المسح الضوئي بحيث يواجه الراس الامامي للأسفل.
- ضبط حجم الإطار إلى 512 x 512 px ، سرعه المسح الضوئي ل> 4 هرتز ، ومسح المنطقة (في البعد Y) بحيث يتم تغطيه الخلايا العصبية من الفائدة.
4. التصور من العابرة رائحة الكالسيوم من خلال تكييف حاسة الشم
- استخدام نظام تسليم رائحة19،26 التي يمكن ان توفر العديد من المحفزات رائحة بطريقه دقيقه وقتيا.
- استخدم كمبيوتر إضافي للتحكم في الجهاز ، وللتواصل مع برنامج المجهر التصويري لتنسيق عمليات تحفيز الروائح مع التقاط الصور اثناء التجارب.
- بدء حزمه ماكرو مبرمجه مسبقا قادره علي ربط برنامج الحصول علي الصور وبرنامج تسليم الروائح (علي سبيل المثال ، حزمه ماكرو VBA المثبتة في برنامج التحكم في المجهر ، انظر جدول المواد) الذي يستجيب لمدخل خارجي الزناد المقدمة من قبل البدء في بروتوكول تسليم رائحة في برنامج منفصل).
- بدء القياس عن طريق رصد "ما قبل التدريب"/الساذجة التي أثارت رائحة الكالسيوم العابرين في قرار من 512 x 512 px ومعدل الإطار من 4 هرتز. تقديم حافز الرائحة 2.5 s يحيط بها اكتساب صوره اضافيه ل 6.25 s السابقة رائحة بداية (لإنشاء F 0 قيمه الأساس) و 12.5 s بعد أزاحه الرائحة. كرر هذا مع العطر الثاني ثم مع الثالثة.
- مواصله 3 دقائق بعد هذا القياس مع تكييف الكلاسيكية ("التدريب") ذبابه.
- حدد واحده من الروائح المقدمة في مرحله "ما قبل التدريب" لتصبحcs + رائحة واخر لتصبح cs- رائحة. تقديمCS + رائحة باستخدام نظام التحكم بالرائحة التي تسيطر عليها الكمبيوتر ل60 s إلى جانب الصدمات الكهربائية 12 90 V.
- بعد كسر 60 s ، وتقديم CS- رائحة وحدها ل 60 s. استخدام كالمبيدات 4-ميثيلسيكلوهيكانول و 3-اوكتانول. لا تقدم الثالثة العطرة (علي سبيل المثال ، 1-octen-3-ol) خلال هذا التدريب كما يتم استخدامه كعنصر تحكم فقط قبل (الخطوة 4.2.) وبعد (الخطوة 4.4) مرحله التدريب.
- قياس "مرحله ما بعد التدريب" اثار الكالسيوم التي أثارت رائحة مره أخرى عن طريق تكرار "ما قبل التدريب" بروتوكول تحفيز الروائح (الخطوة 4.2.) 3 دقائق بعد الانتهاء من مرحله التدريب (الخطوة 4.3).
ملاحظه: يجب ان يعكس توقيت هذه الخطوة وقت الاهتمام بعد تكوين الذاكرة (علي سبيل المثال ، تنفيذ هذه الخطوة 3-4 دقيقه بعد خطوه التكييف للتحقيق في الذاكرة علي المدى القصير). عاده ، يمكن البقاء علي قيد الحياة الذباب لعده ساعات في هذا الاعداد. - احفظ ملفات الصور بتنسيق مناسب (علي سبيل المثال ، Tiff) لتحليل الصور لاحقا.
5-تحليل الصور
- لتحليل الصور ، افتح ملفات Tiff (أو ما شابه) في برنامج تحليل الصور مثل فيجي27.
- محاذاة المكدسات باستخدام خوارزميه تصحيح الحركة لضمان الحد الأدنى من الحركة في الاتجاهين X و Y. تجاهل اي تسجيلات تظهر حركه قويه في المحور Z.
- حدد أداه البرنامج المستخدمة لوضع علامة علي منطقه الاهتمام (ROI) حول المنطقة التي سيتم فحصها. وينبغي ان يكون هذا دقيقا قدر الإمكان للحد من تاثير فلوري الخلفية.
- استخدم الاداه الخاصة بالبرنامج لاستخراج بيانات كثافة الفلورية الزمنيه كملفات بيانات من عائد الاستثمار المحدد ، بحيث يتم إنشاء قيمه لكل اطار من التسجيل.
- افتح البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات لحساب قيم ΔF/F0 لكل تتبع رائحة. F0 = متوسط فلوري في 2 ق قبل بداية الرائحة. ΔF = الفرق بين الفلوري الخام في اطار معين و F0. من هذه القيم ، احسب قيمه ΔF/F0 لكل اطار والتي يمكن رسمها مع الوقت لتعكس الفلورية النسبية طوال فتره تحفيز الروائح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن النظر إلى مثال علي الصور التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول أعلاه في الشكل 2. د يتم التعبير عن GCaMP3 في الخلايا العصبية إخراج ميغابايت الذي تشعبات inعصبيه المقصورة 1 من ميغابايت γ (يسمي الخلايا العصبية MVP228,29) ويستهدف وراثيا باستخدام خط انقسام Gal4 MB112C16. أيضا ، ثبت هو الفرق في التوطين تحت الخلوية من عصاري خلوي ومؤشر الكالسيوم المترجمة بعد المشبك. عند مقارنه الاشكال 2a والشكل 2a، يمكن للمرء ان نلاحظ بوضوح التعبير المحدد ، مجزاه من الاستشعار GCaMP314 -مع عدم وجود التعبير في المقصورات محواري من الخلايا العصبية ، واشاره تتخللها مرئية في المقصورة الجذعية. واضح-علي الرغم من ان الردود اقل السعه-رائحة يمكن ان ينظر اليه في الذباب التعبير عن دهوميروس-GCaMP3 (الشكل 2، لوحات اقل) ، مقارنه مع الذباب التعبير عن عصاري خلوي GCaMP6f23 (الشكل 2، اللوحات العليا). وهذا يدل علي ان الاداه فعاله لتصور الاستجابات حاسة الشم علي مستوي المشبك ، التالي ، يوفر خصوصية اضافيه لفحص الدوائر العصبية الكامنة وراء ، في هذه الحالة ، والترميز رائحة و التعلم حاسة الشم.
ويمكن النظر إلى مثال لهذه الاخيره في الشكل 3. في هذه التجربة ، وأعرب عن GCaMP3 dكما في الشكل 2 -في الجسم فطر الخلايا العصبية الناتج MVP2. هذا هو الخلايا العصبية المعروف ان التضمين من خلال التعلم حاسة الشم مثل هذا الاكتئاب بريسينابتيك نتيجة لتكييف الحاسة الشم ينعكس في استجابه بوستسينابتيك المتوفي لرائحة المدربين28,29 وهنا ويظهر تاكيد هذه النتيجة باستخدام هذا في بروتوكول التصوير الكالسيوم الجسم الفيفو. وتمثل اثار الكالسيوم المبينة في الشكل 3 بيانات نموذجيه من ذبابه فرديه واحده. لاحظ ان مستوي الضجيج والسعه يمكن ان تختلف بين الاستعدادات الفردية (علي سبيل المثال ، مقارنه الشكل 2 هاء والشكل 3c-e). ولذلك ، فان المقارنة داخل الحيوانية بين ما قبل التدريب وما بعده توفر طريقه لحساب التباين بين الافراد. وبطبيعة الحال ، فان البروتوكول هو مناسبه لنقلها إلى التصوير من الخلايا العصبية الأخرى ذات الاهميه.
الشكل 1: بناء غرفه التركيب واعداد ذبابه للتصوير. (ا) الخطوات اللازمة لبناء غرفه التصاعد الجوي. تتشكل القاعدة من شريحة المجهر القياسية (1) مغطاه بشبكه بلاستيكية دقيقه (2). يتم لصق اثنين من الأسلاك الكهربائية تحمل الرسوم المتعارضة (3) إلى الشريحة علي اي من الجانبين. يتم تجريد الأسلاك وعازمه علي عبور الشريحة (4) تشغيل موازيه مع بعضها البعض ولكن ليس في اتصال. يتم أضافه طبقات من شريط لاصق واضح (5) حتى تصل إلى ارتفاع ذبابه (حوالي 1 ملم). يتم قطع قناه من خلال الشريط عموديا (6) ، حوالي 1 ملم واسعه لتناسب عرض ذبابه. منصة مرتفعه مصنوعة من شريط لاصق واضح (7) بنيت فقط فوق الأسلاك الكهربائية لتشكيل وساده لراس ذبابه في حين ان الصدر هو علي راس الأسلاك. (ب) الرسم التخطيطي للتحليق المتمركز تحت المجهر الثنائي الفوتون. يتم تحقيق تحفيز الروائح من خلال ابره الحاجز التي توضع امام راس الذبابة (يتم إدخالها عبر القناة في الشريط (6) وفوق المنصة (7) لتوجيه الروائح إلى الهوائيات). (ج)-(ح) تحديد الراس المتطاير وفتحه. (ج) ذبابه ثابته داخل غرفه التصوير ، داخل القناة (شريط مقياس = 1 ملم) وتعقد في مكان بقطعه جديده من شريط لاصق واضح علي الطاير كله. (د) الرؤية المكبرة للطيران في الموقع. شريط مقياس = 0.1 مم. (ه) يتم قطع نافذه في الشريط حول راس ذبابه. (f) الراس هو أيضا ثابته مع الغراء الأزرق علاج الضوء. (ز) يتم تغطيه كبسوله الراس مع حل الرنين وفتح. (ح) الانتهاء من اعداد الدماغ مع الانسجه الزائدة والقصبة الهوائية (الانسجه البيضاء مرئية في (ز) أزاله). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكالسيوم المترجمة بعد المشبك باستخدام dهوميروس-GCaMP3. (ا) الصور المجهرية البؤرية التي تبين التعبير عن GCaMP6f المترجمة الخلوية (1) والمترجمة بعد المشبك dهوميروس-GCaMP3 (ii) في الخلايا العصبية الناتجة MB MVP2. يشير السهم الأخضر إلى المنطقة الفرعية γ1 من الفص γ الخاص ب MB. قضبان المقياس = 15 ميكرومتر. (ب)-(د) الصور الملتقطة باستخدام المجهر الاثاره الثنائي الفوتون من الأنماط الجينية أعلاه ، والتي تبين الفلورية في الجسم الحركي لأجهزه استشعار الكالسيوم ذات الصلة. (b) F0 (الفلورية الاساسيه) الصور ، وأظهرت كمتوسط الإسقاط كثافة من 2 ق قبل بداية رائحة. قضبان المقياس = 10 μm. (ج) صورالروائح الكريهة (الفلورية اثناء تحفيز الروائح) ، والتي تظهر كمتوسط الإسقاط المكثف علي مدي فتره الاستجابة لرائحة (2.5 s). (د) ΔF الصور التي تم إنشاؤها عن طريق طرح f0 صوره من صورهرائحة و ، لإظهار اشاره الاستجابة رائحة الفعلية. (ه) ΔF/F0 اثار من الذباب أعلاه من الأنماط الجينية المعنية من خلال تحفيز الروائح (شريط رمادي). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الحث علي التعلم اللدونة بعد متشابك تصور عبر dهوميروس-GCaMP3. (ا) تخطيط بروتوكولات التكييف المستخدمة في هذه التجارب. الاستجابات رائحة ساذجه ، قبل تكييف ("قبل") تقاس أولا. ثم كل ذبابه تجارب واحده من ثلاثه بروتوكولات تكييف ممكن: "الاقتران" ، حيث يتم اقران رائحة واحده (cs +) مع الصدمات الكهربائية (الولاياتالامريكيه) واخر (cs-) لا يعزز. "الروائح فقط" ، حيث يتم عرض الروائح فقط ، علي حد سواء دون تعزيز ، للسيطرة علي اثار التعرض لرائحة ؛ و "الصدمات فقط" ، حيث يتم عرض الصدمات الكهربائية فقط دون اي محفزات الروائح ، للسيطرة علي اثار التعرض للصدمات. بعد هذه المرحلة تكييف ، ثم يتعرض الذباب إلى "ما قبل" الروائح مره أخرى لاختبار النشاط الذي اثار رائحة المتغيرة ("آخر"). (ب) مثال علي تعديل الاستجابة لرائحة الروائح نتيجة للعرض المقترن بالروائح/الصدمات. ويمكن رؤية قمع قوي للاستجابة للCS + رائحة في منطقه γ1 دون الاقليميه (خط منقط). (ج)-(ه) اثار الاستجابة لرائحة الروائح من نفس الذبابة كما في (ب) ، مما يدل علي ان هذا التاثير القمعي لا يلاحظ الا في حاله الروائح المدربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشريح الدوائر العصبية الكامنة وراء التعلم والذاكرة هو هدف بارز في مجال علم الأعصاب. ان امكانيه الحصول علي الجينات الوراثية واتساع الاختبارات السلوكية وسهولتها يجعلها أداه مثاليه للتحقيق في هذه الظواهر. هنا ، يتم تقديم طريقه التي من الممكن ان تصور ، داخل الذباب الفردية ، والتحوير الذي يحدث علي مستوي الخلايا الفرعية نتيجة لتكييف حاسة الشم. من خلال تنفيذ التصور ما قبل التدريب وما بعد التدريب من ديناميات الكالسيوم التي أثارت رائحة ، التي وضعت لأول مره من قبل مجموعتنا17، فمن الممكن لرسم المقارنة مباشره ، داخل الحيوانية بين الاستجابات رائحة ساذجه والمستفادة ، التالي ، فحص اللدونة من الخلايا العصبية من الفائدة. وهذا يعطي ميزه لهذا البروتوكول علي التقييمات الجماعية (المستخدمة في الكلاسيكية حاسة الشم) لان الولايات قبل وبعد التدريب يمكن تقييمها كميا للافراد ، والذي يسمح للمرء ان يحدد بين الافراد تقلب. وعلاوة علي ذلك ، فان الاجراء التدريبي الذي يتم تنفيذه مباشره تحت المجهر يعادل إلى حد كبير النموذج الكلاسيكي لتكييف حاسة الشم الذي يستخدم عاده في التجارب السلوكية ولا يتضمن التحفيز الأوبتوجينيتيك الاصطناعي للخلايا العصبية. بطبيعة الحال ، والتعامل مع الذباب الصغيرة وفتح بعناية كبسوله الراس دون اتلاف انسجه المخ مع الحفاظ علي الاجهزه الحسية سليمه يتطلب مستوي من الخبرة التي يمكن الحصول عليها من قبل التدريب الدقيق والمتكرر ، وليس علي عكس المدى الذي نراه في التقييمات الفسيولوجية مثل الفيزيولوجيا الكهربية.
بالاضافه إلى ذلك ، يتم إثبات امكانيه استخدام مؤشرات الكالسيوم المترجمة لفحص اللدونة عند مستوي الخلايا العصبية الواحدة-مما يضيف مزيدا من الدقة إلى تشريح الدائرة العصبية. ويتجلى هذا من خلال إظهار الاكتئاب الناجم عن التعلم من استجابه بعد المتشابك في إخراج ميغابايت التحقيق جيدا الخلايا العصبية28,29. السلالات التي تعبر عن مجموعه متنوعة من أجهزه استشعار الفلورية المترجمة بالمشبك تحت سيطرة uas متوفرة ، علي سبيل المثال ، التعبير عن مستشعر موضعي presynaptically أو مستشعر الفلورسنت الأحمر من متشابك انتقال سينابتوفيسين-pHTomato20. وبطبيعة الحال ، يمكن تنفيذ مجموعه متنوعة من البروتينات الاستشعار مضان باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه.
والتقنيات التصويرية البصرية محدوده بشكل عام بالاستبانة الزمانيه والمكانية لنظام الحصول علي الصور المجهرية (مثلا ، مجهر ثنائي الفوتون) والاستبانة الزمنيه لجهاز الاستشعار نفسه (علي سبيل المثال ، حركيه مستشعر الكالسيوم). التسجيلات الكهربائية ، علي سبيل المثال ، باستخدام التصحيح المشبك الكهربي من somata من الخلايا العصبية في الدماغ دروفيسيلا ، لا تزال تقدم قرارا الزمانيه لا مثيل لها ، ولكن دون توفير اي الدقة المكانية. نظرا لخصوصية التعبير الجيني في الخلايا العصبية من الفائدة جنبا إلى التوطين تحت الخلوية للاستشعار ، تقنيات التصوير البصرية يمكن ان تكمل التقنيات الكهربائية الفسيولوجية للكشف عن اللدونة العصبية الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة. ولعل التقدم المستمر في تطوير أجهزه الاستشعار مضان توفير امكانيه لصهر البروتينات الاستشعار مع حركيه أسرع أو اعلي نسب الاشاره إلى الضوضاء (علي سبيل المثال ، GCaMP6 المتغيرات23) مع البروتينات الموضعية المشبك (مثل (دهومر كما ان التطورات الاخيره في إنشاء تقنيات مجهريه ذات معدلات اكتساب أسرع أو استبانه مكانيه اعلي ستثبت بأنها لا تقدر بثمن في مزيد من الصقل الدقيق لنهجنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث ألماني من خلال مركز البحوث التعاونية SFB 889 "أليات المعالجة الحسية" ووحده البحوث ل 2705 "تشريح حلبه الدماغ: هيكل, اللدونة والوظيفة السلوكية لل جسم فطر دروفيا ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
- Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
- Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
- de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
- Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
- Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
- Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
- Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
- Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
- Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
- Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
