Summary
本文描述了一个临床前动物模型，用于研究重建显微外科中缺血再灌注损伤的病理生理学。这种基于大鼠表面的胆皮外胃血管的自由皮瓣模型也可以允许评估不同的疗法和化合物，以抵消缺血-再灌注损伤相关的损伤。
Abstract
缺血再灌注损伤是重建显微外科皮瓣衰竭的主要原因。大鼠因其成本效益和对人类的转化，是生物医学研究领域中首选的临床前动物模型。该协议描述了一种在缺血再灌注损伤大鼠中创建临床前自由皮瓣模型的方法。描述3厘米x6厘米无鼠皮瓣模型很容易获得后放置几个血管结扎和部分血管足节。然后，8小时后缺血侮辱和完成显微外科麻醉，自由皮瓣发展组织损伤。本模型可以研究这些缺血-再灌注损伤相关损伤，使其成为评估治疗剂解决这种病理生理学过程的合适模型。此外，该动物模型评估协议中还描述了两种主要的监测技术：中转时超声技术和激光斑点对比度分析。
Introduction
显微外科已成为一种常见的重建手术技术，它允许干预（例如，自由组织转移），以恢复复杂的组织缺陷，重新种植截肢，甚至复合组织异体移植。
显微外科重建是创伤、烧伤或肿瘤切除引起的各种缺陷的理想选择。然而，自由瓣故障的百分比较低，其中缺血性再灌注（I/R）损伤是主要原因之一。所有显微手术转移组织都经受强制性缺血期，然后进行再灌注。这一时期原发性缺血通常耐受性良好;因此，显微外科手术的成功率超过90%1，2。然而，只有63.7%的皮瓣需要手术修正可以完全保存3。此外，在再植手指外伤的情况下，成功率为66%4;在复合组织异体移植遭受I/R损伤的情况下，由于I/R损伤激活先天免疫5，6，排斥百分比增加。
因此，研究这种病理生理学现象是值得关注的。动物模型对于研究生理机制和评估新疗法至关重要，才能应用于人类。血管解剖学和大鼠与人类的生理相似性使大鼠成为研究I/R损伤等生物过程的理想模型。
在这里，我们提出了一个详细的协议，用于创建具有I/R损伤的无鼠皮瓣模型，以及术中和术后评估的不同可能性。该方法的总体目标是描述一个有用的临床前模型，以研究I/R损伤和可能的治疗方法，以减少其相关损害。
Protocol
所有程序均按照Jesés Usón微创手术中心的道德委员会和基于欧洲立法的地方政府的福利准则进行。
1. 手术前和外科准备
- 在22~25°C的笼子里，有290~350克重的威斯塔大鼠，可以自由获得食物和水。手术前1周适应，以防止压力引起的问题。
- 将大鼠放入麻醉诱导室，输送5分钟氧气（0.5-1升/分钟），并使用蒸发器输送5%的分氟病以诱导麻醉。
- 麻醉后将大鼠带出腔室。将吸入面罩放在大鼠身上，并提供2%的分氟化物流速以维持麻醉。检查脚趾捏没有反应。
- 使用眼保护膏，防止角膜干燥和损伤。
- 监测动物在一般麻醉下如下：放置直肠温度计（35.9~37.5 °C），检查粘膜颜色，并定位啮齿动物脉搏血氧仪，检查O2饱和度（>95%）和心率（250~450 bpm）。
- 使用热支持（电加热垫或循环水毯）来避免体温过低，并改善术后麻醉恢复。
- 注射5 mL的温暖皮下生理盐水溶液，以保持适当的水化。
- 在手术前和术后5天，提供镇痛和消炎药（1毫克/千克/天）和预防抗生素（安罗伐沙辛7.5毫克/千克/天）。
- 勒有动物的腹部和内脏区域。
- 应用局部的波维酮碘，然后70%乙醇。用无菌窗帘盖住动物。
2. 免费皮肤皮瓣模型手术
- 使用手术标记，绘制一个3厘米x6厘米的活门匹配6厘米两侧与腹部中线。接下来，在腹部中线进行6厘米的皮肤切口，在6厘米中线切口的上部和下部进行两个垂直3厘米切口。
- 要开始解剖设计的 3 厘米 x 6 厘米皮瓣，使用剪刀和 Adson 钳子提高皮瓣 （而不是手术刀） 由于皮肤的流动性。
- 轻轻地将皮瓣从颅面区域拉向胆小板区域，以帮助进行解剖，并确定被大量松散结缔组织包围的表观胃囊。
- 在不接触皮瓣的情况下，不接触它，或者尽可能少地抓住花瓣，以避免损坏船壁。
- 使用 8/0 尼龙缝合线通过结扎近端牛股体血管、侧周弯曲股体容器和树液容器来遮挡。因此，皮瓣的灌注由股动脉提供，并直接通过表面的牛皮胃动脉继续，而静脉排水由表面牛皮胃静脉对股骨静脉执行。
- 夹紧血管，然后切开它，开始8小时缺血期。在手术过程中使用电热毯来保持温度。两次5ml注射热 （25°C） 0.9% 盐水溶液被分皮施用。第一次管理在程序开始后 2 小时执行;第二个在程序结束时获得动物的适当恢复。
- 使用肝素化盐水溶液（100 U/mL）注入皮瓣，从微循环中去除停滞的血液。
- 使用10/0尼龙缝合线进行显微手术麻醉剂。
- 8小时后缺血后，通过取出微血管夹来重新注入皮瓣，并检查如下所述的血管通量。
3. 术中评估
- 对静脉和动脉执行手动试管测试（空和填充测试）。为此，使用两个显微手术钳，将它们定位到远端的麻醉，并进行挤奶。首先释放最接近阿阿托莫西斯站点的钳子。如果血管部分被清空后血流继续，那么血管炎是专利。
- 使用中转时间超声波流量计和显微外科探头评估血流量。
- 测量水泡容器的直径，以便为流动探头选择合适的尺寸。
注：0.7 mm 流量探头可测量 0.4 mm 至 0.7 mm 的容器;1.0 毫米流量探头可测量 0.7 mm 至 1.0 mm 的容器;1.5 mm 流量探头可测量 1.0 mm 至 1.5 mm 的容器。 - 将目标容器放置在流量探头的超声波感应窗口（反射器和传感器之间），以量化流量。
注：将探头保持空对容器平面，以避免任何张力或拉力。 - 通过观察显示屏上所有条形均为绿色，检查声耦合的质量。
注：如果难以获得良好的声学耦合，请使用超声波凝胶或生理盐水溶液进行局部使用。 - 当实现良好的耦合并将容器放置在无张力的声学窗口中时，单击显示屏上的"记录"按钮以存储数据。
注：要获得可靠和正确的测量，请确保波形模式是可连续重复的。
- 测量水泡容器的直径，以便为流动探头选择合适的尺寸。
- 完成后，使用聚糖酸 （PGA） 4-0 可吸收编织缝合线 （16mm 3/8 三角针） 关闭皮肤。如果部分缝合线在术后被大鼠咬掉，请使用简单的中断模式来维持强度和组织位置。
- 使用激光斑点对比度分析 （LASCA） 评估活门的微循环。
- 为每个动物和每次研究的后续记录进行新的记录。为此，请单击"文件/新录制"。将打开一个新窗口，并显示"设置面板"。然后编辑项目名称、主题、操作员和录制名称的信息。
- 为了达到最大可重复性，可标准化以下参数：工作距离、测量面积、点密度、帧速率和环境光照条件。
- 通过移动与组织相关的激光来调整工作距离。放大或缩小激光头朝向感兴趣的组织。要检查测量值，请单击"图像设置"。这里，设置在12.0厘米。
- 通过在图像设置中输入所需的宽度和高度来标准化测量区域。设计的活门尺寸为 3 厘米 x 6 厘米。对于此测量，请选择宽度为 4.0 厘米和高度为 7.0 厘米以具有一些额外空间。
- 在图像设置中将点密度设置为高。高、中和低是三个选项。
- 在图像捕获设置中，选择录制的帧速率（10 图像/秒） 和录制持续时间（1 分钟）。
注：在手术或执行评估时，在手术室中具有相同的环境光条件。 - 单击"录制"按钮开始录制。设置面板由录制面板替换。数据将自动保存。在此过程中拍摄快照，以便进一步比较。
注：可以更改灌注比例以提高可视化效果（单击"工具" |过滤器和色阶 |灌注量表 |手动 0 - 150），但测量的灌注值不会受到影响。在录制之前和之后，可以创建不同的兴趣区域 （ROIs） 来测量其中的灌注。在这里，我们只评估了练习的活门区域（3 厘米 x 6 厘米）。
- 使用 ImageJ 软件测量生存和坏死区域。
- 在活门侧面找到一把尺子，然后拍摄控制图片，以对活门生存区域进行宏观测量。
- 要评估图片，请打开 ImageJ 用户界面。单击"文件"并打开要测量的图像。
- 在工具箱处选择直线，并在标尺 1 厘米以上绘制一条直线。点击分析 |设置比例，并在文本框中引入已知距离值 1 厘米。
- 单击"多边形选择工具"，并在活门上绘制多边形线以计算可行区域。最终，点击分析 |度量以获取面积值。
- 在住房前在动物身上放置术后敷料，以防止手术区域自残。手术后，动物分别被安置在笼子里，在有温度控制的房间里（22°C至25°C）。
4. 术后评估和组织取样
- 按照本议定书（步骤1.2和1.3）中前面描述的步骤，在术后7天对大鼠进行皮瓣评估和组织取样麻醉。检查麻醉的深度，因为对脚趾捏没有反应。
- 拍摄手术区域，以便对皮瓣生存和坏死区域进行宏观测量。按照协议（步骤 3.5）中之前解释的术中评估的相同步骤进行术后宏观测量。
注：在使用多边形选择工具时，请注意绘制分隔可行区域的活门上的线条（以厘米2为单位）。可计算面积的百分比可以计算为（可生存面积的厘米2/总活门面积的 cm2） = 100。 - 使用 LASCA 技术（步骤 3.4）评估活门的微循环，以可视化和量化灌注差异
- 在宏观分析后，去除4/0缝合线，并升高皮瓣，使用中转时间超声波重新评估血管血流量。
-
通过纵向将活门分成两个部分，1.5 厘米 x 6 厘米，执行组织采样。
- 在室温下将一部分浸入活检容器中，在室温下使用4%的甲醛，以便进行进一步组织学分析。
- 将组织的另一部分引入冷冻保存管中，将其浸入液氮中，然后冷冻保存管，将其储存在-80°C，以用于未来的分子分析。
- 根据道德委员会的建议，在普通吸入麻醉下，使用2M KCl/kg的快速心脏内注射对大鼠进行安乐死。
Representative Results
在显微外科麻醉剂的产生之后，我们获得比文献8中建议的最小流量更高的血流量;因此，所有显微外科麻醉剂在手术后1周均获得专利（图1）。
图1：过境时间超声血流评估。（A） 显微外科流动探针的位置，以评估血流。（B） 皮瓣的血管获得血流模式和定量。请点击此处查看此图的较大版本。
利用LASCA技术，观察缺血性侮辱期间血流的微循环剥夺，包括皮瓣再灌注过程中的立即过度灌注，以及术前，在研究结束后7天确实坏死的术后皮瓣坏死的不同区域（图2）。
图2：激光斑点对比度分析技术。（A） 生理条件下微循环组织血液灌注的可视化.（B） 缺血期间微循环组织血液灌注的可视化. （C） 再灌注后立即对微循环组织血液灌注进行可视化.请点击此处查看此图的较大版本。
8小时后缺血及其后续再灌注后的皮瓣生存面积约为40%。先前公布的结果9显示，当该模型与未造成缺血性侮辱的皮瓣进行比较时，具有统计学意义。
Discussion
显微手术自由组织转移已成为重建大缺陷的首选方法。在这种自由组织转移期间，就会发生缺血期。当这个周期超过组织的耐受性时，I/R损伤可能导致练习的自由皮瓣9的失效。描述开发一种具有成本效益和转化的临床前模型来研究重建显微外科中的I/R损伤的方法，可能有助于领导对不同化合物的研究，以抵消这种病理生理学过程。
在所述的动物模型中，血管结扎放置后，自由皮瓣被抬起，没有注意到后肢血流妥协，也没有疼痛或跛行。正如Kochi等人10所描述的那样，我们的模型还留下了三条通过肌肉网络的辅助路线。
监测自由皮瓣是非常重要的11，因为抢救与缺血发病与其临床识别之间的持续时间成反比。为此，应在术中和术后研究自由活门。
术中，广泛使用的空填试验或声学多普勒能够识别，但不能量化流动的存在或不存在通过麻醉12。出于这个原因，我们使用了中转时间超声技术，一种新方法，允许外科医生量化微外科麻醉剂13的血流。在我们的研究中，所有显微外科麻醉剂在8小时缺血侮辱后以及研究结束时均获得专利。在显微外科麻醉剂的产生之后，我们注意到血流量高于文献8中建议的最小量。在研究结束时，这预测了良好的灌注，表明结果不是受显微外科技术的影响，而是受I/R损伤事件级联的影响。但是，此技术并非没有限制。为了获得可靠的结果，显微外科探头必须保持容器平面的中性，而不是拉扯或造成任何张力。需要良好的声学耦合才能获得适当的信号，这可以通过超声波凝胶或盐水来实现。设备提供的高质量耦合信号是测量过程中需要考虑的重要参数。
我们使用LASCA，也称为激光斑点对比度成像或激光斑点成像，术后14。该技术代表了自由活门内流量的半定量实时映射的宝贵技术，此处已验证。其中一个限制是结果以任意单位提供，与实际流值没有直接关系。从这个意义上说，需要进一步的研究来验证这种相关性。激光多普勒流量测定仪更常用，但受以下事实的限制：它只测量皮瓣中单个点的灌注，而LASCA允许在皮瓣15内检测皮肤灌注的区域变化。此外，最近的一项研究16表明，LASCA可能即将预测术后皮瓣坏死高风险的区域。我们的结果表明，LASCA是自由皮瓣的术前和术后监测的一项有前途的技术。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该研究项目在Jesés Usón微创外科中心（CCMIJU）进行，该中心是南生物研究所的一部分。该研究是在以下南生物组的协助下进行的：U21，实验手术室;U22，动物外壳;和U14，细胞疗法。这项工作得到了ISCIII项目PI16/02164的支持。在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面，受资者没有角色。特别感谢玛丽亚·佩雷斯准备数字，感谢费尔南达·卡里佐萨不断给予鼓励和支持科学书目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AureFlo Unit | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | Transit-time ultrasound flowmeter equipment |
| Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | Set of microsurgical instruments |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | Anesthesia Delivery System |
| Micro clamps ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | Double microvascular clamp with frame |
| Micro clamps ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | Double microvascular clamp without frame |
| Micro clamps B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | Sigle microvascular clamp |
| Nylon suture 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | Microsurgical suture |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | Surgical microscope |
| PeriCam PSI System | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | Laser speckle contrast analysis equipment |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | Monitoring system |
| Protector posoperatorio para roedores | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | Postoperative protector for rodents |
References
- Siemionow, M., Arslan, E. Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers. Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).
- Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).
- Chen, K. T., et al. Timing of presentation of the first signs of vascular compromise dictates the salvage outcome of free flap transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 120 (1), 187-195 (2007).
- Sears, E. D., Chung, K. C. Replantation of finger avulsion injuries: a systematic review of survival and functional outcomes. The Journal of Hand Surgery. 36 (4), 686-694 (2011).
- Caterson, E. J., Lopez, J., Medina, M., Pomahac, B., Tullius, S. G. Ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation. The Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 51-56 (2013).
- Amin, K. R., Wong, J. K. F., Fildes, J. E. Strategies to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in Vascularized Composite Allotransplantation of the Limb. The Journal of Hand Surgery. 42 (12), 1019-1024 (2017).
- Barre-Sinoussi, F., Montagutelli, X. Animal models are essential to biological research: issues and perspectives. Future Science OA. 1 (4), (2015).
- Shaughness, G., Blackburn, C., Ballestin, A., Akelina, Y., Ascherman, J. A. Predicting Thrombosis Formation in 1-mm-Diameter Arterial Anastomoses with Transit-Time Ultrasound Technology. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (6), 1400-1405 (2017).
- Ballestin, A., et al. Ischemia-reperfusion injury in a rat microvascular skin free flap model: A histological, genetic, and blood flow study. PloS One. 13 (12), 0209624 (2018).
- Kochi, T., et al. Characterization of the Arterial Anatomy of the Murine Hindlimb: Functional Role in the Design and Understanding of Ischemia Models. PloS One. 8 (12), (2013).
- Smit, J. M., Zeebregts, C. J., Acosta, R., Werker, P. M. Advancements in free flap monitoring in the last decade: a critical review. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 177-185 (2010).
- Krag, C., Holck, S. The value of the patency test in microvascular anastomosis: Correlation between observed patency and size of intraluminal thrombus: An experimental study in rats. British Journal of Plastic Surgery. 34, 64-66 (1981).
- Selber, J. C., et al. A prospective study of transit-time flow volume measurement for intraoperative evaluation and optimization of free flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 270-281 (2013).
- Briers, D., et al. Laser speckle contrast imaging: theoretical and practical limitations. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066018 (2013).
- Zotterman, J., Bergkvist, M., Iredahl, F., Tesselaar, E., Farnebo, S. Monitoring of partial and full venous outflow obstruction in a porcine flap model using laser speckle contrast imaging. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 69 (7), 936-943 (2016).
- Zotterman, J., Tesselaar, E., Farnebo, S. The use of laser speckle contrast imaging to predict flap necrosis: An experimental study in a porcine flap model. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 72 (5), 771-777 (2019).
