Summary
이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.
Abstract
중추 신경계 (CNS)에서 미세 혈관의 분리는 일반적으로 여러 동물, 가장 자주 설치류에서 피질 조직을 결합하여 수행됩니다. 이 접근은 피질에 혈액 두뇌 방벽 (BBB) 속성의 심문을 제한하고 개별적인 비교를 허용하지 않습니다. 이 프로젝트는 여러 CNS 영역에서 신경 혈관 단위 (NVU)의 비교를 허용하는 격리 방법의 개발에 초점을 맞추고: 피질, 소뇌, 광학 엽, 시상 하부, 뇌하수체, 뇌간, 및 척수. 더욱이, 원래 뮤린 견본을 위해 개발된 이 프로토콜은, 우리가 또한 두뇌 반구 백색 물질에서 microvessels를 격리할 수 있는 작고 큰 척추동물 종에서 CNS 조직에 사용을 위해 성공적으로 적응되었습니다. 이 방법은, 면역 표지와 결합될 때, 개별, 조직 모형, 또는 처리 사이 단백질 발현 그리고 통계적인 비교의 정량화를 허용합니다. 우리는 신경염증성 질환, 다발성 경화증의 뮤린 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안 단백질 발현의 변화를 평가함으로써 이러한 적용성을 입증했습니다. 또한, 이 방법으로 분리된 마이크로혈관은 qPCR, RNA-seq 및 웨스턴 블롯과 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 이것은 초원심분리 또는 효소 해리를 사용하지 않고 CNS 마이크로 혈관을 분리하려는 첫 번째 시도가 아니지만 단일 개인 및 다중 CNS 영역의 비교에 대한 숙련도가 독특합니다. 따라서, 그것은 그렇지 않으면 모호한 남아있을 수있는 차이의 범위의 조사를 허용: CNS 부분 (피질, 소뇌, 광학 엽, 뇌간, 시상 하부, 뇌하수체, 척수), CNS 조직 유형 (회색 또는 백색 물질), 개인, 실험 치료 그룹, 및 종.
Introduction
우리의 뇌는 우리 몸에서 가장 중요한 기관입니다. 이러한 이유로, 정상에서 편차를 일으킬 수 있는 외부 요인에도 불구 하 고 뇌 항상성을 유지 하는 것이 우선 순위. 일부 학자에 따르면, 약 400-5억 년 전1,척추 동물은 우리가 지금 혈액 뇌 장벽으로 알고 개발 (BBB)2,3. 이 보호 "울타리"는 혈액과 CNS 자렌 치마 사이의 이온, 분자 및 세포의 수송을 엄격하게 조절하여 중추 신경계 (CNS) 항상성 및 기능에 가장 큰 영향을 미칩니다. BBB가 중단되면 뇌는 독성 노출, 감염 및 염증에 취약해집니다. 따라서, BBB 기능 장애는 많은 연관, 전부는 아니지만, 신경 및 신경 발달 장애4,5,6.
BBB의 정교한 기능은 신경 혈관 단위 (NVU)2,3에의해 부합하는 독특한 CNS 미세 혈관 구조에 기인한다. 고도로 전문화된 내피 세포, 회구 및 성상 세포 끝피트는 NVU2,3의세포 성분이다. 이들 세포에 의해 생성된 세포외 기matrix는 또한 NVU 및 BBB 생리학2,3에필수적이다. NVU의 필수 세포 및 분자 성분이 척추동물 사이에서 보존되지만, 이질성은 주문 및 종7,8사이에서 보고된다. 그러나, 기술적 한계는 신경 생물학, 생물 의학, 또는 번역 연구에 있는 이 다름을 완전히 고려하는 우리의 기능을 방해합니다.
이 때문에, 우리는 물고기, 양서류, 파충류, 조류 및 포유류 : 우리는 모든 다섯 척추 동물 그룹에서 수많은 종에 적용 할 수 있도록 CNS 지역 별 마이크로 혈관 격리 방법을 확장했다. 이 프로토콜은 번역 관련성이 있는 종을 포함하는 작은 계수뇌증 및 큰 자뇌척추동물에 사용하기 위해 기술된다9. 추가적으로, 우리는 이 문맥 내의 전에 조사되지 않은 CNS의 그밖 지구를 포함합니다, 그러나 신경 생리학및 엄청난 임상 연루와 관련있는: 시상 하부, 뇌하수체 및 백색 물질. 마지막으로, 우리는 NVU 및 / 또는 BBB9,10,11을따라 단백질 발현의 변화를 식별하는 신뢰할 수있는 도구로이 격리 방법의 용량을 테스트했습니다. 개념 증명으로서, 우리는 면역형광에 이어 격리 방법을 사용하여 EAE 동안 VCAM-1 및 JAM-B 발현의 변화를 결정하는 방법을 보여주었다.
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Protocol
본 연구의 모든 절차는 캘리포니아 대학 (UC), 데이비스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설정 된 지침에 따라. UC 데이비스의 동물 보호는 여러 독립적 인 자원에 의해 규제되며 1966 년부터 실험실 동물 관리 국제 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 완전히 인증되었습니다. 돼지 CNS 조직은 동물 과학의 UCD 학과에서 얻은, 육류 과학 연구소. rhesus 원숭이에서 CNS 조직은 캘리포니아 국립 영장류 연구 센터 병리학 부 (NIH P51OD011107)에서 수득되었습니다. 돼지와 원숭이에 실험실 직원에 의해 어떤 마취, 안락사, 또는 부검을 수행하지 않았다. 따라서 이러한 문제에 대한 특별한 권장 사항은 없습니다.
참고 : 이 방법은 여러 종에 대해 검증되었지만 제공된 프로토콜은 마우스 및 돼지 조직에 보다 직접적으로 대응합니다. 포유류 표본을 사용할 때 는 광학 엽에 관련된 세부 사항이 적용되지 않습니다. 모든 생체 유해 물질은 적절한 생물 안전 수준(BSL) 시설에서 처리되어야 합니다. 모든 급성 독성 물질은 연기 후드 아래에 처리해야합니다. 모든 생체 유해 의료 폐기물 및 급성 독성 폐기물은 올바르게 폐기해야 합니다.
1. 준비
- 솔루션 준비(표 1)적어도 하루 전에.
참고 : 70 kDa 분자량 (MW) 덱젠을 용해하는 것은 매우 어렵습니다. 용액이 파라핀 필름 또는 호일로 덮여 밤새 교반하게하는 것이 더 효율적입니다. 이 프로토콜은 조사 중인 시편에 따라 두 가지 다른 MV-2 용액을 사용해야 합니다. 18% 덱스론은 작은 lissencephalic 견본에 프로토콜을 능력을 발휘할 때 마이크로 혈관 펠릿에서 myelin를 효율적으로 분리합니다. 그러나, 그것은 큰 gyrencephalic 견본에서 CNS 조직의 계면 내의 myelin의 얼룩을 개발합니다, 뿐만 아니라 작은 견본에서 시상 하부 및 뇌하수체. 이 얼룩은 20% 덱스렌을 사용하여 방지됩니다. - 폴리-D-리신의 웰당 50 μL을 적재하여 잘 슬라이드를 준비하고 바람직하게는 생물학적 안전 캐비닛 클래스 2 (BSC-2)에서 실온 (RT)에서 2 시간 동안 건조시십시오. 지나치게 말리지 마십시오. 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 헹구고 사용할 준비가 될 때까지 냉장고에 보관하십시오.
2. 작은 Lissencephalic 척추 동물 견본에서 CNS 조직 해부
참고 : 이 문서는 C57BL6 / J, 10 주 된, ~ 25g, 남성 마우스에 프로토콜의 응용 프로그램을 보여줍니다.
- 시편당 MV-1 용액의 각각 5mL 및 1mL로 2개의 15mL 원점 튜브와 1.7mL 미세원원각지 튜브를 준비합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 마취
- 케타민, 자일라진, 아세프로마진 마취칵테일을 kg 체중당 100/10/3 mg으로 주사제하고 70% 에탄올로 스프레이하여 마우스를 마취시고. 눈을 만지고 발을 꼬집어 팔목과 페달 반사의 부재를 각각 평가하여 마취를 확인하십시오.
- 유도 마취 상자를 사용하여 5 %의 이소플루란을 흡입하여 비둘기를 마취시다.
- 물고기와 개구리를 1% 트리카인으로 마취시키면 물탱크나 수륙양용 링거용액(재료표)을들고 있는 물고기입니다.
- 안락사 전에 4 °C에서 냉각하여 도마뱀을 마취.
- 수술 용 가위로 동물을 참수하고, 두개골을 노출시키기 위해 집게로 피부를 벗기고, LaGrange 가위로 자르고 포라멘 매그넘 (그림 1A).
- 주걱으로 뇌를 해부하고 MV-1 용액으로 15 mL 원엽 튜브로 옮김. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 포셉으로 두개골의 셀라 터시카에서 뇌하수체를 검색하고 MV-1 용액으로 1.7 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 척추 기둥을 노출하기 위해 피부와 근육을 제거합니다. 사지, 흉곽 및 내부 장기를잘라냅니다(그림 1B).
- 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나에 의해 척수를 해부하십시오. 이어서, MV-1 용액을 사용하여 5 mL 원엽 튜브로 이송한다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 요추에 도달 할 때까지, 자궁 경부 척추 포어를통해 시작, LaGrange 가위로 꼬리 방향으로 로스트랄에서 절단하여 laminectomy을 수행합니다.
- MV-1 용액이 적재된 18 G 바늘과 10 mL 주사기로 요추 척추 포라멘 전체에 걸쳐 로스트랄 방향으로 캐걸로 플러싱을 수행합니다(그림1C,D).
참고 :이 방법은 매우 작은 표본, 주로 설치류 (<100g)에서만 작동합니다.
- 해부 범위를 사용하여 스프링 가위로 척수에서 경막 낭을 자르고 이중 갈래 로 나머지 수막을 제거합니다(그림 2).
- 페트리 접시에 뇌를 전송하고, 해부 범위를 사용하여, 이중 갈래 선택(그림 2A-C)로수막을 제거합니다.
- 후각 전구와 시상집, 홍채 가위, 스프링 가위로 절제합니다. 이중 갈래 선택을 사용하여 모든 뇌실에서 촉막 신경총신경절을 제거하십시오. 모든 경막염 신경총이 제거되었는지 확인하십시오.
참고 : 경막염 신경총과 후각 전구는 오염의 거대한 소스입니다. BBB와는 달리, 이러한 모세 혈관은 매우 페네스트화되고 제거되지 않으면 후속 실험의 결과가 손상됩니다. - 집게를 사용하여 피질, 소뇌, 뇌간, 광학 엽 (포유류 표본이 아님) 및 시상 하부와 같은 뚜렷한 CNS 영역을 분리합니다.
3. 큰 자뇌척성 척추 동물 표본에서 CNS 조직 해부
참고 : 이 프로토콜은 아바토이르에서 얻은 돼지 CNS 조직을 사용합니다. 따라서 마취, 안락사 또는 부검은 여기에 설명하거나 표시되지 않습니다.
- 얼음 가슴/양동이 내부에 MV-1 용액이 적재된 0.946 L(32 oz) 조직학 용기에 돼지 CNS 조직을 운반합니다.
- 해부 범위를 사용하여 각 CNS 조직에서 이중 갈래 선택, 집게, 홍채 가위 및 봄 가위로 수구를 제거하십시오. 뇌실에서 촉막 신경총 조각을 제거해야합니다.
4. CNS 조직 균질화
참고 : 두 명의 조사자가 균질화 과정에 참여할 때 더 효율적입니다 : 하나는 스테레오 스코프 하에서 수막을 해부하고 다른 하나는 다진 조직을 균질화합니다. 이렇게하면 조직은 신속하게 얼음 양동이로 돌아와 차갑게 유지됩니다.
- 각 CNS 영역을 MV-1 용액의 ~1 mL로 페트리 접시에 놓습니다. 단일 에지 블레이드를 사용하여 조직을 잘라 서 1-2mm 조각을 얻습니다.
- 작은 척추동물 표본의 경우 100mm x 20mm 페트리 접시를 사용하십시오.
- 큰 척추 동물 표본의 경우 150mm x 15mm 페트리 접시를 사용하십시오.
- 작은 척추동물 표본의 균질화(표 2 및 표 3)
- 피질, 소뇌, 뇌간, 광학 엽 및 척수를 개별 10 mL Potter-Elvehjem 유리 조직 분쇄기로 개별 10 mL에서 MV-1 용액의 ~1 mL로 전사 파이펫을 사용하여 PTFE 유봉으로 옮김을 옮김을 전달한다. MV-1 용액 5 mL을 추가하고 각 조직 (~10 스트로크)을 균질화하십시오. 개별 15 mL 원엽 튜브로 전송합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
참고: 작은 척추동물의 경우, 광학 엽유무에 관계없이 각각 10 mL Potter-Elvehjem 그라인더와 15 mL 원추형 튜브가 필요합니다. - 개별 1.7 mL 튜브에서 MV-1 용액의 ~ 100 μL에 집게로 시상 하부 와 뇌하수를 전송하고 조심스럽게 유리 마이크로 페슬로 균질화. MV-1 용액의 ~ 1 mL로 각 마이크로 페슬을 헹구고. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
참고: 작은 척추동물의 경우 2개의 유리 마이크로페스트와 1.7mL 튜브가 필요합니다.
- 피질, 소뇌, 뇌간, 광학 엽 및 척수를 개별 10 mL Potter-Elvehjem 유리 조직 분쇄기로 개별 10 mL에서 MV-1 용액의 ~1 mL로 전사 파이펫을 사용하여 PTFE 유봉으로 옮김을 옮김을 전달한다. MV-1 용액 5 mL을 추가하고 각 조직 (~10 스트로크)을 균질화하십시오. 개별 15 mL 원엽 튜브로 전송합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 큰 척추동물 표본의 균질화(표 4 및 표 5)
- 전사 파이펫을 사용하여, 다진 티슈를 PTFE 유봉으로 55 mL Potter-Elvehjem 유리 조직 분쇄기로 옮기고 오버헤드 교반기에 부착한다. 균질화되는 특정 CNS 부분에 따라 MV-1 용액의 권장 부피의 절반을 추가한다(표5).
- 매우 낮은 속도 (~ 150 rpm)에서 오버 헤드 교반기의 켜고 조심스럽게 약 30 s에 대한 위아래로 유리 튜브를 이동합니다.
- 오버헤드 교반기의 끄기, MV-1 용액 을 더 추가하고, 균일한 슬러리를 얻을 때까지 4.3.2 단계를 반복합니다.
- 50 mL 원엽 튜브로 옮김. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 각 CNS 조직 균질화 사이에 탈이온수로 분쇄기를 세척합니다.
참고: 백색 물질의 유무에 관계없이 큰 척추동물 5 또는 4의 경우 각각 50mL 원추형 튜브가 필요합니다. 마찬가지로, 두 (2) 15 mL 원추형 튜브 는 시상 하 부와 뇌 하 수 체에 필요한.
5. 마이크로 혈관 정화
- 원심분리기 조직은 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 4.2.1 단계, 4.2.2 또는 4.3.4에서 유래한다. 미엘린의 큰 흰색 인터페이스는 붉은 미세 혈관의 펠릿의 상단에 형성됩니다. 상급자를 버리십시오.
- 작은 척추 동물 표본(표 2 및 표 3)
- 5 mL의 혈청학적 파이펫 (~10 플러시)으로 얼음 차가운 MV-2 용액 5 mL에서 피질, 소뇌, 뇌간, 광엽 및 척수 펠릿을 다시 중단하십시오. 각 서스펜션에 5mL의 얼음 차가운 MV-2 용액을 추가하고 튜브를 뒤집어 조심스럽게 섞습니다.
- MV-2 용액 1 mL로 시상 하부 및 뇌하수체 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 큰 척추 동물 표본(표 4 및 표 5)
- 피질, 소뇌, 뇌간 및 척수 미세 혈관 펠릿에 20 mL의 얼음 차가운 MV-2 용액을 추가하십시오. 튜브 리볼버 셰이커에 혼합하여 펠릿을 다시 중단하고 40 rpm에서 ~ 5 분 동안 교반하십시오.
- 5 mL 혈청학적 파이펫 (~10 플러시)으로 MV-2 용액의 5 mL에서 시상 하부 및 뇌하수체 미세 혈관 펠릿을 다시 중단하십시오. 서스펜션에 5mL의 얼음 차가운 MV-2 용액을 추가하고 튜브를 뒤집어 조심스럽게 섞습니다.
- 작은 척추 동물 표본(표 2 및 표 3)
- 4°C에서 15분 동안 4,400 x g의 원심분리기.
- 조심스럽게 천천히 튜브를 회전하고 상층이 벽을 따라 통과 할 수 있도록하여 각 튜브의 벽에서 액체 인터페이스에 두껍고 조밀 한 myelin 층을 분리합니다.
- 미엘린과 액체 인터페이스를 버리고 각 튜브의 내부 벽을 낮은 보풀 종이 닦음으로 감싼 주걱으로 얼룩지십시오. 작은 척추 동물 표본의 경우, 전사 파이펫으로 조심스럽게 흡입하여 각 시상 하부와 뇌하수체 튜브에서 미엘린 층을 제거하십시오.
- 꼬인 낮은 보풀 종이 닦음으로 여분의 액체를 닦아냅니다. 낮은 바인딩 팁을 사용하여 MV-3 용액 1mL로 각 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
6. 마이크로 용기 용출 및 여과
- 각 CNS 영역에 대한 개별 비커에 얼음 차가운 MV-3 용액을 붓습니다. 4 °C에서 유지합니다.
- 작은 척추동물 표본의 경우 50mL 비커당 10mL의 MV-3 용액을 사용하십시오. 광학 엽이 포함되는지 여부에 따라 총 6-7개의 비커가 필요합니다.
- 큰 척추동물 표본의 경우 100mL 비커당 30mL의 MV-3 용액을 사용하십시오. 백색 물질이 포함되어 있는지 여부에 따라 총 6-7 개의 비커가 필요합니다.
- 50 mL 원엽 튜브 위에 세포 스트레이너를 놓습니다. CNS 리전당 하나를 사용합니다. 피질, 뇌간, 광학 엽, 척수 및 뇌하수체에 100 μm 스트레이너를 사용하십시오. 소뇌와 시상 하부70 μm 세포 여과기를 사용하십시오.
- 얼음 차가운 MV-3 용액 1 mL로 각 스트레이너를 적시세요.
- 응집체를 피하기 위해 혼합하는 동안 혈청학적 파이펫으로 5.5 단계에서 제조된 현탁액에 더 많은 MV-3 솔루션을 추가합니다. 조심스럽게 스트레이너 위에 마이크로 선박을로드합니다. 얼음으로 차가운 MV-3 용액으로 헹네하십시오.
- 작은 척추 동물 표본(표 2 및 표 3)의경우 혈청 학적 파이펫으로 MV-3 용액 10-15 mL을 추가하고 MV-3 용액 5 mL로 헹구습니다.
- 큰 척추 동물 표본의 경우 혈청 학적 파이펫으로 MV-3 용액 20 mL을 추가하고 MV-3 용액 10 mL로 헹급하십시오.
- 수정된 필터홀더(그림 2D)에 20 μm 나일론 그물 필터를 배치하여 여과 유닛을 조립합니다(그림 2D),CNS 영역당 하나.
- 작은 척추동물표본(표 2 및 표 3)의경우 피질, 소뇌, 뇌간, 광학 엽 및 척수에 대해 25mm 변형 필터 홀더를 사용합니다. 시상 하부와 뇌하수체에 13mm 변형 필터 홀더를 사용하십시오.
- 큰 척추 동물 표본(표 4 및 표 5)의경우 피질, 소뇌, 뇌간 및 척수에 대해 47mm 변형 필터 홀더를 사용합니다. 시상 하 부와 뇌 하 수 체에 대 한 25 mm를 사용 하 여.
- 50mL 원추형 튜브와 습식 필터 위에 5mL의 얼음-차가운 MV-3 용액을 장착하여 버퍼가 원추형 튜브에 필터 홀더를 쏟아붓도록 합니다.
- 용출 된 마이크로 혈관 (단계 6.4에서)을 20 μm 나일론 그물 필터 위에 옮기고 얼음 차가운 MV-3 용액 5-10 mL로 마이크로 혈관을 헹구습니다.
- 깨끗한 집게를 사용하여 필터를 회수하고 6.1단계에서 제조된 얼음 차가운 MV-3 용액을 함유하는 비커에 담급질한다.
- 약 30초 동안 부드럽게 흔들어 서 필터에서 마이크로 혈관을 분리합니다. 작은 척추 동물 표본의 경우 15 mL 원추형 튜브에 비커 함량을 붓습니다. 큰 척추 동물 표본의 경우 비커 함량을 50 mL 원추형 튜브에 붓습니다.
- 2,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고, 저결합 파이펫 팁을 사용하여 1 mL의 얼음-차가운 MV-3 용액으로 펠릿을 재중단시켰다.
- 작은 척추동물 표본의 경우, 현탁액(6.10단계)을 1.7mL 미세원심지 튜브로 옮기고 원심분리기를 20,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 옮니다.
참고: 이 스핀은 강력한 수율을 보장하기 위해 최대 속도(~20,000 x g)의벤치탑 원심분리기에서 수행됩니다. - 큰 척추 동물 표본의 경우, 5.0 mL 미세 원심 분리 튜브로 단계 6.10에서 현탁액을 전송, MV-3 용액의 4 mL를 추가하고, 4 °C에서 5 분 동안 2,000 x g에서 원심 분리.
- 작은 척추동물 표본의 경우, 현탁액(6.10단계)을 1.7mL 미세원심지 튜브로 옮기고 원심분리기를 20,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 옮니다.
7. 면역 염색
참고: 헤마톡신 및 에오신(H&E) 염색은 프로토콜 타당성의 개념 증명으로 파충류, 수륙 양용 및 어패류 표본에서 수행되었습니다. 따라서, 이 견본을 위한 면역 표지를 위한 추천이 없습니다.
- 미세 원심 분리튜브에서 상급체를 제거합니다.
- 저결합 파이펫팁(재료 표)을사용하여 1x 멸균 PBS에서 펠릿을 다시 놓습니다. 여러 번 파이펫팅하여 미세 혈관이 응집체를 형성하지 못하게하십시오. 작은 척추 동물 표본(표 3)의경우 펠릿 크기에 따라 ~ 100 μL-2,000 μL을 사용하십시오. 큰 척추 동물 표본(표 5)의경우 펠릿 크기에 따라 ~ 1,000 μL-4,000 μL을 사용하십시오.
- 낮은 바인딩 파이펫 팁을 사용하여, 잘 슬라이드에 미세 혈관을 전송, 측면 벽을 피하면서, 각 우물의 중심에 추가조심.
- BSC-2 내부에 잘 미끄러지기, 덮여, 설정하고 RT에서 20~30 분 동안 건조시키십시오.
참고: 골재 형성을 피하기 위해 비교적 많은 부피가 1x PBS로 사용됩니다. 이 때문에, 마이크로 혈관이 폴리 D-리신 코팅에 의해 개최되고 있는지 확인하기 위해 고정하기 전에 슬라이드를 건조하게 할 필요가있다. - 이송 파이펫으로 파이펫팅하여 잔류 1x PBS를 제거하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)의 200 μL을 추가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 파이펫을 꺼내 서 RT에서 5 분 동안 1x PBS의 200 μL로 3 x를 세척하십시오.
참고 : 물고기, 수륙 양용 및 파충류 CNS 마이크로 선박에 H & E 염색이 시점에서 수행되었다. - 웰 슬라이드에 200 μL의 블로킹 버퍼를 넣고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
- 이송 피펫으로 차단 완충제를 제거하고 1차 항체 칵테일의 200 μL을희석항체(표)에첨가한다. 밤새 4°C에서 배양합니다.
- 1차 항체 칵테일을 파이펫아웃하고 RT에서 5분 동안 1x PBS의 200 μL로 3x를 세척합니다.
- 1x PBS로 희석된 이차 항체 칵테일(재료표)을적재하고 RT에서 2시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
- 이차 항체 칵테일을 파이펫 아웃하고 RT에서 5 분 동안 1 x PBS의 200 μL로 3 x를 씻어 빛으로부터 보호합니다. 마지막 세척 후 잘 슬라이드의 프레임을 분리하고 낮은 보풀 종이 닦아 여분의 1x PBS를 블롯 건조.
- 핵 염색을 위해 커버슬립, 액체 안티페이드 마운트 매미, 4′,6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)를 추가합니다. 빛으로부터 보호된 RT에서 밤새 건조시키세요.
- 건조가 끝나면 공초점 현미경 및 데이터 수집준비가 될 때까지 4°C의 슬라이드 박스의 빛으로부터 보호하십시오.
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Representative Results
뮤린 CNS로부터 분리된 미세혈관은 신경혈관 단위2,3의모든 내재세포 성분을 보였다. 내피 세포에 대한 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (PECAM, CD31이라고도 함) 또는 isolectin IB4 (내피 세포 글리코칼릭스를 결합하는 당단백질)를 사용하여, 혈소판 유래 성장 인자 β(PDGFRβ) 또는 신경-신경교 항원 2(NG2)는 성상 세포종말피트를 위한 구혈구 및 아쿠아포린-4(AQP4)에 대해(그림 3A, B)이러한 본질적인 성분이 단리된 마이크로혈관에 존재한다는 것을 보여준다. 가시적인 CNS 영역은 피질 미세혈관(도3B),소뇌(도3C),뇌하수체(도3D),시상하부(그림3E),뇌간(도3F),및 척수(도3G)를포함한다. 모두 이러한 표준 마커의 표현을 보였다.
마찬가지로, 마이크로혈관은 접합 접합 단백질 VE-카데린(그림4A,C),단단한 접합 단백질 클라우딘-5 및 조울라 옥루덴스-1(CLDN5 및 ZO-1) 의 발현을 보였다. 도 4A, D),삼세포 접합 단백질 앙굴린-1(그림 4A, E)및 아피코바살 마커 C-X-C 모티프 케모킨 리간드 12 및 감마-글루타밀 트랜스퍼라제 1(CXCL12 및 GGT1, 도 4A,F). 이러한 사실 인정은 이들 단백질이 중추적인 BBB 특이적 특성의 지표이기 때문에 관련이있다 9,12,13,14. 신경교 섬유성 단백질을 발현하는 성상 세포, 올리고덴드로시트 및 뉴런의 제한된 존재(GFAP, 도 4B, C,G),올리고덴드로시트 특이적 단백질(OSP, 도 4B, G), 및 신경필라멘트 배지(NFM, 도 4B,H),각각, 분리된 미세혈관이 비신경세포의 비미순환성 미량 세포를 가졌다는 것을 보여준다. 더욱이, 대부분의 미세혈관은 α-평활근 액틴의 발현이 결여되었다(αSMA, 도 5B,C). 이는 αSMA가 동맥 및 베누아와 관련된 평활근 세포에 대한 마커이기때문에(도 5A),이러한 격리 프로토콜이 작은 구경 마이크로혈관(15)을 선택적으로 표적임을 나타내는 것이다.
다른 작은 lissencephalic 척추동물에서 얻은 마이크로 혈관은 물고기 (개구리와 도마뱀이 도시되지 않음)와 조류 마이크로 선박에서 볼 수 있듯이 일부 형태학적 특징을 공유합니다. 이는 이 방법이 종 간 NVU의 차이를 더욱 특성화하는 데 유용하다는 것을시사한다(도 6). 더욱이, 조류 CNS 마이크로혈관(그림 6H-N)은인간 및 마우스용으로 개발된 많은 항체와 의 교차 반응성을 보였다. 이것은 생물학과 생물 의학 BBB 연구 결과를 위한 조류 견본의 추가 조사를 격려합니다. 돼지와 원숭이, 두 개의 자이엔스팔릭 종으로부터 마이크로혈관을 분리했을 때 유사한 결과를 관찰했습니다(그림7). 돼지 미세 혈관의 NVU 정식 마커만 표시됩니다. 전술한 CNS 영역 이외에, 우리는 심실 백물로부터 미세 혈관을 분리할 수있었다(그림 7B). 이것은 백색 물질이 신경 염증 성 조건 (예를 들어, 다발성 경화증16,17,18)에연루되어 있기 때문에 관련이 있습니다.
우리는 이 방법이 단백질 발현의 변화를 결정하는 신뢰할 수 있는 도구로 사용될 수 있는지 알아보고싶었습니다. VCAM-1과 JAM-B가 EAE 기간 동안 척수에서 신경 염증 과정에 연루되었다는 것을 알고, 우리는 EAE와 sham-control 마우스 (10 주 령 C57BL/6J 마우스)의 피크 및 만성 단계에서 이러한 단백질의 발현을 양량화하기로결정했습니다9,10, 11. 이를 위해 마이크로선박의 직경을 따라 임의의 강도 단위(AUI)를 측정했습니다. 그런 다음, DAPI에 대해 ≤20 AUI의 임계값을 사용하여, CNS 영역당 50개의 마이크로혈관에 대해 VE-카데린, VCAM-1 및 JAM-B에 대한 곡선(AUC) 하에서 영역을 계산하였다(그림8A,B). 마지막으로, 우리는 단백질 발현의 변화의 통계적 유의성을 결정하기 위해 Sidak의 사후 테스트에 이어 양방향 ANOVA를 수행했습니다.
예상대로, 우리는 EAE의 피크 동안 척수 미세 혈관을 따라 VCAM-1 및 JAM-B의 증가를 관찰(그림 8D,E). 그러나 이전에 EAE에 대해 보고되지 않은 다른 CNS 지역의 변화를 관찰했습니다. VCAM-1 은 뇌하수체 미세 혈관에서 크게 증가하고 시상 하부 및 뇌간 미세 혈관에서 감소했습니다. 모든 CNS 조직에서 만성 EAE 동안 변화가 있었다(그림 8D). JAM-B는 만성 EAE 동안 시상 하부 및 뇌하수체 미세 혈관에서 유의히 증가(그림 8E). 흥미롭게도, 우리는 EAE의 피크 동안 시상 하부와 뇌간에서 분리 된 마이크로 혈관을 따라 VE-카데린의 변화를 관찰, 만성 EAE 동안 소뇌(그림 8C),피크 및 만성 EAE 동안 뇌하수체 미세 혈관 폭의 감소. 전반적으로, 이 데이터는 마이크로 혈관 격리의 이 방법이 건강과 질병 도중 국소 단백질 발현 패턴에 있는 변경을 특성화하는 유용한 공구이다는 것을 건의합니다.
그림 1 : 하구 절제술없이 효율적인 척수 해부. 작은 척추 동물 표본 (최대 100g)에서 척수의 해부는 척추 포어맨전체에 걸쳐 척추 방향으로 코드를 소문자방향으로 플러시하여 더 빠르고 효율적으로 수행됩니다. 해부 가위를 사용하여 머리는 아틀라스 관절에 의해 제거되고 척추는 엉덩이(A)에의해 절단됩니다. 남아있는 모든 장기는 척추(B)만남기고 제거됩니다. 요추 척추 포어내척은 자궁 경부 줄의 폭에 비해 매우 작은 흰색 원 (&1 mm 직경)으로 나타납니다(B,노란색 화살표). 요추 척추 포멘에서 좁은 개구부를 유지하면 18G 바늘과 10 cc 주사기로 1x PBS(C 및 D)가적재 된 상태로 씻어 내면 요추에서 자궁 경부 척추까지 압력 구배가 촉진됩니다. 일단 플러시되면 척수(D, 노란색 화살표)는 경막 낭이 거의 완전히 결여되어 있으며 해부 범위 하에서 피아만 제거해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이중 갈래 선택 해부 도구 및 수정된 필터 홀더. 이 11cm 길이의 해부 도구(A)는매우 날카롭고 거의 수평으로 반대되는 두 개의 포인트, 2mm 팁대 팁(B)을가지고 있습니다. 부드러운 하향 압력을 적용하고 시계 방향으로 약간 비틀어(C),포인트는 위쪽으로 들어 올릴 수 있도록 수막에 수평으로 자신을 포함. 이것은 소뇌 Folia의 깊이에 접근 할 수 있기 때문에 소뇌에서 수막을 제거 할 때 특히 유용합니다. 또한 피질 조직, 특히 자뇌증에서 수막을 제거 할 때 매우 유용합니다. 이 경우, 피아는 마이크로세혈관 분리의 순도를 손상시킬 고음분 혈관구조에 매우 매립되어 있습니다. 마찬가지로, 그것은 오염의 유사한 근원인 choroid 신경총의 제거를 용이합니다. 직경 47 mm, 25 mm 및 13 mm 직경의 필터 홀더는 상부 구획(E)에서입구 커넥터(D)를제거하기 위해 레이저 컷을 했지만 체 성분(G)을유지하였다. 이러한 변형은 20 μm 나일론 필터 망을 체 및 하단부(G,H)에배치함으로써 필터유닛(I,J)의조립을 허용하고, 상부부(E)를나사로 조일 때 그물을 제자리에 고정한다. 25mm 필터 홀더만 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 다중 CNS 영역에서 분리된 마이크로혈관은 정식 신경혈관 단위 마커를 발현하였다. (A)면역 표지 및 공초점 현미경을 사용하여, NVU의 본질적인 세포 분대는 성인 (8-14 주 된 C57BL/6J) 뮤린 CNS 마이크로 혈관을 확인하는 데 사용됩니다. 피질 미세 혈관(B)에대한 병합 이미지에서 볼 수 있듯이, 내피 세포 마커 CD31 (흰색), 상혈구 마커 PDGFRβ (빨간색), 및 성상 세포 끝 피트 마커 AQP4 (녹색)에 대한 개별 공초점 이미지 이상이 모든 세포 성분이 유지됩니다. 내피 세포와 pericytes 사이의 친밀한 관계는 병합 된 그림에 자홍색으로 나타나게하고 성상 세포 종말 발은 그들을 둘러싼 후광을 가지고 있는 것처럼 보입니다(B). 소뇌(C),뇌하수체(D),시상 하부(E),뇌간(F),및 척수(G,DAPI, 핵 얼룩 = 파란색; 스케일 바 = 10 μm)에 대해 동일한 발현 패턴이 관찰된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 미세혈관은 BBB 특이적 특성과 관련된 단백질을 발현한다. 내피 세포는 신경혈관 단위(NVU) 또한 그들의 본질적인 장벽 특성과 관련된 단백질에 의해기술된다(A). 도면에서 볼 수 있듯이, 내피 세포는 VE-카데린, CLDN5, ZO-1(A, 노란색) 및 앙굴린-1(A, 청록색)으로 만들어진 접합을 갖는다. 그(것)들은 또한 GGT-1및 CXCL12(A,녹색 및 빨강)를 포함하여 다중 단백질에 양봉극성을 전시합니다. 뉴런, 올리고엔드로시트, 및 성상세포 세포체는NVU(B)에내재되어 있지 는 않지만 단리된 마이크로혈관에 포함될 수 있다. 이들은 각각 NFM(적색), OSP(시안), 및 GFAP(라임 그린)의 발현에의해 식별될 수 있다. 이와 일치, 우리의 분리 된 마이크로 혈관 은 단백질 VE-cadherin(C,적색), 단단한 접합 단백질 CLDN5 및 ZO-1(D,적색 및 녹색, 각각 병합 = 노란색), 삼세포 접합 단백질 LSR(E, 녹색), 및 양피 세포 마커 CXCL12 및 GGT1(F, 적색 및 녹색)을 각각 표명했다. 그(것)들은 또한 GFAP의 한정된 양을 전시했습니다(A,녹색, G,백색), OSP(G,녹색), 및 NFM(H, 빨강), 비 신경 혈관 단위 세포의 무시할 수 있는 보유를 건의합니다 (DAPI, 핵 얼룩 = 파란색; 규모 막대 = 10 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 대부분의 단리된 마이크로혈관은 αSMA를 발현하지 않는다. 신경 혈관 단위는 동맥 모세관 -venule(A)에서정교한 전환을 나타낸다. αSMA 항문발현은 동맥을 명확하게 식별하고, 모세관이 됨에 따라αSMA(B,적색) 발현이 감소하여, 벽화 마커 NG2(B, 녹색)를 노출한다. αSMA+ 및 αSMA-용기(흰색 브래킷, n = 20)의 직경을 측정하여 동맥 또는 모세혈관(DAPI, 핵 얼룩 = 파란색, 스케일 바 = 10 μm)으로 구분했습니다. αSMA+ 및 αSMA-혈관의 직경에 대한 짝이 없는 t-테스트 분석은 높은 통계적유의성(C,αSMA+=적색, αSMA-적색/녹색, ****p < 0.0001)을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 다른 경수구 종으로부터 CNS 마이크로혈관의 성공적인 분리. CNS는 야생 잡은 개구리 (8.2 cm), 도마뱀 (12.7 cm), 탱크 제기 무지개 송어 (2 세, 35.6 cm), 조류 사육 비둘기 (9 개월, ~ 300g)에서 수확되었습니다. 개구리, 물고기, 도마뱀의 마이크로 선박은 H & E에 의해 염색되었습니다 (송어에서 만 마이크로 선박이 표시됩니다, 스케일 바 = 20 μm). 비둘기 마이크로혈관을 면역표지되었다. 우리는 물고기와 비둘기 CNS 윤곽에 표시된 대로 모든 지역에 마이크로 혈관을 식별 할 수 있었다 : 피질(A 및 H),광학 엽(B와 I),소뇌(C와 J와 I),뇌하수체(D 및 L),시상 하부(E 및 K),뇌간(F 및 M),척수(G 및 N). 추가적으로, 우리는 비둘기의 고립된 마이크로혈관 (DAPI, 핵 얼룩 = 파란색, 규모 막대 = 10 μm)에서 isolectin IB4 (백색), AQP4 (녹색)를 가진 성상 세포 끝피트 및 NFM (빨간색)를 가진 인접한 뉴런을 가진 내피 세포를 확인할 수 있었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 자뇌세포 종으로부터 CNS 마이크로혈관의 분리. 뇌와 척수는 마이크로혈관 분리 및 면역 라벨링을 위해 농장에서 자란 돼지(생후 6개월~ 120kg)에서 해부되었습니다. 우리는 긍정적으로 IB4에 대한 표지 된 마이크로 혈관을 식별 할 수 있었다 (흰색), PDGFRβ (빨간색), 및 AQP4 (녹색) 돼지 CNS의 모든 영역에: 피질(A),심실 백질(B),소뇌(C),뇌하수체(D),시상 하부(E),뇌간(F),및 척수(G,DAPI, 핵 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: CNS 마이크로혈관 절연의 다른 적용의 예. JAB-B 및 VCAM-1의 발현은 뮤린 EAE 마이크로혈관에 대해 정량화되었다. 임의의 강도 단위(AUI)는 EAE의 피크 및 만성 단계에서 쥐의 피질, 소뇌, 시상 하부, 뇌하부, 척수, 그리고 대조군으로 가짜(n=4)를 측정하였다. 각 CNS 영역에 대해, 12개의 마이크로혈관을 마우스당 평가하여 플루오로크롬당 AUI와마이크로혈관(A)의직경을 결정하였다. 백색 브래킷은 VCAM-1(흰색), VE-카데린(녹색), JAM-B(빨간색), 및 DAPI(파란색, 스케일 바 = 10 μm)에 대한 AUI를 결정하는 데 사용되는 공초점 현미경 소프트웨어 측정 도구의 예를 보여줍니다. 이어서, 생성된 AUI는 단백질 발현의 추정치로서 각 면역표지된 단백질에 대한 곡선(AUC) 이하의 면적을 계산하기 위해 미크론(B)의 직경에 대하여 플롯하였다. 그룹당 평균 AUC를 양방향 ANOVA로 분석한 다음, CNS 영역당 총 48개의 마이크로혈관에 대해 Sidak의 사후 테스트가 수행되었습니다. 뇌하수체 미세혈관을 제외하고, 우리는 질병상태(C,insert)와 관련된 미세혈관 직경 간의 큰 차이를 관찰하지 는 않았지만, EAE 마우스에서 시상 하부 및 뇌간으로부터VE-카데린 발현이 현저한 감소를 관찰하였다(C). 유사한 통계 분석은 EAE의 피크 동안 신경 염증 상태와 일치하는 척수에서 VCAM-1(D)및 JAM-B(E)에대한 유의한 증가를 보였다. 흥미롭게도, 우리는 또한 시상 하 부에서 VCAM-1에 대 한 변화를 관찰, 뇌 하 수 체, 그리고 뇌간. 이러한 결과는 조사 중입니다(검정색 막대 및 점 = sham, 빨간색 막대 및 점 = 피크 EAE, 연어 막대 및 점 = 만성 EAE, *p&0.05, @p&0.01, #p&0.001 및 &p&0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| MV-1 | 10 mM HEPES |
| 칼슘과 마그네슘이 함유된 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) 1배 | |
| MV-2 | 18% 70 kDa 분자량 (MW) 덱스렌 |
| 10 mM HEPES / HBSS (MV-1) | |
| MV-2 | 20% 70 kDa MW 덱스렌 |
| 10 mM HEPES / HBSS (MV-1) | |
| MV-3 | 1% 소 세럼 알부민 (BSA) |
| 10 mM HEPES / HBSS (MV-1) | |
| 고정 제 | 4% 파라포름알데히드 (PFA) |
| 1x 인산염 완충식염수(PBS) pH 7.4 | |
| 세척 버퍼 | 1x PBS pH 7.4 |
| 투압 및 차단 버퍼 | 10% BSA |
| 0.25% 난오계면활성제 | |
| 1x PBS pH 7.4 | |
| 항체 희석제 | 5% BSA |
| 0.25% 난오계면활성제 | |
| 1x PBS pH 7.4 |
표 1: 프로토콜에 사용되는 솔루션입니다.
| 스텝(들) | 작업 |
| 4.1 및 4.1.1 | 단일 에지 블레이드가 있는 MV-1 솔루션의 최소화 |
| 4.2 ~ 4.2.2 | 포터-ELVJ PTFE 또는 마이크로튜브 유봉을 사용하여 MV-1 용액의 균질화 |
| 5.1 | 2,000 x g,4 °C, 10 분에서 회전 |
| 5.1.1 ~ 5.1.1.2 | MV-2 용액에서 펠릿을 다시 일시 중단 |
| 5.2 | 4,400 x g,4 °C, 15 분에서 회전 |
| 5.3 ~ 5.5 | MV-3 용액 1mL로 펠릿을 다시 일시 중단 |
| 6.2 ~ 6.4.1 | 셀 스트레이너를 통해 50 mL 원원튜브를 통해 경화하고 MV-3 용액으로 헹구십시오. |
| 6.5, 6.5.1, 6.6 및 6.7 | 수정된 필터 홀더에 20 μm 나일론 그물필터 |
| 6.8 | 나일론 그물을 MV-3 용액 10 mL로 50mL 비커에 로드하고 30 s동안 흔들어줍니다. |
| 6.9 ~ 6.10 | 15 mL 원뿔 튜브로 데컨트하고 2,000 x g,4 °C, 5 분에서 회전 |
| 6.10 | MV-3 솔루션의 1mL로 재중단 |
| 6.10.1 | 1.7 mL 마이크로튜브로 전송하고 20,000 x g,4 °C, 5 분에서 회전 |
| 7.1 ~ 7.3 | 1x PBS에서 다시 일시 중단하고 웰 슬라이드에 로드 |
표 2: 작은 척추동물 미세혈관 격리를 위한 레이아웃. 이 차트는 lissencephalic 견본을 사용할 때 프로토콜의 요약된 버전입니다.
| 스텝(들) | 솔루션 | 작업 | Ctx | CBL | 선택 | 영국 서머 타임 | 사우스 캐롤라이나 | 하이프 (약 수)는 | 구 덩이 |
| 4.1 | MV-1 | 접시에 다진 | 100 mm x 20mm 페트리 접시, 1 mL | 해당 /a | |||||
| 4.2.1 및 4.2.2 | MV-1 | 균질화 | 5 mL, 유봉이있는 10 mL 포터 - 엘베젬 | 1 mL, 마이크로 페슬 | |||||
| 5.1.1.1 및 5.1.1.2 | MV-2 | 일시 중단 | 5 mL + 5 mL, 18% 덱스렌 | 1 mL, 20% 덱젠 | |||||
| 5.5 및 6.4.1 | MV-3 | 일시 중단 | 1 mL + 10-15 mL | 1 mL | |||||
| 6.2 및 6.4.1 | MV-3 | 스트레이너 사이즈 | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| 린스 | 5 mL | ||||||||
| 6.5, 6.5.1 및 6.7 | MV-3 | 필터 크기, 헹작 | 25mm 필터, 10mL | 13mm, 5mL | |||||
| 6.8 | MV-3 | 비커에 흔들어 | 10 mL | ||||||
| 6.10 | MV-3 | 일시 중단 | 1 mL | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | 일시 중단 | 1.5 ~ 2.0 mL | 0.5 ~ 1.0 mL | 0.1 ~ 0.2 mL | ||||
| 7.3 | 1x PBS | 웰당 하중 | 200 μL | 100 μL | 25 ~ 50 μL | ||||
| CTX = 피질, CBL = 소뇌, BST = 뇌간, OPT = 광학 엽 (포유류에 존재하지 않음), HYP = 시상 하부, PIT = 뇌하수체, SC = 척수. 권장량은 20g (어린 마우스)에서 800g (성인 쥐)에 이르는 크기의 동물에서 전체 조직에 대한 것입니다. | |||||||||
표 3: 권장 볼륨/크기. 이 개요는 ~ ~ 20 ~~800 g, 또는 더 구체적으로, ~25 g 마우스비디오에 표시된 작은 척추동물 표본을 사용하기위한 용액의 권장 볼륨을 가지고있다. 필요한 부피를 최종 조정하는 것은 해부 후 얻은 젖은 조직의 특정 양에 따라 연구원에 의해 결정되어야합니다. 연습과 문제 해결을 적극 권장합니다. CTX = 피질, CBL = 소뇌, BST = 뇌간, OPT = 광학 엽 (포유류에 존재하지 않음), HYP = 시상 하부, PIT = 뇌하수체, SC = 척수.
| 스텝(들) | 작업 |
| 4.1 및 4.1.2 | 단일 에지 블레이드가 있는 MV-1의 최소화 |
| 4.3 ~ 4.3.4 | PTFE 유봉이 있는 포터-엘베젬 그라인더를 사용하여 MV-1 용액의 균질화 |
| 5.1 | 2,000 x g,4 °C, 10 분에서 회전 |
| 5.1.2 ~ 5.1.2.2 | MV-2 용액에서 펠릿을 다시 일시 중단 |
| 5.2 | 4,400 x g,4 °C, 15 분에서 회전 |
| 5.3 ~ 5.5 | MV-3 용액 1mL로 펠릿을 다시 일시 중단 |
| 6.2 ~ 6.4 및 6.4.2 | 셀 스트레이너를 통해 50 mL 원원튜브를 통해 경화하고 MV-3 용액으로 헹구십시오. |
| 6.5, 6.5.2, 6.6 및 6.7 | 수정된 필터 홀더에 20 μm 나일론 그물필터 |
| 6.8 | 30 mLMV-3 용액으로 나일론 그물을 50mL 비커에 로드하고 30 s동안 흔들어줍니다. |
| 6.9 및 6.10 | 50 mL 원뿔 튜브로 데컨트하고 2,000 x g,4 °C, 5 분에서 회전 |
| 6.10 | MV-3 솔루션의 1mL로 재중단 |
| 6.10.2 | 5 mL 마이크로튜브로 전송하고 2,000 x g,4 °C, 5 분에서 회전 |
| 7.1 ~ 7.3 | 1x PBS에서 다시 일시 중단하고 웰 슬라이드에 로드 |
표 4: 대형 척추동물 미세혈관 격리를 위한 레이아웃. 이 차트는 자뇌세포 표본을 사용할 때 프로토콜의 요약 된 버전입니다.
| 스텝(들) | 수티온 (주) | 작업 | Ctx | CBL | Wm | 영국 서머 타임 | 사우스 캐롤라이나 | 하이프 (약 수)는 | 구 덩이 |
| 4.1 | MV-1 | 접시에 다진 | 3-5 mL | 1 mL | |||||
| 4.3 ~ 4.3.4 | MV-1 | 균질화 | 20-30 mL, 55 mL 포터-엘베젬( 유봉 및 오버헤드 교반기) | 5 mL, 유봉이있는 10 mL 포터 - 엘베젬 | |||||
| 5.1.2 ~ 5.1.2.2 | MV-2 | 일시 중단 | >20 mL, 20% 덱스렌 | 5 mL + 5 mL, 20% 덱스렌 | |||||
| 5.5, 6.4 및 6.4.2 | MV-3 | 일시 중단 | 1 mL + 20 mL | 1 mL + 10 mL | |||||
| 6.2 및 6.4.2 | MV-3 | 스트레이너 사이즈 | 100 μm | 70 μm | 100 μm | 70 μm | 100 μm | ||
| 린스 | 10 mL | ||||||||
| 6.5, 6.5.2 및 6.7 | MV-3 | 필터 크기, 헹작 | 47mm 필터, 10mL | 25mm, 10mL | |||||
| 6.8 | MV-3 | 비커에 흔들어 | 30 mL | ||||||
| 6.10 및 6.10.2 | MV-3 | 일시 중단 | 1 mL + 4 mL | ||||||
| 7.2 | 1x PBS | 일시 중단 | 2.0 ~ 4.0 mL | 1.0 ~ 2.0 mL | |||||
| 7.3 | 1x PBS | 웰당 하중 | 200 μL | 100 μL | |||||
| CTX = 피질, CBL = 소뇌, WM = 백색 물질, BST = 뇌간, HYP = 시상 하부, PIT = 뇌하수체, SC = 척수. 권장 부량은 CTX, CBL, BST 및 SC 전체 HYP 및 PIT의 경우 ~ 45cm3의 샘플에 적합합니다. | |||||||||
표 5: 권장 볼륨/크기. 이 개요는 큰 척추 동물 표본을 사용하기위한 솔루션의 권장 볼륨을 가지고있다. 보다 구체적으로, 그것은 피 질에 대 한 ~45 cm3의 CNS 조직 생 검에 적용, 소뇌, 백색 물질, 뇌간, 척수, 그리고 전체 시상 하 부 와 뇌 하 수 체, 비디오에 표시 된 대로. 필요한 부피를 최종 조정하는 것은 해부 후 얻은 젖은 조직의 특정 양에 따라 연구원에 의해 결정되어야합니다. 연습과 문제 해결을 적극 권장합니다. CTX = 피질, CBL = 소뇌, WM = 백색 물질, BST = 뇌간, HYP = 시상 하부, PIT = 뇌하수체, SC = 척수.
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Discussion
BBB는 CNS 항상성에 중요한 단단한, 부착-, "페그 소켓"- 접합부 및 CNS 항상성에 중요한 접착 플라크의 정교한 아키텍처에 의해 결합된 뇌 미세 혈관 내피 세포의 독특한특성을포함한다2,3,19. 내피 세포 특성은 주위 세포및 주변 아스트로글리아 말발 공정2,3,19에의해 유도 및 유지된다. BBB 미세혈관구조는 극성(즉, 발광 또는 분수 내피 세포 표면에 국한된 단백질의 비대칭 발현패턴)(20)을표시한다. 이 간단 하 게 BBB를 정의할 수 있습니다 하는 동안, 현실에서 그것은 신경 과학에서 가장 수수께끼 개념 중 하나 남아. 예를 들어, NVU 내의 지역, 성별 및 연령 차이는 외상, 독성, 감염 및 염증에 대한 CNS 지역 적 취약성을 설명할 수 있으며, 이는 주요 임상 결과를 초래할 수 있는3,5,6. BBB의 이해에 또 다른 장애물은 여러 taxa 중 관찰 차이7,8. BBB를 이해하고 조사하는 주요 장애물 중 하나는 BBB를 포괄하는 NVU의 격리와 관련된 난이도가 정확하면서도 장벽별 특성을 유지하면서14.
BBB, CNS 지역 적 차이뿐만 아니라 종 차이에 대한 이해를 가속화하기 위해 이전에 발표 된 방법을 적용했습니다. 우리는 성공적으로 이들, 특히 Boulay 등21,단일 피질에서 미세 혈관을 얻기 위해, 소뇌, 시상 하부, 뇌하부, 뇌간, 및 척추 조직의 무수한에 : 물고기, 양서류, 파충류, 조류, 및 포유 동물(그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 5). 이 방법의 한 가지 장점은 적응이 CNS 조직의 전체 크기를 기반으로한다는 것입니다 : 연구원은 종, 성별 및 나이에 관계없이 습식 조직에 따라 용액의 양, 조직 분쇄기, 원뿔 형 튜브, 필터 홀더 등을 선택합니다. 면역 표지에 대한 우리의 경험에서, ~ 20g 표본은 피질, 소뇌, 광학 엽, 뇌간 및 척수 당 8 웰 슬라이드와 시상 하부와 뇌하수체 당 8 잘 슬라이드에 대한 충분한 마이크로 혈관을 산출합니다. 그러나, 피질과 광학 엽의 수율은 소뇌, 뇌간 및 척수에 비해 훨씬 높습니다.
도시된 바와 같이, 우리는 돼지와 원숭이의 CNS 미세혈관의 격리 및 면역 표지에 필요한 적응을 수행하였고, 더 큰 자뇌증 포유동물은 번역 연구에 더 관련이있다(그림 7). 특히, 우리는 이 종에만 심실 백물질을 포함시킬 수 있었습니다. 이들 동물의 CNS가 더 크므로, 우리는 제2 원심분리 동안 미엘린 층으로부터 미세혈관 펠릿을 분리할 수 있도록 충분한 백색 물질을 수집하였다(단계 5.3, MV-2와 20% 덱스렌). 우리는 임계 질량이 분리를 chive 할 수 있을 필요가 있다고 추측하고 우리는 적극적으로 뮤린 CNS 조직과 유사한 결과를 얻는 방법을 모색하고 있습니다.
단순성을 위해 생략되었지만, 우리는 조류, 돼지 및 마카크 마이크로 혈관에 NVU 정식 마커를 넘어 면역 라벨링을 수행했습니다. 특히, 모든 종은 BBB 기능(접합 단백질 VE-cadherin, CLDN5, ZO-1, 및 LSR 및 피코바살 마커 CXCL12 및 GGT1)에 근접하거나 NVU(NFM, OSP 및 GFAP)에 근접하여 뮤린 샘플에서 이전에 확인된 세포 및 분자 마커를 공유하였다. 다시, 이 사실 인정은 더 종 중 NVU 정형과 발산을 확인하기 위하여 그밖 종에 이 방법의 사용을 격려합니다. 그것은 또한 NVU 긴장에 추가 조사를 위한 기회를 엽니다., 성별, 그리고 동일한 종 내에서 나이 차이 BBB 생물 의학 연구에 대 한 다른 유기 체를 사용 하 여의 타당성. 우리는 또한 신경 염증 동안 단백질 발현 수준에 있는 변경을 양량하기 위하여 이 마이크로 혈관 격리 방법의 성공적인 사용의 증거를 보여줍니다(그림 8). 우리는 개념 증명으로이 실험을 수행하더라도, 여기에 사용되는 접근 방식은 현재 광범위하게 우리의 실험실에서 악용된다. 우리는 CNS 마이크로 혈관9,13,22의복잡한 외관 내에서 발현 수준뿐만 아니라 상대 단백질 풍부, CXCL12 및 기타 양피 단백질의 재배치, 접합 단백질의 연계 등에 초점을 맞추고 싶기 때문에 다른 정량적 방법 (예를 들어, 웨스턴 블롯)에 비해이 접근법을 선호합니다. 마찬가지로, 우리는 현재 NVU 세포 성분 (내피 세포 및 회음구), RNA-seq 및 프로테오믹스23,24,25,26의추가 격리와 같은 다른 응용 프로그램에 대한 우리의 방법을 문제 해결합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
크루즈 오렌고 박사는 캘리포니아 대학, 데이비스, 수의학 창업 기금의 학교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
References
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