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Neuroscience

फ्रेट-आधारित सेंसर ATeam1.03YEMK का उपयोग कर माउस मस्तिष्क के ऑर्गानोटिक ऊतक स्लाइस में इंट्रासेलुलर एटीपी की इमेजिंग

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60294
* These authors contributed equally

Summary

हम माउस फोरब्रेन की ऑर्गानोटिक स्लाइस संस्कृतियों में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एफआरईटी-आधारित सेंसर ATeam1.03YEMK की सेल-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में सेलुलर एटीपी स्तरों की गतिशील इमेजिंग के लिए इस सेंसर का उपयोग कैसे करें।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में न्यूरोनल गतिविधि एडेनोसाइन त्रिपोस्फेट (एटीपी) के टूटने द्वारा प्रदान की गई सेलुलर ऊर्जा पर उच्च मांग पैदा करती है। न्यूरॉन्स के विद्युत संकेत द्वारा अपमानित प्लाज्मा झिल्ली में आयन ग्रेडिएंट को फिर से स्थापित करने के लिए एटीपी के एक बड़े हिस्से की आवश्यकता होती है। इस बात के सबूत हैं कि एस्ट्रोसाइट्स - तेज़ विद्युत संकेतों को उत्पन्न नहीं करते हैं - न्यूरोनल गतिविधि के जवाब में एटीपी के बढ़ते उत्पादन से गुजरना और उन्हें ऊर्जा मेटाबोलाइट्स प्रदान करके सक्रिय न्यूरॉन्स का समर्थन करते हैं। विभिन्न मेटाबोलाइट्स के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर का हालिया विकास अब न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के बीच इस तरह के मेटाबोलिक इंटरैक्शन के अध्ययन को सक्षम बनाता है। यहां, हम एटीपी-सेंसिटिव फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण की सेल-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं- (FRET-) सेंसर ATeam1.03YEMK माउस हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स की ऑर्गानोटिक ऊतक स्लाइस संस्कृतियों में एडेनो-संबद्ध वायरल वेक्टर (एएवी) का उपयोग करके। इसके अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि इस सेंसर को अतिरिक्त पोटेशियम में वृद्धि और रासायनिक इस्केमिया (यानी, सेलुलर ऊर्जा चयापचय का अवरोध) के बाद न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में सेलुलर एटीपी स्तरों में परिवर्तन के गतिशील मापन के लिए कैसे नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

न्यूरॉन्स की उत्तेजक विद्युत गतिविधि काफी हद तक अपने प्लाज्मा झिल्ली में सोडियम (एनए+)और पोटेशियम (के+)जैसे केंशन के प्रवाह पर आधारित है। इस प्रकार सिग्नलिंग के लिए इन दोनों आयनों के इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट ्स का रखरखाव आवश्यक है। यह सेलुलर ना+/K+-ATPase (NKA) द्वारा पूरा किया जाता है, एक सर्वव्यापी रूप से व्यक्त इलेक्ट्रोजेनिक ट्रांसमेम्ब्रेन पंप, जो एक्सट्रासेलुलर स्पेस से 2 K + के बदले में सेल से 3 एनए+ को बाहर निकालता है, जिसके लिए प्रति परिवहन चक्र1एटीपी के एक अणु की खपत की आवश्यकता होती है । एनकेए के अलावा, प्लाज्मा झिल्ली सीए2 +-एटपास सहित कई अन्य एटीपी-उपभोग करने वाले आयन ट्रांसपोर्टर हैं, जो इंट्रासेलुलर सीए2 + होमोस्टोसिस और गतिविधि-प्रेरित बाढ़2के बाद इसके निर्यात के लिए महत्वपूर्ण है। प्रेसीनैप्टिक वेसिकल्स में, एक वैक्यूलर-टाइप एच+-एटपास (वी-एटपास) इस डिब्बे3में न्यूरोट्रांसमीटर तेज के लिए आवश्यक प्रोटोन ग्रेडिएंट बनाता है।

जबकि न्यूरॉन्स की गतिविधि इस प्रकार एटीपी4की एक पर्याप्त मात्रा की आवश्यकता है, वे ऊर्जा के भंडारण के लिए एक महत्वपूर्ण क्षमता का प्रदर्शन नहीं करते । इसके बजाय, वे पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स, मस्तिष्क5में प्रमुख ग्लाइकोजन स्टोर के साथ मेटाबोलिक बातचीत पर भरोसा करने लगते हैं। यह सुझाव दिया गया है कि एस्ट्रोसाइटिक ग्लाइकोजन वास्तव में न्यूरोनल ऊर्जा जरूरतों को समर्थन देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; और दो सेल प्रकार के बीच इस प्रस्तावित न्यूरो मेटाबोलिक युग्मन में एक महत्वपूर्ण घटना न्यूरोसाइट्स की क्षमता है न्यूरोनल गतिविधि6,7,8के जवाब में अपने एटीपी उत्पादन में वृद्धि . एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन लैक्टेट शटल (एएनसीएल) के रूप में जानी जाने वाली यह परिकल्पना अभी भी बहस के घेरे में है, क्योंकि अन्य काम ने इस बात के सबूत दिए हैं कि न्यूरॉन्स भी उत्तेजना9,10के जवाब में ग्लाइकोलाइसिस की अपनी दर में वृद्धि कर सकते हैं, न्यूरो-ग्लिया इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए आगे के तरीकों और दृष्टिकोणों की आवश्यकता को दर्शाती है।

न्यूरो-ग्लिया मेटाबोलिक इंटरैक्शन को स्पष्ट करने के लिए न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में सेलुलर ऊर्जा चयापचय और एटीपी स्तर की जांच लंबे समय से मस्तिष्क के ऊतकों में जीवित कोशिकाओं में मेटाबोलाइट सांद्रता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयुक्त जांच की कमी से बाधित हुई है। हालांकि, पिछले दशक में एटीपी, लैक्टेट, पायरुवेट और अन्य11,12के लिए सेंसर सहित विभिन्न मेटाबोलाइट्स के लिए नए उपकरणों और नए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट जांच के विकास में वृद्धि हुई है । इन उपकरणों का उपयोग करके, अब सेलुलर एटीपी खपत और एकल कोशिका स्तर पर सेलुलर ऊर्जा के स्तर में परिवर्तन और बरकरार मस्तिष्क ऊतक13में सेल-प्रकार विशिष्ट तरीके से संबंधित प्रश्नों का सीधा समाधान करना संभव है।

वर्तमान कार्य में, हम न्यूरॉन्स और सुसंस्कृत ऑर्गानोटिक मस्तिष्क स्लाइस के एस्ट्रोसाइट्स पर साइटोसोलिक एटीपी गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। हम दिखाते हैं कि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एटीपी-नैनोसेंसर ATeam1.03YEMK (14)के कोशिका-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एडेनो-संबद्ध वायरल वेक्टर (एएवी) को कैसे नियोजित किया जाए, न्यूरॉन्स में और माउस मस्तिष्क के स्लाइस के एस्ट्रोसाइट्स को कई हफ्तों तक सेल संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है15। सुसंस्कृत ऊतक स्लाइस को कवर करने वाले ग्लियल निशान को कैसे हटाया जाए, इसकी एक प्रक्रिया वर्णित है, जो नीचे ऑर्गानोटिक ऊतक परतों में कोशिकाओं की ऑप्टिकल पहुंच और इमेजिंग में सुधार करती है। अंत में, हम दिखाते हैं कि इस तैयारी में सेलुलर एटीपी स्तरों में परिवर्तनों की FRET-आधारित इमेजिंग करने के लिए ATeam1.03YEMK का उपयोग कैसे किया जा सकता है। यह विधि उन प्रमुख फायदों को होस्ट करती है जिन्हें सर्जिकल मस्तिष्क प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है, सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइस में सेंसर और सेल प्रकार विशिष्टता की अभिव्यक्ति का उच्च स्तर प्रदान करता है, अन्य तरीकों की तुलना में कोशिकाओं में आक्रामकता या तनाव को कम करता है, जैसे अन्य वायरल वैक्टर10,16,17के साथ इलेक्ट्रोपोेशन या ट्रांसड्यूक्शन द्वारा ट्रांसफेक्शन। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य एफआरआई आधारित नैनोसेंसर पर लागू किया जा सकता है, उनमें से ATeam1.03 के वेरिएंट जो एटीपी14के लिए कम बाध्यकारी आत्मीयता प्रदान करते हैं।

Protocol

वर्तमान अध्ययन हेनरिक हेइन विश्वविद्यालय डसेलडोर्फ के संस्थागत दिशा निर्देशों के साथ-साथ यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश (2010/63/ईयू) के संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार कड़ाई से किया गया था । ऑर्गानोटिक ब्रेन स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोगों को पशु कल्याण कार्यालय द्वारा हेनरिक हेन विश्वविद्यालय डसेलडोर्फ (संस्थागत अधिनियम संख्या: O50/05) की पशु देखभाल और उपयोग सुविधा में सूचित किया गया था। यूरोपीय आयोग18की सिफारिशों के अनुसार, 10 दिन तक पुराने जानवरों को डेपुटेशन से मार डाला गया ।

1. ऑर्गानोटिक ब्रेन स्लाइस संस्कृतियों (ओटीसी) की तैयारी

  1. प्रक्रिया से पहले या कम से कम 30 मिन से पहले का दिन
    1. पेट्री डिश (बाँझ परिस्थितियों में) तैयार करें। 6 अच्छी प्लेट के ढक्कन निकालें और ओटीसी माध्यम के 800-850 μL प्रत्येक अच्छी तरह से जगह है । जरूरत होने तक प्लेट को इनक्यूबेटर (37डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2/95% ओ2)में रखें।
    2. वाशिंग पेट्री व्यंजन (बाँझ परिस्थितियों में) तैयार करें। प्रत्येक 30 मिमी पेट्री डिश में एचबीएसएस का 3 एमएल जोड़ें। प्रति प्रक्रिया कुल 5 व्यंजन ों की आवश्यकता है। उन्हें इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस,5% सीओ 2/95% ओ2)में कम से कम 30 00 के लिए रखें - आवश्यकता होने तक रात भर।
    3. एसीएसएफ(टेबल 1)तैयार करें। अगले दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्लूकोज के बिना खारा रखें।
सलाइन ्सएंड मीडिया - फॉर्मूलेशन
नाम संक्षिप्तिकरण संरचना एकाग्रता [एमएम] टिप्पणियाँ
कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड समाधान एसीएसएफ Nacl 125 5% सीओ 2/95% ओ2,पीएच 7.4 के साथ बुलबुला
केसीएल 2.5 उपयोग से पहले हमेशा ग्लूकोज जोड़ें।
सीएसीएल2 2 ग्लूकोज के साथ एक दिन से अधिक के लिए स्टोर न करें
एमजीसीएल2 1 ~ 310 mOsm/L
NaH2पीओ4 1.25
नाहको3 26
ग्लूकोज 20
प्रायोगिक एसीएसएफ ई-एसीएसएफ Nacl 136 5% सीओ 2/95% ओ2,पीएच 7.4 के साथ बुलबुला
केसीएल 3 उपयोग से पहले हमेशा ग्लूकोज जोड़ें।
सीएसीएल2 2 ग्लूकोज के साथ एक दिन से अधिक के लिए स्टोर न करें
एमजीसीएल2 1 ~ 320 mOsm/L
NaH2पीओ4 1.25
नाहको3 24
ग्लूकोज 5
लैक्टेट 1
केमिकल इस्केमिया सॉल्यूशन सीआईएस Nacl 136 5% सीओ 2/95% ओ2,पीएच 7.4 के साथ बुलबुला
केसीएल 3 ~ 318 mOsm/L
सीएसीएल2 2
एमजीसीएल2 1
NaH2पीओ4 1.25
नाहको3 24
2, 2-डिऑक्सीग्लूकोज 2
नैन3 5
8 मीटर पोटेशियम ACSF 8 एमएम के+ एसीएसएफ Nacl 128 5% सीओ 2/95% ओ2,पीएच 7.4 के साथ बुलबुला
केसीएल 8 ~ 320 mOsm/L
सीएसीएल2 2
एमजीसीएल2 1
NaH2पीओ4 1.25
नाहको3 24
ग्लूकोज 5
लैक्टेट 1
हेप्स-बफर एसीएसएफ एच-एसीएसएफ Nacl 125 NaOH के साथ पीएच 7.4 को समायोजित
केसीएल 3 उपयोग से पहले हमेशा ग्लूकोज जोड़ें
सीएसीएल2 2 ग्लूकोज के साथ एक दिन से अधिक के लिए स्टोर न करें
एमजीएसओ4 2 ~ 310 mOsm/L (सुक्रोज के साथ समायोजित)
NaH2पीओ4 125
हेप्स 25
ग्लूकोज 10
हैंक्स का संतुलित नमक समाधान एचबीएस सिग्मा (कैटलॉग नंबर H9394) ।
दुल्बेकको का फॉस्फेट-बफर्ड लवकुश डीपीबीएस गिब्को (सूची संख्या 14287-080)
ऑर्गानोटिक कल्चर मीडियम ओटीसी मीडियम हीट-निष्क्रिय घोड़ा सीरम 20% 34 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,पीएच 7.4, पुलिया की हालत के तहत
Mem 79% ~ 320 mOsm/L
एल-ग्लूटामाइन 1
इंसुलिन 0.01 मिलीग्राम/एमएल
Nacl 14.5
एमजीएसओ4 2
सीएसीएल2 1.44
एस्कोबिक एसिड 0.00125 %
डी-ग्लूकोज 13

तालिका 1: समाधान संरचना।

  1. तैयारी के दिन, ACSF में ग्लूकोज जोड़ें, इसे बर्फ पर रखें और कम से कम 30 मिन के लिए 95% ओ2/5% सीओ2 के साथ बुदबुदाते शुरू करें ताकि 7.4 का पीएच हो।
  2. विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया
    1. रात के बाद के दिनों में माउस (बाल्बीसी, दोनों लिंगों) का बलिदान करें 6 से 8 तेजी से डेपुटेशन द्वारा और सिर को बर्फ-ठंडा ACSF युक्त ग्लास पेट्री डिश में रखें।
    2. नाक की हड्डी के पीछे की नोक तक त्वचा को पीठ से काटकर खोपड़ी को बेनकाब करें। फिर, सावधानी से एक शल्य कैंची का उपयोग कर फोरमेन मैग्नम से खोपड़ी काट और मस्तिष्क का पर्दाफाश।
      नोट: सत्यापित करें कि प्रक्रिया संस्था के दिशा-निर्देशों के अनुसार है।
    3. मस्तिष्क को हटादें और एसीएसएफ से भरे बर्फ-ठंडी पेट्री डिश में फिल्टर झिल्ली पर रखें।
    4. गोलार्द्धों को अलग करें और 45 डिग्री के कोण पर पैरासिग्टल कट करें। सुपरग्लू के साथ वाइब्रेटोम ऊतक चरण में एक गोलार्द्ध को ठीक करें। तुरंत ऊतक ब्लॉक को वाइब्रेटम बाथ में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ-ठंडा एसीएसएफ (5% सीओ 2/95% ओ2के साथ बुलबुला)। अंत में ऊतक संरेखित करना। दूसरे गोलार्द्ध को बर्फ-ठंडा एसीएसएफ में टुकड़ा करने की क्रिया तक रखें।
    5. वाइब्रेटोम को 250-400 माइक्रोन पर स्लाइस काटने के लिए समायोजित करें। 250 माइक्रोन पर टुकड़ा करने की क्रिया प्रति पशु लगभग 12 स्लाइस निकलेगा (400 माइक्रोन: ~ 7 स्लाइस)।
    6. टुकड़ा काटने के बाद(चित्रा 1ए),अपनी विशिष्ट रूपात्मक उपस्थिति(चित्रा 1)के आधार पर हिप्पोकैम्पल गठन की पहचान करें और हिप्पोकैम्पस के निकट सेरेब्रल कॉर्टेक्स के हिस्से को रखते हुए हाइपोडर्मिक सुइयों (23 गेज, 1") का उपयोग करके इसे अलग करें।
      नोट: नवजातण करते समय नियोकॉर्टेक्स को संरक्षित करना हिप्पोकैम्पस की अखंडता को संरक्षित करने में मदद करता है। हालांकि, हिप्पोकैम्पस को आवश्यकता होने पर कॉर्टेक्स के बिना अलग और संस्कारित किया जा सकता है।
    7. स्लाइस को गर्म, एसीएसएफ (34 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2/95% ओ2के साथ बुलबुला) में एक जाल पर रखें जब तक कि सभी स्लाइस एकत्र न हो जाएं।
    8. स्लाइस को बाँझ परिस्थितियों में जारी रखने के लिए लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में स्थानांतरित करें।

Figure 1
चित्रा 1: तीव्र और ऑर्गानानोटिक मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के प्रतिनिधि संचरण छवियां। एक तीव्रता से अलग पैरासिग्टल मस्तिष्क टुकड़ा(ए)और एक पैरासिसिग्टल ऑर्गानोटिक मस्तिष्क स्लाइस की तुलना 12 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा(बी)व्यापक क्षेत्र ट्रांसलुमिनेशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । डीजी = डेनटेट जायरस; CA1/3 = CA1/CA3-हिप्पोकैम्पस का क्षेत्र; ई-सीटीएक्स = एंटोराइनल कॉर्टेक्स; CTX = (नव) प्रांतस्था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. स्लाइस की गणना

  1. धीरे से ACSF से स्लाइस को एक उल्टे बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके बाँझ हांक के नमक समाधान से भरे पूर्व-गर्म पेट्री व्यंजनों में से एक में स्थानांतरित करें।
    नोट: ऊतक की नसबंदी कमजोर पड़ने (चरण 3.2) द्वारा प्राप्त की जाती है। पेट्री डिश के लिए संभव के रूप में थोड़ा ACSF के रूप में स्थानांतरण ।
  2. पिपेट बदलें और स्लाइस को दूसरी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। प्रक्रिया को कुल मिलाकर 5 बार दोहराएं। निम्नलिखित पेट्री व्यंजनों के लिए संभव के रूप में थोड़ा HBSS के रूप में स्थानांतरण।
  3. धीरे संस्कृति डालने के शीर्ष पर एक समय में एक टुकड़ा जगह है । प्रत्येक स्लाइस के लिए प्रक्रिया दोहराएं। पिपेट में अशांति से बचें और पाश्चर पिपेट की नोक पर स्लाइस वंश तक इंतजार करें। एक एक झिल्ली पर 4 स्लाइस तक जगह हो सकती है।
  4. ध्यान से एक अच्छा टिप का उपयोग करके डालने के ऊपर से किसी भी अतिरिक्त हांक समाधान को हटा दें।
  5. संस्कृतियों(चित्रा 2)को गैस (कार्बोजन, 95% ओ2 /5% सीओ2)और प्रयोग के दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर तरल के बीच इंटरफेस पर एक इनक्यूबेटर में रखें। हर 2-3 दिन में मीडियम को बदलें।

Figure 2
चित्रा 2: आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर ATeam1.03YEMKका उपयोग करके सुसंस्कृत ऑर्गानोटिक मस्तिष्क स्लाइस में FRET-आधारित एटीपी इमेजिंग का सिद्धांत। इस काम में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। संक्षेप में, पैराग्सिटिटल ऑर्गानोटिपिक स्लाइस, 1-3 दिनों के लिए सुसंस्कृत, एक एडेनो-संबद्ध वायरल वेक्टर के साथ ट्रांसड्यू किया जाता है जिसमें या तो, एस्ट्रोसाइट-विशिष्ट hGFAP-या न्यूरॉन-विशिष्ट एचएसआईएन-प्रमोटर और ATeam1.03YEMKकी अभिव्यक्ति के लिए अनुक्रम होते हैं। इन वेक्टर (1:2-1:4) के पतला एलिकोट सीधे एक स्लाइस के शीर्ष पर लागू होते हैं, जिसे कम से कम 6 दिनों तक खेती की स्थिति में बनाए रखा जाता है। इंट्रासेलर एटीपी स्तर में परिवर्तन तो यह ४३४ एनएम पर रोमांचक द्वारा सेंसर व्यक्त कोशिकाओं में कल्पना की जा सकती है और ५२७ (स्वीकारकर्ता) और ४७५ (दाता) एनएम पर एक साथ फ्लोरेसेंस उत्सर्जन प्राप्त करके । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. एडेनो से जुड़े वायरल वेक्टर के साथ एटीपी सेंसर की अभिव्यक्ति(चित्रा 2)

नोट: आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों की हैंडलिंग के लिए सभी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए सुनिश्चित करें!

  1. वायरल वेक्टर को संभालने के लिए, बार-बार ठंड और विगलन से बचने के लिए 1-2 μL पर एलिकोट एडेनो-संबद्ध वायरल वेक्टर (AAV2/5) । -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स स्टोर करें।
  2. वेक्टर के संपर्क में आने वाली सभी उपयोग की गई अवशिष्ट सामग्री को त्यागने के लिए बाँझ बेंच पर 10% ब्लीच युक्त एक फ्लास्क रखें।
  3. ट्रांसड्यूक्शन के लिए, डीपीबीएस के 2-3 माइक्रोन के साथ वेक्टर के 1 माइक्रोन का कमजोर पड़ने की तैयारी करें। स्टॉक समाधान आम तौर पर 1012 वायरल जीनोम प्रति एमएल (vg/mL) की भयावहता में एक भौतिक टिटर प्रदर्शित करते हैं।
  4. बाँझ हुड में एक सुसंस्कृत टुकड़ा युक्त एक प्रविष्टि स्थानांतरण।
  5. ऊतक को छूने के बिना, प्रत्येक टुकड़े के शीर्ष पर सीधे पतला वेक्टर के 0.5 माइक्रोन लागू करें।
    नोट: ऊतक की गहरी परतों में बेहतर अभिव्यक्ति विट्रो (DIV) में 1-3 दिनों में सुसंस्कृत स्लाइस को ट्रांसड्यूकरने से प्राप्त की जाती है। पुरानी संस्कृतियों के ट्रांसड्यूक्शन के परिणामस्वरूप आसपास के ग्लियल निशान में कोशिकाओं की एक प्रमुख अभिव्यक्ति या न्यूरॉन्स में कम अभिव्यक्ति हो सकती है।
  6. अंत में, स्लाइस को वापस इनक्यूबेटर में रखें और उन्हें कम से कम 6 दिनों तक बनाए रखें। ट्रांसड्यूक्शन के दिन माध्यम न बदलें।

4. ग्लिल निशान को हटाना(चित्रा 3)

  1. प्रयोग शुरू करने से ठीक पहले, एक सम्मिलित को बाँझ हुड में सुसंस्कृत स्लाइस से युक्त स्थानांतरित करें और इसे 30 मिमी पकवान में रखें, जिसमें OCT माध्यम या MEM का 1 mL हो।
  2. डिश को स्टीरियोस्कोप के नीचे रखें और स्लाइस की सतह पर ध्यान केंद्रित करें।
  3. एक चुने हुए टुकड़े(चित्रा 3)के संकीर्ण किनारों पर एक छोटे से क्रॉस-कट सही बनाने के लिए दो बाँझ हाइपोडर्मिक सुइयों (23 जी, 1") का उपयोग करें। यह प्रक्रिया ग्लिल निशान द्वारा बनाई गई सतह में तनाव को जारी करेगी जिससे यह वापस आ जाएगा, जिससे अंतर्निहित परतों को उजागर किया जा सके (चित्रा 5देखें)।
    नोट: पहला टिश्यू लेयर (ग्लिल निशान) मुख्य रूप से प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स द्वारा बनाया जाता है। चौड़े क्षेत्र इमेजिंग में, इस घने ऊतक परत प्रकाश के अतिरिक्त बिखरने में परिणाम होगा, जिसके परिणामस्वरूप धुंधली छवियां होंगी। निशान को हटाना इस प्रकार गहरी परतों की बेहतर दृश्यता प्राप्त करने के लिए लाभप्रद है, जिसमें उचित ऑर्गानोटिक ऊतक होते हैं। इस प्रकार, इस कटौती को विशेष रूप से किनारे पर और स्लाइस तैयार करने की ऊपरी परत में करने के लिए सावधान रहें और नीचे के ऊतकों को नुकसान न पहुंचाएं। हमने ओटीसी में प्राप्त आंकड़ों के बीच अंतर का पालन नहीं किया, जिसमें निशान मुक्त ओटीसी (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ ग्लियल निशान था।
  4. डालने से तैयार स्लाइस निकालें। इस उद्देश्य के लिए, झिल्ली में सीधे समानांतर कटौती करके, केंद्र में स्लाइस के साथ एक वर्ग या त्रिकोण बनाकर, चिमटी के साथ झिल्ली के किनारों को पकड़ते हुए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें और इसे उत्पादित करें। यदि डालने अतिरिक्त स्लाइस होस्ट करता है, तो इसे मूल प्लेट में और इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें। मध्यम की सतह तनाव झिल्ली की सतह पर इसके रिसाव को रोक देगा।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लिल निशान के यांत्रिक हटाने का योजनाबद्ध चित्रण। यह आंकड़ा एक हिप्पोकैम्पस स्लाइस कल्चर दिखाता है जो ग्लियल निशान (ब्लूश एलिप्लाइड) से ढका हुआ है। एक बार तक संस्कृति के सबसे छोटे ध्रुव पर दो सिरिंज सुइयों के सुझावों को बाल काटना और ग्लियल निशान (नीली धराशायी रेखा) के किनारे पर, निशान एक तरफ फ्लिप होगा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

5. FRET आधारित एटीपी इमेजिंग(चित्रा 4)

  1. प्रयोग से पहले, ई-ACSF तैयार करें और इसे कम से कम 30 टिन के लिए 95% O2/5%सीओ2 के साथ बुलबुला करें ताकि 7.4 का पीएच प्राप्त किया जा सकता है। मोनोक्रोमेटर(चित्रा 4)के फ्लोरोसेंट लाइट सोर्स (ज़ेनन लैंप) पर स्विच करें। इनक्यूबेटर से स्लाइस लेने से ठीक पहले परफ्यूजन शुरू करें।
    नोट: पूरे प्रयोग के दौरान 95% O2 और 5% सीओ2 के साथ खारा बुलबुला रखें।
  2. स्लाइस को एक प्रायोगिक कक्ष में स्थानांतरित करें जो लगातार पेरिस्टैटिक पंप(चित्रा 4)का उपयोग करके ताजा कार्बोजेनेटेड ई-एसीएसएफ के साथ व्याप्त होता है। फिर, एक ग्रिड के साथ टुकड़ा ठीक करें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर चैंबर रखें और परफ्यूजन सिस्टम को कनेक्ट करें। गैस प्रूफ प्रयोगशाला ट्यूबिंग perfusion के लिए सिफारिश की है।
    नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर कमरे के तापमान पर या शारीरिक तापमान के पास प्रयोग किए जा सकते हैं। ऊतक के आंदोलन और/या कतरनी तनाव में परिवर्तन से प्रेरित ध्यान के परिवर्तन से बचने के लिए परफ्यूजन प्रवाह की स्थिरता और विश्वसनीयता की जांच करें । हमारे और कई अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले स्लाइस कार्य के लिए मानक परफ्यूजन वेग 1.5-2.5 mL/min हैं।

Figure 4
चित्रा 4: FRET इमेजिंग सेटअप का विन्यास। (A)एफआरटी इमेजिंग सेटअप के लिए आवश्यक विभिन्न घटकों और उनकी स्थानिक व्यवस्था का योजनाबद्ध चित्रण। इस व्यवस्था में एक प्रकाश स्रोत के रूप में एक ज़ेनन लैंप के साथ एक मोनोक्रोमेटर, एक ईमानदार निश्चित चरण माइक्रोस्कोप (1), एक छवि-स्प्लिटर सिस्टम (2), समय-चूक रिकॉर्डिंग (3) के लिए एक डिजिटल सीसीडी या सीएमओएस कैमरा, और स्थिर स्थिर परफ्यूजन (4) के लिए अनुकूलित एक प्रयोगात्मक स्नान शामिल है। स्नान perfusion समायोज्य प्रवाह दर के साथ एक पेरिस्टैटिक पंप द्वारा महसूस किया जाता है। (ख)प्रयोगात्मक कार्यक्षेत्र की छवि । FRET इमेजिंग सेटअप एक कंपन-नम मेज पर एक एक्स/y-ट्रांसलेशनल चरण ले जाने पर मुहिम शुरू की है, जिसमें प्रयोगात्मक स्नान एंबेडेड है । संख्या: देखें(ए)। (ग)मोनोक्रोमेटर से डिजिटल कैमरे तक प्रकाश मार्ग का योजनाबद्ध दृश्य। संकेत दिया गया है कि विभिन्न फिल्टर और डिक्रोइक मिरर की स्थिति है। संख्या: देखें(ए)कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. ट्रांसमिशन लाइट का उपयोग करके सुसंस्कृत टुकड़ा को ध्यान में लाएं। उस क्षेत्र की पहचान करें जहां प्रयोग किए जाएंगे (उदाहरण: हिप्पोकैम्पस का CA1 क्षेत्र)। इमेजिंग प्रयोग शुरू करने से पहले, स्लाइस को खारा परिस्थितियों में ढालने की अनुमति देने के लिए कम से कम 15 मिन का इंतजार करें। प्रायोगिक सेटअप के विन्यास के लिए, चित्र4देखें ।
  2. कैमरा और इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर स्विच करें। इसके बाद उचित फिल्टर क्यूब का चयन करें।
  3. 435/17 एनएम (~ 435 एनएम) पर दाता फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईसीएफपी) उत्तेजित करें। एक्सपोजर टाइम 40 से 90 एमएस के बीच सेट करें।
    नोट: फ्लोरोसेंट प्रकाश में स्लाइस के मजबूत प्रदर्शन के परिणामस्वरूप फोटोटॉक्सिक प्रभाव हो सकते हैं।
  4. 435 एनएम पर उत्तेजना दोनों 475 एनएम (ईसीएफपी; दाता) और 527 एनएम (वीनस; स्वीकारकर्ता) पर उत्सर्जन में परिणाम है। एक उत्सर्जन छवि स्प्लिटर के साथ ५०० एनएम पर फ्लोरेसेंस उत्सर्जन विभाजित और 483/32 और 542/27 पर बैंड पास फिल्टर रोजगार के लिए आगे दाता और स्वीकारकर्ता फ्लोरेसेंस अलग । मजबूत अभिव्यक्ति डिटेक्टरों के संतृप्ति में परिणाम हो सकता है । इस मामले में, आप उत्तेजना की तीव्रता को कम करने के लिए एक तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग कर सकते हैं।
  5. पृष्ठभूमि घटाव के लिए सेलुलर फ्लोरेसेंस से रहित ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का चयन करें। इसके बाद आरओआई डेलिनटिंग सेल बॉडी बनाएं।
  6. छवि अधिग्रहण की आवृत्ति और समग्र रिकॉर्डिंग समय निर्धारित करें। लंबे (>30 min) प्रयोगों के लिए, फोटोटॉक्सिकिटी को रोकने के लिए 0.2-0.5 हर्ट्ज की अधिग्रहण आवृत्ति की सिफारिश की जाती है।
  7. रिकॉर्डिंग शुरू करें। तैयारी की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए बेसलाइन शर्तों के तहत कम से कम 5 मिन रिकॉर्ड करने की सिफारिश की जाती है।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो रिकॉर्डिंग के दौरान सेल का ध्यान समायोजित करें।
  8. इंट्रासेलर एटीपी में बदलाव को प्रेरित करने के लिए, परफ्यूजन ट्यूब को मानक एसीएसएफ से मेटाबोलिक अवरोधकों वाले खारा करने के लिए स्थानांतरित करें (उदाहरण के लिए सीआईएस, तालिका 1 और नीचे देखें)। वैकल्पिक रूप से, सक्रिय न्यूरॉन्स से पोटेशियम की रिहाई की नकल करने के लिए ऊंचा पोटेशियम एकाग्रता के साथ एक खारा का उपयोग करें।
    नोट: स्नान perfusion द्वारा आवेदन एक अपेक्षाकृत धीमी प्रक्रिया है, जो विश्व स्तर पर पूरी तैयारी पर कार्य करता है । उस समय ध्यान दें जिस पर नया समाधान वास्तव में प्रायोगिक स्नान में प्रवेश करना शुरू कर दिया। कक्ष और खारा जलाशय के बीच की दूरी के साथ-साथ परफ्यूजन की गति के आधार पर, देरी के समय पर विचार किया जाना चाहिए।

6. सेलुलर एटीम फ्लोरेसेंस का उच्च संकल्प दस्तावेज

  1. रिकॉर्डिंग के बाद सीधे, स्लाइस कल्चर वाले रिकॉर्डिंग चैंबर को कॉन्फोकल लेजर स्कैन माइक्रोस्कोप पर स्थानांतरित करें।
    नोट: इसका विशेष ध्यान रखें। संभावित फोटोक्षति के कारण, प्रयोगों के बाद ही इस चरण को करें। प्रलेखन उद्देश्यों के लिए, कोई भी एच-एसीएसएफ के साथ ई-एसीएसएफ का आदान-प्रदान कर सकता है। इसलिए, एक परफ्यूजन प्रणाली की आवश्यकता नहीं है।
  2. दिए गए ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन पर संभव उच्चतम जेड रिज़ॉल्यूशन पर जेड-स्टैक लें।
  3. छवि संकल्प बढ़ाने के लिए एक डेकोवोलुशन एल्गोरिदम लागू करें।

Representative Results

एएवी वेक्टर जीवित ऊतक16के भीतर कोशिकाओं में विदेशी जीन को चुनिंदा रूप से व्यक्त करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण हैं । ATeam1.03YEMK के अनुक्रम कैसेट और चुने हुए सेल प्रकार में सेंसर की एक उच्च अभिव्यक्ति में एक विशिष्ट प्रमोटर युक्त AAVs के प्रत्यक्ष आवेदन । DIV 14 में (~ 10 दिन एक ट्रांसड्यूक्शन के बाद), मानव सिनेप्सिन प्रमोटर के तहत एटीम व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स स्लाइस सतह के नीचे 50 माइक्रोन तक की गहराई में सुसंस्कृत ऊतक स्लाइस के नियोकॉर्टेक्स में उच्च घनत्व पर पाए जाते हैं(चित्रा 5ए)। हिप्पोकैम्पस(चित्रा 5बी)में तुलनीय परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: सुसंस्कृत पैरासैसिटिटल ऑर्गानेपिक ब्रेन स्लाइस में ATeam1.03YEMK व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स का दृश्य। बाईं ओर छवियां हिप्पोकैम्पल ऊतक के 70 ऑप्टिकल वर्गों (0.6 माइक्रोन प्रत्येक) के कॉर्टिकल ऊतक(ए)और(बी)के 43 ऑप्टिकल वर्गों (1.05 माइक्रोन प्रत्येक) के विस्तारित फोकस अनुमानों के अनुरूप हैं। दाईं ओर छवियां एक ही प्रक्षेपण के वॉल्यूम व्यू का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाओं को सही पर रंग पैमाने से संकेत के रूप में टुकड़ा सतह के सापेक्ष उनकी गहराई के अनुसार रंग कोडित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एस्ट्रोसाइट्स में एटीपी स्तर की माप के लिए, ATeam1.03YEMK मानव ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP) प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है। इसके परिणामस्वरूप सुसंस्कृत ऊतक स्लाइस(चित्र6)के नियोकॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस दोनों में कोशिकाओं का कुशल ट्रांसड्यूक्शन होता है। विशेष रूप से, स्लाइस तैयारी की सतह के सापेक्ष गहराई के आधार पर दो अलग-अलग रूपात्मक फेनोटाइप को प्रतिष्ठित किया जा सकता है। पहली, सतही परत में, कोशिकाओं को मोटी प्राथमिक प्रक्रियाओं की विशेषता होती है जो सतह के समानांतर मुख्य रूप से व्यवस्थित होती हैं। ये कोशिकाएं दृढ़ता से ओवरलैपिंग डोमेन प्रदर्शित करती हैं, जो जाहिरा तौर पर प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स(चित्रा 6)का एक घना जाल बनाती हैं। गहरी परतों (सतह से 30-60 माइक्रोन) में, ट्रांसड्यूस एस्ट्रोसाइट्स ठीक सेलुलर प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं जो काफी हद तक गोलाकार डोमेन बनाते हैं और उनकी आकृति विज्ञान सीटू में एस्ट्रोसाइट्स जैसा दिखता है जैसा कि पहले19,20,21 (चित्रा 6)की रिपोर्ट की गई थी। गहरी परत एस्ट्रोसाइट्स के बेहतर ट्रांसड्यूक्शन के साथ-साथ इन गहरी परतों तक बेहतर ऑप्टिकल पहुंच प्राप्त करने के लिए, ग्लियल निशान ऊतक को चरण 4 में वर्णित के रूप में हटाया जा सकता है।

Figure 6
चित्रा 6: सुसंस्कृत पैरासिग्टल ऑर्गानोटिक मस्तिष्क स्लाइस में ATeam1.03YEMK व्यक्त एस्ट्रोसाइट्स का दृश्य। बाईं ओर छवि 191 ऑप्टिकल वर्गों (0.45 माइक्रोन प्रत्येक) के विस्तारित फोकस प्रक्षेपण से मेल खाती है। उदाहरण उद्देश्यों के लिए, ग्लिल निशान को एस्ट्रोसाइट्स के प्रक्षेपण से बाहर रखा गया था। दाईं ओर छवियां ग्लिल निशान को हटाने से पहले और बाद में एक ही प्रक्षेपण की मात्रा दृश्य का प्रतिनिधित्व करती हैं। कोशिकाओं को सही पर रंग तराजू द्वारा इंगित स्लाइस सतह के सापेक्ष उनकी गहराई के अनुसार रंग-कोडित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ATeam1.03YEMK की सफल अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स या एस्ट्रोसाइट्स में एटीपी स्तर में परिवर्तन के गतिशील माप की अनुमति देता है, प्रवर्तक के आधार पर (ऊपर देखें)। प्रयोग एक प्रयोगात्मक स्नान में लगातार ई-ACSF के साथ व्याप्त किया गया (९५% O2/5%सीओ2के साथ बुलबुला) । हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में ATeam1.03YEMK व्यक्त ऑर्गानोपिक स्लाइस में, रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) का चयन किया गया था, जो पिरामिड कोशिकाओं की सोमता का प्रतिनिधित्व करता है(चित्रा 7ए)। इसके अलावा, पृष्ठभूमि घटाव के लिए एक क्षेत्र चुना गया था(चित्रा 7ए)। शुक्र के उत्सर्जन के साथ-साथ ईसीएफपी फ्लोरेसेंस को इनमें से प्रत्येक आरओआई के लिए अलग से एकत्र किया गया था और समय के साथ फ्लोरेसेंस उत्सर्जन स्तर(चित्रा 7बी)के रूप में चित्रित किया गया था। एक स्थिर आधार रेखा सुनिश्चित करने के लिए कई मिनट ों के लिए नियंत्रण शर्तों के तहत फ्लोरेसेंस रिकॉर्ड करने के बाद, सेलुलर चयापचय को ग्लूकोज मुक्त खारा करने के लिए स्लाइस तैयारी को उजागर करके बाधित किया गया था, जिसके लिए 5 mM सोडियम एजाइड (NaN3)को एक मिनट के लिए जोड़ा गया था(चित्रा 7बी)। इस हेरफेर ने एफआरईटी जोड़ी(चित्रा 7बी,बाएं पैनलों) की उत्सर्जन तीव्रता में विपरीत परिवर्तनों को प्रेरित किया, जिसमें वीनस (527 एनएम) की कमी और ईसीएफपी (475 एनएम) उत्सर्जन में वृद्धि हुई है। ईसीएफपी (एफवीनस/एफईसीएफपी)द्वारा वीनस के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को विभाजित करके एफआरईटी अनुपात की गणना करने के परिणामस्वरूप संकेत मिले जो इंट्रासेलर एटीपी स्तरों में सापेक्ष परिवर्तनों को दर्शाते हैं, तथाकथित "एटीम FRET अनुपात"(चित्रा 7बी,सही पैनल)। सभी रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन्स (एन = 70 कोशिकाओं में एन = 5 स्लाइस), एन3 ने एटीम एफआरटी अनुपात में रिवर्सिबल कमी का कारण बना, जो सेलुलर मेटाबोलिज्म के अवरोध पर इंट्रासेलर एटीपी स्तर में रिवर्सिबल कमी का संकेत देता है।

Figure 7
चित्रा 7: समय चूक ATeam FRET अनुपात इमेजिंग का प्रदर्शन। (A)शीर्ष बाएं: पिरामिड परत और एक सुसंस्कृत ऑर्गानोटिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस के CA1 क्षेत्र के स्ट्रैटम रेडियम की वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस छवि न्यूरॉन्स में ATeam1.03YEMK व्यक्त करती है। शीर्ष दाएं: बाईं ओर संकेत के रूप में बॉक्स्ड अनुभाग का बढ़ा हुआ दृश्य। सफेद लाइनें ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) 1-3 CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के सेल निकायों का प्रतिनिधित्व(बी)में विश्लेषण के लिए चुना चित्रण । बीजी पृष्ठभूमि सुधार के लिए चुने गए आरओआई का प्रतिनिधित्व करता है। नीचे: छद्म रंग की छवियां शुक्र (हरे), eCFP (बैंगनी) और वीनस/eCFP के अनुपात के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ख)आरओआई 1-3 में समय चूक रिकॉर्डिंग, न्यूरोनल सेल निकायों का प्रतिनिधित्व (एदेखें) । बाएं शो पर निशान वीनस (ग्रीन) और eCFP (मजेंटा) के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को सामान्यीकृत किया गया । सही पर निशान इसी एटीम FRET अनुपात दिखाते हैं। ध्यान दें कि 1 मिनट (ग्रे बार) के लिए बाह्य ग्लूकोज की अनुपस्थिति में 5 mM NaN3 के साथ perfusion ATeam FRET अनुपात में एक रिवर्सिबल कमी लाती है, इंट्रासेलुलर एटीपी एकाग्रता में कमी का संकेत है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

दीर्घकालिक प्रयोग स्थितियों के तहत तैयारी और सेंसर की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, न्यूरॉन्स या एस्ट्रोसाइट्स में एटीम व्यक्त करने वाले स्लाइस लगातार लंबे समय तक एसीएसएफ के साथ मौजूद थे (>50 min; n = 12 कोशिकाएं प्रत्येक, एन = 3 ओटीसी 3 दिमाग से)। इन शर्तों के तहत, एटीम FRET अनुपात में परिवर्तन नहीं हुआ(चित्रा 8)। मेटाबोलिक अवरोधकों ("रासायनिक इस्केमिया", टेबल 1देखें) युक्त सीआईएस की तैयारियों को उजागर करना, इसके विपरीत, फिर से ऊपर देखी गई एटीम FRET अनुपात में अपेक्षित गिरावट हुई।

Figure 8
चित्रा 8: आधाररेखा प्रयोगATeam रोजगार । न्यूरॉन्स (ऊपर) और एस्ट्रोसाइट्स (नीचे) में बेसलाइन स्थितियों के तहत 14 विभिन्न कोशिकाओं में दीर्घकालिक एटीम FRET अनुपात इमेजिंग। अन्य प्रायोगिक आंकड़ों के रूप में तुलनीय परिस्थितियों में डेटा लिया गया था । प्रत्येक माप के अंत में, रासायनिक इस्केमिया को तीर द्वारा इंगित के रूप में CIS के साथ परफ्यूजन द्वारा प्राप्त किया गया था। नोट: बेसलाइन एटीम FRET अनुपात आधारभूत स्थितियों के तहत समय के साथ स्थिर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इसके बाद, हमने अतिरिक्त सेलुलर पोटेशियम एकाग्रता में वृद्धि के लिए ATeam1.03YEMK व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया। एक स्थिर बेसलाइन स्थापित करने के बाद, न्यूरॉन्स एक खारा जिसमें पोटेशियम एकाग्रता 3 मिनट के लिए 3 से 8 mM(चित्रा 9ए)से बढ़ गया था के साथ व्याप्त थे । हालांकि, इस हेरफेर ने एटीम फ्रेट अनुपात (एन = 5 स्लाइस में 56 कोशिकाओं) में एक पता लगाने योग्य परिवर्तन का परिणाम नहीं दिया। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेंसर एटीपी के स्तर में परिवर्तन पर प्रतिक्रिया व्यक्त की, स्लाइस फिर से रासायनिक इस्केमिया की एक निरंतर अवधि के संपर्क में थे सीआईएस द्वारा ई-ACSF की जगह द्वारा प्राप्त । रासायनिक इस्केमिया के परिणामस्वरूप एटीम फ्रेट अनुपात में एक नए, स्थिर स्तर पर तेजी से कमी आई, जो 2-3 मिन(चित्रा 9ए)के बाद एटीपी की नाममात्र की कमी का संकेत है।

Figure 9
चित्र 9: प्रतिनिधि प्रयोग न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में एटीपी के स्तर में परिवर्तन को दर्शाते हैं। (ए,बी):बाईं ओर छवियां ऑर्गानोटिपिक स्लाइस के हिप्पोकैम्पल सीए1 क्षेत्र में स्थित न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स से एटीम फ्लोरेसेंस दिखाती हैं। सही पर निशान एक ही सेल शरीर पर तैनात एक आरओआई से प्राप्त ATeam FRET अनुपात के समय चूक रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं । दोनों प्रयोगों में, स्लाइस पहले 3 मिनट के लिए बाह्य पोटेशियम एकाग्रता में वृद्धि के अधीन थे (बार देखें), रासायनिक इस्केमिया के लिए एक अंतिम जोखिम के बाद । ध्यान दें कि न्यूरॉन्स एक्सट्रासेलुलर पोटेशियम(ए)की ऊंचाई का जवाब नहीं देते हैं, एस्ट्रोसाइट्स एटीपी(बी)में वृद्धि के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक ही प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्लाइस के साथ किया गया था, जिसमें एस्ट्रोसाइट्स में ATeam1.03YEMK व्यक्त किया गया था। न्यूरॉन्स में जो देखा गया था उसके विपरीत, एस्ट्रोसाइट्स ने एटीम फ्रेट अनुपात में रिवर्सिबल वृद्धि द्वारा एक्स्ट्रासेलुलर पोटेशियम में वृद्धि पर प्रतिक्रिया व्यक्त की, जो इंट्रासेलर एटीपी स्तर (एन = 5 स्लाइस में 70 कोशिकाओं)(चित्रा 9बी)में वृद्धि का संकेत है। रासायनिक इस्केमिया के बाद के जोखिम के परिणामस्वरूप, एटीम फ्रेट अनुपात में एक बड़ी गिरावट में, इंट्रासेलर एटीपी(चित्र9बी)की मामूली कमी का संकेत है।

Discussion

यहां, हम माउस मस्तिष्क15के ऑर्गानोटिक ऊतक स्लाइस संस्कृतियों में एस्ट्रोसाइट्स या न्यूरॉन्स में एटीपी स्तर में परिवर्तन की माप के लिए ATeam1.03YEMK,एक FRET आधारित, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड नैनोसेंसर14की कोशिका-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक प्रक्रिया प्रदर्शित करते हैं। अनुकरणीय रिकॉर्डिंग में, हम बताते हैं कि एक्स्सेल्युलर पोटेशियम एकाग्रता में वृद्धि के परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स में एटीपी सांद्रता में परिवर्तन नहीं होता है, जबकि इस हेरफेर के जवाब में एस्ट्रोसाइटिक एटीपी का स्तर बढ़ जाता है। इसके अलावा, हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि सेलुलर चयापचय के अवरोध पर, ATeam1.03YEMK FRET अनुपात तेजी से दोनों सेल प्रकारों में गिरता है, जो इंट्रासेलर एटीपी में तेजी से कमी का संकेत देता है।

ऑर्गानोटिक स्लाइस संस्कृतियों में ATeam1.03YEMK की अभिव्यक्ति के लिए कम से कम 7-10 दिनों के लिए नियंत्रित परिस्थितियों में संस्कृति में ऊतक के रखरखाव की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, ATeam1.03YEMK को तीव्रता से अलग मस्तिष्क ऊतक स्लाइस में और चूहों की ऑप्टिक नसों में13,15में एटीपी के मापन के लिए भी नियोजित किया जा सकता है। तीव्रता से अलग ऊतक में माप, हालांकि, ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी या मस्तिष्क में वायरल वैक्टर के एक स्टीरियोटैक्टिक आवेदन की आवश्यकता है, पशु प्रयोग और सख्त पशु देखभाल प्रोटोकॉल शामिल हैं । इस संबंध में, ऑर्गानोटिक ऊतक स्लाइस संस्कृतियों में ATeam1.03YEMK अभिव्यक्ति एक उपयोगी और मूल्यवान वैकल्पिक22,23का प्रतिनिधित्व करती है। कई वर्षों के लिए, ऑर्गानोटिक ऊतक टुकड़ा संस्कृतियां तंत्रिका गुणों, कनेक्टिविटी और विकास24,25,26का अध्ययन करने के लिए एक स्थापित मॉडल प्रणाली के रूप में काम करती हैं। वे न केवल सामान्य ऊतक वास्तुकला और लेमिनेशन(चित्रा 1)को बनाए रखते हैं, बल्कि सेल संस्कृतियों के तरजीही गुणों जैसे बेहतर पहुंच और प्रयोगात्मक स्थितियों के प्रत्यक्ष नियंत्रण की मेजबानी भी करते हैं। ऑर्गानोटिक टिश्यू स्लाइस संस्कृतियों को भी नियमित रूप से वायरल वैक्टर27का उपयोग करके विदेशी जीन व्यक्त करने के लिए नियोजित किया जाता है । कई प्रकार के वायरल वेक्टर मस्तिष्क केऊतकों 16,28में ट्रांसजीन देने की सूचना मिली है . एडेनोवायरल वेक्टर ग्लियल कोशिकाओं में उच्च अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं, लेकिन हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स16नहीं, और ग्लिअल रिएक्टिविटी17उत्पन्न कर सकते हैं। एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर के रूप में यहां इस्तेमाल किया एक अच्छा विकल्प15के रूप में उभरने, और उनकी प्रभावशीलता भी वीवो29में दिखाया गया है ।

जबकि मुख्य रूप से न्यूरोनल गुणों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, हाल के अध्ययनों की स्थापना की है कि organotypic ऊतक टुकड़ा संस्कृतियों भी एस्ट्रोसाइट्स के विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है । सुसंस्कृत स्लाइस आमतौर पर प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स19,30 (चित्रा 5)की एक परत द्वारा कवर किए जाते हैं, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स गहरी परतों19,30 (चित्रा 5)में अधिक देशी, असक्रिय आकृति विज्ञान और साइटोआर्किटेक्चर प्रदर्शित करते हैं। वर्तमान अध्ययन में, हम बाहरी ग्लियल निशान के यांत्रिक हटाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उचित ऑर्गानासाइटिक ऊतक परतों के भीतर देशी एस्ट्रोसाइट्स की बेहतर प्रयोगात्मक और ऑप्टिकल पहुंच होती है। इसके अलावा, इसके हटाने से ऑर्गानासाइटिक स्लाइस की गहरी परतों में अभिव्यक्ति प्रभावकारिता में सुधार होता है; यदि ग्लियल निशान को हटाया नहीं जाता है, तो एएवी द्वारा ट्रांसड्यूक्शन सतही कोशिका परतों तक सीमित हो सकता है।

ऊतक स्लाइस में प्रयोग करते समय कई बाहरी यांत्रिक कारकों पर विचार करने की आवश्यकता होती है। स्नान परफ्यूजन वेग में भिन्नता पूरी तैयारी के आंदोलनों को प्रेरित कर सकती है और/या ध्यान में परिवर्तन को प्रेरित कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप सेंसर सिग्नल के कृत्रिम क्षणिक परिवर्तन होते हैं । इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स दोनों को यांत्रिक विरूपण का जवाब देने के लिए सूचित किया गया है जैसे कि उच्च परफ्यूजनदरों 32,33द्वारा लगाया गया है। हमारे हाथों में, एक विश्वसनीय पेरिटैल्टिक पंप का उपयोग करके, ऊतक और उद्देश्य (मेनिस्कस) के बीच खारा की छोटी और स्थिर मात्रा को बनाए रखने के साथ यहां उपयोग किए जाने वाले परफ्यूजन वेग (1.5-2.5 mL/min) पर बेसलाइन स्थितियों के तहत एक स्थिर FRET-सिग्नल में परिणाम है; चित्रा 8)

वर्तमान अध्ययन में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि एटीम1.03YEMK के साथ FRET-आधारित इमेजिंग को न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में एटीपी स्तर की निगरानी के लिए नियोजित किया जा सकता है। सेलुलर एटीपी की माप के लिए पहले पेश किया गया एक वैकल्पिक साधन तथाकथित लुसिफेरिन-ल्यूसिफ़ेराज़ परख34,35,36,37है । हालांकि, यह दृष्टिकोण बायोल्यूमिनेसेंस की इमेजिंग पर आधारित है और केवल उच्च पृष्ठभूमि शोर के स्तर के कारण आंशिक रूप से कम लौकिक और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। हाल के वर्षों में नियमित रूप से नियोजित एक अन्य विधि आयन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोफोर मैग्नीशियम ग्रीन38,39,40का उपयोग करके इंट्रासेलर मैग्नीशियम एकाग्रता में परिवर्तन की इमेजिंग थी । यह दृष्टिकोण इस अवलोकन से संबंधित है कि एटीपी की खपत के परिणामस्वरूप इसके सह-कारक मैग्नीशियम की रिहाई होती है । मैग्नीशियम हरे रंग के साथ इमेजिंग जिससे केवल एटीपी के स्तर में परिवर्तन का एक माध्यमिक अनुमान प्रदान करता है। इसके अलावा, मैग्नीशियम ग्रीन भी इंट्रासेलुलर कैल्शियम में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, जब इस विधि के साथ प्राप्त परिणामों की व्याख्या करते समय एक और कठिनाई शुरू होती है।

सेलुलर मेटाबोलाइट्स की डायरेक्ट इमेजिंग के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड नैनोसेंसर का हालिया विकास, इसलिए,11,12आगे एक बड़ा कदम का प्रतिनिधित्व किया। कई अलग - अलग सेंसर तैयार किए गए जिनसे इंट्रासेलर एटीपी36,41 ,42,43की माप के लिए नियोजित किया जा सकता है . उन में रेशियोमेट्रिक फ्लोरोसेंट एटीपी इंडिकेटर "क्वीन"41 के साथ-साथ पर्सवलएचआर भी हैं, जो एटीपी: एडीपी अनुपात42को होश में रखते हैं। जबकि बाद की जांच कोशिकाओं की ऊर्जा की स्थिति के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, इसके लिए पीएच42में परिवर्तन ों के एक साथ माप की आवश्यकता होती है।

एटीम एक नैनोसेंसर है जिसमें से कई वेरिएंट मौजूद हैं, जो-दूसरों के बीच-एटीपी14के लिए उनकी बाध्यकारी आत्मीयता में भिन्न हैं । विट्रो में, ATeam1.03YEMK 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.2 mM के एक कश्मीरडी प्रदर्शित करता है, जो विभिन्न न्यूरोनल सेल प्रकारों में निर्धारित सेलुलर एटीपी स्तर के करीब है, हाइपोथैलेमस और सेरिबैलम34 से लेकर हिप्पोकैम्पस37,44,45तक। क्यूवेट मापन में, तापमान को 10 डिग्री सेल्सियस तक कम करने के परिणामस्वरूप एटीम 1.03YEMK की एटीपी के लिए बाध्यकारी आत्मीयता में काफी कमी आई, जिससे यह सुझाव दिया गया कि यह कमरे के तापमान14पर सेलुलर इमेजिंग के लिए आदर्श नहीं हो सकता है। हमारे पहले अध्ययन15,हालांकि, प्रदर्शन किया है कि व्यवहार और अलग जोड़तोड़ के लिए न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में व्यक्त ATeam1.03YEMK की प्रतिक्रिया के पास शारीरिक और कमरे के तापमान पर समान है, यह दर्शाता है कि सेंसर दोनों स्थितियों के तहत इंट्रासेलुलर एटीपी स्तर के विश्वसनीय निर्धारण की अनुमति देता है । इसके अलावा, हमारे पिछले प्रयोगों ने15कोशिकाओं के अंदर व्यक्त ATeam1.03YEMK की पीएच-संवेदनशीलता को संबोधित किया, जिसमें यह दर्शाया गया है कि यह इंट्रासेलर पीएच में लगभग 0.1-0.2 पीएच इकाइयों द्वारा परिवर्तन के प्रति असंवेदनशील है। यदि कम एमएम रेंज में केडी एक चिंता का विषय है, वैकल्पिक एटीम वेरिएंट14इस्तेमाल किया जा सकता है, उनमें से ATeam के लाल स्थानांतरित वेरिएंट ("जाओ-ATeam")४३

ATeam1.03YEMK का उपयोग कर के हमारे प्रयोगों से पता चलता है कि कुछ mM द्वारा एक्स्ट्रासेलुलर पोटेशियम एकाग्रता में वृद्धि केवल (3 से 8 mM तक) के परिणामस्वरूप ऑर्गानोटिपिक स्लाइस संस्कृति में एस्ट्रोसाइट्स में ATeam1.03YEMK अनुपात में क्षणिक वृद्धि हुई है। यह अवलोकन पहलेके अध्ययनों कीपुष्टि करता है15,46 और स्पष्ट रूप से इंगित करता है कि एस्ट्रोसाइट्स सक्रिय न्यूरॉन्स द्वारा पोटेशियम की रिहाई का जवाब देते हैं, जो उनके एटीपी उत्पादन में वृद्धि के साथ सक्रिय न्यूरॉन्स द्वारा पोटेशियम की रिहाई का जवाब देते हैं, ज्यादातर एनए+/K+-ATPase और Na+/HCO3- coट्रांसपोर्टर, क्रमशः47,48की उत्तेजना के परिणामस्वरूप होने की संभावना है। इसके विपरीत, न्यूरॉन्स ने प्रतिक्रिया नहीं दिखाई, जो पिछले काम के साथ-साथ15के अनुरूप है। हालांकि, दोनों सेल प्रकारों ने15से पहले दिखाए गए सेलुलर ग्लाइकोलिसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के अवरोध पर तेजी से और दृढ़ता से प्रतिक्रिया व्यक्त की। रासायनिक इस्केमिया की शर्तों के तहत, एटीम FRET अनुपात एक नए स्थिर स्तर पर गिर गया, सेलुलर एटीपी की मामूली कमी का संकेत है । बाद के परिणाम से पता चलता है कि न्यूरॉन्स के साथ-साथ एस्ट्रोसाइट्स दोनों ही सिनैप्टिक एक्टिवेशन या न्यूरोट्रांसमीटर के आवेदन द्वारा अतिरिक्त उत्तेजना के बिना स्थिर-राज्य की स्थितियों के तहत एटीपी की प्रासंगिक खपत का प्रदर्शन करते हैं। एक साथ लिया, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड नैनोसेंसर के साथ FRET-आधारित इमेजिंग, उनमें से ATeam1.03YEMK,विभिन्न परिस्थितियों में इंट्रासेल्युलर एटीपी स्तर और सेलुलर एटीपी खपत में परिवर्तन के लिए जिम्मेदार सेलुलर प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करेगा।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं । लेखकों को वित्तीय सहायता प्राप्त हुई जिससे निकॉन माइक्रोस्कोप सॉल्यूशंस, डसेलडोर्फ, जर्मनी द्वारा खुली पहुंच प्रकाशन को सक्षम किया जा सके, जो वीडियो लेख में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों का उत्पादन करता है। कंपनी न तो यहां प्रस्तुत प्रयोगों को डिजाइन करने में शामिल थी, न उनके निष्पादन में, न डेटा हैंडलिंग में, न ही पांडुलिपि लेखन में।

Acknowledgments

लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए क्लाउडिया रोडरिगो और सिमोन ड्यूरी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम ऑर्गानानोटिक स्लाइस संस्कृतियों की तैयारी में सहायता के लिए डॉ निकलस जे जर्काउ और M.Sc जोएल नेल्सन को धन्यवाद देते हैं । लेखक की प्रयोगशाला में अनुसंधान जर्मन रिसर्च एसोसिएशन (डीएफजी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; २७९५ के लिए: आरओ 2327/13-1 और SPP १७५७: आरओ 2327/8-2 सीआरआर के लिए; और एसपीपी १७५७: युवा ग्लिया स्टार्ट-अप आरएल को धन) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxyglucose Alfa Aesar L07338 Non-metabolizable glucose analog
36-IMA-410-019 Argon laser Melles Griot 488 nm wavelength argon
Ascorbic acid Carl Roth 3525.1 Antioxidant, Vitamin C
band pass filters 483/32 AHF Analysentechnik AG Splitter compatible emmision filter
band pass filters 542/27 AHF Analysentechnik AG Splitter compatible emmision filter
Beamsplitter T 455 LP AHF Analysentechnik AG Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR AHF Analysentechnik AG Splitter dichroic
Confocal laser scannig microscope C1 Nikon Microscope Solutions Modular confocal microscope system C1
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) OriginLab corporation Scientific graphing and data analysis software
D-glucose monohydrate Caelo 2580-1kg
DPBS GIBCO/Life 14190250 Dulbecco's phosphate-buffered saline
Eclipse E 600FN upright microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 upright microscope Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber custom build Perfusion chamber for live-cell imaging
EZ-C1 Silver Version 3.91 Nikon Microscope Solutions Imaging software for confocal microscope
Hanks' Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H9394 With Phenol Red for pH monitoring
HERAcell 150 Thermo Scientific CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine
HERAsafe KS/KSP Thermo Scientific Safety Cabinet
Horse serum GIBCO/Life 26050088 Heat inactivated
Huygens Professional SVI Imaging Deconvolution software
Image J 1.52i Wayne Rasban national Institute of Health Image processing Software available in the public domain
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Insulin from bovine pancreas
IP serie peristaltic pump Ismatec High-precisionmulti-channel pump
Layout software, Illustrator CS6 Adobe Vector graphics editor
L-glutamine GIBCO/Life 25030024
Microm HM 650 V Thermo Scientific Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.
Microscope stage custom build
Microsoft Excel 16 Microsoft Spreadsheet software for basic data processing
Millicell culture insert Merck Millipore PICM0RG50 Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich M7278 Synthetic cell culture media
Monochromator Polychrome V Thermo Scientific/FEI Ultra fast switching monochromator
NaN3 (Sodium Azide) Sigma-Aldrich S-8032 Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 Nikon Microscope Solutions Water Immersion Microscope Objective
NIS Elements 4.50 advanced Research Nikon Microscope Solutions Imaging software. Upgraded version for FRET imaging
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics Digital CMOS camera
Perfusion tubing Pro Liquid GmbH Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0 Adobe Image processing software
Sodium L-lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) ETH Zürich v244 Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) ETH Zürich v307 Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.
WVIEW GEMINI optic system Hamamatsu Photonics Emission Image Splitter

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References

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Lerchundi, R., Kafitz, K. W.,More

Lerchundi, R., Kafitz, K. W., Färfers, M., Beyer, F., Huang, N., Rose, C. R. Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (154), e60294, doi:10.3791/60294 (2019).

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