Summary
Her presenterer vi en protokoll som pre-og/eller postsynaptic kalsium kan bli visualisere i sammenheng med Drosophila læring og minne. In vivo kalsium bildebehandling bruker synaptically lokaliserte kalsium sensorer er kombinert med en klassisk olfactory condition paradigme slik at Synaptic plastisitet underliggende denne typen assosiativ læring kan bestemmes.
Abstract
Ti år med forskning i mange modell organismer har ført til dagens konsept av Synaptic plastisitet underliggende læring og minne formasjon. Læring-indusert endringer i Synaptic overføring er ofte fordelt på mange neurons og nivåer av behandling i hjernen. Derfor metoder for å visualisere læring-avhengig Synaptic plastisitet over neurons er nødvendig. Frukten fly Drosophila melanogaster representerer en spesielt gunstig modell organisme for å studere neuronal kretser underliggende læring. Protokollen som presenteres her demonstrerer en måte som prosessene som ligger til grunn for dannelsen av assosiativ olfactory minner, for eksempel Synaptic aktivitet og deres forandringer, kan overvåkes in vivo. Ved hjelp av det brede utvalget av genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila, er det mulig å spesifikt uttrykke genetisk kodede kalsium indikatorer i bestemt celle populasjoner og til og med enkeltceller. Ved å feste en flue på plass, og åpne hodet kapselen, er det mulig å visualisere kalsium dynamikk i disse cellene mens levere olfactory stimuli. I tillegg viser vi et oppsett der fly kan utsettes, samtidig, til elektrisk støt til kroppen. Dette gir et system der fluer kan gjennomgå klassisk olfactory condition-der en tidligere naiv lukt er lært å være assosiert med elektrisk sjokk straff-samtidig som representasjon av denne lukten (og andre uerfarne lukter) er observert i hjernen via to-Foton mikroskopi. Vår Lab har tidligere rapportert generering av synaptically lokaliserte kalsium sensorer, som gjør det mulig å begrense fluorescerende kalsium signaler til pre-eller postsynaptic rom. To-Foton mikroskopi gir en måte å romlig løse fine strukturer. Vi er eksempler på dette ved å fokusere på neurons integrere informasjon fra sopp kroppen, en høyere-Order sentrum av insekt hjernen. Samlet gir denne protokollen en metode for å undersøke Synaptic forbindelser mellom neurons hvis aktivitet er modulert som følge av olfactory læring.
Introduction
Tyde hvor og hvordan informasjonen er ervervet i hjernen gjennom læring og deretter lagret som minne utgjør en av de mest utfordrende oppgavene i nevrovitenskap1. Neuroscientific forskning har ført til begrepet en endring i Synaptic transmisjon som neuronal substrat som ligger til grunn for læring og minne formasjon2,3. Det er hypotetisk gjennomsnitt at, under læring, Synaptic forbindelser mellom neuronal ensembler som er aktive under oppfatningen av en stimulans blir endret slik at deres kombinerte aktivitet mønster kan hentes under minne huske, og dermed instruere fremtidig atferds handling4. Disse "engram celler" og deres synapser er ofte fordelt over hjernen regioner og nivåer av behandling, som gjør det vanskelig å tildele observerte endringer i Synaptic overføring til læring av en oppgave eller en stimulans. Å lokalisere og visualisere disse Synaptic endringene som er causally knyttet til en bestemt læring oppgave man trenger en passende modell system som gjør det mulig for nettopp confining de synapser.
For slik en bestrebe, Drosophila melanogaster er spesielt egnet fordi den syndikatene slektning hjerne enkelhet, opptreden rikdom, og eksperimentelle tilgjengeligheten. Blant de veletablerte modellen organismer, Drosophila ligger mellom nematode C. elegans og genetisk medgjørlig pattedyr som mus i form av neuronal kompleksitet. Stereotypic antall neurons (~ 300) og begrenset atferdsmessige repertoar er observert i C. elegans. Pattedyr, derimot, har millioner av neurons og svimlende atferdsdata kompleksitet. Hjernen av frukten fly er, med sine ~ 100 000, neurons betydelig mindre enn hjernen til de fleste virveldyr, og mange av neurons er individuelt identifiserbar5. Likevel, Drosophila demonstrere et bredt spekter av komplekse atferd, inkludert en evne til å vise robust assosiativ olfactory læring og minne formasjon, først beskrevet over 40 år siden6. I løpet av denne klassiske condition prosedyren, grupper av fluer er utsatt for en lukt som betinget stimulans (CS+) mens de får en straffe elektrisk sjokk som unconditioned STIMULANS (US). En annen lukt (CS-) er så presentert uten noen straff. Dermed, dyrene lærer å unngå lukt forbundet med straffen, som kan testes i en senere valg situasjon mellom de to lukter, CS+ og cs-. Arbeidet med dissekere den neuronal underlaget underliggende denne oppførselen i Drosophila har identifisert sopp organer (MB) som den primære stedet for "engram"7,8,9,10 og derfor kretsen av denne hjernen regionen var og er gjenstand for intens forskning for å avdekke logikken som en minne engram er ervervet og lagret (nylig gjennomgått i11,12).
Den Drosophila MB består av ~ 2 000 iboende neurons (Kenyon celler) per halvkule, organisert parallelt axonal anslag13. Axons av olfactory projeksjon neurons er utvidet til lateral protocerebra og til MB calyces, den viktigste dendrittiske input området av MB og motta olfactory innspill fra Fasettøynene fliker. Den lange, parallelle axons bunt av Kenyon celler utgjør peduncle og fliker. De fleste Kenyon celler bifurcate forming horisontale β/β'-fliker ved å forlenge en sikkerhet mot midtlinjen av hjernen, og den vertikale α/α'-fliker ved å utvide andre sikkerhet prosjektering i rygg-fremre retning. Den andre gruppen av Kenyon celler danner den horisontale γ-fliker13 av MB der læringsprosessen og påfølgende kortsiktige minne formasjon kan være lokalisert10. MB fliker motta afferente input og gi efferent output, som begge er vanligvis begrenset til distinkte avdelings sub-regioner langs Kenyon celle axons14,15,16. Spesielt afferente dopaminerg MB input neurons har vist å megle verdi-basert, for eksempel, straffe, forsterkende effekter i assosiativ olfactory læring15,17. Stereotypic og individuelt identifiserbare efferent MB utgang neurons fra sopp kroppen fliker integrere informasjon på tvers av et stort antall Kenyon celler, målrette ulike hjernen områder og Bjørn atferd-lærerikt appetitive eller aversive informasjon15 . Denne neuronal arkitekturen har ført til et konsept for organiseringen av de assosiativ engram. Lukt er relativt presist kodet av tynt aktiverte ensembler av Kenyon celler. Den sammenfallende aktivitet av disse Kenyon celle ensembler og utgivelsen av dopamin-fremkalt av straffe stimuli-modulerer overføring fra Kenyon celle presynapses på MB utgang neurons slik at dyrene vil senere unngå denne lukten10 ,12. Vi bruker dette ganske presist definerte og lokaliserte engram som en paradigmatiske sak for å illustrere hvordan disse lærings avhengige endringene i Synaptic-aktivitet kan fastslås og overvåkes.
Verdien av Drosophila som modell system avhenger sterkt på uovertruffen genetisk verktøykasse som tillater en å uttrykke transgenes for identifisering, overvåking, og kontrollerende enkelt neurons innen komplekse kretser18. Ankomsten av teknikker for neuronal aktivitet overvåking-som kalsium Imaging, diskutert her-har lov til fastsettelse av neuronal aktivitet mønstre som svar på en bestemt stimulans. Ved å kombinere spesifikke Gal4-drevet uttrykk for genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) med olfactory stimulering, kan man visualisere lukt-fremkalt kalsium dynamikk av neurons av interesse19. I denne protokollen, er det vist at ved viderekopling denne teknikken med en klassisk condition paradigme, er det mulig å undersøke disse olfactory svarene i sammenheng med læring. Læring-indusert plastisitet kan ytterligere dissekert bruker GECIs som ikke bare er lokalisert til en enkelt bestemt Nevron, men også til bestemte subcompartments av en Nevron. Pech et al.20 etablerte et utvalg av verktøy som tillater akkurat dette. Ved målretting GCaMP321 til enten pre-eller postsynapse-via kobling til virveldyr Synaptophysin eller dHomer, henholdsvis20-differensial modulering av disse områdene kan skilles. Denne lokalisering gir, i denne sammenheng, en fordel over de fleste GECIs som er overalt til stede i hele stoffer-f. eks, GCaMP22, GCaMP321, eller GCaMP623 -fordi det betyr at pre-og postsynaptic transienter kan skilles fra den samlede integrerte kalsium tilstrømningen som oppstår som et resultat av Nevron aktivering. Dette kan gi ledetråder om plassering og typer plastisitet som oppstår som et resultat av eller som forårsaker læring og minne formasjon. Som et eksempel protokollen gitt her viser verdien av dette verktøyet i å tyde modulering av MB utgang neurons under olfactory assosiativ læring ved å målrette uttrykket av kalsium sensor til bare postsynapse. Ved å overvåke, innenfor en individuell fly, lukt-fremkalt aktivitet før og etter olfactory condition en direkte sammenligning kan trekkes mellom en naiv lukt respons og en lært lukt respons. Mens fast i samme bildebehandling kammer, fluer er utsatt for et utvalg av lukt. Deretter får de en aversive assosiativ condition protokoll der en av disse lukter er sammenkoblet med elektrisk sjokk (bli CS+) og en annen lukt er presentert uten forsterkning (bli cs-). Til slutt, fluene er igjen utsatt for samme lukt som i første trinn. Kalsium dynamikk er observert ved hjelp av to-Foton mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transgene frukt fluer, Drosophila melanogaster
- Cross kvinnelige jomfru og mannlige fluer (oppvokst ved 25 ° c i 60% relativ luftfuktighet på en 12 h lys/mørk syklus) bærer ønsket Gal4 og UAS konstruerer25, henholdsvis å produsere fluer der bestemte neurons av interesse uttrykke en genetisk kodet kalsium-indikator.
- Alder den kvinnelige avkom av de ovennevnte korset før de er i størrelsesklasse 3-6 dager etter eclosion. Kvinnelige fluer er å foretrekke på grunn av deres litt større størrelse.
2. utarbeidelse av frukten fly for in vivo kalsium bilde
- Velg en enkelt kvinnelig flue og bedøve på is i ikke lenger enn 5 min.
- Ved hjelp av fine tang, plassere fly i bilde kammeret (demonstrert i figur 1c). Sørg for at thorax og bena er i kontakt med de elektriske ledningene i bunnen av kammeret og at hodet ligger flatt. Fix posisjonen til fly ved hjelp av klar teip.
Merk: denne protokollen krever en spesialbygd kammer der fluene er festet, med hodet kapselen tilgjengelig for åpning, og fluene i stand til å motta både lukt stimuleringer til antenner og elektriske støt til thorax og ben (figur 1). - Ved hjelp av et kirurgisk skalpell blad festet til skalpell håndtaket (se tabell av materialer), skjær et vindu i tapen rundt hodet på fly, slik at antennene dekket og bare den fremre-meste delen av thorax eksponert.
- Omgi sidene og baksiden av hodet med blått lysherding lim, nøye manipulert ved hjelp av et insekt PIN holdt av konkave-konvekse kjever. Sett limet ved hjelp av en blå lys-Emitting LED-lampe.
- Kontroller at limet er helt innstilt og fjern eventuelle rester av uherdet lim fra rygg flaten på fly hodet.
- Påfør en dråpe ringer løsning24 (se tabell over materialer) for å dekke den eksponerte cuticle av hodet.
- Ved hjelp av en veldig fin-Bladed stikke kniv, skjære gjennom cuticle. For den mest effektive fjerning av cuticle, først skjære over bakre av hodet ved hjelp av Epiophlebioptera som utgangspunkt. Deretter kuttet opp hver side, midtre til øynene, for å danne en klaff av cuticle som lett kan slites av ved hjelp av tang.
- Fjern eventuelle overflødig cuticle som kan blokkere hjernen regionen av interesse.
- Forsiktig fjerne rygg overflaten av ethvert luftrør ved hjelp av fine tang, unngå forstyrrelse av hjernevevet selv. Fjerne og oppdatere ringe løsning24 (se tabell over materialer) som kreves for å fjerne området av vev rusk.
- Plasser sprøyte lukt levering nål i posisjon, ca 1 cm fra hodet på fly. Sørg for at det ikke er noe som kan hindre lukt levering til antennene.
- Ved mikroskopet kobler du bilde kammeret til lukt leveringssystemet via sprøyte lukt leverings nål.
- Å la fly til fullt å komme seg fra anestesi og kirurgi, og å tilpasse seg luftstrømmen, gjennomføre en 10 min hvileperiode på dette stadiet.
3. in vivo kalsium bilde
- Bruk et multiphoton mikroskop utstyrt med infrarød laser og en vann nedsenking objektiv (se tabell over materialer), installert på et vibrasjonsisolert bord. For visualisering av GFP-baserte kalsium indikatorer, tune laseren til en eksitasjon bølgelengde på 920 NM og installere en GFP band-pass filter.
- Bruk den grove Z justeringsknotten til å skanne gjennom Z-aksen i hjernen og finne den regionen som interesserer hjernen. Bruk beskjæringsfunksjonen til å fokusere skanning bare på dette området for å redusere skanne tiden, og til å rotere skanne visningen slik at fremre del av hodet vender nedover.
- Juster rammen størrelsen til 512 x 512 px, skannehastighet til > 4 Hz, og skanne region (i Y-dimensjonen) slik at neurons av interesse er dekket.
4. visualisering av lukt-fremkalt kalsium transienter gjennom olfactory condition
- Bruk en lukt leveranse system19,26 som kan levere flere lukt stimuli i en timelig presis måte.
- Bruk en ekstra datamaskin til å styre enheten, og til å kommunisere med bilde mikroskop programvaren for å koordinere lukt stimuleringer med bildeopptak under eksperimenter.
- Initiere en pre-programmert makro pakke i stand til å knytte bildet oppkjøpet programvare og lukt levering program (f. eks, en VBA makro pakke installert i mikroskopet kontrollprogramvare, se tabell over materialer) som er mottakelig for en ekstern inngang utløser gitt ved initiering av en lukt leverings protokoll i et eget program).
- Start målingen ved å overvåke "pre-trening"/naiv lukt-fremkalt kalsium transienter med en oppløsning på 512 x 512 px og en bildefrekvens på 4 Hz. lever en 2,5 s lukt stimulans flankert av ytterligere bilde oppkjøpet for 6,25 s foregående lukt utbruddet (å etablere en F 0 Baseline verdi) og 12,5 s etter lukt forskyvning. Gjenta dette med en andre odorant og deretter med en tredje odorant.
- Fortsett 3 min etter denne målingen med klassisk condition ("trening") i fly.
- Velg en av lukt som presenteres i "pre-trening" fase for å bli CS+ lukt og en annen for å bli cs- lukt. Presenter CS+ lukt ved hjelp av datastyrte lukt-levere system for 60 s sammen med 12 90 V elektrisk sjokk.
- Etter en 60 s pause, presentere CS- lukt alene for 60 s. Bruk som odorants 4-methylcyclohexanol og 3-oktanol. Ikke Presenter den tredje odorant (f. eks 1-octen-3-OL) under denne treningen da den brukes som kontroll før (trinn 4,2.) og etter (trinn 4,4) trenings fasen.
- Mål "post-trening" lukt-fremkalt kalsium transienter igjen ved å gjenta "pre-trening" lukt stimulering protokollen (trinn 4,2.) 3 min etter endt trening fase (trinn 4,3).
Merk: tidspunktet for dette trinnet skal gjenspeile tidspunktet for interessen etter minne formasjon (f. eks, gjennomføre dette trinnet 3-4 min etter condition trinn for å undersøke korttidsminne). Vanligvis kan fluer overleve i flere timer i dette preparatet. - Lagre bildefiler i et passende format (for eksempel TIFF) for senere bildeanalyse.
5. bildeanalyse
- Å analysere profilen, åpen TIFF (eller lignende) fil-størrelse inne bildet analyseprogramvare som Fiji27.
- Juster bunkene ved hjelp av en algoritme for bevegelses korrigering for å sikre minimal bevegelse i retningene X og Y. Kast alle innspillinger som viser sterk bevegelse i Z-aksen.
- Velg verktøyet for programvaren som brukes til å markere en region av interesse (ROI) rundt området som skal undersøkes. Dette bør være så presis som mulig for å begrense påvirkningen av bakgrunnen fluorescens.
- Bruk det respektive verktøyet av programvaren til å trekke ut Temporal fluorescens intensitet data som datafiler fra den valgte AVKASTNINGEN, slik at en verdi er generert for hvert bilde av opptaket.
- Åpne dataene ved hjelp av et dataanalyse program for å beregne ΔF/F0 -verdiene for hver lukt sporing. F0 = gjennomsnittlig fluorescens i 2 s før lukt utbruddet. ΔF = forskjellen mellom rå fluorescens i en gitt ramme og F0. Fra disse verdiene, beregne en ΔF/F0 verdi for hver ramme som kan tegnes mot tiden for å reflektere relative fluorescens hele lukt stimulans perioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på bilder ervervet med protokollen ovenfor kan ses i figur 2. d Homer-GCaMP3 uttrykkes i en MB output Nevron som dendrites innervate kupé 1 av MB γ-flik (den Nevron er betegnet MVP228,29) og er genetisk målrettet ved hjelp av Split-Gal4 linje MB112C16. Også demonstrert er forskjellen i subcellulære lokalisering av en cytosolic og post-synaptically lokaliserte kalsium indikator. Når man sammenligner tall 2a og figur 2F, kan man tydelig observere den spesifikke, compartmentalized uttrykk for dHomer-GCaMP3 sensor14 -uten uttrykk i axonal rom av Nevron, og en markert signal synlig i det dendrittiske rommet. Clear-om lavere amplitude-lukt svar kan sees i fluer uttrykker dHomer-GCaMP3 (figur 2, lavere paneler), sammenlignet med fluer uttrykker cytosolic GCaMP6f23 (figur 2, øvre paneler). Dette viser at verktøyet er effektivt for visualisering av olfactory reaksjoner på nivået av postsynapse, og derfor gir en ekstra spesifisitet til undersøkelse av nevrale kretser underliggende, i dette tilfellet, lukt koding og olfactory læring.
Et eksempel på sistnevnte kan sees i Figur 3. I dette eksperimentet, dHomer-GCaMP3 uttrykkes som i figur 2 -i SOPP kroppen utgang Nevron MVP2. Dette er en Nevron kjent for å være modulert gjennom olfactory læring slik at presynaptiske nerve depresjon som følge av aversive olfactory condition gjenspeiles i en avdød postsynaptic svar på trent lukt28,29 og her en bekreftelse på dette resultatet vises ved hjelp av denne in vivo kalsium bilde protokoll. Den kalsium spor vist i Figur 3 representerer eksemplarisk data fra ett individ fly. Vær oppmerksom på at støynivået og amplituden kan variere mellom individuelle preparater (f.eks. sammenligne figur 2e og figur 3c-e). Derfor, en innenfor-dyr sammenligning av pre-vs. post-trening gir en måte å gjøre rede for Inter-individuell variasjon. Selvfølgelig er protokollen egnet til å bli overført til Imaging av andre neurons av interesse.
Figur 1: bygging av et monterings kammer og utarbeidelse av en flue for bildebehandling. (a) trinn for bygging av fly monterings kammeret. Basen er dannet av et standard mikroskop lysbilde (1) dekket med en fin plast Mesh (2). To elektriske ledninger som bærer motstridende ladninger (3) limes til lysbildet på hver side. Ledningene er strippet og bøyd til å krysse raset (4) kjører parallelt med hverandre, men ikke i kontakt. Lag av klar tape (5) er lagt til når høyden på en flue (ca 1 mm). En kanal kuttes gjennom tapen vertikalt (6), ca 1 mm bred for å passe til bredden på et fly. En forhøyet plattform laget av klar teip (7) er bygget like over elektriske ledninger for å danne en pute for fly hode mens thorax er på toppen av ledningene. (b) skjematisk illustrasjon av fly plassert under to-Foton mikroskop. Den odor stimulering oppnås gjennom en sprøyte nål plassert foran fly hode (satt inn gjennom kanalen i tapen (6) og på toppen av plattformen (7) for å dirigere lukt til antenner). (c)-(h) festing og åpning av fly hodet. (c) en flue fast inne i bilde kammeret, inne i kanalen (Scale bar = 1 mm) og holdt på plass av et friskt stykke klar tape over hele fly. (d) forstørret visning av fly i posisjon. Scale bar = 0,1 mm. (e) et vindu er skåret inn i tapen rundt hodet på fly. (f) hodet er ytterligere fast med blått lys-herding lim. (g) hode kapselen er dekket med ringe løsning og åpnet. (h) fullført utarbeidelse av hjernen med overflødig vev og luftrør (hvitt vev synlig i (g) fjernet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Postsynaptically-lokalisert kalsium visualisere ved hjelp av dHomer-GCaMP3. (a) konfokalmikroskopi mikroskopi bilder som viser uttrykk for Cytosolically lokaliserte GCaMP6f (i) og postsynaptically lokaliserte dHomer-GCaMP3 (II) i MB output Nevron MVP2. Grønn pil angir γ1-under region til MB γ-flik. Skala bars = 15 μm. (b)-(d) bilder tatt med to-Foton eksitasjon mikroskopi av genotyper ovenfor, viser in vivo fluorescens av de respektive kalsium sensorer. (b) F0 (Baseline fluorescens) bilder, vist som en gjennomsnittlig intensitet projeksjon av 2 s før lukt debut. Skala bars = 10 μm. (c) Flukt bilder (fluorescens under lukt stimulering), demonstrert som en gjennomsnittlig intensitet projeksjon over lukt respons perioden (2,5 s). (d) ΔF bilder generert ved å trekke f0 bilde fra flukt bilde, for å vise faktiske lukt respons signal. (e) ΔF/F0 spor fra ovenstående fluer i de respektive genotyper gjennom en lukt stimulering (grå bar). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Learning-indusert postsynaptic plastisitet visualisere via dHomer-GCaMP3. (a) skjematisk av condition protokoller som brukes i disse eksperimentene. Naiv lukt svar, før condition ("pre") måles først. Deretter hver flue opplever en av tre mulige condition protokoller: "sammenkoblet", der en lukt (CS+) er sammenkoblet med elektrisk sjokk (US) og en annen (cs-) er ikke forsterket; "Lukt bare", der bare lukt presenteres, både uten forsterkning, å kontrollere for lukt eksponeringseffekter; og "sjokk bare", hvor bare elektriske støt blir presentert uten lukt stimuli, for å kontrollere for sjokk eksponeringseffekter. Etter denne condition fase, fluer blir deretter utsatt for "pre" lukt igjen for å teste for endret lukt-fremkalt aktivitet ("post"). (b) et eksempel på lukt respons modulering som et resultat av den sammenkoblede lukt/sjokk presentasjon. Sterk undertrykkelse av responsen på CS+ lukt kan sees i γ1 under region (stiplet linje). (c)-(e) lukt respons spor fra samme fly som i (b), viser at denne undertrykkelse effekten er bare observert i tilfelle av trenet lukt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Disseksjon av nevrale kretser underliggende læring og hukommelse er et fremtredende mål innen nevrovitenskap. Den genetiske tilgjengeligheten av Drosophila og bredden og enkel atferds testing gjør dette til et ideelt verktøy for å undersøke slike fenomener. Her er en metode presentert som det er mulig å visualisere, innenfor individuelle fluer, modulering som oppstår på et subcellulære nivå som følge av olfactory condition. Ved å utføre både pre-trening og post-trening visualisering av lukt-fremkalt kalsium dynamikk, først etablert av vår gruppe17, er det mulig å trekke en direkte, innenfor-dyr sammenligning mellom naive og lært lukt svar, og derfor undersøke plastisitet av neurons av interesse. Dette gir en fordel til denne protokollen over en masse vurderinger (brukes i klassisk olfactory condition) fordi pre-og post-trening stater kan kvantitativt vurderes for individer, som gjør det mulig å bestemme Inter-individuelle Variasjon. Videre treningen prosedyren utføres direkte under mikroskopet er i stor grad tilsvarer den klassiske olfactory condition paradigmet vanligvis brukes i atferdsmessige eksperimenter og ikke involverer kunstig optogenetic stimulering av neurons. Selvfølgelig, håndtering av små fluer og forsiktig åpne hodet kapselen uten å skade hjernevevet samtidig som de sensoriske organene intakt krever et nivå av kompetanse som kan oppnås ved grundig og gjentatt trening, ikke ulikt den grad sett i fysiologiske vurderinger som elektrofysiologi.
I tillegg potensialet til å bruke lokaliserte kalsium indikatorer for å undersøke plastisitet på enkelt Nevron nivå er demonstrert-legge større presisjon til neuronal krets disseksjon. Dette er et eksempel på ved å vise en læring-indusert depresjon av en postsynaptic respons på en godt undersøkt MB output Nevron28,29. Drosophila stammer uttrykker en rekke synaptically lokaliserte fluorescens SENSORER under UAS kontroll er tilgjengelig, for eksempel uttrykker den presynaptically lokaliserte sensoren Synaptophysin-GCaMP3 eller den røde fluorescerende sensoren av Synaptic overføring Synaptophysin-pHTomato20. Selvfølgelig kan variasjonen av fluorescens sensor proteiner implementeres ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor.
Optisk tenkelig teknikker er generelt begrenset av den timelige og romlig oppløsning av mikroskopisk bilde oppkjøpet system (f. eks et to-Foton mikroskop) og Temporal oppløsning av sensoren selv (f. eks, Kinetics av kalsium sensor). Elektrofysiologisk innspillinger, for eksempel ved hjelp av patch Clamp elektrofysiologi fra somata av neurons i Drosophila hjernen, fortsatt tilby en uovertruffen Temporal oppløsning, men uten å gi noen romlig presisjon. På grunn av spesifisitet av genet uttrykk i neurons av interesse kombinert med subcellulære lokalisering av sensoren, optiske Imaging teknikker kan potensielt utfylle elektrofysiologisk teknikker for å avdekke neuronal plastisitet underliggende læring og minne formasjon. Kontinuerlig fremgang i utviklingen av fluorescens sensorer vil kanskje gi muligheten til å smelte sensor proteiner med raskere Kinetics eller høyere signal-til-støy-forhold (f.eks. GCaMP6-varianter23) med synaptically lokaliserte proteiner som dHomer. Også de siste fremskritt i å etablere mikroskopiske teknikker med raskere oppkjøp priser eller høyere romlig oppløsning vil være uvurderlig i ytterligere finjustering av vår tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den tyske Forskningsrådet gjennom Collaborative Research Center SFB 889 "mekanismer for sensorisk prosessering" og Research Unit FOR 2705 "Disseksjon av en Brain Circuit: struktur, plastisitet og Behavioral funksjon av Drosophila sopp Body ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
- Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
- Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
- de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
- Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
- Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
- Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
- Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
- Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
- Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
- Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
