Summary
여기에서, 우리는 재건 미세 수술에서 허혈 재관류 상해의 병리생리학을 공부하기 위한 전임상 동물 모델을 기술한다. 이 자유 피부 플랩 모델은 쥐에 있는 표면 의 코달 상복부 혈관에 기초하 고 또한 허혈 재관류 상해 관련 손상을 중화하기 위하여 다른 치료 및 화합물의 평가를 허용할 수 있습니다.
Abstract
허혈 재관류 상해는 재건 미세 수술에서 플랩 실패의 주요 원인입니다. 쥐는 그것의 비용 효과 및 인간에 그것의 번역 때문에 생물 의학 연구의 많은 분야에서 바람직한 전임상 동물 모델. 이 프로토콜은 허혈 재관류 손상을 가진 랫트에서 전임상 자유 피부 플랩 모델을 생성하는 방법을 기술한다. 기재된 3 cm x 6 cm 쥐 프리 스킨 플랩 모델은 여러 혈관 합자 및 혈관 페디클의 섹션을 배치한 후 용이하게 수득된다. 이어서, 허혈성 모욕과 미세 외과 적 해부학의 완료 후 8 시간, 자유 피부 플랩은 조직 손상을 개발한다. 이 허혈 재관류 상해 관련 손상은 이 모형에서 공부될 수 있습니다, 이 병리생리학 프로세스를 다루기 위하여 치료에이전트를 평가하기위한 적당한 모형만들기. 또한, 이 동물 모델의 평가를 위한 프로토콜에 설명된 두 가지 주요 모니터링 기술: 운송 시간 초음파 기술 및 레이저 반점 대비 분석.
Introduction
미세 수술은 복잡한 조직 결함, 절단 된 사지의 재이식, 심지어 복합 조직 동종 이식을 복원하기 위해 개입 (예 : 무료 조직 전달)을 허용하는 재건을위한 일반적인 외과 기술이되었습니다.
미세 외과 재건은 외상성 부상, 화상 또는 종양학 절제술로 인한 다양한 결함에 이상적입니다. 그러나, 허혈 재관류 (I/R) 상해가 주요 책임 요인의 한개인 사이에서, 자유로운 플랩 실패의 낮은 비율이 있습니다. 모든 미세 외과 적으로 옮겨진 조직은 허혈의 필수 기간을 견디고 재관류가 뒤따릅니다. 1 차적인 허혈의 이 기간은 일반적으로 잘 용납됩니다; 따라서 미세 수술 의 성공률은 90 %1,2를초과합니다. 그러나 외과 적 개정이 필요한 플랩의 63.7 %만이3. 또한, 손가락 avulsion 부상의 재배의 경우, 성공률은 66 %4; 및 복합 조직 동종 이식의 경우 I / R 부상을 앓고, I / R 부상은 타고난 면역을 활성화하기 때문에 거부 비율이 증가5,6.
따라서이 병리생리 현상에 대한 연구가 흥미 로합니다. 동물 모델은 인간에게 적용될 수 있기 전에 생리적 메커니즘을 조사하고 새로운 치료법을 평가하는 데 필수적이다7. 혈관 해부학과 쥐와 인간 사이의 생리적 유사성은 쥐를 I /R 부상과 같은 생물학적 과정의 조사를위한 이상적인 모델로 만듭니다.
여기에서는 I/R 부상을 입은 쥐 없는 피부 플랩 모델의 생성을 위한 상세한 프로토콜과 수술 후 평가를 위한 다양한 가능성을 제시합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 I/R 상해및 관련 손상을 감소시키기 위하여 가능한 처리를 공부하는 유용한 전임상 모형을 기술하는 것입니다.
Protocol
모든 절차는 Jesús Usón 최소 침습 수술 센터의 윤리위원회와 유럽 법률에 근거한 지방 정부의 복지 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 수술 전 및 외과 준비
- 22-25 °C의 케이지에서 290-350g의 무게의 하우스 위스타 쥐는 음식과 물을 무료로 이용할 수 있습니다. 스트레스로 인한 문제를 예방하기 위해 수술 전 1주동안 적응합니다.
- 마취 유도 챔버에 쥐를 놓고 산소 5 분 (0.5-1 L / 분)을 전달하고 기화기를 사용하여 마취를 유도하기 위해 5 % 세보플루란을 전달합니다.
- 마취가 유도되면 챔버에서 쥐를 꺼내. 쥐에 흡입 안면 마스크를 놓고 마취를 유지하기 위해 2 %의 세보플루란의 유량을 제공합니다. 발가락 핀치에 대한 반응이 없는지 확인합니다.
- 각막 건조 와 손상을 방지하기 위해 눈 보호 연고를 사용합니다.
- 다음과 같이 전신 마취하에 동물을 모니터링하십시오: 직장 온도계(35.9-37.5°C)를 놓고 점막 색상을 확인하고 설치류 펄스 산소 측정기를 배치하여O2 포화도를 확인합니다(>95%) 심박수(250-450 bpm).
- 저체온증을 피하고 절차 후 마취 회복을 개선하기 위해 열 지지대 (전기 가열 패드 또는 순환 물 담요)를 사용하십시오.
- 적절한 수분을 유지하기 위해 따뜻한 피하 생리식염수 용액 5 mL을 주입하십시오.
- 진통 및 항염증제 (멜록시캄 1 mg / kg / 일) 및 예방 항생제 (enrofloxacin 7.5 mg / kg / 일) 피하 시전 및 수술 후 5 일 동안 제공하십시오.
- 동물의 복부 및 인과 부위를 면도하십시오.
- 국소 포비동 요오드를 바르고 70 % 에탄올을 바르습니다. 멸균 드레이프로 동물을 덮습니다.
2. 무료 피부 플랩 모델 수술
- 수술 마커를 사용하여, 복부 중간선과 6cm 측면 중 하나를 일치하는 3cm x 6cm 플랩을 그립니다. 다음으로, 6cm 중도 절개의 상부 및 하부에 복부의 중간선과 2개의 수직 3cm 절개에서 6cm 피부 절개를 한다.
- 디자인 된 3cm x 6cm 피부 플랩을 해부하려면 가위와 Adson 집게를 사용하여 피부의 이동성으로 인해 플랩 (메스가 아닌)을 올립니다.
- 부드럽게 해부를 돕고 풍부한 느슨한 결합 조직에 둘러싸인 상복부 혈통을 식별하기 위해 꼬리 영역으로 두개골 영역에서 플랩을 당깁니다.
- 플랩 페디클을 만지지 않고 해부하거나 선박 벽을 손상시키지 않도록 가능한 한 적게 출현을 파악하여 해부하십시오.
- 8/0 나일론 봉합사를 사용하여 근위 꼬리 대퇴 혈관, 측면 곡절 대퇴 혈관 및 사페누스 혈관을 합자에 의해 폐색하십시오. 이에 의해, 플랩의 관류는 대퇴 동맥에 의해 제공되고 피상적인 꼬리 상복부 동맥을 통해 직접 계속되며, 정맥 배수는 대퇴 정맥을 향한 피상적 인 꼬리 상복부 정맥에 의해 수행된다.
- 혈관 페디클을 클램프 한 다음 8 시간 허혈 기간을 시작하기 위해 잘라. 절차 중에 온도를 유지하기 위해 전기 담요를 사용합니다. 따뜻한 (25° C) 0.9 % 식염수 용액의 두 5 ml 주사는 피하 투여된다. 제 1 투여는 절차가 시작된 후 2 시간 후에 수행된다; 그리고 동물의 적절한 회복을 얻기 위해 절차의 끝에서 두 번째.
- 헤파린화된 식염수(100 U/mL)를 사용하여 플랩을 침투시키고 미세 순환에서 정체된 혈액을 제거합니다.
- 10/0 나일론 봉합사를 사용하여 미세 외과 적 해부학을 수행하십시오.
- 허혈8시간 후, 미세혈관 클램프를 제거하여 플랩을 레퍼퓨즈하고 아래에 설명된 바와 같이 혈관 개통을 확인한다.
3. 수술 중 평가
- 정맥과 동맥에 대한 수동 개통 테스트 (빈 및 리필 테스트)를 수행하십시오. 이렇게하려면 두 개의 미세 수술 집게를 사용하고, 해부학에 말단을 배치하고 착유를 수행하십시오. 먼저 해부학 사이트에 가장 가까운 집게를 놓습니다. 혈관 절편이 비워진 후에도 혈류가 계속되면 해부학은 특허입니다.
- 이동 시간 초음파 유량계 및 미세 수술 프로브를 사용하여 혈류를 평가합니다.
- 유량 프로브에 적합한 크기를 선택하려면 페디클 용기의 직경을 측정합니다.
참고: 0.7 mm 유량 프로브는 0.4 mm에서 0.7 mm에 이르는 혈관을 측정 할 수 있습니다. 1.0 mm 유량 프로브는 0.7 mm에서 1.0 mm에 이르는 혈관을 측정 할 수 있습니다. 1.5mm 유량 프로브는 1.0mm에서 1.5mm에 이르는 용기를 측정할 수 있습니다. - 유량 부피를 정량화하기 위해 유량 프로브의 초음파 감지 창(반사판과 트랜스듀서 사이)에 대상 용기를 배치합니다.
참고: 프로브를 용기의 평면에 중립으로 고정하여 장력이나 당김을 피하십시오. - 모든 막대가 디스플레이의 녹색임을 확인하여 음향 커플링의 품질을 확인합니다.
참고: 좋은 음향 커플링을 얻기 어려운 경우 초음파 젤 또는 생리식염수 용액을 국소적으로 사용하십시오. - 좋은 커플링이 이루어지고 용기가 장력 없이 음향 창에 놓이면 디스플레이의 기록 버튼을 클릭하여 데이터를 저장합니다.
참고: 신뢰할 수 있고 정확한 측정을 얻으려면 파형 패턴을 지속적으로 반복할 수 있는지 확인하십시오.
- 유량 프로브에 적합한 크기를 선택하려면 페디클 용기의 직경을 측정합니다.
- 폴리글리콜산(PGA) 4-0 흡수성 편조 봉합사(16mm 3/8 삼각형 바늘)를 사용하여 피부를 닫습니다. 봉합사의 일부가 수술 후 쥐에 의해 물린 경우 강도와 조직 위치를 유지하기 위해 간단한 중단 패턴을 사용합니다.
- 레이저 반점 대비 분석(LASCA)을 사용하여 플랩의 미세 순환을 평가합니다.
- 각 동물과 연구의 각 후속 에 대한 새로운 기록을 확인합니다. 이렇게 하려면 파일/새 기록을 클릭합니다. 새 창이 열리고 설치 패널이 표시됩니다. 그런 다음 프로젝트 이름, 제목, 연산자 및 기록 이름의 정보를 편집합니다.
- 재현성을 극대화하기 위해 작동 거리, 측정 영역, 포인트 밀도, 프레임 속도 및 주변 광 조건과 같은 매개 변수를 표준화합니다.
- 조직과 관련하여 레이저를 이동하여 작동 거리를 조정합니다. 레이저 헤드를 관심 있는 조직쪽으로 확대 또는 축소합니다. 측정된 값을 확인하려면 이미지 설정을클릭합니다. 이쪽은 12.0 cm로 설정되어 있습니다.
- 이미지 설정에서 원하는 너비와 높이를 입력하여 측정 영역을 표준화합니다. 디자인 된 플랩은 3cm x 6cm를 측정합니다. 이 측정을 위해 너비 4.0cm와 높이 7.0cm를 선택하여 여유 공간을 확보합니다.
- 이미지 설정에서 점 밀도를 높게 설정합니다. 높음, 중간 및 낮음은 세 가지 옵션입니다.
- 이미지 캡처 설정에서 레코딩의 프레임 속도(10개 이미지/s)와 레코딩의 지속 시간(1분)을 선택합니다.
참고: 수술을 하거나 평가를 수행하는 동안 수술실에서 동일한 주변 광 상태를 가지고 있습니다. - 녹음 단추를 클릭하여 녹화를 시작합니다. 설치 패널이 기록 패널로 대체됩니다. 데이터가 자동으로 저장됩니다. 추가 비교를 가능하게 하기 위해 프로시저 중에 스냅숏을 만듭니다.
참고: 관류 스케일을 변경하여 시각화를 개선할 수 있습니다(도구 클릭 | 필터 및 컬러 스케일 | 관류 스케일 | 수동 0 - 150)하지만 측정된 관류 값은 영향을 받지 않습니다. 기록 전후에 다양한 관심 영역(ROI)을 만들어 그 내의 관류를 측정할 수 있습니다. 여기서, 연습된 플랩(3 cm x 6cm)의 면적만을 평가하였다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 생존 및 괴사 영역을 측정합니다.
- 플랩 의 측면에 있는 눈금자를 찾은 다음 플랩 생존 영역의 거시적 측정을 위해 제어 사진을 찍습니다.
- 사진을 평가하려면 ImageJ 사용자 인터페이스를 엽니다. 파일을 클릭하고 측정할 이미지를 엽니다.
- 도구 상자에서 직선을 선택하고 눈금자의 1cm 위에 직선을 그립니다. 분석 |을 클릭합니다. 배율을 설정하고 알려진 거리 1cm의 값에 대한 텍스트 상자에 소개합니다.
- 다각형 선택 도구를 클릭하고 플랩 위에 다각형 선을 그려 실행 가능한 영역을 계산합니다. 궁극적으로, 클릭 분석 | 면적 값을 얻기 위해 측정합니다.
- 수술 부위의 자가 절단을 방지하기 위해 하우징 전에 동물에 수술 후 드레싱을 놓습니다. 절차가 끝나면 동물은 온도 조절이있는 실 (22 ° C ~ 25 ° C)의 케이지에 개별적으로 보관됩니다.
4. 수술 후 평가 및 조직 샘플링
- 이 프로토콜에 앞서 설명된 동일한 단계를 수행하여 플랩 평가 및 조직 샘플링을 위한 7수술 후 일에서 랫트(1.2 단계 및 1.3단계)에 랫트체를 마취시다. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 플랩 생존 및 괴사 영역의 거시적 측정을 가능하게하는 수술 영역을 촬영합니다. 프로토콜(3.5단계)에서 이전에 설명된 수술 중 평가의 동일한 단계를 따라 수술 후 거시적 측정을 수행합니다.
참고: 다각형 선택 도구를 사용하는 동안 실행 가능한 영역을 구분하는 플랩에 선을 그려서 주의하십시오(cm2로 측정). 실행 가능한 영역의 백분율은 (총 플랩 면적의 가능한 영역 /cm2의 cm2) × 100으로 계산할 수 있습니다. - LASCA 기법(3.4단계)을 사용하여 플랩의 미세 순환을 평가하여 관류 차이를 시각화하고 정량화합니다.
- 거시적 분석 후, 4/0 봉합사를 제거하고 플랩을 상승시켜 통과 시간 초음파를 사용하여 혈관 과실 혈류를 재평가하십시오.
-
플랩을 1.5 cm x 6 cm의 두 부분으로 세로로 나누어 조직 샘플링을 수행합니다.
- 추가 조직학적 분석을 위해 실온에서 4% 파라포름알데히드가 있는 생검 용기에 한 부분을 담그고 있습니다.
- 조직의 다른 부분을 동결 보존 튜브에 도입하고 액체 질소에 담근 다음 향후 분자 분석을 위해 -80 °C에 저장하여 튜브를 냉동 보존합니다.
- 윤리위원회의 권고에 따라 2 M KCl /kg의 빠른 심장 주사를 사용하여 일반 흡입 마취하에 쥐를 안락사시.
Representative Results
미세 외과 해부학의 생성 직후, 우리는 문헌8에서권장하는 최소 흐름보다 더 높은 혈류량을 얻었습니다. 따라서, 모든 미세 외과 해부학은 수술 후 1 주일 특허했다(그림 1).
그림 1: 전송 시간 초음파 혈류 량 평가. (A)혈류를 평가하기 위한 미세외과 유량 프로브의 위치. (B)플랩 페디클의 해부학 혈관의 혈류 패턴 및 정량화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
허혈성 모욕 동안 혈류의 미세 순환 박탈의 관찰은 FLAP 재관류 동안 즉각적인 과류를 포함하는 LASCA 기술로 가능했으며, perioperative, 상이한 영역은 관류가 적고 수술 후 플랩 괴사의 위험이 더 높았으며, 연구 종료 후 7일 후에 실제로 괴사되었다(그림2).
그림 2: 레이저 반점 대비 분석 기술. (a)생리학적 상태의 미세순환 조직 혈액 관류의 시각화. (B)허혈 중 미세순환조직 혈액관류의 가시화. (C)재관류 직후 미세순환 조직 혈액 관류의 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
허혈의 8 시간 후 플랩 생존 영역과 그 후속 재관류는 약 40 %였다. 이전에 발표된 결과9는 이 모형이 허혈성 모욕이 가해되지 않은 플랩과 비교될 때 통계적으로 유의한 다름을 보여주었습니다.
Discussion
미세 외과 무료 조직 전송은 큰 결함을 재구성하기위한 선택의 방법이되었다. 허혈의 기간은 이러한 자유 조직 전달 중에 발생합니다. 이 기간이 조직의 허용 오차를 초과하는 경우, I / R 부상은 연습 무료플랩9의 실패를 일으킬 수 있습니다 . 재건 미세 수술에서 I/R 부상을 연구하는 비용 효과적이고 번역전임상 모델을 개발하는 방법론에 대한 설명은 이 병리생리학적 과정을 중화하기 위해 다른 화합물의 연구를 이끌 도움이 될 수 있습니다.
기재된 동물 모델에서, 혈관 합자를 배치하고 자유 플랩을 올린 후, 뒷다리 혈류 타협이 지적되지 않았으며, 통증이나 절뚝거리지 않았다. Kochi 등10설명으로, 우리의 모델은 또한 근육 내 네트워크를 통해 세 가지 부수적 인 경로를 떠났다.
무료 플랩의 모니터링은 매우 중요하다11,인양은 허혈 발병과 임상 인식 사이의 기간과 반비례하기 때문에. 이를 위해, 무료 플랩은 수술 후 연구되어야한다.
수술 중, 널리 사용되는 빈 리필 테스트 또는 음향 도플러는해부학(12)을통해 유동 유무의 정량화를 가능하게 하지만 정량화되지 는 않는다. 이러한 이유로, 우리는 외과 의사가 미세 외과 해부학13의혈류를 정량화 할 수있는 새로운 방법인 운송 시간 초음파 기술을 사용했습니다. 우리의 연구에서, 모든 미세 외과 해부학은 연구 결과의 끝에 뿐 아니라 허혈성 모욕의 8 시간 후에 특허되었습니다. 미세 외과 해부학의 생성 직후, 우리는 문헌8에서권장하는 최소값보다 더 높은 혈류량을 주목했습니다. 이것은 연구 결과의 끝에 좋은 pedicle 관류를 예측했습니다, 결과가 미시수술 기술에 의해 아니라 오히려 사건의 I/R 상해 폭포에 의해 영향을 받았다는 것을 보여주는. 그러나 이 기술은 제한이 없습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 미세 수술 프로브를 용기를 당기거나 장력을 생성하지 않고 용기의 평면에 중립으로 유지해야합니다. 초음파 젤 또는 식염수를 사용하여 달성 할 수있는 적절한 신호를 얻으려면 좋은 음향 커플링이 필요합니다. 장비에서 제공하는 고품질 커플링 신호는 측정 중에 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다.
우리는 또한 레이저 반점 대조 화상 진찰 또는 레이저 반점 화상 진찰로 알려져 있는 LASCA를, 수술 후14를이용했습니다. 이 기술은 여기에서 확인된 바와 같이 자유 플랩 내에서 유동을 반정량적 실시간 매핑하기 위한 귀중한 기술을 나타냅니다. 제한 사항 중 하나는 결과가 실제 흐름 값과 직접 관련이 없는 임의 단위로 제공된다는 것입니다. 이러한 의미에서, 추가 연구는이 상관 관계를 확인 하는 데 필요한. 레이저 도플러 유동측정은 더 일반적으로 사용되지만 플랩의 단일 지점에서관류만측정한다는 사실에 의해 제한되는 반면, LASCA는 플랩15내의 피부 관류에서 국부적 변화를 검출할 수 있다. 게다가, 최근 연구16 LASCA는 수술 후 플랩 괴사의 고위험에 지구를 perioperative로 예측할 수 있다는 것을 표시했습니다. 우리의 결과는 LASCA가 자유 플랩의 peri- 및 수술 후 모니터링을위한 유망한 기술임을 시사한다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
연구 프로젝트는 ICTS 난비오시스의 일부인 Jesús Usón 최소 침습 수술 센터 (CCMIJU)에서 수행되었습니다. 연구는 다음과 같은 난바이오시스 단위의 도움으로 수행되었다: U21, 실험 수술실; U22, 동물 하우징; 및 U14, 세포 치료. 이 작업은 ISCIII 프로젝트 PI16/02164에 의해 지원되었습니다. 자금 은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었다. 마리아 페레즈는 수치를 준비하고 페르난다 카리조사에게 지속적인 격려와 과학적 참고문헌을 지원해 주신 것에 대해 특별한 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AureFlo Unit | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | Transit-time ultrasound flowmeter equipment |
| Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | Set of microsurgical instruments |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | Anesthesia Delivery System |
| Micro clamps ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | Double microvascular clamp with frame |
| Micro clamps ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | Double microvascular clamp without frame |
| Micro clamps B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | Sigle microvascular clamp |
| Nylon suture 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | Microsurgical suture |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | Surgical microscope |
| PeriCam PSI System | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | Laser speckle contrast analysis equipment |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | Monitoring system |
| Protector posoperatorio para roedores | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | Postoperative protector for rodents |
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