Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging af intracellulære ATP i Organotypic væv skiver af muse hjernen ved hjælp af FRET-baseret sensor ATeam 1,03Yemk

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60294
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en protokol for celle-typespecifikke udtryk for den genetisk kodede FRET-baseret sensor ATeam 1.03Yemk i organotypiske skive kulturer af musen forhjernen. Desuden viser vi hvordan man bruger denne sensor til dynamisk billeddannelse af cellulære ATP-niveauer i neuroner og astrocytter.

Abstract

Neuronal aktivitet i centralnervesystemet (CNS) fremkalder en stor efterspørgsel på cellulære energi, der leveres af nedbrydningen af adenosin trifosfat (ATP). En stor del af ATP er nødvendig for at re-installere ion gradienter på tværs af plasma membraner forringet af elektrisk signalering af neuroner. Der er tegn på, at astrocytter-selv om det ikke genererer hurtige elektriske signaler selv-undergår øget produktion af ATP som reaktion på neuronal aktivitet og støtte aktive neuroner ved at give energi metabolitter til dem. Den seneste udvikling af genetisk kodede sensorer til forskellige metabolitter gør det nu muligt at studere sådanne metaboliske interaktioner mellem neuroner og astrocytter. Her beskriver vi en protokol for celletype specifikt udtryk for ATP-følsom fluorescens resonans energioverførsel-(FRET-) sensor ATeam 1,03Yemk i organotypic vævs skive kulturer af musen hippocampus og cortex ved hjælp af adeno-associerede virale vektorer (AAV). Desuden viser vi, hvordan denne sensor kan anvendes til dynamisk måling af ændringer i cellulære ATP-niveauer i neuroner og astrocytter efter stigninger i ekstracellulært kalium og efter induktion af kemisk iskæmi (dvs. en hæmning af cellulære energimetabolisme).

Introduction

Excitatoriske elektriske aktivitet af neuroner er i vid udstrækning baseret på flux af kationer såsom natrium (na+) og kalium (K+) på tværs af deres plasma membraner. Vedligeholdelse af de elektrokemiske gradienter af disse to ioner er således påkrævet for signalering. Dette opnås ved cellulær na+/k+-ATPase (nka), en allestedsnærværende udtrykt elektro gen transmembran pumpe, som ekstrudere 3 na+ ud af cellen i bytte for 2 K+ fra det ekstracellulære rum, der kræver forbrug af et molekyle af ATP pr. transport cyklus1. Ud over NKA er der flere andre ATP-forbrugende iontransportører, herunder plasma membranen ca2 +-ATPase, hvilket er afgørende for intracellulær ca2 + homøostase og dets eksport efter aktivitets induceret tilstrømning2. I præsynaptiske vesikler skaber en vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) den protongradient, der er nødvendig for neurotransmitter optagelsen i dette rum3.

Mens aktiviteten af neuroner derfor kræver en betydelig mængde ATP4, de ikke udviser en betydelig kapacitet til oplagring af energi. I stedet, de synes at stole på metaboliske interaktioner med tilstødende astrocytter, de store glykogen butikker i hjernen5. Det er blevet antydet, at astrocytisk glykogen faktisk spiller en vigtig rolle i at støtte neuronal energibehov; og et centralt fænomen i denne foreslåede Neuro-metaboliske kobling mellem de to celletyper er astrocyternes kapacitet til at øge deres ATP-produktion som reaktion på neuronal aktivitet6,7,8. Denne hypotese, kendt som astrocyte-neuron laktat shuttle (anls), er stadig under debat, fordi andet arbejde har givet bevis for, at neuroner også kan øge deres egen sats af glycolyse som reaktion på stimulation9,10, afspejler nødvendigheden af yderligere metoder og tilgange til at studere Neuro-glia interaktion.

Undersøgelse af cellulære energimetabolisme og ATP niveauer i neuroner og astrocytter til at belyse Neuro-glia metaboliske interaktioner har længe været hæmmet af manglen på egnede sonder til påvisning af ændringer i metabolit koncentrationer i levende celler i hjernevæv. Det sidste årti har imidlertid givet en kraftig stigning i udviklingen af nye værktøjer og nye genetisk kodede fluorescerende sonder for forskellige metabolitter, herunder sensorer til ATP, lactat, pyruvat og andre11,12. Ved hjælp af disse værktøjer, er det nu muligt at direkte behandle spørgsmål relateret til cellulære ATP forbrug og ændringer i cellulære energi niveauer på enkelt celleniveau og i en celle-type specifik måde i intakt hjernevæv13.

I det nuværende arbejde, beskriver vi en procedure for at visualisere cytosolisk ATP dynamik på neuroner og astrocytter af dyrkede organotypiske hjernen skiver. Vi viser, hvordan man ansætter adeno-associerede virale vektorer (AAV) for celle-type specifikt udtryk for den genetisk kodede ATP-Nanosensor ATeam 1.03Yemk (14) i neuroner og astrocytter af skiver af muse hjernen, der kan opretholdes i cellekultur i flere uger15. En procedure for, hvordan man fjerner det gliale ar, der dækker dyrkede vævs skiver, er beskrevet, hvilket forbedrer optisk tilgængelighed og billeddannelse af celler i de organotypiske vævs lag nedenunder. Endelig viser vi, hvordan ATeam 1.03Yemk kan bruges til at udføre fret-baseret billeddannelse af ændringer i cellulære ATP-niveauer i denne forberedelse. Denne metode er vært for de store fordele, at det ikke kræver kirurgiske hjerne procedurer, giver høje niveauer af ekspression af sensoren og celletype specificitet i dyrkede hjerne skiver, reducere invasivitet eller stress i cellerne sammenlignet med andre metoder, ligesom transfektering ved elektro poration eller transduktion med andre virale vektorer10,16,17. Desuden kan denne protokol anvendes på andre FRET-baserede nanosensorer, blandt dem varianter af ATeam 1.03, der giver lavere bindingsaffinitet for ATP14.

Protocol

Denne undersøgelse blev gennemført i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra Heinrich Heine-universitetet i Düsseldorf og fra Det Europæiske Fællesskabs rådsdirektiv (2010/63/EU). Alle forsøg med anvendelse af organotypiske hjerne skive kulturer blev kommunikeret til og godkendt af dyrevelfærds kontoret ved den af Heinrich Heine University Düsseldorf omhandlede dyrepleje-og brugs facilitet (institutionel akt nummer: O50/05). I overensstemmelse med henstillingerne fra Europa-Kommissionen18blev dyr på op til 10 dage dræbt ved halshugning.

1. forberedelse af Organotypiske Brain Slice kulturer (OTCs)

  1. Dagen før eller mindst 30 minutter før proceduren
    1. Forbered Petri skålen (under sterile forhold). Fjern låget på 6-brønd pladen og Placer 800-850 μL OTC-medium i hver brønd. Opbevar pladen i inkubator (37 °C, 5% CO2/95% O2), indtil det er nødvendigt.
    2. Tilbered vaske Petri skålene (under sterile forhold). Tilsæt 3 mL HBSS til hver 30 mm Petri skål. Der kræves i alt 5 retter pr. procedure. Placer dem i inkubator (37 °C, 5% CO2/95% O2) i mindst 30 minutter — natten over, indtil det er nødvendigt.
    3. Forbered ACSF (tabel 1). Opbevar saltvand uden glucose ved 4 °C indtil næste dag.
Salines og medie formulering
Navn Forkortelse Sammensætning Koncentration [mM] Kommentarer
Kunstig cerebrospinalvæske opløsning ACSF Nacl 125 Bukkede med 5% CO2/95% O2, pH 7,4
KCl 2,5 Tilsæt altid glukose lige før brug.
CaCl2 2 Må ikke opbevares i mere end en dag med glucose
MgCl2 1 ~ 310 mOsm/L
NaH2po4 1,25
NaHCO3 26
Glukose 20
Eksperimentel ACSF E-ACSF Nacl 136 Bukkede med 5% CO2/95% O2, pH 7,4
KCl 3 Tilsæt altid glukose lige før brug.
CaCl2 2 Må ikke opbevares i mere end en dag med glucose
MgCl2 1 ~ 320 mOsm/L
NaH2po4 1,25
NaHCO3 24
Glukose 5
Laktat 1
Kemisk iskæmi opløsning Cis Nacl 136 Bukkede med 5% CO2/95% O2, pH 7,4
KCl 3 ~ 318 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
NaH2po4 1,25
NaHCO3 24
2, 2-deoxyglucose 2
NaN3 5
8 mM kalium ACSF 8 mM K+ acsf Nacl 128 Bukkede med 5% CO2/95% O2, pH 7,4
KCl 8 ~ 320 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
NaH2po4 1,25
NaHCO3 24
Glukose 5
Laktat 1
Hepes-Buffered ACSF H-ACSF Nacl 125 Justeret til pH 7,4 med NaOH
KCl 3 Tilsæt altid glukose lige før brug
CaCl2 2 Må ikke opbevares i mere end en dag med glucose
MgSO4 2 ~ 310 mOsm/L (justeret med saccharose)
NaH2po4 125
Hepes 25
Glukose 10
Hanks ' balanceret salt opløsning HBU'ERNE Sigma (katalognummer H9394).
Dulbecco's fosfat-bufferet saltvand DPBS Gibco (katalognummer 14287-080)
Organotypisk kultur medium OTC-medium varme inaktiveret heste serum 20 34 °c, 5% Co2, pH 7,4, under dyrkning condition
Mem 79% ~ 320 mOsm/L
L-glutamin 1
Insulin 0,01 mg/mL
Nacl 14,5
MgSO4 2
CaCl2 1,44
Ascorbinsyre 0,00125%
D-glucose 13

Tabel 1: sammensætning af opløsningen.

  1. På dagen for forberedelsen, tilsæt glukose til ACSF, Placer det på is og start boblende med 95% O2/5% Co2 i mindst 30 min at resultere i en pH-værdi på 7,4.
  2. Dissektion og udskæring
    1. Ofrer musen (balbc, begge køn) på postnatal dage 6 til 8 ved hurtig hugning og placere hovedet i en glaspetri skål indeholdende iskold acsf.
    2. Udsæt kraniet ved at skære huden fra bagsiden til den bageste spids af næse knoglen. Derefter skærer du forsigtigt kraniet fra foramen magnum ved hjælp af en kirurgisk saks og udsætter hjernen.
      Bemærk: Kontroller, at proceduren er i overensstemmelse med institutionens retningslinjer.
    3. Fjern hjernen og Placer den på en filtermembran i en iskold Petri skål fyldt med ACSF.
    4. Adskil halvsfærerne og Udfør en parasagittal-udskæring i en vinkel på 45 °. Fix en halvkugle på vibratome væv fase med superlim. Straks overføres vævs blokken til det vibratome bad, der indeholder iskold ACSF (bukkede med 5% CO2/95% O2). Endelig justere vævet. Hold den anden halvkugle i iskold ACSF indtil udskæring.
    5. Juster vibratomet for at skæreskiver ved 250-400 μm. skæring på 250 μm vil give ca. 12 skiver pr. dyr (400 μm: ~ 7 skiver).
    6. Efter skæring af skive (figur 1A), identificere den hippocampale dannelse baseret på dens typiske morfologiske udseende (figur 1) og isolere det ved hjælp af hypodermic nåle (23 gauge, 1 "), holde den del af hjernebarken støder op til hippocampus.
      Bemærk: Bevarelse af neocortex mens dyrkning hjælper med at bevare integriteten af hippocampus. Dog kan hippocampus isoleres og kultiveret uden cortex, hvis det kræves.
    7. Placer skiven på en maske i opvarmet, ACSF (34 °C, bukkede med 5% CO2/95% O2), indtil alle skiver er indsamlet.
    8. Overfør udsnittene til laminar flow kabinettet for at fortsætte under sterile forhold.

Figure 1
Figur 1: repræsentative transmissions billeder af akutte og organotypiske hjerne skive præparater. Sammenligning af en akut isoleret parasagittal hjerne Skive (A) og en parasagittal organotypisk hjerne skive bevaret i kultur i 12 dage (B) ved hjælp af bred-felt translumination mikroskopi. DG = dentate gyrus; Carnot/3 = Carnot/CAEGON-regionen af hippocampus; E-CTX = entorhinal cortex; CTX = (neo-) cortex. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. dyrkning af skiver

  1. Overfør forsigtigt skiverne fra ACSF til en af de forvarmede Petri skåle fyldt med steril Hank's saltopløsning ved hjælp af en inverteret steril glas Pasteur-pipette.
    Bemærk: Sterilisering af vævet opnås ved fortynding (trin 3,2). Overfør så lidt ACSF som muligt til Petri skålen.
  2. Skift pipetten og Overfør udsnittene til den anden Petri skål. Gentag processen 5 gange samlet. Overfør så lidt HBSS som muligt til følgende Petri skåle.
  3. Placer forsigtigt en skive ad gangen på toppen af kultur indsatsen. Gentag processen for hvert udsnit. Undgå turbulenser i pipetten og vent, indtil udsnittet stiger ned til spidsen af Pasteur-pipetten. Man kan placere op til 4 skiver på en enkelt membran.
  4. Fjern forsigtigt alle overskydende Hank's opløsning fra toppen af skæret ved hjælp af en fin spids.
  5. Hold kulturerne (figur 2) i en inkubator ved grænsefladen mellem gas (carbogen, 95% O2 /5% Co2) og væsken ved 37 °c indtil eksperimentets dag. Udskift mediet hver 2-3 dage.

Figure 2
Figur 2: princippet om FRET-baseret ATP-billeddannelse i dyrkede organiske hjerne skiver ved hjælp af den genetisk kodede sensor ATeam 1,03Yemk. Skematisk gengivelse af den protokol, der præsenteres i dette arbejde. Kort, parasagittal organotypiske skiver, kultiveret i 1-3 dage, er transduceret med en adeno-associeret viral vektor, der indeholder enten den astrocyt-specifikke hGFAP-eller den neuron-specifikke hSyn-promotor og sekvensen for ekspression af ATeam 1.03Yemk. Fortyndede aliquoter af disse vektorer (1:2-1:4) påføres direkte på toppen af en skive, som vedligeholdes under dyrkningsforholdene i mindst 6 dage mere. Ændringer i intracellulære ATP niveauer kan derefter visualiseres i celler, der udtrykker sensoren ved spændende det ved 434 nm og ved at erhverve fluorescens emission samtidig ved 527 (acceptor) og 475 (donor) nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. angivelse af ATP-sensorer med en Aadeno-associeret viral vektor (figur 2)

Bemærk: Sørg for at opfylde alle krav til håndtering af genetisk modificerede organismer!

  1. Til håndtering af viral vektor, alikvot adeno-associerede virale vektorer (AAV2/5) ved 1-2 μl for at undgå gentagen frysning og optøning. Aliquoterne opbevares ved-80 °C.
  2. En kolbe, der indeholder 10% blegemiddel, anbringes på den sterile bænk for at kassere alt brugt restmateriale, der var i kontakt med vektoren.
  3. For transduktion forberedes en fortynding på 1 μL af vektoren med 2-3 μL DPBS. Stamopløsninger udviser normalt en fysisk titer i størrelsesordenen 1012 virale genomer pr. ml (VG/ml).
  4. Overfør en indsats, der indeholder en kultiveret skive, ind i den sterile hætte.
  5. Uden at røre ved vævet, påføres 0,5 μL af den fortyndede vektor direkte til toppen af hver skive.
    Bemærk: Bedre udtryk i de dybere lag af vævet opnås ved at transducere kultiverede skiver på 1-3 dage in vitro (DIV). Transduktion af ældre kulturer kan resultere i et fremherskende udtryk af celler i det omgivende gliaceller ar eller et lavt udtryk i neuroner, hhv.
  6. Endelig placere skiver tilbage i inkubator og vedligeholde dem i mindst 6 dage mere. Du må ikke ændre mediet på dagen for transduktion.

4. fjernelse af glial ar (figur 3)

  1. Lige før du starter et eksperiment, skal du overføre en indsats, der indeholder kultiverede skiver, ind i den sterile hætte og anbringe den i en 30 mm skål, der indeholder 1 mL OLT-medium eller MEM.
  2. Placer skålen under Stereoskopet og Fokusér på udsnittets overflade.
  3. Brug to sterile hypodermiske nåle (23 G, 1 ") til at lave en kort tværsnit lige på de smalle kanter af et valgt Skive (figur 3). Denne procedure vil frigive spændingen i overfladen skabt af gliaceller ar får den til at trække sig tilbage og derved udsætte de underliggende lag (Se figur 5).
    Bemærk: Det første vævs lag (glial ar) dannes hovedsageligt af reaktive astrocytter. I vidfelt Imaging, vil dette tætte vævs lag resultere i yderligere spredning af lyset, hvilket resulterer i slørede billeder. Fjernelse af ar er således fordelagtigt at opnå bedre synlighed af de dybere lag, som indeholder den rette organotypic væv. Således, være omhyggelig med at udføre dette snit udelukkende på kanten og i det øvre lag af udsnitspræparatet kun og ikke at beskadige vævet nedenunder. Vi har ikke observere forskelle mellem data opnået i OTCs med gliaceller Scar med dem fra Scar-Free OTCs (data ikke vist).
  4. Fjern det forberedte udsnit fra skæret. Til dette formål, bruge en steril skalpel og punktafgiftspligtige det ved at gøre lige parallelle nedskæringer til membranen, danner en firkant eller en trekant med skive i midten, mens du holder kanterne af membranen med pincet. Hvis indsatsen er vært for yderligere udsnit, skal den overføres tilbage til den oprindelige plade og ind i inkubator. Overfladen spændinger af mediet vil forhindre sin lækage på overfladen af membranen.

Figure 3
Figur 3: skematisk illustration af den mekaniske fjernelse af gliaceller ar. Figuren viser en hippocampus skive kultur, som er dækket af et gliaceller ar (blueish ellipsoide). Ved en gang klipning spidsen af to sprøjte nåle på den mindste pol af kulturen og på kanten af gliaceller ar (blå stiplede linje), vil ar flip til side. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

5. FRET-baseret ATP Imaging (figur 4)

  1. Før eksperimentet skal du tilberede E-ACSF og boble det med 95% O2/5% Co2 i mindst 30 minutter for at få en pH-værdi på 7,4. Tænd for mono kromatorens fluorescerende lyskilde (xenon-lampe) (figur 4). Start perfusion lige før du tager ud af skive fra inkubator.
    Bemærk: Opbevar salt Boerne med 95% O2 og 5% Co2 under hele forsøget.
  2. Overføre udsnittet til et eksperimentelt kammer, der hele tiden er perfekteret med frisk carbogenated E-ACSF ved hjælp af en peristaltisk pumpe (figur 4). Fastgør derefter udsnittet med et gitter. Placer kammeret på mikroskop scenen, og Tilslut perfusions systemet. Gasbestandig laboratorie slange anbefales til perfusion.
    Bemærk: Eksperimenter kan udføres ved stuetemperatur eller nær fysiologisk temperatur, afhængigt af det eksperimentelle design. Kontroller stabiliteten og pålideligheden af perfusions strømmen for at undgå ændringer i fokus induceret af bevægelse af vævet og/eller ændringer i forskydnings stress. Standard perfusions hastigheder for skive arbejde, der anvendes af os og mange andre laboratorier, er 1,5-2,5 mL/min.

Figure 4
Figur 4: konfiguration af Fret Imaging setup. (A) skematisk illustration af de forskellige komponenter og deres rumlige arrangement, der kræves til opsætning af Fret Imaging. Arrangementet består af en mono kromator med en xenon lampe som en lyskilde, en oprejst fast fase mikroskop (1), et billede-splitter system (2), en digital CCD eller CMOS kamera til tidsforskudt optagelse (3), og et eksperimentelt bad tilpasset til stabil konstant perfusion (4). Badet perfusion er realiseret af en peristaltisk pumpe med justerbar strømningshastighed. (B) billede af det eksperimentelle arbejdsområde. Opsætningen af FRET Imaging er monteret på en vibrationsdæmpet tabel, der bærer et x/y-translationelt stadie, hvor det eksperimentelle bad er indlejret. Tal: Se (A). C) Skematisk visning af lysvejen fra monochromatoren til det digitale kamera. Indikeret er placeringen af de forskellige filtre og koldtlysreflektorlamper spejlet. Tal: Se (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Bring den kultiverede skive i fokus ved hjælp af transmissions lys. Identificer det område, hvor der skal udføres eksperimenter (f. eks.: Carnot-regionen i hippocampus). Før du starter billedbehandlings eksperimenter, skal du vente mindst 15 min for at tillade, at skiver tilpasser sig salt forholdene. For konfigurationen af den eksperimentelle opsætning, se figur 4.
  2. Tænd kameraet og billedbehandlings softwaren. Vælg derefter den korrekte filter kube.
  3. Excite donor fluorescerende protein (eCFP) ved 435/17 nm (~ 435 nm). Indstil eksponeringstid mellem 40 og 90 MS.
    Bemærk: Kraftig udsættelse af skiver til fluorescerende lys kan resultere i fototoksiske virkninger.
  4. Excitation på 435 nm resulterer i emission ved både 475 nm (eCFP; donor) og 527 nm (Venus; acceptor). Fluorescens emission opdeles ved 500 nm med en emissions billed splitter og anvender band pass-filtre ved 483/32 og 542/27 for yderligere at isolere donor og acceptor fluorescens. Stærkt udtryk kan resultere i mætning af detektorerne. I dette tilfælde kan du bruge et neutralt tætheds filter til at reducere intensiteten af excitation.
  5. Vælg et interesseområde (ROI) tilsyneladende blottet for cellulær fluorescens for baggrunds subtraktion. Opret derefter ROIs-afgrænse celle legemer.
  6. Indstil hyppigheden af billed erhvervelse og den samlede optagetid. For lange (> 30 min) eksperimenter anbefales en anskaffelses hyppighed på 0,2-0,5 Hz for at forhindre fototoksicitet.
  7. Start optagelsen. Det anbefales at optage mindst 5 min under baseline betingelser for at sikre stabiliteten af præparatet.
    Bemærk: Juster cellens fokus under optagelsen, hvis det er nødvendigt.
  8. For at inducere ændringer i intracellulær ATP, Overfør perfusions røret fra standard ACSF til et saltvand indeholdende metaboliske hæmmere (f. eks. CIS, se tabel 1 og nedenfor). Alternativt kan du bruge et saltvand med forhøjet kaliumkoncentration til at efterligne frigivelse af kalium fra aktive neuroner.
    Bemærk: Ansøgning ved Bath perfusion er en forholdsvis langsom proces, som globalt virker på hele præparatet. Vær opmærksom på det tidspunkt, hvor den nye løsning faktisk begyndte at komme ind i eksperimenterende bad. Afhængigt af afstanden mellem kammeret og saltholdets reservoir, samt på hastigheden af perfusion, en forsinkelsestid skal overvejes.

6. høj opløsning dokumentation af cellulære ATeam fluorescens

  1. Umiddelbart efter optagelserne overføres optage kammeret med udsnitskulturen til confokal laser scannings mikroskopet.
    Bemærk: Vær særlig forsigtig. På grund af potentielle foto skader, udføre dette trin kun efter eksperimenter. Til dokumentationsformål kan man udveksle E-ACSF med H-ACSF. Derfor er et perfusions system ikke nødvendigvis nødvendigt.
  2. Tag z-stakke ved den højest mulige z-opløsning ved den givne optiske konfiguration.
  3. Anvend en dekoncentrerings algoritme for at øge billedopløsningen.

Representative Results

AAV vektorer er et pålideligt værktøj til selektivt at udtrykke udenlandske gener i celler i levende væv16. Direkte anvendelse af AAVs, der indeholder sekvens kassetten af ATeam 1,03Yemk , og en specifik promotor resulterer i et højt ekspression af sensoren i den valgte celletype. På DIV 14 (~ 10 dage efter en transduktion), neuroner udtrykker ATeam under den menneskelige synapsin promotor findes ved høj densitet i neocortex af dyrkede væv skiver i dybder på op til 50 μm under udsnitsfladen (figur 5a). Sammenlignelige resultater kan opnås i hippocampus (figur 5B).

Figure 5
Figur 5: visualisering af neuroner udtrykker ATeam 1,03Yemk i kulturperler parasagittal organotypiske hjerne skiver. Billeder til venstre svarer til udvidede fokus projektioner af 43 optiske sektioner (1,05 μm hver) af kortikale væv (A) og (B) af 70 optiske sektioner (0,6 μm hver) af hippocampus væv. Billeder til højre repræsenterer volumen visningen af den samme projektion. Celler er farvekodede i henhold til deres dybde i forhold til udsnitsoverfladen som angivet af farve skalaen til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Til måling af ATP-niveauer i astrocytter udtrykkes ateam 1,03yemk under kontrol af den humane gliale fibrillary sure protein (GFAP)-promotor. Dette resulterer i effektiv transduktion af celler i både neocortex og hippocampus af dyrkede vævs skiver (figur 6). Især kan der skelnes mellem to forskellige morfologiske fænotyper, afhængigt af dybden i forhold til overfladen af skive præparater. I den første, overfladiske lag, celler er karakteriseret ved tykke primære processer, der er overvejende arrangeret parallelt med overfladen. Disse celler udviser stærkt overlappende domæner, hvilket skaber et tæt meshwork af tilsyneladende reaktive astrocytter (figur 6). I dybere lag (30-60 μm fra overfladen), transducerede astrocytter udviser fine cellulære processer, der udgør stort set sfæriske domæner og deres morfologi ligner astrocytter in situ som rapporteret tidligere19,20,21 (figur 6). For at opnå bedre transduktion af astrocytter i dybere lag samt bedre optisk adgang til disse dybere lag kan gliaceller arvæv fjernes som beskrevet i trin 4.

Figure 6
Figur 6: visualisering af astrocytter udtrykker ATeam 1,03yemk i kulturperler parasagittal organotypiske hjernen skiver. Billedet til venstre svarer til en udvidet fokus projektion af 191 optiske sektioner (0,45 μm hver). Til illustration formål blev gliaceller ar udelukket fra projektion af astrocytter. Billeder til højre repræsenterer volumen visningen af den samme projektion før og efter fjernelse af gliaceller ar. Cellerne er farvekodede i henhold til deres dybde i forhold til udsnitsoverfladen som angivet af farveskalaerne til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Vellykket udtryk for ATeam 1.03Yemk giver mulighed for dynamisk måling af ændringer i ATP niveauer i neuroner eller astrocytter, afhængigt af arrangøren anvendes (se ovenfor). Eksperimenter blev udført i et eksperimentelt bad, der konstant perfektanes med E-ACSF (bukkede med 95% O2/5% Co2). I organotypiske skiver, der udtrykker ATeam 1,03Yemk i hippocampus neuroner, blev regioner af interesse (Rois) valgt før optagelsen, der repræsenterer somata af pyramidale celler (figur 7A). Desuden blev der valgt en region for baggrunds subtraktion (figur 7a). Emission af Venus og eCFP fluorescens blev derefter indsamlet for hver af disse ROIs separat og afbildet som fluorescens emissionsniveau over tid (figur 7B). Efter optagelse af fluorescens under kontrolforhold i flere minutter for at sikre en stabil baselineblev cellulær metabolisme hæmmet ved at udsætte udsnitspræparatet for et glucosefri saltvand, hvortil der blev tilsat 5 mM natrium-Azid (NaN3) i et minut (figur 7B). Denne manipulation inducerede modsatte ændringer i den emissionsintensitet af FRET pair (figur 7B, venstre paneler), med et fald på Venus (527 nm) og en stigning i ecfp (475 nm) emission. Beregning af FRET ratio ved at dividere den fluorescens emission af Venus med eCFP (FVenus/fecfp) resulterede i signaler, der afspejler de relative ændringer i de intracellulære ATP-niveauer, den såkaldte "ateam fret ratio" (figur 7B, højre panel). I alle indspillede neuroner (n = 70 celler i N = 5 skiver) forårsagede NaN3 et reversibelt fald i ATEAM fret ratio, hvilket indikerer et reversibelt fald i intracellulære ATP-niveauer ved hæmning af cellulær metabolisme.

Figure 7
Figur 7: demonstration af tidsforskudt ATeam fret ratio Imaging. A) øverst til venstre: fluorescens i bred felts billede af det pyramideformede lag og stratum radiatum i området med en kultiveret organotypisk hippocampus-skive, der udtrykker ateam 1,03yemk i neuroner. Øverst til højre: forstørret visning af boxed sektion som angivet til venstre. Hvide linjer afgrænse regioner af interesse (Rois) 1-3 repræsenterer celle kroppe af Carnot pyramide neuroner valgt til analyse i (B). BG repræsenterer det ROI, som er valgt til baggrundskorrektion. Bund: pseudo-farvede billeder, der repræsenterer fluorescens emission af Venus (grøn), eCFP (lilla) og forholdet mellem Venus og eCFP. B) tidsforskudt optagelse i rois 1-3, der repræsenterer neuronale celle organer (Se A). Spor til venstre viser normaliseret fluorescens emission af Venus (grøn) og eCFP (magenta). Traces til højre viser det tilsvarende ATeam FRET-forhold. Bemærk, at perfusion med 5 mM NaN3 i fravær af ekstracellulært glucose i 1 minut (grå bjælke) inducerer et reversibelt fald i ATEAM fret ratio, hvilket indikerer et fald i INTRACELLULÆR ATP-koncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at sikre stabiliteten af præparatet og sensoren under langvarige eksperiment forhold, blev skiver, der udtrykker ATeam i neuroner eller astrocytter, konstant perfektioneres med ACSF i længere perioder (> 50 min; n = 12 celler hver, N = 3 OTC'er fra 3 hjerner). Under disse omstændigheder ændrede ATeam FRET-forholdet sig ikke (figur 8). At udsætte forberedelserne til CIS, der indeholder metaboliske hæmmere ("kemisk iskæmi", se tabel 1), resulterede derimod igen i det forventede fald i ATEAM fret-forholdet som observeret ovenfor.

Figure 8
Figur 8: grundlæggende eksperimenter med ATeam. Langsigtet ATeam FRET ratio Imaging i 14 forskellige celler under baseline forhold i neuroner (top) og astrocytter (nederst). Data blev taget på sammenlignelige betingelser som andre eksperimentelle data. Ved afslutningen af hver måling blev kemisk iskæmi fremkaldt ved perfusion med CIS som angivet af pilen. Bemærk: baseline ATeam FRET ratio er stabile over tid under baseline forhold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Dernæst analyserede vi svarene fra neuroner og astrocytter, som udtrykker ATeam 1,03Yemk til en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration. Efter etableringen af en stabil baselineblev neuroner perfektaret med et saltvand, hvor kaliumkoncentrationen blev forøget fra 3 til 8 mM i 3 minutter (figur 9a). Denne manipulation resulterede dog ikke i en detekterbar ændring i ATeam FRET ratio (n = 56 celler i N = 5 skiver). For at sikre, at sensoren reagerede på en ændring i ATP-niveauerne, blev skiver igen udsat for en vedvarende periode med kemisk iskæmi fremkaldt ved at erstatte E-ACSF med CIS. Kemisk iskæmi resulterede i et hurtigt fald i ATeam FRET ratio til et nyt, stabilt niveau, hvilket indikerer nominel nedbrydning af ATP efter 2-3 min (figur 9a).

Figure 9
Figur 9: repræsentative eksperimenter illustrerer ændringer i ATP niveauer i neuroner og astrocytter. (A,B): billeder til venstre viser ateam fluorescens fra neuroner og astrocytter placeret i hippocampus-området af organotypiske skiver. Traces til højre repræsenterer tidsforskudt optagelser af ATeam FRET ratio opnået fra et ROI placeret over en enkelt celle krop. I begge forsøg blev skiver først udsat for en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration i 3 minutter (Se bar), efterfulgt af en endelig eksponering for kemisk iskæmi. Bemærk, at mens neuroner ikke reagerer på højden af ekstracellulære kalium (A), astrocytter reagerer med en stigning i ATP (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den samme eksperimentelle protokol blev udført med skiver, hvor ATeam 1,03Yemk blev udtrykt i astrocytter. I modsætning til hvad der blev observeret i neuroner, reagerede astrocytter på stigningen i ekstracellulært kalium ved en reversibel stigning i ATeam FRET ratio, hvilket indikerer en stigning i intracellulære ATP-niveauer (n = 70 celler i N = 5 skiver) (figur 9B). Efterfølgende eksponering for kemisk iskæmi resulterede, som forventet, i et stort fald i ATeam FRET ratio, hvilket indikerer nominel nedbrydning af intracellulær ATP (figur 9B).

Discussion

Her demonstrerer vi en procedure for celle typen specifikt udtryk for ATeam 1.03Yemk, en fret-baseret, genetisk kodet Nanosensor14, til måling af ændringer i ATP-niveauer i astrocytter eller neuroner i organotypiske vævs skive kulturer i muse hjernen15. I eksemplariske optagelser viser vi, at en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration ikke resulterer i en ændring i ATP-koncentrationerne i neuroner, mens astrocytiske ATP-niveauer stiger som reaktion på denne manipulation. Desuden, vores resultater viser, at ved hæmning af cellulære metabolisme, ATeam 1,03Yemk fret forholdet hurtigt falder i begge celletyper, indikerer en hurtig nedgang i intracellulære ATP.

Udtryk for ATeam 1,03Yemk i organisk skive kulturer kræver vedligeholdelse af vævet i kulturen under kontrollerede forhold i mindst 7-10 dage. Alternativt kan ateam 1.03yemk også anvendes til måling af ATP i akut isolerede hjernevæv skiver og i optiske nerver af mus13,15. Målinger i akut isoleret væv, dog nødvendiggør generering af transgene dyr eller en Stereotaktisk anvendelse af virale vektorer i hjernen, der involverer dyreforsøg og strenge dyrepleje protokoller. I denne henseende er ateam 1,03yemk udtryk i organiske typiske vævs skive kulturer et nyttigt og værdifuldt alternativ22,23. I mange år nu, organotypic vævs skive kulturer tjene som en etableret model system til at studere neurale egenskaber, konnektivitet og udvikling24,25,26. De bevarer ikke kun den generelle vævs arkitektur og laminering (figur 1), men er også vært for de præference egenskaber af cellekulturer såsom overlegen tilgængelighed og direkte kontrol af eksperimentelle forhold. Organotypic vævs skive kulturer er også rutinemæssigt ansat til at udtrykke fremmede gener ved hjælp af virale vektorer27. Flere typer af virale vektorer er blevet rapporteret til at levere transgener i hjernevæv16,28. Adenoviral vektorer inducerer høj ekspression i gliaceller celler, men ikke hippocampus neuroner16, og kan generere gliaceller reaktivitet17. Adeno-associerede virale vektorer som anvendes her fremstå som et godt alternativ15, og deres effektivitet er også blevet vist i vivo29.

Mens der hovedsagelig anvendes til undersøgelse af neuronal egenskaber, nylige undersøgelser har fastslået, at organotypic vævs skive kulturer kan også anvendes til analyse af astrocytter. Kultiverede skiver er normalt dækket af et lag af reaktive astrocytter19,30 (figur 5), men astrocytter udviser en mere indfødt, ikke-reaktiv morfologi og cytoarkitektur i dybere lag19,30 (figur 5). I nærværende undersøgelse beskriver vi en procedure for mekanisk fjernelse af det ydre gliaceller ar, hvilket resulterer i en bedre eksperimentel og optisk tilgængelighed af indfødte astrocytter inden for de rette organotypiske vævs lag. Desuden, dens fjernelse forbedrer ekspression effekt i dybere lag af organotypiske skiver; Hvis det gliale ar ikke fjernes, kan transduktion af AAVs have tendens til at være begrænset til de overfladiske cellelag.

Flere eksterne mekaniske faktorer skal tages i betragtning, når der udføres eksperimenter i vævs skiver. En variation i badet perfusion hastighed kan inducere bevægelser af hele præparatet og/eller inducere ændringer i fokus, hvilket resulterer i kunstige forbigående ændringer af sensorsignalet. Desuden, både astrocytter og neuroner er blevet rapporteret til at reagere på mekanisk deformation såsom pålagt af høje perfusion satser32,33. I vores hænder, ved hjælp af en pålidelig peristaltisk pumpe, sammen med at opretholde små og stabile mængder af saltvand mellem vævet og målet (meniscus) resulterer i en stabil FRET-signal under baseline betingelser ved perfusion hastighed anvendes her (1,5-2,5 mL/min; Figur 8).

I denne undersøgelse viser vi også, at FRET-baseret billeddannelse med ATeam 1.03Yemk kan anvendes til at overvåge ATP-niveauer i neuroner og astrocytter. Et alternativt middel introduceret tidligere til måling af cellulære ATP er den såkaldte luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Denne fremgangsmåde er imidlertid baseret på billeddannelse af bioluminescens og giver kun en forholdsvis lav tidsmæssig og rumlig opløsning til dels på grund af høje baggrundsstøj niveauer. En anden metode rutinemæssigt anvendt i de seneste år var billeddannelse af ændringer i den intracellulære magnesium koncentration ved hjælp af ion-følsomme fluoroforet magnesium grøn38,39,40. Denne fremgangsmåde vedrører den konstatering, at et forbrug af ATP resulterer i frigivelsen af dets co-faktor magnesium. Billeddannelse med magnesium grøn giver således kun et sekundært skøn over ændringer i ATP-niveauerne. Desuden er magnesium Green også følsom over for ændringer i intracellulær calcium, hvilket introducerer en anden vanskelighed ved tolkning af resultater opnået med denne metode.

Den seneste udvikling af genetisk kodede nanosensorer til direkte billeddannelse af cellulære metabolitter, derfor repræsenterede et stort skridt fremad11,12. Flere forskellige sensorer blev genereret, der kan anvendes til måling af intracellulære ATP36,41,42,43. Blandt disse er den ratiometriske-fluorescerende ATP-indikator "QUEEN"41 samt PercevalHR, som sanser ATP: ADP ratio42. Mens sidstnævnte sonde er et værdifuldt værktøj til undersøgelse af cellernes energi status, kræver det samtidig måling af ændringer i pH42.

ATeam er en Nanosensor, som der findes flere varianter af, som — blandt andre — adskiller sig fra hinanden i deres bindingsaffinitet for ATP14. In vitro udviser ATeam 1,03yemk en Kd på 1,2 mm ved 37 °c, hvilket er tæt på cellulære ATP-niveauer bestemt i forskellige neuronal celletyper, der spænder fra hypothalamus og cerebellum34 til hippocampus37,44,45. Ved kuvette målinger resulterede sænkning af temperaturen med 10 °C i et signifikant fald i ATeam 1.03Yemens bindingsaffinitet til ATP, hvilket tyder på, at det måske ikke er ideelt til cellulær billeddannelse ved stuetemperatur14. Vores tidligere undersøgelse15, dog, viste, at adfærd og respons af ateam 1,03yemk udtrykt i neuroner og astrocytter til forskellige manipulationer er ens på nær fysiologiske og ved stuetemperatur, hvilket indikerer, at sensoren giver pålidelig bestemmelse af intracellulære ATP niveauer under begge betingelser. Derudover behandlede vores tidligere eksperimenter pH-følsomheden af ATeam 1,03Yemk udtrykt i cellerne15, hvilket viser, at det er ufølsomt over for ændringer i intracellulær pH med ca. 0,1-0,2 pH-enheder. Hvis Kd i den lave mm rækkevidde er en bekymring, alternative ateam varianter kan anvendes14, blandt dem rød-skiftede varianter af ATEAM ("Go-ateam")43.

Vores eksperimenter med ATeam 1,03yemk viser, at en stigning i den ekstracellulære kaliumkoncentration med nogle få mm kun (fra 3 til 8 mm) resulterer i en forbigående stigning i Ateam 1,03yemk ratio i astrocytter i organotypiske skive kultur. Denne observation bekræfter tidligere undersøgelser15,46 og tydeligt indikerer, at astrocytter reagerer på frigivelsen af kalium af aktive neuroner med en stigning i deres ATP-produktion, for det meste sandsynligvis som følge af en stimulering af na+/k+-ATPase ogna +/HCO3- cotrans Porter, henholdsvis47,48. I modsætning til dette viste neuroner ikke et svar, hvilket er i tråd med tidligere arbejde samt15. Begge celletyper reagerede dog hurtigt og stærkt på hæmning af cellulær glycolyse og mitokondrie respiration som vist før15. Under betingelser af kemisk iskæmi, ATeam FRET nøgletal faldt til et nyt stabilt niveau, hvilket indikerer en nominel udtømning af cellulære ATP. Sidstnævnte resultat tyder på, at både neuroner samt astrocytter udviser et relevant forbrug af ATP også under Steady-State betingelser uden yderligere stimulation ved synaptisk aktivering eller anvendelse af neurotransmittere. Tilsammen konkluderer vi, at FRET-baseret billeddannelse med genetisk kodede nanosensorer, blandt dem ATeam 1,03Yemk, vil give en værdifuld tilgang til at belyse de cellulære processer, der er ansvarlige for ændringer i intracellulære ATP-niveauer og cellulære ATP-forbrug under forskellige forhold.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser. Forfatterne har modtaget økonomisk støtte, der muliggør åben adgang publikation fra Nikon Micro Scope Solutions, Düsseldorf, Tyskland, som producerer instrumenter, der anvendes i videoen artiklen. Virksomheden var hverken involveret i udformningen af de eksperimenter, der blev præsenteret her, eller i deres udførelse, heller ikke i datahåndteringen, eller i manuskriptet skriftligt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Claudia Roderigo og Simone Durry for teknisk ekspertbistand. Vi takker Dr. Niklas J. Gerkau og M.Sc. Joel Nelson for hjælp til forberedelsen af de organotypiske skive kulturer. Forskningen i forfatterens laboratorium blev finansieret af den tyske forsknings sammenslutning (DFG; FOR 2795: ro 2327/13-1 og SPP 1757: ro 2327/8-2 til CRR; og SPP 1757: unge glia-opstarts midler til RL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxyglucose Alfa Aesar L07338 Non-metabolizable glucose analog
36-IMA-410-019 Argon laser Melles Griot 488 nm wavelength argon
Ascorbic acid Carl Roth 3525.1 Antioxidant, Vitamin C
band pass filters 483/32 AHF Analysentechnik AG Splitter compatible emmision filter
band pass filters 542/27 AHF Analysentechnik AG Splitter compatible emmision filter
Beamsplitter T 455 LP AHF Analysentechnik AG Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR AHF Analysentechnik AG Splitter dichroic
Confocal laser scannig microscope C1 Nikon Microscope Solutions Modular confocal microscope system C1
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) OriginLab corporation Scientific graphing and data analysis software
D-glucose monohydrate Caelo 2580-1kg
DPBS GIBCO/Life 14190250 Dulbecco's phosphate-buffered saline
Eclipse E 600FN upright microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 upright microscope Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber custom build Perfusion chamber for live-cell imaging
EZ-C1 Silver Version 3.91 Nikon Microscope Solutions Imaging software for confocal microscope
Hanks' Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H9394 With Phenol Red for pH monitoring
HERAcell 150 Thermo Scientific CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine
HERAsafe KS/KSP Thermo Scientific Safety Cabinet
Horse serum GIBCO/Life 26050088 Heat inactivated
Huygens Professional SVI Imaging Deconvolution software
Image J 1.52i Wayne Rasban national Institute of Health Image processing Software available in the public domain
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Insulin from bovine pancreas
IP serie peristaltic pump Ismatec High-precisionmulti-channel pump
Layout software, Illustrator CS6 Adobe Vector graphics editor
L-glutamine GIBCO/Life 25030024
Microm HM 650 V Thermo Scientific Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.
Microscope stage custom build
Microsoft Excel 16 Microsoft Spreadsheet software for basic data processing
Millicell culture insert Merck Millipore PICM0RG50 Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich M7278 Synthetic cell culture media
Monochromator Polychrome V Thermo Scientific/FEI Ultra fast switching monochromator
NaN3 (Sodium Azide) Sigma-Aldrich S-8032 Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 Nikon Microscope Solutions Water Immersion Microscope Objective
NIS Elements 4.50 advanced Research Nikon Microscope Solutions Imaging software. Upgraded version for FRET imaging
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics Digital CMOS camera
Perfusion tubing Pro Liquid GmbH Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0 Adobe Image processing software
Sodium L-lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) ETH Zürich v244 Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) ETH Zürich v307 Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.
WVIEW GEMINI optic system Hamamatsu Photonics Emission Image Splitter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  3. Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
  4. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
  5. Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
  6. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
  7. Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
  8. Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
  9. Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
  10. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
  11. Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
  12. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
  13. Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241 (2017).
  14. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
  15. Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
  16. Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
  17. Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
  18. Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
  19. Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
  20. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623 (2018).
  21. Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
  22. Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
  23. Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
  24. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  25. Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
  26. Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
  27. Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
  28. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  29. Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
  30. Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605 (2013).
  31. Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
  32. Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
  33. Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
  34. Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
  35. Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
  36. Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
  37. Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
  38. Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
  39. Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
  40. Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
  41. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
  42. Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550 (2013).
  43. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
  44. Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
  45. Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
  46. Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
  47. Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141 (2016).
  48. Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).

Tags

Neurovidenskab Neuro Sciences organotypic hjerne skive astrocyt Neuron AAV hippocampus cortex FRET
Imaging af intracellulære ATP i Organotypic væv skiver af muse hjernen ved hjælp af FRET-baseret sensor ATeam 1,03<sup>Yemk</sup>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerchundi, R., Kafitz, K. W.,More

Lerchundi, R., Kafitz, K. W., Färfers, M., Beyer, F., Huang, N., Rose, C. R. Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (154), e60294, doi:10.3791/60294 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter