Summary
Aquí, describimos un modelo animal preclínico para estudiar la fisiopatología de la lesión isquemia-reperfusión en microcirugía reconstructiva. Este modelo de colgajo de piel libre basado en los vasos epigástricos caudales superficiales de la rata también puede permitir la evaluación de diferentes terapias y compuestos para contrarrestar el daño relacionado con la lesión por isquemia-reperfusión.
Abstract
La lesión por isquemia-reperfusión es la principal causa de falla en la colgajo en la microcirugía reconstructiva. La rata es el modelo animal preclínico preferido en muchas áreas de investigación biomédica debido a su rentabilidad y su traducción a los seres humanos. Este protocolo describe un método para crear un modelo preclínico de colgajo de piel libre en ratas con lesión por isquemia-reperfusión. El modelo de solapa de piel libre de rata de 3 cm x 6 cm descrito se obtiene fácilmente después de la colocación de varias ligaduras vasculares y la sección del pediculo vascular. Luego, 8 h después del insulto isquémico y la finalización de la anastomosis microquirúrgica, el colgajo cutáneo libre desarrolla el daño tisular. Estos daños relacionados con lesiones por isquemia-reperfusión se pueden estudiar en este modelo, por lo que es un modelo adecuado para evaluar agentes terapéuticos para abordar este proceso fisiopatológico. Además, en el protocolo para la evaluación de este modelo animal se describen dos técnicas principales de monitorización: la tecnología de ultrasonido en tiempo de tránsito y el análisis de contraste de motas láser.
Introduction
La microcirugía se ha convertido en una técnica quirúrgica común para la reconstrucción que permite intervenciones (por ejemplo, transferencias de tejido sin tejido) para restaurar defectos tisulares complejos, replantación de extremidades amputadas e incluso alotrasplantes de tejido compuesto.
Las reconstrucciones microquirúrgicas son ideales para una amplia variedad de defectos causados por lesiones traumáticas, quemaduras o resecciones oncológicas. Sin embargo, hay un bajo porcentaje de falla de colgajo libre, entre los cuales la lesión isquemia-reperfusión (I/R) es uno de los principales factores responsables. Todos los tejidos transferidos microquirúrgicamente soportan un período obligatorio de isquemia seguido de la reperfusión. Este período de isquemia primaria es generalmente bien tolerado; por lo tanto, la tasa de éxito de los procedimientos microquirúrgicos supera el 90%1,2. Sin embargo, sólo el 63,7% de las aletas que requieren revisión quirúrgica se pueden salvar por completo3. Además, en los casos de replantación de lesiones por avulsión de los dedos, la tasa de éxito es 66%4; y en los casos de alotrasplante de tejido compuesto que sufre lesión de I/R, los porcentajes de rechazo se incrementan ya que la lesión por I/R activa la inmunidad innata5,6.
Por lo tanto, el estudio de este fenómeno fisiopatológico es de interés. Los modelos animales son esenciales para investigar los mecanismos fisiológicos y evaluar nuevas terapias antes de que puedan aplicarse a los seres humanos7. La anatomía de los vasos y las similitudes fisiológicas entre ratas y seres humanos hacen de las ratas un modelo ideal para la investigación de procesos biológicos como la lesión de I/R.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la creación de un modelo de solapa de piel libre de ratas con lesión de I/R, así como diferentes posibilidades para evaluaciones intra y postoperatorias. El objetivo general de este método es describir un modelo preclínico útil para estudiar la lesión por I/R y posibles tratamientos para reducir sus daños relacionados.
Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con el comité ético del Centro de Cirugía Mínimamente Invasiva Jesús Usón y las directrices de bienestar del gobierno regional que se basan en la legislación europea.
1. Preparación prequirúrgica y quirúrgica
- Casa ratas Wistar que pesan 290–350 g en jaulas a 22-25 oC con libre acceso a alimentos y agua. Aclimatarse durante 1 semana antes de la cirugía para prevenir problemas inducidos por el estrés.
- Colocar una rata en una cámara de inducción anestésica, entregar 5 min de oxígeno (0,5-1 L/min) y utilizar un vaporizador para administrar un 5% de sevoflurano para inducir anestesia.
- Saque la rata de la cámara una vez que se induzca anestesia. Coloque la mascarilla para la inhalación en la rata y proporcione un caudal de 2% de sevoflurano para mantener la anestesia. Compruebe la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del tiempo.
- Use una pomada para la protección de los ojos para evitar el secado y el daño de la córnea.
- Supervise al animal bajo anestesia general de la siguiente manera: Coloque un termómetro rectal (35,9–37,5 oC), compruebe el color de la membrana mucosa y coloque un oxímetro de pulso de roedores para comprobar la saturación de O2 (>95%) frecuencia cardíaca (250–450 bpm).
- Utilice un soporte térmico (almohadillas de calentamiento eléctricas o mantas de agua circulantes) para evitar la hipotermia y mejorar la recuperación de la anestesia postprocesal.
- Inyectar 5 ml de solución salina fisiológica subcutánea tibia para mantener una hidratación adecuada.
- Proporcionar analgésicos y antiinflamatorios (meloxicam 1 mg/kg/día) y antibióticos profilácticos (enrofloxacina 7,5 mg/kg/día) por vía subcutánea antes del procedimiento y durante 5 días postoperatorios.
- Afeitar las zonas abdominales e inguinales del animal.
- Aplicar povidona-yodo tópico, seguido de 70% de etanol. Cubra al animal con una cortina estéril.
2. Cirugía del modelo de solapa de la piel libre
- Con un marcador quirúrgico, dibuje un colgajo de 3 cm x 6 cm que coincida con uno de los lados de 6 cm con la línea media del abdomen. A continuación, haga una incisión cutánea de 6 cm en la línea media del abdomen y dos incisiones perpendiculares de 3 cm en la parte superior e inferior de la incisión de línea media de 6 cm.
- Para empezar a disección el colgajo de piel diseñado de 3 cm x 6 cm, usa tijeras y fórceps de Adson para elevar la solapa (en lugar de un bisturí) debido a la movilidad de la piel.
- Tire suavemente de la solapa del área craneal hacia el área caudal para ayudar con la disección e identificar el pediculo epigástrico rodeado por el abundante tejido conectivo suelto.
- Disecciona el pediculo de la solapa sin tocarlo o agarrando la adventitia lo menos posible para evitar dañar la pared del recipiente.
- Utilice suturas de nylon 8/0 para ocluir ligaduras los vasos femorales caudales proximales, los vasos femorales circunflejos laterales y los vasos fefenosos. De este caso, la perfusión de la solapa es proporcionada por la arteria femoral y continúa directamente a través de la arteria epigástrica caudal superficial, mientras que el drenaje venoso se realiza por la vena epigástrica caudal superficial hacia la vena femoral.
- Sujete el pediculo vascular y luego córtelo para iniciar el período de isquemia de 8 h. Durante el procedimiento, utilice mantas eléctricas para mantener la temperatura. Se administran por vía subcutánea dos inyecciones de 5 ml de solución salina tibia (25oC) del 0,9%. La primera administración se realiza 2 h después del comienzo del procedimiento; y el segundo al final del procedimiento para obtener una recuperación adecuada del animal.
- Utilice la solución salina heparinizada (100 U/ml) para perfumar la solapa y eliminar la sangre estancada de la microcirculación.
- Utilice suturas de nylon 10/0 para realizar las anastomosas microquirúrgicas.
- Después de 8 h de isquemia, repermere la solapa quitando las abrazaderas microvasculares y compruebe la patencia vascular como se describe a continuación.
3. Evaluación intraoperatoria
- Realice una prueba de patencia manual (prueba de vacío y recarga) para la vena y la arteria. Para ello, utilice dos fórceps microquirúrgicos, colóquelos distal a la anastomosis y realice el ordeño. Suelte primero los fórceps más cercanos al sitio de la anastomosis. Si el flujo sanguíneo continúa después de vaciar una sección vascular, entonces la anastomosis es patente.
- Evalúe el flujo sanguíneo utilizando un medidor de flujo de ultrasonido en tiempo de tránsito y sondas microquirúrgicas.
- Mida el diámetro de los recipientes pediculares para elegir el tamaño adecuado para las sondas de flujo.
NOTA: Una sonda de flujo de 0,7 mm puede medir recipientes que van desde 0,4 mm a 0,7 mm; una sonda de flujo de 1,0 mm puede medir recipientes que van desde 0,7 mm a 1,0 mm; una sonda de flujo de 1,5 mm puede medir recipientes que van desde 1,0 mm a 1,5 mm. - Coloque el recipiente de destino en la ventana de detección ultrasónica (entre el reflector y los transductores) de la sonda de flujo para cuantificar el volumen de flujo.
NOTA: Sujete la sonda neutral al plano del recipiente, para evitar cualquier tensión o tracción. - Compruebe la calidad del acoplamiento acústico observando que todas las barras están en verde en la pantalla.
NOTA: Si es difícil obtener un buen acoplamiento acústico, utilice gel ultrasónico o solución salina fisiológica tópicamente. - Cuando se logra un buen acoplamiento y el recipiente se coloca en la ventana acústica sin ninguna tensión, haga clic en el botón Grabar en la pantalla para almacenar los datos.
NOTA: Para obtener una medición fiable y correcta, asegúrese de que el patrón de forma de onda es constantemente repetible.
- Mida el diámetro de los recipientes pediculares para elegir el tamaño adecuado para las sondas de flujo.
- Una vez hecho esto, utilice suturas trenzadas absorbibles de ácido poliglicólico (PGA) 4-0 (16mm 3/8 aguja triangular) para cerrar la piel. Utilice un patrón interrumpido simple para mantener la fuerza y la posición del tejido si parte de la sutura es mordida por la rata postoperatoria.
- Evalúe la microcirculación de la solapa utilizando el análisis de contraste de motas láser (LASCA).
- Hacer una nueva grabación para cada animal y para cada seguimiento del estudio. Para ello, haga clic en Archivo/Nueva grabación. Se abre una nueva ventana y se muestra el Panel de configuración. A continuación, edite la información del nombre del proyecto, asunto, operador y nombre de grabación.
- Para una máxima reproducibilidad, estandarice los siguientes parámetros: distancia de trabajo, área de medición, densidad de puntos, velocidad de fotogramas y condiciones de luz ambiental.
- Ajuste la distancia de trabajo moviendo el láser en relación con el tejido. Acercar o alejar la cabeza del láser hacia el tejido de interés. Para comprobar el valor medido, haga clic en Configuración de imagen. Aquí, fijado en 12,0 cm.
- Estandarice el área de medición introduciendo la anchura y la altura deseadas en la configuraciónde imagen . La solapa diseñada mide 3 cm x 6 cm. Para esta medida, seleccione una anchura de 4,0 cm y una altura de 7,0 cm para tener algo de espacio adicional.
- Establezca la Densidad de puntos como alta en la Configuración de imagen. Alto, medio y bajo son las tres opciones.
- En configuración de captura de imagen, seleccione la velocidad de fotogramas (10 imágenes/s) para la grabación y la duración (1 min) de la grabación.
NOTA: Tener la misma condición de luz ambiental en la sala de cirugía mientras opera o realiza las evaluaciones. - Haga clic en el botón Grabar para iniciar la grabación. El panel de configuración se sustituye por el Panel de grabación. Los datos se guardan automáticamente. Tome instantáneas durante el procedimiento para permitir una comparación adicional.
NOTA: La escala de perfusión se puede cambiar para mejorar la visualización (Haga clic en Herramientas ? Filtros y escalas de colores ? Escala de perfusión (Perfusion Scale) Manual 0 - 150), pero los valores de perfusión medidos no se verán afectados. Antes y después de la grabación, se pueden crear diferentes regiones de interés (ROI) para medir la perfusión dentro de ellas. Aquí, evaluamos sólo el área de la solapa practicada (3 cm x 6 cm).
- Utilice el software ImageJ para medir las áreas de supervivencia y necrosis.
- Localice una regla en el lado de la solapa y luego tome fotografías de control para las mediciones macroscópicas del área de supervivencia de la solapa.
- Para evaluar imágenes, abra la interfaz de usuario de ImageJ. Haga clic en Archivo y abra la imagen que desea medir.
- Seleccione Línea recta en la caja de herramientas y dibuje una línea recta de más de 1 cm de la regla. Haga clic en Analizar . Establezca Escala e introduzca en el cuadro de texto para la distancia conocida el valor de 1 cm.
- Haga clic en la Herramienta Selección de Polígonos y dibuje las líneas poligonales sobre la solapa para calcular el área viable. En última instancia, haga clic en Analizar . Mida para obtener el valor de área.
- Coloque un vendaje postoperatorio sobre el animal antes de la vivienda para evitar la automutilación del área quirúrgica. Después de los procedimientos, los animales se alojan en jaulas individualmente, en una habitación con control de temperatura (22 oC a 25 oC).
4. Evaluación postoperatoria y muestreo de tejidos
- Anestetizar la rata a los 7 días postoperatorios para la evaluación de la solapa y el muestreo de tejidosiguiendo los mismos pasos descritos anteriormente en este protocolo (pasos 1.2 y 1.3). Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
- Fotografíe el área quirúrgica para permitir mediciones macroscópicas de las áreas de supervivencia y necrosis del colgajo. Realice las mediciones macroscópicas postoperatorias siguiendo los mismos pasos de la evaluación intraoperatoria que se han explicado antes en el protocolo (paso 3.5).
NOTA: Preste atención mientras utiliza la Herramienta Selección de Polígonos dibujando las líneas en la solapa delimitando el área viable (medida en cm2). El porcentaje de la superficie viable se puede calcular como (cm2 de área viable/cm2 de área total de la solapa) a 100. - Evaluar la microcirculación del colgajo utilizando la técnica LASCA (paso 3.4) para visualizar y cuantificar las diferencias de perfusión
- Después del análisis macroscópico, retire las suturas 4/0 y levante la solapa para reevaluar el flujo sanguíneo del pediculo vascular utilizando el ultrasonido en tiempo de tránsito.
-
Realice muestreos de tejido dividiendo longitudinalmente la solapa en dos partes de 1,5 cm x 6 cm.
- Sumerja una parte en un envase de biopsia con un 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente para análisis histológicos posteriores.
- Introducir la otra parte del tejido en un tubo de criopreservación, sumergirlo en nitrógeno líquido y luego, criopreservar el tubo almacenándolo a -80 oC para futuros análisis moleculares.
- Eutanasia a la rata bajo anestesia general por inhalación utilizando una inyección intracardiaca rápida de 2 M KCl/kg de acuerdo con las recomendaciones del comité ético.
Representative Results
Inmediatamente después de la creación de las anastomosas microquirúrgicas, obtuvimos volúmenes de flujo sanguíneo más altos que los flujos mínimos recomendados en la literatura8; por lo tanto, todas las anastomosas microquirúrgicas fueron patentes 1 semana después de la cirugía(Figura 1).
Figura 1: Evaluación del flujo sanguíneo de ultrasonido en tiempo de tránsito. (A) Posición de la sonda de flujo microquirúrgico para evaluar el flujo sanguíneo. (B) Patrón de flujo sanguíneo y cuantificación obtenida de los vasos anastomosed del pediculo de la solapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La observación de la privación microcirculatoria del flujo sanguíneo durante el insulto isquémico fue posible con la técnica LASCA, incluida la hiperperfusión inmediata durante la reperfusión del colgajo, y, perioperatoriamente, las diferentes áreas con menos perfusión y un mayor riesgo de necrosis de colgajo postoperatorio que fueron necrotizadas 7 días después del final del estudio(Figura 2).
Figura 2: Tecnología de análisis de contraste de motas láser. (A) Visualización de la perfusión sanguínea del tejido microcirculatorio en la condición fisiológica. (B) Visualización de la perfusión sanguínea de tejido microcirculatorio durante la isquemia. (C) Visualización de la perfusión de tejido microcirculatorio inmediatamente después de la reperfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El área de supervivencia del colgajo después de 8 h de isquemia y su posterior reperfusión fue de alrededor del 40%. Los resultados publicados anteriormente9 mostraron diferencias estadísticamente significativas cuando este modelo se comparó con colgajos donde no se infligió ningún insulto isquémico.
Discussion
Las transferencias de tejidolibre microquirúrgicas se han convertido en el método de elección para reconstruir grandes defectos. Un período de isquemia ocurre durante tales transferencias de tejido libre. Cuando este período excede la tolerancia del tejido, la lesión de I/R puede causar el fracaso de la solapa libre practicada9. La descripción de la metodología para desarrollar un modelo preclínico rentable y traslacional para estudiar la lesión por I/R en microcirugía reconstructiva puede ayudar a liderar el estudio de diferentes compuestos para contrarrestar este proceso fisiopatológico.
En el modelo animal descrito, después de que se colocaron las ligaduras vasculares y se levantó el colgajo libre, no se observaron compromisos de flujo sanguíneo de las extremidades posteriores, ni dolor o cojera. Como kochi y otros10 describieron, nuestro modelo también dejó tres rutas colaterales a través de redes intramusculares.
El seguimiento de los colgajos libres es de gran importancia11,ya que el salvamento está inversamente relacionado con la duración entre el inicio de la isquemia y su reconocimiento clínico. Para ello, las aletas libres deben estudiarse de forma intraoperatoria y postoperatoria.
Intraoperatoriamente, la prueba de vacío y recarga ampliamente utilizada o el Doppler acústico permiten identificar pero no cuantificar la presencia o ausencia de flujo a través de una anastomosis12. Por esta razón, utilizamos la tecnología de ultrasonido en tiempo de tránsito, un método novedoso que permite a los cirujanos cuantificar el flujo sanguíneo de las anastomosas microquirúrgicas13. En nuestro estudio, todas las anastomosas microquirúrgicas fueron patentes después de 8 h de insulto isquémico, así como al final del estudio. Inmediatamente después de la creación de las anastomosas microquirúrgicas, observamos volúmenes de flujo sanguíneo más altos que los mínimos recomendados en la literatura8. Esto predijo una buena perfusión pedicular al final del estudio, demostrando que los resultados no fueron influenciados por la técnica microquirúrgica, sino más bien por la cascada de eventos de lesiones de I/R. Sin embargo, esta técnica no está libre de limitaciones. Para obtener resultados fiables, las sondas microquirúrgicas deben mantenerse neutrales para el plano del recipiente, no tirando de él ni creando ninguna tensión. Se necesita un buen acoplamiento acústico para obtener una señal adecuada, que se puede lograr utilizando gel ultrasónico o salina. Una señal de acoplamiento de alta calidad, proporcionada por el equipo, es un parámetro importante a tener en cuenta durante las mediciones.
Hemos utilizado LASCA, también conocido como imágenes de contraste de motas láser o imágenes de motas láser, postoperatoriamente14. Esta tecnología representa una técnica valiosa para el mapeo semicuantitativo en tiempo real del flujo dentro de las solapas libres como se verifica aquí. Una de las limitaciones es que los resultados se proporcionan en unidades arbitrarias y no están directamente relacionados con los valores de flujo reales. En este sentido, se necesitan más investigaciones para validar esta correlación. La metría Doppler láser se utiliza más comúnmente, pero limitada por el hecho de que sólo mide la perfusión en un solo punto de la solapa, mientras que LASCA permite la detección de cambios regionales en la perfusión de la piel dentro de la solapa15. Además, un estudio reciente16 indicó que LASCA puede predecir perioperatoriamente las regiones con alto riesgo de necrosis postoperatoria de colgajo. Nuestros resultados sugieren que LASCA es una técnica prometedora para el monitoreo peri- y postoperatorio de flaps libres.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El proyecto de investigación se realizó en el Centro de Cirugía Mínimamente Invasiva Jesús Usón (CCMIJU), parte del ICTS Nanbiosis. El estudio se realizó con la ayuda de las siguientes unidades Nanbiosis: U21, quirófano experimental; U22, alojamiento animal; y U14, terapia celular. Esta labor fue apoyada por el proyecto PI16/02164 del ISCIII. El funder ono tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación de manuscritos. Agradecemos especialmente a María Pérez por preparar las figuras y a Fernanda Carrizosa por dar un estímulo constante y apoyar la bibliografía científica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AureFlo Unit | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | Transit-time ultrasound flowmeter equipment |
| Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | Set of microsurgical instruments |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | Anesthesia Delivery System |
| Micro clamps ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | Double microvascular clamp with frame |
| Micro clamps ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | Double microvascular clamp without frame |
| Micro clamps B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | Sigle microvascular clamp |
| Nylon suture 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | Microsurgical suture |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | Surgical microscope |
| PeriCam PSI System | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | Laser speckle contrast analysis equipment |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | Monitoring system |
| Protector posoperatorio para roedores | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | Postoperative protector for rodents |
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