Summary
Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.
Abstract
Birçok model organizmalarda onlarca yıllık araştırmalar, öğrenme ve hafıza oluşumunun altında yatan mevcut sinaptik plastisite kavramına yol açmıştır. Sinaptik iletim öğrenme kaynaklı değişiklikler genellikle birçok nöronlar ve beyinde işleme düzeyleri arasında dağıtılır. Bu nedenle, nöronlar arasında öğrenme bağımlı sinaptik plastisite görselleştirmek için yöntemler gereklidir. Meyve sinek Drosophila melanogaster öğrenme altında yatan nöronal devreleri incelemek için özellikle olumlu bir model organizma temsil eder. Burada sunulan protokol, ilişkiye giren koku hafızasının oluşumunun altında yatan süreçlerin, yani sinaptik aktivitenin ve bunların değişimlerinin in vivo olarak izlenebileceğini göstermektedir. Drosophilamevcut genetik araçların geniş bir yelpazede kullanarak , özellikle belirlenen hücre popülasyonları ve hatta tek hücrelerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ifade etmek mümkündür. Yerinde bir sinek sabitleme ve baş kapsülü açarak, koku uyaranları sunarken bu hücrelerde kalsiyum dinamikleri görselleştirmek mümkündür. Ayrıca, sineğin aynı anda vücuda elektrik şoklarına maruz kabileceği bir kurulum gösteriyoruz. Bu, sineklerin klasik koku alma kondisyonundan geçebildiği bir sistem sağlar - bu nedenle daha önce naif bir kokunun elektrik çarpması cezasıyla ilişkilendirildiği öğrenilir - aynı zamanda bu kokunun (ve diğer eğitimsiz kokuların) temsili olarak iki foton mikroskopisi ile beyinde gözlenir. Laboratuvarımız daha önce sinaptetik olarak lokalize kalsiyum sensörleri üretdiğini bildirmiştir, bu da floresan kalsiyum sinyallerini ön veya postsinaptik bölmelerle sınırlandırmanızı sağlar. İki fotonlu mikroskopi, ince yapıları mekansal olarak çözmenin bir yolunu sağlar. Bunu, böcek beyninin üst düzey bir merkezi olan mantar vücudundaki bilgileri birleştiren nöronlara odaklanarak örnek liyoruz. Genel olarak, bu protokol olan aktivite koku öğrenme sonucu modüle nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıları incelemek için bir yöntem sağlar.
Introduction
Bilginin öğrenme yoluyla beyinde nereden ve nasıl elde edildiği ve daha sonra bellek olarak depolandığı deşifre etmek, nörolojinin en zorlu görevlerinden birini oluşturmaktadır1. Nörobilimsel araştırma öğrenme ve hafıza oluşumu 2 altında yatan nöronal substrat olarak sinaptik iletim bir değişiklik kavramına yol açmıştır2,3. Öğrenme sırasında, bir uyarıcının algılanması sırasında aktif olan nöronal topluluklar arasındaki sinaptik bağlantıların, bir leştirilmiş aktivite deseni hafıza hatırlama sırasında alınabilecek şekilde değiştirilebileceği ve bu nedenle gelecekteki davranışsal eylem4. Bu "engram hücreleri" ve onların sinapsları genellikle beyin bölgeleri ve işleme düzeyleri arasında dağıtılır, hangi zor bir görev veya uyarıcı öğrenme sinaptik iletim gözlenen değişiklikler atamak için yapar. Belirli bir öğrenme görevine nedensel olarak bağlı olan bu sinaptik değişiklikleri yerelleştirmek ve görselleştirmek için, bu sinapsların tam olarak sınırlandırılmasına olanak tanıyan uygun bir model sistemine ihtiyaç vardır.
Böyle bir çaba için, Drosophila melanogaster göreceli beyin basitliği, davranışsal zenginlik ve deneysel erişilebilirlik birleştirir çünkü özellikle uygundur. Köklü model organizmalar arasında, Drosophila nöronal karmaşıklık açısından fareler gibi nematod C. elegans ve genetik olarak çekilebilir memeliler arasında yer almaktadır. C. elegans'tastereotipik nöron sayısı (~300) ve sınırlı davranışsal repertoi gözlenir. Memelilerin ise milyonlarca nörona ve şaşırtıcı davranış sallabına sahiptir. Meyve sineğinin beyni, ~100.000'i ile, çoğu omurgalının beyninden önemli ölçüde daha küçük nöronlardır ve nöronların çoğu tek tek tanımlanabilir5. Ancak, Drosophila karmaşık davranışlarıgeniş bir yelpazede göstermek, sağlam bir bağdaştırıcı koku öğrenme ve hafıza oluşumu sergilemek için bir yetenek de dahil olmak üzere, ilk üzerinde açıklanan40yıl önce 6 . Bu klasik koşullandırma prosedürü sırasında, sinek grupları koşullu uyarıcı (CS+) olarak bir kokuya maruz kalırken, koşulsuz uyarıcı (ABD) olarak cezalandırıcı bir elektrik şoku alırlar. İkinci bir koku (CS-) sonra herhangi bir ceza olmadan sunulmaktadır. Bu nedenle, hayvanlar iki koku, CS+ ve CS arasında bir sonraki seçim durumunda test edilebilir ceza ile ilişkili koku önlemek için öğrenirler-. Drosophila bu davranışın altında yatan nöronal substrat diseksiyon çalışmaları mantar organları (MB) "engram"7,8,9,10 birincil site olarak belirlemiştir ve, bu nedenle, bu beyin bölgesinin devre ve bir bellek engram elde edilir ve saklanır mantığı ortaya çıkarmak için yoğun araştırma konusudur (son zamanlarda gözden11,12).
Drosophila MB oluşur ~ 2,000 içsel nöronlar (Kenyon hücreleri) yarımküre başına, paralel aksonal projeksiyonlar düzenlenen13. Koku projeksiyon nöronların aksonlar lateral protocerebra ve MB calyces, MB ana dendritik giriş sitesi ve anten lobları koku girişi almak uzatılır. Kenyon hücrelerinin uzun, paralel aksonlar demeti peduncle ve loblar oluşturmaktadır. Kenyon hücrelerinin çoğu, bir teminatı beynin orta çizgisine, dikey α/α'-lobları ise dorsal-anterior yönde ikinci kollateral projektifi genişleterek yatay β/β'-loblar oluşturur. Kenyon hücrelerinin diğer grup öğrenme süreci ve sonraki kısa süreli bellek oluşumu lokalize olabilir MB yatay γ-loblar13 oluşturur10. MB loblar afferent giriş almak ve efferent çıkış sağlamak, her ikisi de genellikle Kenyon hücre aksonları boyunca farklı bölümalt bölgeleri ile sınırlıdır14,15,16. Özellikle, afferent dopaminerjik MB giriş nöronların, örneğin, cezalandırıcı, uyarıcı koku öğrenme etkileri takviye değer tabanlı aracılık gösterilmiştir15,17. Mantar vücut loblarından stereotipik ve bireysel olarak tanımlanabilir efferent MB çıkış nöronlar Kenyon hücrelerinin çok sayıda arasında bilgi entegre, hedef çeşitli beyin alanları ve ayı davranış-öğretici iştah açıcı veya aversive bilgi15 . Bu nöronal mimari assosiyatif engram organizasyonu bir kavram yol açmıştır. Kokular nispeten hassas Kenyon hücrelerinin seyrek aktive topluluklar tarafından kodlanır. Bu Kenyon hücre topluluklarının tesadüfi aktivitesi ve dopamin salınımı - uyarıcıları cezalandırarak uyarılmış - Kenyon hücre presynapses mb çıkış nöronlar üzerine bulaşma modüle böylece hayvanlar daha sonra bu özel koku önlemek olacaktır10 ,12. Bu tam olarak tanımlanmış ve lokalize engramı, sinaptik aktivitedeki bu öğrenmeye bağımlı değişikliklerin nasıl belirlenip izlenebileceğini göstermek için paradigmatik bir olgu olarak kullanırız.
Bir model sistemi olarak Drosophila değeri güçlü bir tanımlamak için transgenler ifade sağlar eşsiz genetik araç kutusu dayanır, izleme, ve karmaşık devreler içinde tek nöronlar kontrol18. Nöronal aktivite izleme teknikleri gelişiyle - kalsiyum görüntüleme gibi, burada tartışılan - belirli bir uyarıcı yanıt olarak nöronal aktivite kalıplarının belirlenmesi için izin verdi. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (GECIs) spesifik Gal4 güdümlü ifadesini koku stimülasyonu ile birleştirerek, ilgi nöronların koku uyandıran kalsiyum dinamiklerini görselleştirebilirsiniz19. Bu protokolde, bu tekniği klasik koşullandırma paradigması ile daha fazla bağlayarak, bu koku alma yanıtlarını öğrenme bağlamında incelemenin mümkün olduğu gösterilmiştir. Öğrenme kaynaklı plastisite sadece tek bir spesifik nörona lokalize değil, aynı zamanda bir nöronun belirli alt bölümlerine gecis kullanılarak daha da kesilebilir. Pech ve ark.20 tam olarak bu izin araçları bir seçim kurdu. GCaMP321'i, omurgalı Synaptophysin veya dHomer'a bağlantı yoluyla, sırasıyla20-ön veya postsynapse'ye hedefleyerek, bu sitelerin diferansiyel modülasyonu ayırt edilebilir. Bu yerelleştirme, bu bağlamda, sitosol boyunca her yerde mevcut olan çoğu GECIs üzerinde bir avantaj confers - örneğin, GCaMP22, GCaMP321, veya GCaMP623 - bu önceden ve postsynaptic geçici olabilir anlamına gelir çünkü nöron aktivasyonu sonucu oluşan genel entegre kalsiyum akını ayırt. Bu, öğrenme ve hafıza oluşumuna neden olan veya bunun sonucu olarak ortaya çıkan plastisitenin konumu ve türleri hakkında ipuçları sağlayabilir. Örnek olarak, burada sağlanan protokol, kalsiyum sensörünün ekspresyonunu sadece postsynapse'ye doğru hedefleyerek koku alma sırasında MB çıkış nöronların modülasyonunu çözmede bu aracın değerini göstermektedir. İzleyerek, tek bir sinek içinde, koku kondisyon öncesi ve sonrası koku uyarılmış aktivite naif bir koku tepkisi ve öğrenilen bir koku tepkisi arasında doğrudan bir karşılaştırma çizilebilir. Aynı görüntüleme odasında sabit iken, sinekkokular bir seçim maruz kalır. Daha sonra, bu kokulardan birinin elektrik şokuyla eşleştirilmiş olduğu (CS+olma) ve başka bir kokunun takviye olmadan sunulduğu (CSolma - )bir önleyici bağdaştırıcı koşullandırma protokolü alırlar. Son olarak, sinekler yine ilk adımda olduğu gibi aynı kokulara maruz kalırlar. Kalsiyum dinamiği iki foton mikroskopi ile gözlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transgenik meyve sinekleri, Drosophila melanogaster
- Çapraz dişi bakire ve erkek sinekler (12 saat açık/karanlık bir döngüde %60 bağıl nemde 25 °C'de yükselir) istenilen Gal4'ü taşır ve UAS, belirli ilgi nöronlarının genetik olarak kodlanmış bir şekilde ifade ettiği sinekleri üretmek için sırasıyla25'iinşa eder. kalsiyum göstergesidir.
- Yaş onlar 3-6 gün post-klozyon aralığında olana kadar yukarıdaki haç kadın soyundan. Dişi sinekler biraz daha büyük boyutları nedeniyle tercih edilir.
2. In vivo kalsiyum görüntüleme için meyve sineği hazırlanması
- Tek bir dişi sinek seçin ve en fazla 5 dakika buz üzerinde anestezi.
- İnce çömeçler kullanarak, sineği görüntüleme odasına yerleştirin (Şekil 1c'degösterilmiştir). Toraks ve bacakların odanın altındaki elektrik telleriyle temas halinde olduğundan ve başın düz olduğundan emin olun. Net yapışkan bant kullanarak sineğin konumunu düzeltin.
NOT: Bu protokol, sineklerin sabit olduğu, baş kapsülünün açılması için erişilebilir olduğu ve sineklerin antenlere hem de toraks ve bacaklara elektrik şoklarına hem koku stimülasyonu alabildiği özel olarak inşa edilmiş bir oda gerektirir(Şekil 1). - Neşter sapına sabitlenmiş cerrahi bir neşter bıçağı (Bkz. Malzemeler Tablosu),sineğin başının etrafındaki bantta bir pencere keserek anteni kapalı ve toraksın sadece ön kısmını açıkta bırakarak.
- Mavi ışık kür tutkal ile başın yanve arka surround, dikkatle içbükey-dışbükey çeneler tarafından düzenlenen bir böcek pimi kullanılarak manipüle. Mavi ışık yayan LED lamba kullanarak tutkal ayarlayın.
- Tutkal tamamen ayarlanmış olup olmadığını kontrol edin ve sinek başının sırt yüzeyinden herhangi bir kalıntı sertleşmemiş tutkal temizleyin.
- Başın açıkta kalan manikülünü örtmek için bir damla Ringer çözeltisi24 (Bkz. Malzeme Tablosu)uygulayın.
- Çok ince bıçaklı bıçak kullanarak, miğanı keserek. Miteliğin en verimli şekilde çıkarılması için, ilk olarak ocelli'yi başlangıç noktası olarak kullanarak başın arka tarafına kesin. Sonra, her iki tarafı kesip, gözlere medial, kolayca forseps kullanılarak yırtılmış olabilir mite bir flep oluşturmak için.
- İlgi beyin bölgesini bloke edebilir herhangi bir aşırı mitikül kaldırın.
- İnce prizler kullanarak herhangi bir trakeanın dorsal yüzeyini dikkatlice temizleyin, beyin dokusunun bozulmasını önleyin. Doku enkaz alanını temizlemek için ringer'ın çözeltisi24'ü (Bkz. Malzeme Tablosu)çıkarın ve yenileyin.
- Hipodermik koku iletim iğnesini sinek başından yaklaşık 1 cm uzakta, pozisyona yerleştirin. Antene koku iletimini engelleyecek hiçbir şey olmadığından emin olun.
- Mikroskopta, görüntüleme odasını hipodermik koku dağıtım iğnesi ile koku dağıtım sistemine bağlayın.
- Sineğin anestezi ve ameliyattan tam olarak kurtulması ve hava akışına uyum sağlaması için bu aşamada 10 dk'lık bir dinlenme süresi uygulayın.
3. In vivo kalsiyum görüntüleme
- Bir kızılötesi lazer ve bir su daldırma amacı ile donatılmış bir multifoton mikroskop kullanın (Malzemeler Tablosubakınız), titreşim izole bir tablo üzerine yüklü. GFP tabanlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için lazeri 920 nm'lik uyarma dalga boyuna ayarlayın ve GFP bant geçiş filtresi tonu kurun.
- Kaba Z ayar buzlemi kullanarak, beynin Z ekseni üzerinden tarayıp ilgi çekici beyin bölgesini bulun. Tarama süresini en aza indirmek için yalnızca bu alana odaklanmak ve kafanın ön kısmı aşağı bakacak şekilde tarama görünümünü döndürmek için kırpma işlevini kullanın.
- Çerçeve boyutunu 512 x 512 px'e ayarlayın, hızı > 4 Hz'e ayarlayın ve ilgi çeken nöronların kapsanması için (Y boyutunda) taşkınlık bölgesini takın.
4. Koku alma koşullandırması ile koku uyandıran kalsiyum geçicilerinin görselleştirilmesi
- Bir koku dağıtım sistemi kullanın19,26 bir zamansal hassas bir şekilde çeşitli koku uyaranları sunabilir.
- Cihazı kontrol etmek ve deneyler sırasında koku uyarımlarını görüntü yakalama yla koordine etmek için görüntüleme mikroskop yazılımıyla iletişim kurmak için ek bir bilgisayar kullanın.
- Harici bir girdiye yanıt veren görüntü edinme yazılımı ve koku dağıtım programını (örneğin, mikroskop kontrol yazılımına yüklenmiş bir VBA makro paketi, bkz. Malzeme Tablosu'nabakın) bağlayabilecek önceden programlanmış bir makro paketi başlatın ayrı bir programda bir koku dağıtım protokolü başlatılması ile sağlanan tetikleyici).
- 512 x 512 px çözünürlükte "ön eğitim"/naif koku uyarılmış kalsiyum geçicilerini ve 4 Hz. Kare lik bir kare hızını izleyerek ölçüme başlayın. 0 temel değeri) ve 12.5 s sonra koku ofset. Bunu ikinci bir koku yla ve üçüncü bir koku yla tekrarlayın.
- Klasik klima ("eğitim") sinek ile bu ölçümden sonra 3 dakika devam edin.
- CS+ koku ve başka cs olmak için "ön eğitim" aşamasında sunulan kokuları birini seçin- koku. 12 90 V elektrik şoku ile birlikte 60 s için bilgisayar kontrollü koku teslim sistemi kullanarak CS+ koku mevcut.
- 60 s aradan sonra, CS mevcut- 60 s. koku 4-metilsikloheksanol ve 3-oktanol olarak kullanın tek başına koku. Üçüncü odorant (örneğin, 1-octen-3-ol) bu eğitim sırasında sadece önce kontrol olarak kullanılan olarak (adım 4.2.) ve sonra (adım 4.4) eğitim aşamasından sonra sunmayın.
- Eğitim aşamasını bitirdikten sonra "eğitim öncesi" koku stimülasyon protokolünü (adım 4.2.) 3 dk tekrarlayarak "eğitim sonrası" koku uyarılmış kalsiyum geçicilerini tekrar ölçün (adım 4.3).
NOT: Bu adımın zamanlaması bellek oluşumundan sonraki ilgi süresini yansıtmalıdır (örn. kısa süreli belleği araştırmak için koşullandırma adımından 3-4 dk sonra bu adımı gerçekleştirin). Tipik olarak, sinekler bu hazırlık birkaç saat yaşayabilir. - Görüntüleme dosyalarını daha sonraki görüntü analizi için uygun bir biçimde (örneğin, Tiff) kaydedin.
5. Görüntü analizi
- Görüntüleri analiz etmek için, Fiji27gibi görüntü analizi yazılımında Tiff (veya benzeri) dosyaları açın.
- X ve Y yönünde en az hareketi sağlamak için bir hareket düzeltme algoritması kullanarak yığınları hizala. Z ekseninde güçlü hareket gösteren tüm kayıtları atın.
- İncelenecek alanın etrafındaki ilgi alanını (YG) işaretlemek için kullanılan yazılımın aracını seçin. Bu arka plan floresan etkisini sınırlamak için mümkün olduğunca hassas olmalıdır.
- Seçilen YG'den veri dosyaları olarak zamansal floresan yoğunluğu verilerini ayıklamak için yazılımın ilgili aracını kullanın, böylece kaydın her karesi için bir değer oluşturulur.
- Her koku izleme için ΔF/F0 değerlerini hesaplamak için bir veri analiz programı kullanarak verileri açın. F0 = koku başlamadan önce 2 s ortalama floresan. ΔF = belirli bir çerçevedeki ham floresan ile F0arasındaki fark . Bu değerlerden, koku uyarıcı dönemi boyunca göreceli floresan yansıtacak şekilde zamana karşı çizilebilen her kare için bir ΔF/F0 değeri hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokol ile elde edilen görüntülerin bir örneği Şekil 2'degörülebilir. d Homer-GCaMP3 olan dendritler MB γ-lob bölmesi 1 innervate bir MB çıkış nöron ifade edilir (nöron MVP2 denir28,29) ve genetik split-Gal4 hattı MB112C16kullanılarak hedeflenir . Ayrıca, gösterdi bir sitosolik ve post-synaptically lokalize kalsiyum indikatörü subsellüler lokalizasyon farkıdır. Şekil 2a ve Şekil 2f'yikarşılaştırırken, dHomer-GCaMP3 sensörü14'ün spesifik, bölümlere ayrılmış ifadesini net bir şekilde gözlemleyebilir - nöronun aksonal bölmelerinde ifade bulunmadan ve noktalanmış bir sinyal görünür dendritik bölmede. Berrak - ancak alt genlik - koku yanıtları dHomer-GCaMP3 ifade sineklerde görülebilir(Şekil 2, alt paneller), sitosolik GCaMP6f ifade sinekler ile karşılaştırıldığında23 (Şekil 2, üst paneller). Bu, aracın postinometre düzeyinde koku yanıtlarının görselleştirilmesinde etkili olduğunu gösterir ve bu nedenle, altta yatan nöral devrelerin incelenmesine ek bir özgüllük sağlar, bu durumda, koku kodlama ve koku öğrenme.
İkinciörnek Şekil 3'tegörülebilir. Bu deneyde, dHomer-GCaMP3 Şekil 2 olarak ifade edilir - mantar vücut çıkış nöron MVP2. Bu bir nöron gibi koku öğrenme yoluyla modüle olduğu bilinen önnapif koku klima bir sonucu olarak presinaptik depresyon eğitimli koku28,29 ve burada bir vefat postsinaptik yanıt yansıtılır bu sonucun teyidi in vivo kalsiyum görüntüleme protokolü kullanılarak gösterilmiştir. Şekil 3'te gösterilen kalsiyum izleri tek bir sinekten örnek verileri temsil eder. Gürültü seviyesi ve genlik bireysel preparatlar arasında değişebilir (örneğin, Şekil 2e ve Şekil 3c-ekarşılaştırın). Bu nedenle, eğitim öncesi ve sonrası hayvan içi karşılaştırması, bireysel değişkenliği hesaba katmanın bir yolunu sağlar. Tabii ki, protokol ilgi diğer nöronların görüntüleme aktarılacak uygundur.
Şekil 1: Montaj odasının inşası ve bir sineğin görüntüleme için hazırlanması. (a) Sinek montaj odasının inşası için adımlar. Taban, ince plastik bir kafesle kaplı standart bir mikroskop kaydırağından (1) oluşur (2). Karşıt yükleri taşıyan iki elektrik kablosu (3) her iki taraftaki slayta yapıştırılır. Teller sökülüp bükülür (4) birbirine paralel çalışan ancak temas halinde olmayan kaydırağı geçmek için bükülür. Bir sineğin yüksekliğine (yaklaşık 1 mm) ulaşana kadar net yapışkan bant (5) katmanları eklenir. Bir kanal, bir sineğin genişliğine uyacak şekilde yaklaşık 1 mm genişliğinde dikey olarak (6) teyp üzerinden kesilir. Açık yapışkan banttan yapılmış yüksek bir platform (7), toraks tellerin üzerindeyken sinek başı için bir yastık oluşturmak için elektrik tellerinin hemen üzerine inşa edilmiştir. (b) İki foton mikroskobu altında konumlandırılmış sineğin şematik illüstrasyonu. Koku stimülasyon sinek başının önünde konumlandırılmış bir hipodermik iğne ile elde edilir (bant (6) ve platform (7) üstüne antenin kokuları yönlendirmek için kanal aracılığıyla yerleştirilir). (c)-(h) Sinek başının sabitlenmesi ve açılması. (c)Görüntüleme odasının içinde, kanalın içinde sabitlenmiş bir sinek (Ölçek çubuğu = 1 mm) ve tüm sineğe ait taze bir yapışkan bant parçası yla yerinde tutulur. (d) Pozisyonda sinek büyütülmüş görünümü. Ölçek çubuğu = 0,1 mm. (e) Bir pencere sinek başının etrafındaki bantiçine kesilir. (f) Baş daha mavi ışık kür tutkal ile sabitlenir. (g) Baş kapsülü Ringer çözeltisi ile kaplanır ve açılır. (h) Beynin aşırı doku ve trakea ile hazırlanması nı tamamlamış (beyaz doku görünür (g) çıkarıldı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Postsynaptically-lokalize kalsiyum dHomer-GCaMP3 kullanılarak görselleştirilmiş. (a) MB çıkış nöron MVP2'de sitosolik lokalize GCaMP6f (i) ve postsynaptically lokalize dHomer-GCaMP3 (ii) ekspresyonu gösteren konfokal miksoskopi görüntüleri. Yeşil ok MB γ-lob γ1 alt bölgesini gösterir. Ölçek çubukları = 15 μm. (b)-(d) Yukarıdaki genotiplerin iki foton uyarma mikroskobu kullanılarak çekilen ve ilgili kalsiyum sensörlerinin in vivo floresansını gösteren görüntüler. (b) F0 (bazal floresan) görüntüler, koku başlamadan önce 2 s ortalama yoğunluk projeksiyonolarak gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 10 μm. (c) Fkoku görüntüleri (koku stimülasyonu sırasında floresan), koku tepki süresi (2,5 s) boyunca ortalama yoğunluk projeksiyonu olarak gösterilmiştir. (d) Gerçek koku tepki sinyalini göstermek için F0 görüntüsünüFkoku görüntüsünden çıkararak oluşturulan ΔF görüntüleri. (e) ΔF/F0, yukarıdaki genotiplerin bir koku stimülasyonu (gri çubuk) yoluyla sineklerinden izler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Öğrenmekaynaklı postsinaptik plastisite d Homer-GCaMP3 ile görselleştirilmiş. (a) Bu deneylerde kullanılan koşullandırma protokollerinin şeması. Naif koku yanıtları, klima önce ("pre") ilk ölçülür. Sonra her sinek üç olası klima protokollerinden birini deneyimler: "Eşleştirilmiş", burada bir koku (CS+) elektrik şokları (ABD) ve başka bir (CS-) ile eşleştirilmiş takviye edilmez; "Kokular sadece", sadece kokular sunulmaktadır, her ikisi de takviye olmadan, kokuya maruz kalma etkileri için kontrol etmek; ve "Sadece şoklar", sadece elektrik şokları herhangi bir koku uyaranları olmadan sunulmaktadır, şoka maruz kalma etkileri için kontrol etmek. Bu koşullandırma aşamasından sonra sinekler, değiştirilmiş koku uyandıran aktiviteyi ("Post") test etmek için tekrar "Pre" kokularına maruz kalırlar. (b) Eşleştirilmiş koku/şok sunumu sonucunda koku tepkisi modülasyonunun bir örneğidir. CS+ koku yanıtı güçlü bastırma γ1 alt bölgesinde görülebilir (noktalı çizgi). (c)-(e)Koku tepkisi,(b)ile aynı sineğin izlerini gösterir ve bu bastırma etkisinin sadece eğitilmiş koku durumunda gözlendiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Öğrenme ve hafızanın altında yatan nöral devrelerin diseksiyonu nöroloji alanında önemli bir hedeftir. Drosophila genetik erişilebilirlik ve genişliği ve davranışsal test kolaylığı bu tür olayları araştırmak için ideal bir araç yapar. Burada, koku alma koşullandırması sonucunda hücre altı düzeyde meydana gelen modülasyonu tek tek sinekler içinde görselleştirmenin mümkün olduğu bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak17.grubumuz tarafından kurulan koku uyarılmış kalsiyum dinamiğinin hem eğitim öncesi hem de eğitim sonrası görselleştirmesini gerçekleştirerek, naif ve öğrenilmiş koku yanıtları arasında doğrudan, hayvan içi bir karşılaştırma yapmak mümkündür ve bu nedenle, ilgi nöronların plastisite incelemek. Bu, bu protokole toplu değerlendirmeler (klasik koku alma kondisyonlarında kullanılan) üzerinde bir avantaj sağlar, çünkü eğitim öncesi ve sonrası durumlar bireyler için nicel olarak değerlendirilebilir, bu da bireyin bireysel olarak Çeşitliliğine. Ayrıca, doğrudan mikroskop altında gerçekleştirilen eğitim prosedürü büyük ölçüde genellikle davranışsal deneylerde kullanılan klasik koku klima paradigması eşdeğerdir ve nöronların yapay optogenetik stimülasyon içermez. Tabii ki, küçük sinekler işleme ve dikkatlice duyu organları bozulmadan tutarken beyin dokusuzarar vermeden baş kapsülü açılması, titiz ve tekrarlanan eğitim ile elde edilebilir bir uzmanlık düzeyi gerektirir, ölçüde görülen aksine elektrofizyoloji gibi fizyolojik değerlendirmeler.
Ayrıca, tek nöron düzeyinde plastisite incelemek için lokalize kalsiyum göstergeleri kullanma potansiyeli gösterilmiştir - nöronal devre diseksiyonu için daha fazla hassasiyet ekleyerek. Bu iyi araştırılmış MB çıkış nöron bir postsinaptik yanıt öğrenme kaynaklı depresyon göstererek örneklenmiştir28,29. Drosophila suşları UAS kontrolü altında sinaptically lokalize floresan sensörler çeşitli ifade mevcuttur, örneğin, presynaptically lokalize sensör Synaptophysin-GCaMP3 veya sinaptik kırmızı floresan sensörü ifade şanzıman Synaptophysin-pHTomato20. Tabii ki, floresan sensör proteinlerinin çeşitliliği yukarıda açıklanan protokol kullanılarak uygulanabilir.
Optik görüntüleme teknikleri genel olarak mikroskobik görüntü edinim sisteminin (örneğin, iki fotonlu mikroskop) zamansal ve mekansal çözünürlüğü ve sensörün kendisinin zamansal çözünürlüğü (örn. kalsiyum sensörünün kinetikleri) ile sınırlıdır. Elektrofizyolojik kayıtlar, örneğin, Drosophila beynindeki nöronların somatasından yama kıskaç elektrofizyolojisi kullanarak, hala eşsiz bir zamansal çözünürlük sunar, ancak herhangi bir uzamsal hassasiyet sağlamadan. İlgi nöronlarında gen ekspresyonunun özgüllüğü ve sensörün hücre altı lokalizasyonu nedeniyle, optik görüntüleme teknikleri potansiyel olarak elektrofizyolojik teknikleri tamamlayabilir ve altta yatan nöronal plastisiteyi ortaya çıkarabiliyor. öğrenme ve hafıza oluşumu. Floresan sensörlerin in gelişiminde ki sürekli ilerleme belki de sensör proteinlerini daha hızlı kinetik veya daha yüksek sinyal-gürültü oranlarıyla (örneğin, GCaMP6 varyantları23)sinaptitik lokalize proteinlerle kaynaştırma olanağı sağlayacaktır. DHomer gibi. Ayrıca, daha hızlı edinim oranları veya daha yüksek mekansal çözünürlük ile mikroskobik teknikler kurulmasında son gelişmeler yaklaşımımızın daha ince ayar paha biçilmez kanıtlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Alman Araştırma Konseyi tarafından SFB 889 "Duyusal İşleme Mekanizmaları" ve 2705 "Beyin Devresinin Diseksiyonu: Yapı, Plastisite ve Davranışfonksiyonu" araştırma birimi aracılığıyla desteklenmiştir. Drosophila Mantar Vücut".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
- Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
- Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
- de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
- Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
- Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
- Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
- Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
- Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
- Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
- Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
