Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, Mikrogefäße aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems von lissenzephalischen und gyrencephalen Wirbeltieren zu isolieren.
Abstract
Die Isolierung von Mikrogefäßen aus dem Zentralnervensystem (ZNS) wird häufig durch die Kombination von kortikalem Gewebe von mehreren Tieren, meist Nagetieren, durchgeführt. Dieser Ansatz begrenzt die Abfrage von Eigenschaften der Blut- und Hirnschranke (BBB) auf den Kortex und lässt keinen individuellen Vergleich zu. Dieses Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung einer Isolationsmethode, die den Vergleich der neurovaskulären Einheit (NVU) aus mehreren ZNS-Regionen ermöglicht: Kortex, Kleinhirn, Optiklappen, Hypothalamus, Hypophyse, Hirnstamm und Rückenmark. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll, das ursprünglich für murine Proben entwickelt wurde, erfolgreich für den Einsatz an ZNS-Geweben kleiner und großer Wirbeltierarten angepasst, von denen wir auch Mikrogefäße aus weißer Materie der Gehirnhälfte isolieren können. Diese Methode, in Kombination mit Immunolabeling, ermöglicht die Quantifizierung der Proteinexpression und einen statistischen Vergleich zwischen Individuen, Gewebetyp oder Behandlung. Wir haben diese Anwendbarkeit bewiesen, indem wir Veränderungen der Proteinexpression während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), einem murinen Modell einer neuroinflammatorischen Erkrankung, Multipler Sklerose, bewertethaben. Zusätzlich könnten Mikrogefäße, die mit dieser Methode isoliert werden, unter anderem für nachgelagerte Anwendungen wie qPCR, RNA-seq und Western Blot eingesetzt werden. Auch wenn dies nicht der erste Versuch ist, ZNS-Mikrogefäße ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder enzymatischer Dissoziation zu isolieren, ist es in seiner Fähigkeit für den Vergleich einzelner Individuen und mehrerer ZNS-Regionen einzigartig. Daher ermöglicht es die Untersuchung einer Reihe von Unterschieden, die sonst unklar bleiben können: ZNS-Teile (Cortex, Kleinhirn, optischer Lappen, Hirnstamm, Hypothalamus, Hypophyse und Rückenmark), ZNS-Gewebetyp (graue oder weiße Materie), Personen, experimentellen Behandlungsgruppen und Arten.
Introduction
Unser Gehirn ist das wichtigste Organ in unserem Körper. Aus diesem Grund ist es eine Priorität, die Homöostase des Gehirns trotz externer Faktoren zu halten, die eine Abweichung von der Normalität auslösen können. Einigen Gelehrten zufolge entwickelten Wirbeltierevoretwa 400 bis 500 Millionen Jahren das, was wir heute als Blut-Hirn-Schranke (BBB)2,3bezeichnen. Dieser schützende "Zaun" übt den größten Einfluss auf die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) aus und wirkt, indem er den Transport von Ionen, Molekülen und Zellen zwischen Blut und ZNS-Parenchym streng reguliert. Wenn die BBB gestört ist, wird das Gehirn anfällig für toxische Exposition, Infektion, und Entzündungen. Daher, BBB Dysfunktion ist verbunden mit vielen, wenn nicht alle, neurologische und neuroentwicklungsbedingten Störungen4,5,6.
Die ausgeklügelte Funktion des BBB wird der einzigartigen ZNS-Mikrovaskulatur zugeschrieben, die von der neurovaskulären Einheit (NVU)2,3angepasst wird. Hochspezialisierte Endothelzellen, Pericyten und astrozytäre Endfüße sind die zellulären Komponenten der NVU2,3. Die von diesen Zellen erzeugte extrazelluläre Matrix ist auch für die NVU- und BBB-Physiologie2,3von wesentlicher Bedeutung. Obwohl wesentliche zelluläre und molekulare Komponenten der NVU unter Wirbeltieren konserviert werden, wird Heterogenität zwischen Ordnungen und Arten7,8berichtet. Technische Einschränkungen behindern jedoch unsere Fähigkeit, diese Unterschiede in der Neurobiologie, Biomedizin oder translationalen Forschung vollständig zu berücksichtigen.
Aus diesem Grund haben wir eine CNS-regionsspezifische Mikrogefäß-Isolationsmethode erweitert, um sie auf zahlreiche Arten aus allen fünf Wirbeltiergruppen anzuwenden: Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere. Das Protokoll wird für die Anwendung an klein-lissenzephalischen und großkreiselzephalen Wirbeltieren beschrieben, einschließlich Arten mit translationaler Relevanz9. Darüber hinaus schließen wir andere Regionen des ZNS ein, die in diesem Zusammenhang noch nicht untersucht wurden, aber für die Neurophysiologie relevant sind und enorme klinische Auswirkungen haben: Hypothalamus, Hypophyse und weiße Materie. Schließlich haben wir die Fähigkeit dieser Isolationsmethode als zuverlässiges Werkzeug getestet, um Veränderungen der Proteinexpression entlang der NVU und/oder BBB9,10,11zu identifizieren. Als Proof-of-Concept haben wir gezeigt, wie Veränderungen der VCAM-1- und JAM-B-Expression während der EAE mithilfe der Isolationsmethode gefolgt von Immunfluoreszenz bestimmt werden können.
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Protocol
Alle Verfahren der vorliegenden Studie entsprechen den Richtlinien der University of California (UC), davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Die Tierpflege an der UC Davis wird durch mehrere unabhängige Ressourcen reguliert und ist seit 1966 von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) voll akkreditiert. Porcine CNS Gewebe wurden von UCD Department of Animal Sciences, Meat Sciences Laboratory gewonnen. ZNS-Gewebe aus Rhesus-Makaken wurden vom California National Primate Research Center Pathology Department (NIH P51OD011107) gewonnen. Keine Anästhesie, Euthanasie oder Nekropsie wurde von Labormitarbeitern an Schweinen und Makaken durchgeführt. Daher gibt es keine besonderen Empfehlungen zu diesen Fragen.
HINWEIS: Diese Methode wurde für mehrere Arten validiert, aber das bereitgestellte Protokoll entspricht direkter Maus- und Schweinegewebe. Details zum Optischen Lappen gelten nicht bei der Verwendung von Säugetierproben. Alle biogefährlichen Stoffe müssen in einer geeigneten Biosicherheitseinrichtung (BSL) behandelt werden. Alle akut toxischen Materialien müssen unter einer Dunstabzugshaube behandelt werden. Alle biogefährlichen medizinischen Abfälle und akut giftigen Abfälle müssen ordnungsgemäß entsorgt werden.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie Lösungen(Tabelle 1) mindestens einen Tag im Voraus vor.
HINWEIS: Es ist sehr schwierig, 70 kDa Molekulargewicht (MW) Dextran aufzulösen. Es ist effizienter, die Lösung über Nacht entweder mit Paraffinfolie oder Folie umrühren zu lassen. Das Protokoll erfordert die Verwendung von zwei verschiedenen MV-2-Lösungen, abhängig von der untersuchten Probe. Der 18% Dextran trennt das Myelin effizient vom Mikrogefäßpellet, wenn das Protokoll an kleinen lissenzephalen Proben ausgeführt wird. Es entwickelt jedoch einen Abstrich von Myelin innerhalb der Schnittstelle von ZNS-Geweben von großen gyrencephalen Proben, sowie dem Hypothalamus und der Hypophyse von kleinen Proben. Dieser Abstrich wird durch die Verwendung von 20% dextran verhindert. - Bereiten Sie Well-Dias vor, indem Sie 50 l pro Bohrung von Poly-D-Lysin beladen und 2 h bei Raumtemperatur (RT), vorzugsweise in einem biologischen Sicherheitsschrank Klasse 2 (BSC-2), trocknen lassen. Nicht übertrocknen. Zweimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) abspülen und im Kühlschrank aufbewahren, bis er einsatzbereit ist.
2. ZNS Gewebesektion aus kleinen Lissenzephalic Vertebrate Specimen
HINWEIS: Der Artikel zeigt die Anwendung des Protokolls auf einer C57BL6/J, 10 Wochen alt, 25 g, männliche Maus.
- Bereiten Sie zwei 15 ml konische Rohre und ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit 5 ml bzw. 1 ml MV-1 Lösung pro Probe vor. Rohre auf Eis halten.
- Anästhesisierung
- Anästhesisieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion eines Ketamin-, Xylazin- und Acepromazin-Anästhetikum-Cocktails bei 100/10/3 mg pro kg Körpergewicht und sprühen Sie mit 70% Ethanol. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie das Fehlen von palpebralen und Pedalreflexen bewerten, indem Sie ein Auge berühren bzw. einen Fuß kneifen.
- Tauben durch Einatmen von 5% Isofluran mit einem Induktionsanästhesiekasten anästhesieren.
- Anästhetisieren Sie Fische und Frösche in 1% Tricaine entweder in einem Fisch, der Wassertank oder Amphibienringer-Lösung(Tabelle der Materialien) hält.
- Eidechsen durch Abkühlen bei 4 °C vor der Euthanasie anästhesieren.
- Enthaupten Sie das Tier mit einer chirurgischen Schere, schälen Sie die Haut mit Zangen, um den Schädel freizulegen, und schneiden Sie mit LaGrange Schere durch das Foramen magnum (Abbildung 1A).
- Sezieren Sie das Gehirn mit einem Spachtel und übertragen Sie auf ein 15 ml konisches Rohr mit MV-1-Lösung. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
- Holen Sie die Hypophyse aus der Sella-Turcica des Schädels mit Zange und übertragen Sie auf ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit MV-1-Lösung. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
- Entfernen Sie die Haut und den Muskel, um die Wirbelsäule freizulegen. Gliedmaßen, Rippenkäfig und innere Organe ausschneiden (Abbildung 1B).
- Sezieren Sie das Rückenmark durch eine der beiden unten beschriebenen Methoden. Dann in ein 5 ml konisches Rohr mit MV-1 Lösung übertragen. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
- Führen Sie die Laminektomie durch Schneiden in eine rostrale bis kaudale Richtung mit laGrange Schere, beginnend durch den Halswirbel Foramen, bis zum Erreichen der Lendenschnur.
- Spülung in kaudaler bis rostraler Richtung im Lendenwirbelforamen mit einer 18 G Nadel und einer 10 ml Spritze, die mit MV-1-Lösung beladen ist (Abbildung 1C,D).
HINWEIS: Diese Methode funktioniert nur mit sehr kleinen Proben, meist Nagetieren (<100 g).
- Schneiden Sie mit einem Sezieren den Dur-Sack mit einer Federschere aus dem Rückenmark und entfernen Sie die restlichen Meningen mit einem doppelzackigen Pick (Abbildung 2).
- Übertragen Sie das Gehirn auf eine Petrischale und entfernen Sie die Meningen mit einem doppelzackigen Pick (Abbildung 2A-C).
- Die Olfaktor-Glühbirnen und thalamus mit Zangen, Irisschere und Federschere verbrauchen. Entfernen Sie den Aderhautplexus mit dem doppelzackigen Pick aus allen Hirnventrikeln. Achten Sie darauf, alle Aderhaut plexus zu entfernen.
HINWEIS: Der Aderhautplexus und die Olfaktor-Lampen sind eine massive Kontaminationsquelle. Im Gegensatz zum BBB sind diese Kapillaren stark verfälscht und die Ergebnisse der nachfolgenden Experimente werden kompromittiert, wenn sie nicht entfernt werden. - Mit Zangen, trennen Sie die verschiedenen ZNS-Regionen: Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen (nicht auf Säugetierproben) und Hypothalamus.
3. ZNS Gewebesektion aus einem großen gyrencephalen Wirbeltier
HINWEIS: In diesem Protokoll werden zindertiertes Zinngewebe aus einem Schlachthof verwendet. Daher wird hier keine Anästhesie, Euthanasie oder Nekropsie beschrieben oder gezeigt.
- Transport von ZNS-Geweben mit Schweinen in einem 0,946 L (32 oz) Histologiebehälter, der mit MV-1-Lösung beladen ist, in einer Eistruhe/Eimer.
- Entfernen Sie die Meningen mit einem doppelzackigen Pick, Zangen, Irisschere und Federschere aus jedem ZNS-Gewebe. Achten Sie darauf, alle Stücke von Aderhautplexus aus dem Gehirn Ventrikeln zu entfernen.
4. ZNS Gewebehomogenisierung
HINWEIS: Es ist effizienter, wenn zwei Forscher in den Homogenisierungsprozess einsteigen: einer seziert die Meningen unter dem Stereoskop und der andere homogenisiert das Hackfleisch. Auf diese Weise werden die Gewebe schnell in den Eiskübel zurückgeführt und kalt gehalten.
- Platzieren Sie jede CNS-Region auf einer Petrischale mit einer MV-1-Lösung von 1 ml. Mit einer einschneidigen Klinge das Gewebe zerkleinern, um 1–2 mm Stücke zu erhalten.
- Für eine kleine Wirbeltierprobe eine 100 mm x 20 mm Petrischale verwenden.
- Für eine große Wirbeltierprobe verwenden Sie eine 150 mm x 15 mm Petrischale.
- Homogenisierung eines kleinen Wirbeltiers (Tabelle 2 und Tabelle 3)
- Übertragen Sie den Kortex, das Kleinhirn, das Hirnstamm, den Sehlappen und das Rückenmark in eine individuelle 10 ml Potter-Elvehjem Glasgewebeschleifmaschine mit einem PTFE-Stößel mit einer Transferpipette von 1 ml MV-1-Lösung. Fügen Sie 5 ml MV-1-Lösung hinzu und homogenisieren Sie jedes Gewebe (ca. 10 Striche). Transfer in einzelne 15 ml konische Rohre. Rohre auf Eis halten.
HINWEIS: Für ein kleines Wirbeltier, 5 oder 4, mit oder ohne Sehlappen, werden jeweils 10 ml Potter-Elvehjem-Schleifmaschinen und 15 ml konische Röhren benötigt. - Hypothalamus und Hypophyse mit Zangen in ein individuelles 1,7 ml-Rohr mit Zangen in eine MV-1-Lösung mit 100 l übertragen und mit einem Glasmikropestle sorgfältig homogenisieren. Spülen Sie jede Mikropestle mit einer MV-1-Lösung von 1 ml. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
HINWEIS: Für ein kleines Wirbeltier werden 2 Glasmikroschädlinge und 1,7 ml Röhren benötigt.
- Übertragen Sie den Kortex, das Kleinhirn, das Hirnstamm, den Sehlappen und das Rückenmark in eine individuelle 10 ml Potter-Elvehjem Glasgewebeschleifmaschine mit einem PTFE-Stößel mit einer Transferpipette von 1 ml MV-1-Lösung. Fügen Sie 5 ml MV-1-Lösung hinzu und homogenisieren Sie jedes Gewebe (ca. 10 Striche). Transfer in einzelne 15 ml konische Rohre. Rohre auf Eis halten.
- Homogenisierung eines großen Wirbeltiers (Tabelle 4 und Tabelle 5)
- Mit einer Transferpipette das Hackfleisch auf einen 55 ml Potter-Elvehjem Glasgewebeschleifer mit einem PTFE-Stößel übertragen und an einem Oberrührer befestigen. Fügen Sie die Hälfte des empfohlenen Volumens der MV-1-Lösung je nach dem zu homogenisierenden ZNS-Teil hinzu (Tabelle 5).
- Schalten Sie den Oberrührer bei sehr niedriger Geschwindigkeit (ca. 150 U/min) ein und bewegen Sie das Glasrohr vorsichtig für ca. 30 s nach oben und unten.
- Schalten Sie den Overheadrührer aus, fügen Sie weitere MV-1-Lösung hinzu und wiederholen Sie Schritt 4.3.2, bis Sie eine homogene Gülle erhalten.
- Transfer in ein 50 ml konisches Rohr. Halten Sie Dieröhre auf Eis.
- Waschen Sie den Schleifer mit entionisiertem Wasser zwischen jeder ZNS-Gewebehomogenisierung.
HINWEIS: Für ein großes Wirbeltier 5 oder 4, mit oder ohne weiße Materie, werden jeweils 50 ml konische Röhren benötigt. Ebenso werden zwei (2) 15 ml konische Röhren für den Hypothalamus und die Hypophyse benötigt.
5. Mikrogefäßreinigung
- Zentrifugengewebe homogenate aus Schritt 4.2.1, 4.2.2 oder 4.3.4 bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Auf der Oberseite der Pellets der rötlichen Mikrogefäße bildet sich eine große weiße Schnittstelle von Myelin. Entsorgen Sie die Überräube.
- Kleine Wirbeltierprobe (Tabelle 2 und Tabelle 3)
- Setzen Sie die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm-, Sehlappen- und Rückenmarkspellets in 5 ml eiskalter MV-2-Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette (10 Spülungen) wieder auf. Fügen Sie 5 ml eiskalte MV-2-Lösung zu jeder Suspension hinzu und mischen Sie sorgfältig, indem Sie die Rohre umdrehen.
- Den Hypothalamus und die Hypophysenpellets mit 1 ml MV-2-Lösung aussetzen.
- Große Wirbeltierprobe (Tabelle 4 und Tabelle 5)
- Fügen Sie 20 ml eiskalte MV-2-Lösung in die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksmikrovessel-Pellets. Setzen Sie die Pellets durch Mischen auf einem Röhrenrevolver-Shaker wieder auf, rühren Sie bei 40 U/min für 5 min. Gleichgewichten sie die Volumen der konischen Röhren von Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmarkssuspensionen, indem Sie weitere MV-2-Lösung hinzufügen.
- Den Hypothalamus und die Hypophysenmikrovesselpellets in 5 ml MV-2-Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette (10 Spülungen) wieder aufsetzen. Fügen Sie 5 ml eiskalte MV-2-Lösung zu den Suspensionen hinzu und mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr umdrehen.
- Kleine Wirbeltierprobe (Tabelle 2 und Tabelle 3)
- Zentrifuge bei 4.400 x g für 15 min bei 4 °C.
- Lösen Sie vorsichtig die dicke und dichte Myelinschicht an der Flüssigkeitsschnittstelle von den Wänden jedes Rohrs, indem Sie die Rohre langsam drehen und den Überstand an den Wänden entlang bewegen lassen.
- Entsorgen Sie die Myelin- und Flüssigkeitsschnittstelle und bauchen Sie die Innenwand jedes Rohres mit einem Spachtel, der mit einem papierarmen Papiertuch umwickelt ist. Bei kleinen Wirbeltierproben entfernen Sie die Myelinschicht aus jedem Hypothalamus und Hypophysenrohr, indem Sie sorgfältig mit einer Transferpipette absaugen.
- Überschüssige Flüssigkeit mit einem verdrehten Low-Lint-Papierabwischen auswischen. Setzen Sie jedes Pellet mit 1 ml MV-3-Lösung mit niedrigbindenden Spitzen aus. Rohre auf Eis halten.
6. Mikrogefäß-Elution und Filtration
- Gießen Sie eiskalte MV-3-Lösung in einzelne Becher für jede ZNS-Region. Bei 4 °C aufbewahren.
- Für kleine Wirbeltierproben 10 ml MV-3 Lösung pro 50 ml Becher verwenden. Insgesamt 6–7 Becher sind notwendig, je nachdem, ob der optische Lappen enthalten ist oder nicht.
- Verwenden Sie für große Wirbeltierproben 30 ml MV-3 Lösung pro 100 ml Becher. Insgesamt 6–7 Becher sind notwendig, je nachdem, ob weiße Materie enthalten ist oder nicht.
- Legen Sie ein Zellsieb auf ein 50 ml konisches Rohr. Verwenden Sie eine pro CNS-Region. Verwenden Sie ein 100-m-Sieb für den Kortex, den Hirnstamm, den Sehlappen, das Rückenmark und die Hypophyse. Verwenden Sie ein 70-m-Zellsieb für Kleinhirn und Hypothalamus.
- Befeuchten Sie jedes Sieb mit 1 ml eiskalte MV-3 Lösung.
- Fügen Sie den in Schritt 5.5 vorbereiteten Suspensionen mit einer serologischen Pipette beim Mischen weitere MV-3-Lösungen hinzu, um Aggregate zu vermeiden. Laden Sie Mikrogefäße vorsichtig auf das Sieb. Mit eiskalter MV-3-Lösung abspülen.
- Für kleine Wirbeltierproben(Tabelle 2 und Tabelle 3)10–15 ml MV-3-Lösung mit einer serologischen Pipette hinzufügen und mit 5 ml MV-3-Lösung abspülen.
- Für große Wirbeltierproben 20 ml MV-3-Lösung mit einer serologischen Pipette hinzufügen und mit 10 ml MV-3-Lösung abspülen.
- Montieren Sie die Filtereinheit, indem Sie einen 20-mm-Nylonnetzfilter auf einen modifizierten Filterhalter (Abbildung 2D), einen pro CNS-Bereich, legen.
- Für kleine Wirbeltierproben(Tabelle 2 und Tabelle 3)verwenden Sie 25 mm modifizierte Filterhalter für Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen und Rückenmark. Verwenden Sie 13 mm modifizierte Filterhalter für den Hypothalamus und die Hypophyse.
- Für große Wirbeltierproben(Tabelle 4 und Tabelle 5)verwenden Sie modifizierte 47 mm Filterhalter für Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark. Verwenden Sie 25 mm für den Hypothalamus und die Hypophyse.
- Platzieren Sie den Filter auf ein 50 ml kegelförmiges Rohr und einen Nassfilter mit 5 ml eiskalter MV-3-Lösung, um sicherzustellen, dass der Puffer den Filterhalter auf das konische Rohr heruntergießt.
- Übertragen Sie die eluierten Mikrogefäße (ab Schritt 6.4) auf den 20-m-Nylonnetzfilter und spülen Sie die Mikrogefäße mit 5–10 ml eiskalter MV-3-Lösung.
- Den Filter mit sauberen Zangen wiederherstellen und in den Becher eintauchen, der die eiskalte MV-3-Lösung enthält, die in Schritt 6.1 vorbereitet wurde.
- Lösen Sie die Mikrogefäße aus dem Filter, indem Sie sie für ca. 30 s sanft schütteln. Für kleine Wirbeltierproben den Bechergehalt in ein 15 ml konisches Rohr gießen. Für große Wirbeltierproben den Bechergehalt in ein 50 ml konisches Rohr gießen.
- Zentrifugieren Sie bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C und setzen Sie das Pellet in 1 ml eiskalter MV-3-Lösung mit einer bindungsarmen Pipettenspitze wieder auf.
- Bei kleinen Wirbeltierproben die Suspension (ab Schritt 6.10) in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 20.000 x g für 5 min bei 4 °C übertragen.
HINWEIS: Dieser Spin wird auf einer Tischzentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 x g) durchgeführt, um eine robuste Ausbeute zu gewährleisten. - Bei großen Wirbeltierproben die Suspension von Schritt 6,10 in ein 5,0 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen, 4 ml MV-3-Lösung und Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen.
- Bei kleinen Wirbeltierproben die Suspension (ab Schritt 6.10) in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 20.000 x g für 5 min bei 4 °C übertragen.
7. Immunostaining
HINWEIS: Hematoxylin- und Eosinfärbung (H&E) wurde an Reptilien-, Amphibien- und Fischproben als Proof-of-Concept der Protokolldurchführbarkeit durchgeführt. Daher gibt es keine Empfehlung für die Immunkennzeichnung für diese Proben.
- Entfernen Sie den Überstand aus den Mikrozentrifugenrohren.
- Das Pellet in 1x sterilem PBS mit einer bindungsarmen Pipettenspitze (Materialtabelle )wieder aufsetzen Halten Sie die Mikrogefäße vor der Bildung von Aggregaten durch mehrere Pipetten mehrere Male. Für kleine Wirbeltierproben (Tabelle 3)verwenden Sie je nach Pelletgröße 100 l–2.000 l. Für große Wirbeltierproben (Tabelle 5)verwenden Sie je nach Pelletgröße 1.000 l–4.000 l.
- Übertragen Sie die Mikrogefäße mit einer niedrigbindenden Pipettenspitze auf Brunnenschlitten, wobei Sie darauf achten, sie in die Mitte jedes Brunnens zu stellen und die Seitenwände zu vermeiden.
- Stellen Sie die Brunnenrutschen, unbedeckt, in einem BSC-2, und lassen Sie für 20 bis 30 min bei RT trocknen.
HINWEIS: Ein relativ hohes Volumen von 1x PBS wird verwendet, um die Aggregatbildung zu vermeiden. Aus diesem Grund ist es notwendig, die Dias vor der Fixierung trocknen zu lassen, um sicherzustellen, dass die Mikrogefäße von der Poly-D-Lysin-Beschichtung gehalten werden. - Reste 1x PBS entfernen, indem sie mit einer Transferpipette herauspipettieren, 200 L Mit4% Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen und 30 min bei RT brüten.
- Pipette aus der fixativen Lösung und waschen 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT.
HINWEIS: An dieser Stelle wurde eine H&E-Färbung von Fisch-, Amphibien- und Reptilien-ZNS-Mikrogefäßen durchgeführt. - Fügen Sie dem Bohrspeicher 200 L Blockierpuffer hinzu und brüten Sie 60 min bei 37 °C.
- Entfernen Sie den Sperrpuffer mit einer Transferpipette und fügen Sie 200 L des primären Antikörpercocktails in das Antikörperverdünnungsmittel(Materialtabelle )ein. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.
- Den primären Antikörpercocktail auspfeifen und 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT waschen.
- Den sekundären Antikörpercocktail (Tabelle der Materialien) in 1x PBS verdünnt und 2 h bei RT inkubieren, vor Licht geschützt.
- Den Sekundärantikörper-Cocktail auspfeifen und 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT waschen, lichtgeschützt. Nach der letzten Wäsche lösen Sie den Rahmen des Brunnenschlittens und blot-dry überschüssige 1x PBS mit einem niedrigen Fusselpapiertuch.
- Fügen Sie ein Coverslip, flüssiges Antifade-Mountant-Medium und 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für die kernnukleare Färbung hinzu. Über Nacht bei RT vor Licht geschützt trocknen lassen.
- Nach dem Trocknen bei 4 °C vor Licht geschützt halten, bis sie für die konfokale Mikroskopie und Datenerfassung bereit sind.
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Representative Results
Mikrogefäße, die aus muriner ZNS isoliert wurden, zeigten alle intrinsischen zellulären Komponenten der neurovaskulären Einheit2,3. Verwendung von Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmolekül-1 (PECAM, auch bekannt als CD31) oder Isolectin IB4 (ein Glykoprotein, das die Endothelzelle Glycocalyx bindet) für Endothelzellen, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGFR) oder neuron-gliales Antigen 2 (NG2) für Pericyte und Aquaporin-4 (AQP4) für astrozytische Endfüße (Abbildung 3A,B) zeigt, dass diese intrinsischen Komponenten in isolierten Mikrogefäßen vorhanden sind. Zu den sichtbaren ZNS-Regionen gehören die kortikalen Mikrogefäße (Abbildung 3B), Kleinhirn (Abbildung 3C), Hypophyse (Abbildung 3D), Hypothalamus ( Abbildung3E), Hirnstamm (Abbildung 3F) und Rückenmark (Abbildung 3G). Alle zeigten Denkzeichen dieser kanonischen Marker.
Ebenso zeigten die Mikrogefäße die Expression von Adhäsions-Knotenprotein VE-Cadherin (Abbildung 4A,C), engen Knotenproteinen Claudin-5 und Zonula-Occludens-1 (CLDN5 und ZO-1, Abbildung 4A,D), trizelluläres Junction-Protein-Angulin-1 (Abbildung 4A,E) und apicobasalen Markern C-X-C Motiv Chemokin Ligand 12 und Gamma-Glutamyltransferase 1 (CXCL12 und GGT1, Abbildung 4A,F). Diese Ergebnisse sind relevant, da diese Proteine Indikatoren für zentrale BBB-spezifische Eigenschaften9,12,13,14sind. Eine begrenzte Präsenz von Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen, die glialfibrilläres saures Protein (GFAP, Abbildung 4B,C,G), Oligodendrozyten-spezifisches Protein (OSP, Abbildung 4B,G)und Neurofilament-Medium (NFM, Abbildung 4B,H) exezieren, zeigt, dass isolierte Mikrogefäße vernachlässigbare Spuren unerwünschter nicht-neurovaskulärer Zellen hatten. Darüber hinaus war die Mehrheit der Mikrogefäße frei von der Expression des glatten Muskelaktins (SMA, Abbildung 5B,C). Dies ist relevant, da sMA ein Marker für glatte Muskelzellen ist, die mit Arteriolen und Venulen assoziiert sind (Abbildung 5A), was darauf hindeutet, dass dieses Isolationsprotokoll selektiv auf Kleinkaliber-Mikrogefäßeabzielt 15.
Mikrogefäße, die von anderen kleinen lissenzephalen Wirbeltieren gewonnen werden, weisen einige morphologische Merkmale auf, wie sie bei Fischen (Frosch und Eidechse nicht gezeigt) und Aviären Mikrogefäßen zu beobachten sind. Dies deutet darauf hin, dass diese Methode für die weitere Charakterisierung der Unterschiede in der NVU zwischen den Arten nützlich ist (Abbildung 6). Darüber hinaus zeigten aviäre ZNS-Mikrogefäße (Abbildung 6H-N) Eine Kreuzreaktivität mit vielen der für Mensch und Maus entwickelten Antikörper. Dies fördert die weitere Untersuchung von Aviären Proben für biologische und biomedizinische BBB-Studien. Wir beobachteten ähnliche Ergebnisse, wenn wir Mikrogefäße von Schweinen und Makaken isolierten, zwei gyrencephalen Arten (Abbildung 7). Es werden nur kanonische NVU-Marker in Schweinemikrogefäßen gezeigt. Zusätzlich zu den oben genannten ZNS-Regionen konnten wir Mikrogefäße aus periventrikulärer weißer Materie isolieren (Abbildung 7B). Dies ist relevant, weil weiße Materie in neuroinflammatorische Erkrankungen verwickelt ist (z.B. Multiple Sklerose16,17,18).
Wir wollten herausfinden, ob diese Methode als zuverlässiges Werkzeug zur Bestimmung von Veränderungen in der Proteinexpression eingesetzt werden kann. Da wir wussten, dass VCAM-1 und JAM-B während der EAE in den neuroinflammatorischen Prozess am Rückenmark verwickelt waren, beschlossen wir, die Expression dieser Proteine in Spitzenstadien und chronischen Stadien von EAE- und Scheinkontrollmäusen (10 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse)9,10,11zu quantitieren. Dazu haben wir die willkürliche Intensitätseinheit (AUI) entlang des Durchmessers der Mikrogefäße gemessen. Anschließend berechneten wir unter Verwendung eines Schwellenwerts von 20 AUI für DAPI die Fläche unter der Kurve (AUC) für VE-Cadherin, VCAM-1 und JAM-B für 50 Mikrogefäße pro CNS-Region (Abbildung 8A,B). Schließlich führten wir zwei-Wege-ANOVA durch, gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test, um die statistische Signifikanz von Veränderungen in der Proteinexpression zu bestimmen.
Wie erwartet, beobachteten wir einen Anstieg von VCAM-1 und JAM-B entlang der Rückenmarksmikrogefäße während des Höhepunkts der EAE (Abbildung 8D,E). Wir beobachteten jedoch Veränderungen in anderen ZNS-Regionen, die zuvor nicht für EAE gemeldet wurden. VCAM-1 signifikant in Hypophysen Mikrogefäße erhöht und in der Hypothalamus und Hirnstamm Mikrogefäße verringert. Es gab Veränderungen während der chronischen EAE in allen ZNS-Geweben (Abbildung 8D). JAM-B signifikant erhöht in der Hypothalamus und Hypophyse Mikrogefäße während der chronischen EAE (Abbildung 8E). Interessanterweise beobachteten wir Veränderungen in VE-Cadherin entlang von Mikrogefäßen, die vom Hypothalamus und Hirnstamm während des Höhepunkts der EAE isoliert wurden, das Kleinhirn während der chronischen EAE (Abbildung 8C), und eine Abnahme der Hypophysen-Mikrogefäßbreite während der Spitze und der chronischen EAE. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass diese Methode der Mikrogefäßisolierung ein nützliches Werkzeug ist, um Veränderungen in regionalen Proteinexpressionsmustern während Gesundheit und Krankheit zu charakterisieren.
Abbildung 1: Effiziente Rückenmarkssektion ohne Laminektomie. Die Zerlegung des Rückenmarks von kleinen Wirbeltierproben (bis zu 100 g) erfolgt schneller und effizienter, indem die Schnur in kaudaler bis rostraler Richtung im gesamten Wirbelforamengespült wird. Mit einer Sezierenderschere wird der Kopf durch das Atlasgelenk entfernt und die Wirbelsäule durch die Hüfte ausgeschnitten (A). Alle verbleibenden Organe werden entfernt, so dass nur die Wirbelsäule (B) übrig bleibt. Das Rückenmark innerhalb des Lendenwirbelforamens erscheint als sehr kleiner weißer Kreis (<1 mm Durchmesser) im Vergleich zur Breite des Halsbandes(B,gelbe Pfeile). Das Halten einer schmalen Öffnung am Lendenwirbelforamen erleichtert einen Druckgradienten von der Lenden- zur Halswirbelsäule bei der Spülung mit einer 18 G Nadel und einer 10-ccm-Spritze, die mit 1x PBS (C und D) beladen ist. Einmal gespült, ist das Rückenmark (D,gelber Pfeil) fast vollständig von der Dur-Sac befreit, und nur Pia muss unter dem Sezieren Bereich entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Doppelzange Pick Sezieren Werkzeug und modifizierter Filterhalter. Dieses 11 cm lange Sezierenvon Werkzeug (A) hat zwei sehr scharfe, fast horizontal entgegengesetzte Punkte, 2 mm Spitze-zu-Spitze (B). Durch sanfteabwärts Druck und leicht im Uhrzeigersinn drehend (C) betten sich die Punkte horizontal in die Meningen ein, so dass sie nach oben gehoben werden können. Dies ist besonders nützlich, wenn die Meningen aus dem Kleinhirn entfernt werden, da es den Zugang in die Tiefe der Kleinhirn-Folia ermöglicht. Es ist auch sehr nützlich, wenn die Hirnung aus kortikalen Gewebe, vor allem gyrencephalic. In diesem Fall ist die Pia hochgradig mit hochkalibriger Vaskulatur eingebettet, die die Reinheit der Mikrosevessel-Isolierung beeinträchtigt. Ebenso erleichtert es die Entfernung des Aderhautplexus, der die wahrscheinlichste Quelle der Kontamination ist. Filterhalter von 47 mm, 25 mm und 13 mm Durchmesser wurden lasergeschnitten, um den Einlassstecker (D) aus dem oberen Fach zu entfernen (E), aber halten Sie die Siebkomponente (G). Diese Modifikation ermöglichte die Montage einer Filtereinheit (I,J) durch Platzieren des 20-m-Nylonfilternetzes über dem Sieb und dem unteren Teil (G,H), wobei das Netz beim Verschrauben des Oberteils (E) an Ort und Stelle gesichert wurde. Es wird nur der 25 mm Filterhalter angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mikrogefäße, die aus mehreren ZNS-Regionen isoliert sind, exprimieren kanonische neurovaskuläre Einheitenmarker. (A) Mittels Immunolabeling und konfokaler Mikroskopie werden intrinsische zelluläre Komponenten der NVU verwendet, um erwachsene (8–14 Wochen alte C57BL/6J) murinen ZNS-Mikrogefäße zu identifizieren. Wie auf dem Zusammenführungsbild für kortikale Mikrogefäße (B) über den einzelnen konfokalen Bildern für den Endothelzellmarker CD31 (weiß), pericyt marker PDGFR (rot) und astrozytische Endfußmarker AQP4 (grün) zu sehen, bleiben alle diese Zellkomponenten erhalten. Beachten Sie, dass die intime Beziehung zwischen Endothelzellen und Pericyten sie magentaauf auf dem zusammengeführten Bild erscheinen lässt, während die astrozytischen Endfüße einen Heiligenschein um sie herum zu haben scheinen (B). Das gleiche Expressionsmuster wird für das Kleinhirn (C), Hypophyse (D), Hypothalamus (E), Hirnstamm (F) und Rückenmark (G, DAPI, Kernfleck = blau; Skalenbalken = 10 m) beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mikrogefäße exprimierte Proteine, die mit BBB-spezifischen Eigenschaften assoziiert sind. Endothelzellen innerhalb der neurovaskulären Einheit (NVU) werden auch durch die Proteine beschrieben, die mit ihren intrinsischen Barriereeigenschaften assoziiert sind (A). Wie in der Abbildung zu sehen, haben Endothelzellen Knoten aus VE-Cadherin, CLDN5, ZO-1 (A, gelb) und Angulin-1 (A, Petrol). Sie weisen auch eine apicobasale Polarität gegenüber mehreren Proteinen auf, einschließlich GGT-1 und CXCL12 (A, grün und rot). Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozytenzellkörper können in die isolierten Mikrogefäße aufgenommen werden, obwohl sie der NVU (B) nicht innewohnen. Diese sind durch die Expression von NFM (rot), OSP (Cyan) und GFAP (Kalkgrün) bzw. (B) identifizierbar. In Übereinstimmung mit diesen, unsere isolierten Mikrogefäße ausgedrückt haften Protein VE-Cadherin (C, rot), enge Kreuzung Proteine CLDN5 und ZO-1 (D, rot und grün, bzw. merge = gelb), trizelluläre Knoten Protein LSR (E, grün), und apicobasal Marker CXCL12 und GGT1 (F, rot und grün, bzw.). Sie wiesen auch begrenzte Mengen an GFAP (A, grün, G, weiß), OSP (G, grün) und NFM (H, rot) auf, was auf eine vernachlässigbare Retention von nicht-neurovaskulären Einheitszellen hindeutet (DAPI, Kernfleck = blau; Skalenbalken = 10 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die meisten isolierten Mikrogefäße drücken keine SMA aus. Die neurovaskuläre Einheit weist einen ausgeklügelten Übergang von Arteriole-Kapillar-Venule (A) auf. Der anbuläre Ausdruck sMA identifiziert eindeutig die Arteriole, und wenn es zur Kapillare wird, nimmt der Ausdruck"SMA" (B , rot) ab und setzt den Wandbildmarker NG2 (B, grün) aus. Wir maßen den Durchmesser der Gefäße sMA+ und SMA (weiße Klammern, n = 20), um sie als Arteriolen oder Kapillaren zu unterscheiden (DAPI, Kernfleck = blau, Skalenbalken = 10 m). Die ungepaarte t-Test-Analyse des Durchmessers von SMA+- und SMA-Gefäßen zeigte eine hohe statistische Signifikanz (C, SMA+ = rot, sMA- rot/grün, ****p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Erfolgreiche Isolierung von ZNS-Mikrogefäßen von anderen lissenzephalen Arten. Die ZNS wurde von einem wild gefangenen Frosch (8,2 cm), Eidechse (12,7 cm), Panzer-Regenbogenforelle (2 Jahre alt, 35,6 cm) und Volieren-Hochtaube (9 Monate alt, 300 g) geerntet. Die Mikrogefäße von Frosch, Fisch und Eidechse wurden von H&E gefärbt (nur Mikrogefäße aus Forellen sind abgebildet, Schuppenbalken = 20 m). Taubenmikrogefäße waren immungekennzeichnet. Wir waren in der Lage, Mikrogefäße auf allen Regionen zu identifizieren, wie auf den Fisch- und Tauben-CNS-Umrissen beschriftet: Kortex (A und H), Optiklappen (B und I), Kleinhirn (C und J), Hypophyse (D und L), Hypothalamus (E und K), Hirnstamm (F und M), und Rückenmark (G und N). Zusätzlich konnten wir Endothelzellen mit Isolectin IB4 (weiß), astrozytären Endfüßen mit AQP4 (grün) und angrenzenden Neuronen mit NFM (rot) aus den isolierten Mikrogefäßen der Taube (DAPI, Kernfleck = blau, Skalenbalken = 10 m) identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Isolierung von ZNS-Mikrogefäßen von gyrencephalen Arten. Das Gehirn und das Rückenmark wurden von einem zuchtgezüchteten Schwein (ca. 6 Monate alt, ca. 120 kg) für die Isolierung und Immunkennzeichnung von Mikrogefäßen seziert. Wir konnten Mikrogefäße identifizieren, die für IB4 (weiß), PDGFR (rot) und AQP4 (grün) auf allen Regionen des Porenzz: Kortex (A), periventrikuläre weiße Materie (B), Kleinhirn (C), Hypophyse (D), Hypothalamus (E), Hirnstamm (F) und Rückenmark (G, DAPI, Kernfleck = blau, Skala bar = 10 m) positiv gekennzeichnet waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Beispiel für die andere Anwendung der ZNS-Mikrogefäßisolierung. Die Expression von JAB-B und VCAM-1 wurde für murine EAE-Mikrogefäße quantifiziert. Willkürliche Intensitätseinheiten (AUI) wurden für Den Kortex, Kleinhirn, Hypothalamus, Hypophyse, Hirnstamm und Rückenmark von Mäusen in Spitzen- und chronischen Stadien von EAE gemessen, mit Schein als Kontrolle (n = 4). Für jede ZNS-Region wurden zwölf Mikrogefäße pro Maus ausgewertet, um den AUI pro Fluorchrom und den Durchmesser des Mikrogefäßes (A) zu bestimmen. Weiße Klammern zeigen Beispiele des konfokalen Mikroskop-Messwerkzeugs zur Bestimmung von AUI für VCAM-1 (weiß), VE-Cadherin (grün), JAM-B (rot) und DAPI (blau, Skalenbalken = 10 m). Anschließend wurden die resultierenden AUI gegen den Durchmesser in Mikrometern (B) dargestellt, um die Fläche unter der Kurve (AUC) für jedes immunmarkierte Protein als Schätzung der Proteinexpression zu berechnen. Die durchschnittliche AUC pro Gruppe wurde dann von zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test, für insgesamt 48 Mikrogefäße pro ZNS-Region analysiert. Mit Ausnahme der Hypophysen-Mikrogefäße beobachteten wir keine wesentlichen Unterschiede zwischen dem Mikrogefäßdurchmesser im Zusammenhang mit dem Krankheitsstatus (C, Insert), sondern eine signifikante Abnahme der VE-Cadherin-Expression aus dem Hypothalamus und Hirnstamm bei EAE-Mäusen (C). Ähnliche statistische Analysen zeigten einen signifikanten Anstieg für VCAM-1 (D) und JAM-B (E) am Rückenmark, der mit dem neuroinflammatorischen Status während des Höhepunkts der EAE übereinstimmte. Interessanterweise beobachteten wir auch Veränderungen für VCAM-1 am Hypothalamus, Hypophyse, und Hirnstamm. Diese Ergebnisse werden untersucht (schwarze Balken und Punkte = Schein, rote Balken und Punkte = Spitzen-EAE, Lachsstangen und -punkte = chronische EAE, *p<0.05, @p<0.01, #p<0.001 und &p<0.0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| MV-1 | 10 mM HEPES |
| in 1x Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit Calcium und Magnesium | |
| MV-2 | 18% 70 kDa Molekulargewicht (MW) dextran |
| in 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-2 | 20% 70 kDa MW dextran |
| in 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| MV-3 | 1% Rinderserumalbumin (BSA) |
| in 10 mM HEPES/HBSS (MV-1) | |
| Fixativ | 4% Paraformaldehyd (PFA) |
| in 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS) pH 7,4 | |
| Waschpuffer | 1x PBS pH 7,4 |
| Permeabilisierungs- & Blockierpuffer | 10% BSA |
| 0,25% nichtionisches Tensid | |
| in 1x PBS pH 7,4 | |
| Antikörperverdünner | 5% BSA |
| 0,25% nichtionisches Tensid | |
| in 1x PBS pH 7,4 |
Tabelle 1: Im Protokoll verwendete Lösungen.
| Schritt(e) | Aktion |
| 4.1 und 4.1.1 | Mince in MV-1-Lösung mit einschneidiger Klinge |
| 4.2 bis 4.2.2 | Homogenisieren in MV-1 Lösung mit einem Potter-ELVJ PTFE oder Microtube Pestle |
| 5.1 | Drehung bei 2.000 x g, 4 °C, 10 min |
| 5.1.1 bis 5.1.1.2 | Das Pellet in MV-2-Lösung wieder aufhängen |
| 5.2 | Drehung bei 4.400 x g,4 °C, 15 min |
| 5,3 bis 5,5 | Das Pellet mit 1 ml MV-3-Lösung wieder aufhängen |
| 6.2 bis 6.4.1 | Elute über ein 50 ml konisches Rohr durch ein Zellsieb und spülen mit MV-3 Lösung |
| 6.5, 6.5.1, 6.6 und 6.7 | Filter mit einem 20-mm-Nylonnetz am modifizierten Filterhalter |
| 6.8 | Das Nylonnetz in den 50 ml Becher mit 10 ml MV-3-Lösung legen und 30 s schütteln |
| 6,9 bis 6,10 | Dekantieren sie in ein 15 ml konisches Rohr und drehen Sie bei 2.000 x g,4 °C, 5 min |
| 6.10 | Resuspend in 1 ml MV-3 Lösung |
| 6.10.1 | Transfer in ein 1,7 ml Mikrorohr und Drehung bei 20.000 x g,4 °C, 5 min |
| 7,1 bis 7,3 | In 1x PBS wieder aufsetzen und in Brunnenschlitten laden |
Tabelle 2: Layout für die Isolierung kleiner Wirbeltiermikrogefäße. Dieses Diagramm ist eine gekürzte Version des Protokolls, wenn ein lissenzephales Exemplar verwendet wird.
| Schritt(e) | Lösung | Aktion | Ctx | Cbl | Opt | Bst | Sc | Hyp | Grube |
| 4.1 | MV-1 | Mince auf Teller | 100 mm x 20 mm Petrischale, 1 ml | k.A. | |||||
| 4.2.1 und 4.2.2 | MV-1 | Homogenisieren | 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem mit Stößel | 1 ml, Mikropestle | |||||
| 5.1.1.1 und 5.1.1.2 | MV-2 | Resuspend | 5 ml + 5 ml, 18% Dextran | 1 ml, 20% dextran | |||||
| 5.5 und 6.4.1 | MV-3 | Resuspend | 1 ml + 10-15 ml | 1 ml | |||||
| 6.2 und 6.4.1 | MV-3 | Strainer Größe | 100 m | 70 m | 100 m | 70 m | 100 m | ||
| Spülen | 5 mL | ||||||||
| 6.5, 6.5.1 und 6.7 | MV-3 | Filtergröße, Spülen | 25 mm Filter, 10 ml | 13 mm, 5 ml | |||||
| 6.8 | MV-3 | Shake auf Becher | 10 ml | ||||||
| 6.10 | MV-3 | Resuspend | 1 ml | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | Resuspend | 1,5 bis 2,0 ml | 0,5 bis 1,0 ml | 0,1 bis 0,2 ml | ||||
| 7.3 | 1x PBS | Belastung pro Brunnen | 200 l | 100 l | 25 bis 50 l | ||||
| CTX = Kortex, CBL = Kleinhirn, BST = Hirnstamm, OPT = optischer Lappen (nicht bei Säugetieren), HYP = Hypothalamus, PIT = Hypophyse, SC = Rückenmark. Empfohlene Volumina gelten für ganzes Gewebe von Tieren mit einer Größe von 20 g (junge Maus) bis 800 g (erwachsene Ratte). | |||||||||
Tabelle 3: Empfohlenes Volumen/Größe. Dieser Umriss enthält das empfohlene Volumen an Lösungen für die Verwendung einer kleinen Wirbeltierprobe im Bereich von 20 bis 800 g, genauer gesagt, der im Video gezeigten 25 g-Maus. Die endgültige Anpassung der erforderlichen Volumina muss vom Forscher anhand der spezifischen Menge an Nassgewebe bestimmt werden, die nach der Zerlegung gewonnen wurde. Praxis und Fehlerbehebung sind sehr zu empfehlen. CTX = Kortex, CBL = Kleinhirn, BST = Hirnstamm, OPT = optischer Lappen (nicht bei Säugetieren), HYP = Hypothalamus, PIT = Hypophyse, SC = Rückenmark.
| Schritt(e) | Aktion |
| 4.1 und 4.1.2 | Mince in MV-1 mit einschneidiger Klinge |
| 4.3 bis 4.3.4 | Homogenisieren In MV-1 Lösung mit einem Potter-Elvehjem-Schleifer mit einem PTFE-Stößel |
| 5.1 | Drehung bei 2.000 x g, 4 °C, 10 min |
| 5.1.2 bis 5.1.2.2 | Das Pellet in MV-2-Lösung wieder aufhängen |
| 5.2 | Drehung bei 4.400 x g,4 °C, 15 min |
| 5,3 bis 5,5 | Das Pellet mit 1 ml MV-3-Lösung wieder aufhängen |
| 6.2 bis 6.4 und 6.4.2 | Elute über ein 50 ml konisches Rohr durch ein Zellsieb und spülen mit MV-3 Lösung |
| 6.5, 6.5.2, 6.6 und 6.7 | Filter mit einem 20-mm-Nylonnetz am modifizierten Filterhalter |
| 6.8 | Das Nylonnetz in einen 50 ml Becher mit 30 ml MV-3-Lösung legen und 30 s schütteln |
| 6.9 und 6.10 | Dekantieren sie in ein 50 ml konisches Rohr und drehen Sie bei 2.000 x g,4 °C, 5 min |
| 6.10 | Resuspend in 1 ml MV-3 Lösung |
| 6.10.2 | Transfer in ein 5 ml Mikrorohr und Drehung bei 2.000 x g,4 °C, 5 min |
| 7,1 bis 7,3 | In 1x PBS wieder aufsetzen und in Brunnenschlitten laden |
Tabelle 4: Layout für die Isolierung großer Wirbeltiermikrogefäße. Dieses Diagramm ist eine gekürzte Version des Protokolls, wenn ein gyrencephaler Exemplar verwendet wird.
| Schritt(e) | Soution | Aktion | Ctx | Cbl | WM | Bst | Sc | Hyp | Grube |
| 4.1 | MV-1 | Mince auf Teller | 3 x 5 ml | 1 ml | |||||
| 4.3 bis 4.3.4 | MV-1 | Homogenisieren | 20 x 30 ml, 55 mL Potter-Elvehjem mit Stößel & Oberrührer | 5 mL, 10 mL Potter-Elvehjem mit Stößel | |||||
| 5.1.2 bis 5.1.2.2 | MV-2 | Resuspend | >20 ml, 20% dextran | 5 ml + 5 ml, 20% dextran | |||||
| 5.5, 6.4 und 6.4.2 | MV-3 | Resuspend | 1 ml + 20 ml | 1 ml + 10 ml | |||||
| 6.2 und 6.4.2 | MV-3 | Strainer Größe | 100 m | 70 m | 100 m | 70 m | 100 m | ||
| Spülen | 10 ml | ||||||||
| 6.5, 6.5.2 und 6.7 | MV-3 | Filtergröße, Spülen | 47 mm Filter, 10 ml | 25 mm, 10 ml | |||||
| 6.8 | MV-3 | Shake auf Becher | 30 ml | ||||||
| 6.10 und 6.10.2 | MV-3 | Resuspend | 1 ml + 4 ml | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | Resuspend | 2,0 bis 4,0 ml | 1,0 bis 2,0 ml | |||||
| 7.3 | 1x PBS | Belastung pro Brunnen | 200 l | 100 l | |||||
| CTX = Kortex, CBL = Kleinhirn, WM = weiße Materie, BST = Hirnstamm, HYP = Hypothalamus, PIT = Hypophyse, SC = Rückenmark. Empfohlene Volumina sind für Proben von 45 cm3 für CTX, CBL, BST und SC ganze HYP und PIT. | |||||||||
Tabelle 5: Empfohlenes Volumen/Größe. Dieser Umriss hat das empfohlene Volumen an Lösungen für die Verwendung einer großen Wirbeltierprobe. Genauer gesagt, es gilt für ZNS-Gewebebiopsien von 45 cm3 für Kortex, Kleinhirn, weiße Materie, Hirnstamm, Rückenmark, und den gesamten Hypothalamus und Hypophyse, wie auf dem Video gezeigt. Die endgültige Anpassung der erforderlichen Volumina muss vom Forscher anhand der spezifischen Menge an Nassgewebe bestimmt werden, die nach der Zerlegung gewonnen wurde. Praxis und Fehlerbehebung sind sehr zu empfehlen. CTX = Kortex, CBL = Kleinhirn, WM = weiße Materie, BST = Hirnstamm, HYP = Hypothalamus, PIT = Hypophyse, SC = Rückenmark.
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Discussion
Die BBB enthält die einzigartigen Eigenschaften der Gehirn Mikrovaskulatur Endothelzellen gekoppelt durch eine anspruchsvolle Architektur von engen-, Adheren-, "Peg-Socket"-Kreuzungen und Haftungs-Plaques kritisch für ZNS-Homöostase2,3,19. Endothelzellen Eigenschaften werden induziert und gepflegt durch Pericyten und die umgebenden Astroglia Endfußprozesse2,3,19. BBB-Mikrovaskulatur zeigt Polarität (d.h. das asymmetrische Expressionsmuster von Proteinen lokalisiert auf luminalen oder abluminalen endothelialen Zelloberflächen)20. Während dies kurz die BBB definieren kann, bleibt es in Wirklichkeit einer der rätselhaftesten Begriffe in der Neurowissenschaft. Zum Beispiel können regionale, Geschlechts- und Altersunterschiede innerhalb der NVU die regionalen CNS-Schwachstellen für Traumata, Toxizität, Infektionen und Entzündungen erklären, die schwerwiegende klinische Folgen haben können3,5,6. Ein weiteres Hindernis im Verständnis der BBB sind die Unterschiede zwischen den Mehrfachtaxa7,8. Eine der größten Hürden für das Verständnis und die Untersuchung der BBB ist gerade die Schwierigkeit im Zusammenhang mit der Isolierung der NVU, die die BBB umfasst, während sie ihre barrierespezifischen Eigenschaften behält14.
Um unser Verständnis der BBB, Der CNS-regionalen Unterschiede sowie der Artenunterschiede zu beschleunigen, haben wir zuvor veröffentlichte Methoden angepasst. Wir haben diese, insbesondere Boulay et al.21,erfolgreich angepasst, um Mikrogefäße von einzelnen kortikalen, Kleinhirn-, Hypothalamus-, Hypothalamus-, Hirnstamm- und Wirbelsäulengeweben auf einer Vielzahl von lissenzephalen kleinen Wirbeltieren zu erhalten: Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6). Ein Vorteil dieser Methode ist, dass ihre Anpassungen auf der Gesamtgröße des ZNS-Gewebes basieren: Der Forscher wählt die Menge der Lösung, Die Größe der Gewebemühle, konische Röhre, Filterhalter, etc. nach dem Nassgewebe, unabhängig von Art, Geschlecht und Alter. In unserer Erfahrung mit der Immunetikettierung liefert eine 20 g-Probe genügend Mikrogefäße für ein 8-Well-Dia pro Kortex, Kleinhirn, Sehlappen, Hirnstamm und Rückenmark und eine halbe 8-Well-Dia pro Hypothalamus und Hypophyse. Jedoch, Ertrag von kortikalen und optischen Lappen ist viel höher im Vergleich zu Kleinhirn, Hirnstamm, und Rückenmark.
Wie gezeigt, haben wir die notwendigen Anpassungen für die Isolierung und Immunkennzeichnung von ZNS-Mikrogefäßen von Schweinen und Makaken, größeren gyrencephalen Säugetieren, durchgeführt, die für die translationale Forschung relevanter sind (Abbildung 7). Insbesondere konnten wir periventrikuläre weiße Materie nur auf diese Arten einbeziehen. Da das ZNS bei diesen Tieren größer ist, haben wir genügend weiße Materie gesammelt, um ein Mikrogefäßpellet während der zweiten Zentrifugation von der Myelinschicht zu trennen (Schritt 5.3, MV-2 mit 20% Dextran). Wir spekulieren, dass eine kritische Masse benötigt wird, um diese Trennung erreichen zu können, und wir suchen aktiv, wie wir ein ähnliches Ergebnis mit murinem ZNS-Gewebe erzielen können.
Obwohl wir der Einfachheit halber ausgelassen wurden, haben wir eine Immunkennzeichnung über die kanonischen NVU-Marker auf Aviären, Schweinen und Makakenmikrogefäßen hinaus durchgeführt. Insbesondere teilten sich alle Arten zelluläre und molekulare Marker, die zuvor auf murinen Proben als relevant für die BBB-Funktion identifiziert wurden (Junctional-Proteine VE-Cadherin, CLDN5, ZO-1 und LSR und apicobasale Marker CXCL12 und GGT1) oder in der Nähe von NVU (NFM, OSP und GFAP). Auch diese Ergebnisse fördern die Anwendung dieser Methode auf andere Arten, um die NVU-Orthologie und Divergenz zwischen den Arten weiter zu identifizieren. Es eröffnet auch die Möglichkeit für weitere Untersuchungen zu NVU-Stamm, Geschlecht und Altersunterschieden innerhalb derselben Art und die Durchführbarkeit der Verwendung anderer Organismen für die biomedizinische Forschung der BBB. Wir zeigen auch Hinweise auf eine erfolgreiche Anwendung dieser Mikrogefäß-Isolationsmethode, um Veränderungen der Proteinexpression während der Neuroinflammation zu quantitieren (Abbildung 8). Auch wenn wir dieses Experiment als Proof-of-Concept durchgeführt haben, wird der hier verwendete Ansatz derzeit in unserem Labor ausgiebig genutzt. Wir bevorzugen diesen Ansatz gegenüber anderen quantitativen Methoden (z.B. Western Blot), weil wir uns nicht nur auf die Expressionsebene konzentrieren wollen, sondern auch auf die relative Proteinfülle, die Verlagerung von CXCL12 und anderen apicobasalen Proteinen, die Verknüpfung von Junctional-Proteinen usw. innerhalb des komplizierten Auftretens von ZNS-Mikrogefäßen9,13,22. Ebenso behandeln wir derzeit unsere Methode für andere Anwendungen, wie z. B. die weitere Isolierung von NVU-Zellkomponenten (Endothelzellen und Pericyten), RNA-seq und Proteomik23,24,25,26.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Dr. Cruz-Orengo wurde von der University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
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