Summary
マウス前脳の組織図スライス培養における遺伝的にコードされたFRETベースのセンサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、ニューロンおよびアストロサイトにおける細胞ATPレベルの動的イメージングにこのセンサを使用する方法を示す。
Abstract
中枢神経系の神経活動(CNS)は、アデノシン三リン酸(ATP)の分解によって提供される細胞エネルギーに対する高い需要を呼び起こす。ニューロンの電気的シグナル伝達によって劣化したプラズマ膜全体にイオン勾配を再設置するには、ATPの大きなシェアが必要です。アストロサイトは、高速電気信号自体を生成しない一方で、神経活動に応答してATPの産生を増加させ、それらにエネルギー代謝産物を提供することによって活性ニューロンをサポートするという証拠があります。異なる代謝産物に対する遺伝子コード化されたセンサーの最近の開発は、ニューロンとアストロサイト間のそのような代謝相互作用の研究を可能にするようになりました。ここでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を用いたマウス海馬および皮質の組織海馬および皮質の組織組織スライス培養におけるATP感受性蛍光共鳴エネルギー移転(FRET-)センサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、細胞外カリウムの増加や化学虚血の誘導(すなわち、細胞エネルギー代謝の阻害)に際して、ニューロンやアストロサイトにおける細胞ATPレベルの変化を動的に測定するために、このセンサをどのように用いることができるかを実証する。
Introduction
ニューロンの興奮的な電気活動は、主にその形質膜を横切るナトリウム(Na+)およびカリウム(K+)などのカチオンのフラックスに基づいています。このようにシグナリングには、これら2つのイオンの電気化学的勾配の維持が必要である。これは、細胞Na+/K+-ATPase(NKA)によって達成され、ユビキタスに発現する電気起源膜貫通ポンプであり、細胞外空間から2K+と引き換えに3Na+を細胞から押し出し、輸送サイクル1当たりのATPの1分子の消費を必要とする。NKAに加えて、血漿膜Ca2+-ATPアーゼを含むいくつかの他のATPを消費するイオントランスポーターがあり、これは細胞内Ca2+恒常性およびその輸出に続く活性誘発流入2に不可欠である。シナプス前小胞では、液疱型H+-ATPアーゼ(v-ATPアーゼ)は、このコンパートメント3への神経伝達物質の取り込みに必要なプロトン勾配を作成する。
ニューロンの活性は、このようにATP4のかなりの量を必要としますが、彼らはエネルギーの貯蔵のための重要な容量を示していません。代わりに、彼らは隣接するアストロサイト、脳5の主要なグリコーゲンストアとの代謝相互作用に依存しているようです。星値状グリコーゲンは確かに神経エネルギーの必要性をサポートする上で重要な役割を果たすることが示唆されている;そして、この提案された2つの細胞型間の神経代謝結合における重要な現象は、神経活動6、7、8に応答してATP産生を増加させるアストロサイトの能力である。アストロサイト-ニューロン乳酸シャトル(ANLS)として知られるこの仮説は、他の研究が刺激9、10に応答して糖上昇の独自の速度を増加させるかもしれないという証拠を提供しているので、まだ議論中であり、神経グリア相互作用を研究するためのさらなる方法とアプローチの必要性を反映している。
神経グリア代謝相互作用を解明するニューロンおよびアストロサイトにおける細胞エネルギー代謝およびATPレベルの研究は、脳組織における生細胞における代謝産物濃度の変化の検出に適したプローブの欠如によって長い間妨げられてきた。しかし、過去10年間、ATP、乳酸、ピルビン酸などのセンサーを含む、異なる代謝産物に対する新しいツールと新しい遺伝子コードされた蛍光プローブの開発が急増しました。これらのツールを用いて、細胞ATP消費および細胞エネルギーレベルの変化に関する質問に、単一細胞レベルおよび無傷の脳組織13における細胞型特異的な方法で直接対処することが可能となった。
本研究では、培養組織目細胞のニューロンおよびアストロサイト上の細胞性ATPダイナミクスを可視化する手順について説明する。我々は、数週間15年間細胞培養で維持することができるマウス脳のスライスのニューロンおよびアストロサイトにおいて、遺伝子コードされたATP-ナノセンサATeam1.03YEMK(14)の細胞型特異的発現にアデノ関連ウイルスベクター(AAV)を用いる方法を示す。培養組織スライスを覆うグリア瘢痕を除去する手順について説明し、これは下の組織組織層における細胞の光学的アクセシビリティおよびイメージングを改善する。最後に、ATeam1.03YEMKを使用して、この調製における細胞ATPレベルの変化のFRETベースのイメージングを実行する方法を示します。この方法は、外科的脳の処置を必要としない主な利点をホストし、培養された脳スライスにおけるセンサおよび細胞型特異性の高レベルの発現を提供し、他の方法と比較して細胞内の侵襲性またはストレスを低減し、エレクトロポレーションまたは他のウイルスベクター10、16、17とのトランスフェクションのような。さらに、このプロトコルは、ATP14に対して低い結合親和性を提供するATeam1.03の変異体の中でも、他のFRETベースのナノセンサに適用することができる。
Protocol
本研究は、ハインリヒ・ハイネ大学デュッセルドルフの制度ガイドラインと欧州共同体理事会指令(2010/63/EU)に厳密に従って行われた。組織学的な脳スライス培養を用いたすべての実験は、ハインリヒ・ハイネ大学デュッセルドルフの動物保護利用施設の動物福祉事務所に伝達され、承認された(制度行為番号:O50/05)。欧州委員会18の勧告に従って、生後10日までの動物は首切りによって殺された。
1. 乱視脳スライス培養(OTC)の準備
- 手順の前日または少なくとも30分前
- ペトリ皿を準備します(滅菌条件下で)。6ウェルプレートのふたを取り外し、OTC培地の800~850°Lを各ウェルに入れます。プレートは、必要になるまでインキュベーター(37°、5%CO2/95%O2)に入れておいてください。
- 洗浄ペトリ皿を準備します(滅菌条件下で)。30mmペトリ皿ごとに3mLのHBSSを加えます。1回の手順につき合計5枚の料理が必要です。インキュベーター(37°、5%CO2/95%O2)に少なくとも30分間、必要になるまで一晩置きます。
- ACSF (表 1) を準備します。次の日まで4°Cでブドウ糖なしで生理食リンを保ちます。
| サラインとメディア - 製剤 | ||||
| 名前 | 省略 形 | 組成 | 濃度 [mM] | コメント |
| 人工脳脊髄液溶液 | ACSF | 塩化 ナトリウム | 125 | 5% CO2/95% O2で気泡化 , pH 7.4 |
| Kcl | 2.5 | 常に使用の直前にブドウ糖を追加してください。 | ||
| CaCl2 | 2 | ブドウ糖で1日以上保存しないでください | ||
| MgCl2 | 1 | ~310 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| ナフコ3 | 26 | |||
| グルコース | 20 | |||
| 実験ACSF | E-ACSF | 塩化 ナトリウム | 136 | 5% CO2/95% O2で気泡化 , pH 7.4 |
| Kcl | 3 | 常に使用の直前にブドウ糖を追加してください。 | ||
| CaCl2 | 2 | ブドウ糖で1日以上保存しないでください | ||
| MgCl2 | 1 | ~320 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| ナフコ3 | 24 | |||
| グルコース | 5 | |||
| 乳酸 | 1 | |||
| 化学虚血溶液 | Cis | 塩化 ナトリウム | 136 | 5% CO2/95% O2で気泡化 , pH 7.4 |
| Kcl | 3 | ~318 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| ナフコ3 | 24 | |||
| 2、2-デオキシグルコース | 2 | |||
| NaN3 | 5 | |||
| 8 mM カリウム ACSF | 8 mM K+ ACSF | 塩化 ナトリウム | 128 | 5% CO2/95% O2で気泡化 , pH 7.4 |
| Kcl | 8 | ~320 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| ナフコ3 | 24 | |||
| グルコース | 5 | |||
| 乳酸 | 1 | |||
| ヘペス緩衝ACSF | H-ACSF | 塩化 ナトリウム | 125 | NaOHでpH 7.4に調整 |
| Kcl | 3 | 常に使用直前にブドウ糖を追加する | ||
| CaCl2 | 2 | ブドウ糖で1日以上保存しないでください | ||
| MgSO4 | 2 | ~310 mOsm/L(スクロースで調整) | ||
| NaH2PO4 | 125 | |||
| Hepes | 25 | |||
| グルコース | 10 | |||
| ハンクスのバランスのとれた塩溶液 | HBSS | シグマ(カタログ番号H9394)。 | ||
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩酸塩 | DPBS | ギブコ(カタログ番号14287-080) | ||
| オルガイピックカルチャーミディアム | OTC培地 | 熱不活化馬血清 | 20% | 34°C, 5 % CO2, pH 7.4, 培養条件下 |
| Mem | 79% | ~320 mOsm/L | ||
| L-グルタミン | 1 | |||
| インスリン | 0.01 mg/mL | |||
| 塩化 ナトリウム | 14.5 | |||
| MgSO4 | 2 | |||
| CaCl2 | 1.44 | |||
| アスコルビン酸 | 0.00125 % | |||
| D-グルコース | 13 |
表 1: ソリューションの構成
- 準備の日に、ACSFにブドウ糖を追加し、氷の上に置き、少なくとも30分間95%O2/5%CO2でバブリングを開始し、pHを7.4にします。
- 解剖とスライス
- 出生後6~8日にマウス(BalbC、男女とも)を急速な切断で犠牲にし、氷冷ACSFを含むガラスペトリ皿に頭を置きます。
- 背中から鼻骨の後先端まで皮膚を切ることによって頭蓋骨を露出させる。その後、外科的なはさみを使って、頭蓋骨をマグナムから慎重に切断し、脳を露出させる。
注:手順が機関のガイドラインに従っていることを確認します。 - 脳を取り除き、ACSFで満たされた氷冷ペトリ皿のフィルター膜に置きます。
- 半球を分離し、45°の角度で半腸の切断を行います。スーパーグルーでビブラートム組織ステージで1つの半球を修正します。すぐに氷冷ACSFを含むビブラートム浴に組織ブロックを移す(5%CO2/95%O2で気泡化)。最後に組織を整列させます。スライスするまで、氷冷 ACSF に 2 番目の半球を保持します。
- ビブラートを調整して250~400μmでスライスをカットすると、動物1匹につき約12スライス(400μm:~7スライス)が生成されます。
- スライスを切断した後(図1A)、その典型的な形態学的外観(図1)に基づいて海馬形成を同定し、皮下注射針(23ゲージ、1")を用いて単離し、海馬に隣接する大脳皮質の一部を維持する。
注:培養中に新皮質を保存することは、海馬の完全性を維持するのに役立ちます。しかし、海馬は必要に応じて皮質なしで単離し、培養することができる。 - すべてのスライスが収集されるまで、スライスをメッシュ上に温め、ACSF(34°C、5%CO2/95%O2で泡立てた)を入れ、スライスを配置します。
- スライスを層流キャビネットに移し、滅菌条件下で継続します。
図1:急性および組織図脳スライス製剤の代表的な伝送画像。広視野トランスルミシン顕微鏡を用いて12日間培養(B)に維持された急性単離性視座脳スライス(A)と視鏡下脳スライスの比較DG = 歯立回し;CA1/3 = 海馬の CA1/CA3 領域;E-CTX = 内皮質;CTX = (ネオ)皮質。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. スライスの培養
- ACSFからスライスを、反転滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、滅菌ハンクの塩溶液で満たされた予め温めたペトリ料理の1つにゆっくりと移します。
注:組織の殺菌は希釈によって達成される(ステップ3.2)。できるだけ少ないACSFをペトリ皿に移します。 - ピペットを変更し、スライスを2番目のペトリ皿に移します。全体で5回このプロセスを繰り返します。以下のペトリ料理にできるだけ少ないHBSSを転送します。
- カルチャ挿入の上部に、一度に 1 つのスライスをゆっくりと配置します。スライスごとにこのプロセスを繰り返します。ピペットの乱気流を避け、パスツールピペットの先端までスライスが下降するまで待ちます。1つの膜に最大4つのスライスを置く。
- 細かい先端を使用して、挿入物の上部から余分なハンクの溶液を慎重に取り除きます。
- ガス(カルボゲン、95%O2/5%CO2)と液体との界面で、実験当日まで37°Cのインキュベーターに培養物(図2)を入れておく。2~3日ごとに培地を交換してください。
図2:遺伝的にコードされたセンサATeam1.03YEMKを用いた培養組織図脳スライスにおけるFRETベースのATPイメージングの原理本研究で提示したプロトコルの概略表現簡単に言えば、1〜3日間培養したパラサギトアル組織組織分スライスは、アデノ関連ウイルスベクターのいずれか、アストロサイト特異的hGFAP−またはニューロン特異的hSynプロモーターおよびATeam1.03YEMKの発現のための配列のいずれかで形質転換される。これらのベクターの希釈アリコート(1:2-1:4)は、スライスの上部に直接塗布され、少なくとも6日間培養条件下で維持されます。細胞内ATPレベルの変化は、434 nmで励起し、527(アクセプター)および475(ドナー)nmで同時に蛍光発光を獲得することによって、センサーを発現する細胞で可視化することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
3. アデノ関連ウイルスベクターを用いたATPセンサの発現 (図2)
注:遺伝子組み換え生物の取り扱いに関するすべての要件を満たしていることを確認してください!
- ウイルスベクターを処理するために、アリコートアデノ関連ウイルスベクター(AAV2/5)を1〜2μLで繰り返し凍結および解凍することを避ける。アリコートは-80°Cで保管してください。
- 10%漂白剤を含むフラスコを滅菌ベンチに置き、ベクターに接触した使用済み残留物質をすべて廃棄します。
- 形質導入の場合は、DPBSの2~3μLでベクトルの1μLの希釈を準備します。ストックソリューションは、通常、mLあたり1012のウイルスゲノム(vg/mL)の大きさで物理的な力を示します。
- 培養したスライスを含むインサートを滅菌フードに移します。
- 組織に触れることなく、希釈したベクターの0.5°Lを各スライスの上部に直接塗布します。
注:組織のより深い層におけるより良い発現は、インビトロ(DIV)で1〜3日で培養スライスを形質転換することによって得られる。古い培養物の形質転換は、それぞれ周囲のグリア瘢痕内の細胞の主要な発現またはニューロンの低発現をもたらす可能性がある。 - 最後に、スライスをインキュベーターに戻し、少なくとも6日間維持します。転起当日に培地を変更しないでください。
4. グリア瘢痕の除去 (図 3)
- 実験を開始する直前に、培養したスライスを含むインサートを滅菌フードに移し、OCT培地またはMEMを1mL含む30mm皿に入れます。
- ステレオスコープの下に皿を置き、スライスの表面に焦点を当てます。
- 2本の滅菌皮下注射針(23G,1")を使用して、選択したスライスの狭い縁に短いクロスカットを行います(図3)。この手順では、グリアスカーによって作成されたサーフェスの張力が解放され、リトラクトが引き込まれ、基になるレイヤが露出します(図 5参照)。
注:第1の組織層(グリア瘢痕)は、主に反応性アストロサイトによって形成される。広視野イメージングでは、この緻密な組織層は、光の追加の散乱をもたらし、ぼやけた画像をもたらす。瘢痕を除去することは、適切な組織組織を含むより深い層のより良い可視性を得るために有利である。したがって、このカットは、スライス調製のエッジと上層でのみ排他的に実行し、下の組織を損傷しないように注意してください。グリア傷跡を持つOTCで得られたデータと、傷跡のないOTCからのデータの違いは観察されませんでした(データは示されていません)。 - 準備したスライスを挿入から削除します。この場合、無菌メスを使用し、膜に直平行なカットを行い、ピンセットで膜の縁を保持しながら、中央にスライスを持つ正方形または三角形を形成することによって、それを切除します。挿入で追加のスライスがホストされている場合は、元のプレートとインキュベーターに戻します。媒体の表面張力は膜の表面への漏出を防ぐ。
図3:グリア瘢痕の機械的除去の概略図図は、グリア瘢痕(青みがかった楕円体)で覆われた海馬のスライス培養を示しています。培養の最も小さい極とグリアの傷跡(青い破線)の端にある2本の注射針の先端を一度にせん断することで、傷跡は脇にひっくり返ります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
5. FRET ベースの ATP イメージング (図 4)
- 実験の前に、E-ACSFを準備し、少なくとも30分間95%O2/5%CO2で泡立て、7.4のpHを得た。モノクロメータの蛍光光源(キセノンランプ)のスイッチを入ります(図4)。インキュベーターからスライスを取り出す直前に灌流を開始します。
注:実験全体の間、生理線を95%O2と5%CO2で泡立て続けます。 - 蠕動ポンプを使用して、常に新鮮な軟骨化E-ACSFで浸透している実験室にスライスを移す(図4)。次に、グリッドを使用してスライスを修正します。チャンバーを顕微鏡ステージに置き、灌流システムを接続します。灌流にはガス防止ラボチューブをお勧めします。
注:実験は、実験計画に応じて、室温または生理学的温度付近で行うことができます。灌流の安定性と信頼性を確認して、組織の動きやせん断応力の変化によって引き起こされる焦点の変化を避けます。私たちと他の多くの実験室によって使用されるスライス作業のための標準的な灌流速度は1.5-2.5 mL/分である。
図4:FRETイメージング設定の構成(A) FRET イメージング設定に必要なさまざまなコンポーネントとその空間配置の概略図。この配置は、キセノンランプを光源とするモノクロメータ、直立固定段顕微鏡(1)、画像分割システム(2)、タイムラプス記録用のデジタルCCDまたはCMOSカメラ(3)、および安定した一定灌流に適応した実験用浴(4)からなる。浴灌流は調節可能な流動率が付いている蠕動ポンプによって実現される。(B) 実験ワークスペースの画像。FRETイメージングセットアップは、実験浴が埋め込まれたx/Y翻訳ステージを持つ振動減衰テーブルに取り付けられています。番号: (A) を参照してください。(C) モノクロメータからデジタルカメラへの光経路の概略図。示された異なるフィルタとダイクロイックミラーの位置です。番号: (A) を参照してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 透過光を使用して、培養したスライスを焦点にします。実験が行われる領域を特定する(例:海馬のCA1領域)。イメージング実験を開始する前に、スライスが生理線の状態に適応できるように少なくとも15分間待ちます。実験用セットアップの構成については、図4を参照してください。
- カメラとイメージングソフトウェアの電源を入れます。次に、適切なフィルタ キューブを選択します。
- ドナー蛍光タンパク質(eCFP)を435/17nm(〜435nm)で励起する。露光時間を 40 ~ 90 ミリ秒の間で設定します。
注:蛍光灯へのスライスの強い暴露は、光毒性効果をもたらす可能性があります。 - 435 nmでの励起は、475 nm(eCFP;ドナー)と527 nm(金星;アクセプタ)の両方で発光をもたらす。蛍光発光を500nmで発光画像スプリッタで分割し、483/32および542/27のバンドパスフィルタを使用して、ドナーとアクセプタ蛍光をさらに分離します。強い発現は、検出器の飽和をもたらす可能性があります。この場合、励起の強度を減らすために中性密度フィルタを使用できます。
- 背景減算のために明らかに細胞蛍光を欠いている対象領域(ROI)を選択します。次に、細胞体を剥離する ROIs を作成します。
- 画像取得の頻度と全体的な記録時間を設定します。長時間(>30分)の実験では、光毒性を防ぐために0.2~0.5Hzの集録周波数を推奨します。
- 録音を開始します。調製物の安定性を確保するために、ベースライン条件下で少なくとも5分を記録することをお勧めします。
注:必要に応じて、記録中にセルのフォーカスを調整します。 - 細胞内ATPの変化を誘導するために、標準ACSFから代謝阻害剤を含む生理食べ物に灌流管を移す(例えばCIS、下記表1及び参照)。あるいは、カリウム濃度が上昇した生理積線を使用して、活性ニューロンからのカリウムの放出を模倣する。
注:浴灌流による適用は、世界的に全体の準備に作用する比較的遅いプロセスです。新しいソリューションが実際に実験風呂に入り始めた時間を書き留めておきます。チャンバーと生理食合いの貯水池間の距離、ならびに灌流の速度に応じて、遅延時間を考慮する必要があります。
6. セルラーAチーム蛍光の高解像度ドキュメンテーション
- 記録の直後に、スライス培養物を含む記録室を共焦点レーザースキャン顕微鏡に移す。
注:特別な注意を払う。写真の損傷の可能性があるため、実験後にのみこの手順を実行してください。文書化のために、E-ACSF を H-ACSF と交換することができます。したがって、灌流システムは必ずしも必要ではありません。 - 指定された光学式構成で可能な限り高い z 解像度で Z スタックを使用します。
- デコンボリューション アルゴリズムを適用して、画像の解像度を高める。
Representative Results
AAVベクターは、生体組織16内の細胞において外来遺伝子を選択的に発現させる信頼性の高いツールである。ATeam1.03YEMKのシーケンスカセットと特定のプロモーターを含むAAVの直接適用は、選択されたセルタイプのセンサの高発現をもたらす。DIV 14(転移後〜10日後)において、ヒトシナプスインプロモーターの下でATeamを発現するニューロンは、スライス表面の下に最大50μmの深さで培養組織スライスのネオコルテックスにおいて高密度で発見される(図5A)。海馬で同等の結果を得ることができます (図 5B)。
図5:培養視鏡下組織組織脳スライスにおけるATeam1.03YEMKを発現するニューロンの可視化左側の画像は、海馬組織の70個の光学切片(A)と(B)の43個の光学切片(それぞれ1.05μm)の拡張焦点突起に対応しています。右側のイメージは、同じ投影法のボリューム ビューを表します。セルは、右側のカラー スケールで示されているように、スライス サーフェスに対する深さに応じて色分けされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
アストロサイトにおけるATPレベルの測定のために、ATeam1.03YEMKはヒトグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターの制御下で発現される。これにより、培養組織スライスのネオコルテックスと海馬の両方における細胞の効率的な伝達をもたらす(図6)。特に、スライス調製物の表面に対する深さに応じて、2つの異なる形態表現型を区別することができる。第1の表表面層において、細胞は、主に表面に平行に配置された厚い一次プロセスによって特徴付けられる。これらの細胞は強く重なり合うドメインを示し、明らかに反応性のアストロサイトの緻密なメッシュワークを作り出す(図6)。より深い層(表面から30〜60μm)では、形質誘導アストロサイトは、大部分が球状ドメインを形成する微細な細胞プロセスを示し、その形態は、先に報告したように、その上皮のアストロサイトの形態に似ている(図6)。より深層アストロサイトのより良い伝達を得るために、また、これらのより深い層へのより良い光学アクセスを得るために、グリア瘢痕組織は、ステップ4で説明したように除去することができる。
図6:培養した視鏡組織体細胞におけるATeam1.03YEMKを発現するアストロサイトの可視化左側の画像は、191個の光学セクション(それぞれ0.45μm)の拡張焦点投影に対応しています。説明のために、グリア瘢痕はアストロサイトの投影から除外された。右側の画像は、グリア瘢痕を除去する前後の同じ投影のボリュームビューを表します。セルは、右側のカラー スケールで示されているように、スライス サーフェスに対する深さに応じて色分けされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ATeam1.03YEMKの発現に成功すると、使用されるプロモーターに応じて、ニューロンまたはアストロサイトにおけるATPレベルの変化を動的に測定することができます(上記参照)。実験は、E-ACSF(95%O 2/5%CO2で気泡化)で絶えず浸透した実験浴中で行った。海馬ニューロンでATeam1.03YEMKを発現する組織学的スライスでは、記録を開始する前に目的の領域(ROI)が選択され、ピラミッド細胞のソマタを表す(図7A)。また、背景減算の領域を選択しました (図 7A)。その後、金星とeCFP蛍光の発光をこれらのROIごとに別々に収集し、時間の経過とともに蛍光発光レベルとして描いた(図7B)。安定したベースラインを確保するために数分間制御条件下で蛍光を記録した後、スライス調製物をグルコースフリー生理食用に曝露することにより細胞代謝を抑制し、これに5mMアジ化ナトリウム(NaN3)を1分間添加した(図7B)。この操作は、FRET対の発光強度(図7B、左パネル)の逆の変化を誘発し、金星(527nm)の減少およびeCFP(475 nm)放出の増加を伴う。金星の蛍光発光をeCFP(F金星/FeCFP)とで割ってFRET比を算出すると、細胞内ATPレベルの相対的な変化を反映するシグナル、いわゆる「ATeam FRET比」(図7B、右パネル)が生じた。全ての記録されたニューロン(N=5スライス中のn=70細胞)において、NaN3はATeam FRET比において可逆的な減少を引き起こし、細胞代謝の阻害時に細胞内ATPレベルの可逆的な低下を示す。
図7:タイムラプスATeam FRET比イメージングのデモンストレーション(A)左上:培養した組織分海海馬スライスのCA1領域のピラミッド層および層ラジタムの広視野蛍光画像をニューロンでATeam1.03YEMKを発現する。右上: 左側に示すように、ボックス化されたセクションの拡大表示。白い線は、(B)で分析のために選択されたCA1ピラミッドニューロンの細胞体を表す目的領域(ROI)1-3を表す。BG は、バックグラウンド補正用に選択された ROI を表します。下: 金星(緑)、eCFP(紫色)および金星/eCFPの比率の蛍光発光を表す擬似色画像。(B) ROI 1-3 でのタイムラプス記録は、神経細胞体を表す(Aを参照)。左側の痕跡は、金星(緑)とeCFP(マゼンタ)の正規化された蛍光発光を示す。右側のトレースは、対応する ATeam FRET 比を示しています。なお、細胞外グルコースが1分間存在しない場合に5mMNaN3を用いた灌流(灰色バー)は、ATeam FRET比の可逆的な減少を誘発し、細胞内ATP濃度の低下を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
長期的な実験条件下での調製物およびセンサの安定性を確保するために、ニューロンまたはアストロサイトでATeamを発現するスライスは、常にACSFと長期間にわたって融合された(>50分;n=12細胞、3つの脳から3つのOTC)。このような状況では、ATeam FRET比は変わりません(図8)。代謝阻害剤を含むCIS(「化学的虚血」、「表1参照」)に調製物を曝露すると、対照的に、再び上記で観察したようにATeam FRET比の期待される低下をもたらした。
図 8: ATeam を用いたベースライン実験ニューロン(上)およびアストロサイト(下)のベースライン条件下で14種類の細胞における長期ATeam FRET比イメージング。データは、他の実験データと同等の条件下で採取した。各測定の終わりに、化学的虚血は、矢印で示されるCISとの灌流によって引き起こされた。注: ベースライン ATeam FRET 比は、ベースライン条件下で時間の経過と同じ時間の経過と同じ安定性に基づく安定しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
次に、ATeam1.03YEMKを発現するニューロンおよびアストロサイトの応答を、細胞外カリウム濃度の上昇に分析した。安定したベースラインを確立した後、ニューロンを3分間3mMから8mMに増加させた生理積糸を用いた(図9A)。ただし、この操作では、ATeam FRET 比 (N = 5 スライスの 56 セル) が検出可能な変化を起こさなかった。センサーがATPレベルの変化に反応することを確実にするために、スライスは再びCISによってE-ACSFを置き換えることによって引き起こされる化学虚血の持続期間にさらされた。化学的虚血は、ATeam FRET比が新しい安定したレベルに急激に低下し、2~3分後のATPの名義枯渇を示す(図9A)。
図9:ニューロンおよびアストロサイトにおけるATPレベルの変化を示す代表的な実験。(A,B): 左の画像は、組織分スライスの海馬CA1領域に位置するニューロンおよびアストロサイトからのATeam蛍光を示す。右側のトレースは、単一のセル本体上に配置された ROI から得られた ATeam FRET 比のタイムラプス記録を表します。両方の実験において、スライスはまず細胞外カリウム濃度の3分間の増加を行い(barを参照)、続いて化学的虚血への最終的な暴露を行った。なお、ニューロンは細胞外カリウム(A)の上昇に反応しないが、アストロサイトはATP(B)の増加と反応する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ATeam1.03YEMKをアストロサイトで発現させたスライスでも同じ実験プロトコルを行った。ニューロンで観察されたものとは対照的に、ATeam FRET比の可逆的な増加による細胞外カリウムの増加に反応したアストロサイトは、細胞内ATPレベル(N=5スライス中のn=70細胞)の増加を示す(図9B)。その後の化学的虚血への曝露は、予想通り、ATeam FRET比の大きな低下において、細胞内ATPの名目枯渇を示す(図9B)。
Discussion
ここでは、マウス脳15の組織スライス培養におけるアストロサイトまたはニューロンにおけるATPレベルの変化を測定するための、FRETベースの遺伝子コード化ナノセンサ14であるATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関する手順を示す。例示的な記録では、細胞外カリウム濃度の上昇はニューロンのATP濃度の変化をもたらさない一方で、この操作に応答して星値ATPレベルが上昇することを示す。さらに、我々の結果は、細胞代謝の阻害に際して、ATeam1.03YEMK FRET比が両方の細胞型で急速に低下し、細胞内ATPの急速な減少を示す。
組織分スライス培養におけるATeam1.03YEMKの発現は、少なくとも7〜10日間制御された条件下で培養中の組織の維持を必要とする。あるいは、ATeam1.03YEMKは、急性単離脳組織スライスおよびマウス13、15の視神経におけるATPの測定にも採用することができる。しかし、急性単離組織での測定には、トランスジェニック動物の生成やウイルスベクターの脳への立体的な応用が必要であり、動物実験と厳格な動物ケアプロトコルが含まれる。この点に関して、組織組織スライス培養におけるATeam1.03YEMK発現は、有用かつ貴重な代替22、23を表す。長年にわたり、組織組織スライス培養は、神経特性、接続性および発達を研究するための確立されたモデルシステムとして機能する。それらは、一般的な組織アーキテクチャと積層(図1)を維持するだけでなく、優れたアクセシビリティや実験条件の直接制御などの細胞培養物の優遇特性をホストする。組織組織スライス培養物はまた、ウイルスベクター27を用いて外来遺伝子を発現させるために日常的に用いられ得る。いくつかのタイプのウイルスベクターが脳組織16、28にトランスジーンを送り出することが報告されている。アデノウイルスベクターはグリア細胞において高発現を誘導するが、海馬ニューロン16は誘導せず、グリア反応性17を発生させ得る。ここで使用されるアデノ関連ウイルスベクターは、良好な代替15として出現し、その有効性はvivo29においても示されている。
主に神経特性の研究に使用されている一方で、最近の研究では、組織組織スライス培養物もアストロサイトの分析に用いることができることが確立されています。培養スライスは、通常、反応性アストロサイト19、30(図5)の層で覆われているが、アストロサイトはより深層19、30においてよりネイティブで非反応性の形態および細胞構造を示す(図5)。本研究では、外グリア瘢痕の機械的除去の手順を説明し、適切な組織学的組織層内の天然アストロサイトのより良い実験的および光学的アクセシビリティをもたらす。さらに、その除去は、組織図スライスのより深い層における発現の有効性を改善する。グリア瘢痕が除去されない場合、AAVによる伝達は表面的な細胞層に制限される傾向がある。
組織スライスで実験を行う際には、いくつかの外部機械的要因を考慮する必要があります。浴灌流速度の変動は、調製物全体の動きを誘発し、焦点の変化を誘発し、センサー信号の人工的な過渡変化をもたらす可能性があります。また、アストロサイトとニューロンの両方が、高い灌流率32、33によって課されるような機械的変形に応答することが報告されている。私たちの手では、信頼性の高い蠕動ポンプを使用して、組織と目的(メニスカス)の間の小さく安定した量の生理食合いを維持すると共に、ここで使用される灌流速度(1.5-2.5 mL/min;)図 8)。
本研究では、ATeam1.03YEMKを用いたFRETベースのイメージングを用いて、ニューロンおよびアストロサイトのATPレベルをモニタリングするために採用できることも実証した。細胞ATPの測定のために先に導入された代替手段は、いわゆるルシフェリン-ルシフェラーゼアッセイ34、35、36、37である。しかし、このアプローチは生物発光のイメージングに基づいており、バックグラウンドノイズレベルが高いため、かなり低い時間的および空間的な分解能を提供するだけです。近年日常的に採用されている別の方法は、イオン感受性フルオロフォアマグネシウムグリーン38、39、40を用いた細胞内マグネシウム濃度の変化のイメージングであった。このアプローチは、ATPの消費が同因子マグネシウムの放出をもたらすという観察に関連する。マグネシウムグリーンによるイメージングは、ATPレベルの変化の二次的な推定値を提供するだけです。また、マグネシウムグリーンは細胞内カルシウムの変化にも敏感であり、この方法で得られた結果を解釈する際に別の困難を引き起こしている。
細胞代謝産物の直接イメージングのための遺伝子コードされたナノセンサの最近の開発は、したがって、大きな前進11、12を表した。細胞内ATP 36、41、42、43の測定に用いることができるいくつかの異なるセンサが生成された。その中には、比率測定蛍光ATP指標「QUEEN」41とPercevalHRが含まれており、ATP:ADP比42を感知する。後者のプローブは、細胞のエネルギー状態を研究するための貴重なツールですが、pH42の変化を同時に測定する必要があります。
ATeam は、ATP14に対する結合親和性が異なるいくつかのバリアントが存在するナノセンサーです。インビトロでは、ATeam1.03YEMKは、視床下部および小脳34から海馬37、44、45に至るまで、異なる神経細胞型で決定される細胞ATPレベルに近い37°Cで1.2mMのKdを示す。キュベット測定では、温度を10°C下げると、ATeam1.03YEMKとATPの結合親和性が有意に低下し、室温14での細胞イメージングには理想的ではない可能性が示唆された。しかしながら、我々の以前の研究15は、異なる操作に対するニューロンおよびアストロサイトで発現されるATeam1.03YEMKの挙動および応答が生理学的および室温で類似していることを実証し、センサーが両方の条件下で細胞内ATPレベルの確実な決定を可能にすることを示した。さらに、これまでの実験では、細胞15内で発現するATeam1.03YEMKのpH感受性に対処し、細胞内pHの変化に対して約0.1〜0.2pH単位で感受性が低いことが示された。低mM範囲のKdが懸念される場合、代替ATeamバリアントは14を使用する可能性があり、その中でもATeamの赤シフトバリアント(「GO-ATeam」)43 。
ATeam1.03YEMKを用いた実験では、細胞外カリウム濃度が数mM(3~8mM)だけ増加すると、組織図スライス培養におけるアストロサイトにおけるATeam1.03YEMK比が一時的に増加することが実証されています。この観察は、以前の研究15、46を確認し、アストロサイトがATP産生の増加に伴う活性ニューロンによるカリウムの放出に反応することを明確に示し、主にNa + /K+-ATPaseおよびNa+/HCO3-共輸送体の刺激の結果として、それぞれ47、48。これとは対照的に、ニューロンは応答を示さなかったが、これは以前の作品と同様に15.しかしながら、両方の細胞型は、15日前に示すように細胞糖上昇およびミトコンドリア呼吸の阻害に迅速かつ強く反応した。化学虚血の条件下では、ATeam FRET比は新しい安定したレベルに低下し、細胞ATPの名目枯渇を示す。後者の結果は、両方のニューロンとアストロサイトがシナプス活性化または神経伝達物質の適用によって追加の刺激なしに定常状態条件下でもATPの関連する消費を示すことを示唆している。まとめると、遺伝的にコードされたナノセンサを用いたFRETベースのイメージングは、その中でもATeam1.03YEMKが、異なる条件下で細胞内ATPレベルと細胞ATP消費の変化を引き起こする細胞プロセスを解明するための貴重なアプローチを提供すると結論付ける。
Disclosures
著者たちは競合する利害関係を宣言しない。著者らは、ビデオ記事で使用される楽器を生産するニコン顕微鏡ソリューションズ、デュッセルドルフ、ドイツによるオープンアクセス出版を可能にする財政的支援を受けました。同社は、ここで提示された実験の設計にも、その実行にも、データ処理にも、原稿の執筆にも関与しませんでした。
Acknowledgments
著者たちは、クラウディア・ロデリゴとシモーネ・デュリーに専門家の技術支援を感謝したいと考える。ニクラス・J・ゲルカウ博士とジョエル・ネルソンM.Scは、オルガオティピック・スライス文化の準備に協力してくださったことに感謝します。著者の研究室での研究は、ドイツ研究協会(DFG;2795 の場合: Ro 2327/13-1 および SPP 1757: Ro 2327/8-2 から CRR;SPP 1757: RL へのヤング グリアスタートアップ資金)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
| 36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
| Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
| band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
| Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
| Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
| D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
| HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
| HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
| Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
| Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
| Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
| IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
| Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
| L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
| Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
| Microscope stage | custom build | ||
| Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
| Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
| Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
| NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
| Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
| WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |
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