Summary
Vi beskriver en protokoll for celle-type spesifikke uttrykk for genetisk kodet bånd-basert sensor ATeam 1.03YEMK in organotypic skive kulturer av musen forebrain. Videre viser vi hvordan du bruker denne sensoren for dynamisk bildebehandling av mobilnettet ATP nivåer i neurons og astrocytter.
Abstract
Neuronal aktivitet i sentralnervesystemet (CNS) fremkaller en høy etterspørsel på mobilnettet energi levert av nedbryting av adenosin trifosfat (ATP). En stor andel av ATP er nødvendig for å re-installere ion graderinger på tvers av plasma membraner degradert av elektriske signaler av neurons. Det er bevis for at astrocytter-samtidig ikke generere raske elektriske signaler selv-gjennomgår økt produksjon av ATP som svar på neuronal aktivitet og støtte aktive neurons ved å gi energi metabolitter til dem. Den nylige utviklingen av genetisk kodede sensorer for ulike metabolitter gjør det nå mulig å studere slike metabolske interaksjoner mellom neurons og astrocytter. Her beskriver vi en protokoll for celle-type spesifikke uttrykk for ATP-sensitive fluorescens resonans Energy Transfer-(SLITE-) sensor ATeam 1.03YEMK i organotypic vev skive kulturer av musen hippocampus og cortex bruker adeno-assosiert viral VEKTORER (AAV). Videre viser vi hvordan denne sensoren kan benyttes for dynamisk måling av endringer i cellulære ATP nivåer i neurons og astrocytter ved økninger i ekstracellulære kalium og etter induksjon av kjemiske iskemi (dvs. en hemming av cellulær energi metabolisme).
Introduction
Eksitatoriske elektriske aktivitet av neurons er i stor grad basert på Flux av spesifikasjoner som natrium (na+) og kalium (K+) på tvers av deres plasma membraner. Vedlikehold av elektrokjemiske graderinger av disse to ioner er dermed nødvendig for signalering. Dette oppnås ved mobilnettet na+/K+-ATPase (NKA), en overalt uttrykt electrogenic transmembrane pumpe, som spyr 3 na+ ut av cellen i bytte for 2 K+ fra ekstracellulære plass, som krever inntak av ett molekyl ATP per transport syklus1. I tillegg til NKA, er det flere andre ATP-forbruker ion transportører inkludert plasma membranen ca2 +-ATPase, som er avgjørende for intracellulære ca2 + homeostase og eksport følgende aktivitet-indusert tilstrømningen2. I presynaptiske nerve blemmer, en vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) skaper Proton gradient nødvendig for signalstoffet opptak i dette rommet3.
Mens aktiviteten av neurons dermed krever en betydelig mengde av ATP4, de ikke viser en betydelig kapasitet for lagring av energi. I stedet synes de å stole på metabolske interaksjoner med nabo astrocytter, de store glykogen butikker i hjernen5. Det har blitt antydet at astrocytic glykogen faktisk spiller en viktig rolle i å støtte neuronal energibehov; og et viktig fenomen i denne foreslåtte Nevro-metabolsk kopling mellom de to celle typene er kapasiteten til astrocytter å øke sin ATP produksjon som svar på neuronal aktivitet6,7,8. Denne hypotesen, kjent som astrocytt melkesyre shuttle (ANLS), er fortsatt under debatt, fordi annet arbeid har gitt bevis for at neurons kan også øke sin egen rate på Glykolysen som svar på stimulering9,10, reflekterer nødvendigheten av videre metoder og tilnærminger for å studere Nevro-glia interaksjon.
Gransking av cellulær energi metabolisme og ATP nivåer i neurons og astrocytter til belyse Nevro-glia metabolske interaksjoner har lenge vært hemmet av mangelen på egnede sonder for påvisning av endringer i metabolitten konsentrasjoner i levende celler i hjernevevet. Det siste tiåret har imidlertid gitt en økning i utviklingen av nye verktøy og nye genetisk kodede lysrør sonder for ulike metabolitter, inkludert sensorer for ATP, melkesyre, pyruvat og andre11,12. Ved hjelp av disse verktøyene, er det nå mulig å direkte adresse spørsmål knyttet til mobilnettet ATP forbruk og endringer i mobilnettet energi nivå på enkelt cellenivå og i en celle-type spesifikk måte i intakt hjernevev13.
I dagens arbeid, beskriver vi en prosedyre for å visualisere cytosolic ATP dynamikk på neurons og astrocytter av kultivert organotypic hjerne skiver. Vi viser hvordan å ansette adeno-assosiert viral vektorer (AAV) for celle-type spesifikke uttrykk for genetisk kodet ATP-nanosensor ATeam 1.03YEMK (14) i neurons og astrocytter av skiver av mus hjernen som kan opprettholdes i celle kulturen i flere uker15. En fremgangsmåte av hvor å fjerne det gliacellene arr det dekker kultivert tissue skive er beskrevet, hvilke gjøre bedre optisk tilgjengeligheten og tenkelig av celler inne det organotypic tissue lag nedenunder. Til slutt viser vi hvordan ATeam 1.03YEMK kan brukes til å utføre bånd-basert avbildning av endringer i mobilnettet ATP nivåer i dette preparatet. Denne metoden verter de store fordelene at det ikke krever kirurgiske hjerne prosedyrer, gir høye nivåer av uttrykk for sensor og celle type spesifisitet i kultivert hjerne skiver, redusere invasiveness eller stress i cellene sammenlignet med andre metoder, som transfeksjoner av electroporation eller Transduction med andre viral vektorer10,16,17. I tillegg kan denne protokollen brukes til andre bånd basert nanosensors, blant dem varianter av ATeam 1.03 som gir lavere bindende affinitet for ATP14.
Protocol
Den nåværende studien ble utført i nøye samsvar med de institusjonelle retningslinjene for Düsseldorf-universitetet og det europeiske fellesskaps rådsdirektiv (2010/63/EU). Alle eksperimenter ved hjelp av organotypic hjerne sektor kulturer ble kommunisert til og godkjent av Animal Welfare Office ved Animal Care og bruk Facility av Heinrich Heine University Düsseldorf (institusjonelle Act nummer: O50/05). I samsvar med anbefalingene fra EU-kommisjonen18, dyr opp til 10 dager gamle ble drept av halshogging.
1. utarbeidelse av Organotypic Brain Slice kulturer (OTCs)
- Dagen før eller minst 30 min før prosedyren
- Forbered Petri parabolen (under sterile forhold). Fjern lokket på den 6 brønn platen og plasser 800-850 μL av OTC-medium i hver brønn. Oppbevar platen i inkubator (37 ° c, 5% CO2/95% O2) inntil nødvendig.
- Forbered vask Petri retter (under sterile forhold). Tilsett 3 mL HBSS til hver 30 mm Petri rett. Det kreves totalt 5 retter per prosedyre. Plasser dem i inkubator (37 ° c, 5% CO2/95% O2) i minst 30 min-over natten til nødvendig.
- Klargjør ACSF (tabell 1). Oppbevar saltvann uten glukose ved 4 ° c til neste dag.
| Salines og Media-formulering | ||||
| navn | Forkortelse | Sammensetning | Konsentrasjon [mM] | Kommentarer |
| Kunstig spinalvæske løsning | ACSF | Nacl | 125 | Boblet med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 2,5 | Legg alltid glukose rett før bruk. | ||
| CaCl2 | 2 | Må ikke oppbevares i mer enn én dag med glukose | ||
| MgCl2 | 1 | ~ 310 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 26 | |||
| Glukose | 20 | |||
| Eksperimentell ACSF | E-ACSF | Nacl | 136 | Boblet med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 3 | Legg alltid glukose rett før bruk. | ||
| CaCl2 | 2 | Må ikke oppbevares i mer enn én dag med glukose | ||
| MgCl2 | 1 | ~ 320 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Glukose | 5 | |||
| Laktat | 1 | |||
| Kjemisk iskemi løsning | Cis | Nacl | 136 | Boblet med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 3 | ~ 318 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| 2, 2-Deoxyglucose | 2 | |||
| NaN3 | 5 | |||
| 8 mM kalium ACSF | 8 mM K+ ACSF | Nacl | 128 | Boblet med 5% CO2/95% O2, pH 7,4 |
| KCl | 8 | ~ 320 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1,25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Glukose | 5 | |||
| Laktat | 1 | |||
| Hepes-bufret ACSF | H-ACSF | Nacl | 125 | Justert til pH 7,4 med NaOH |
| KCl | 3 | Legg alltid til glukose rett før bruk | ||
| CaCl2 | 2 | Må ikke oppbevares i mer enn én dag med glukose | ||
| MgSO4 | 2 | ~ 310 mOsm/L (justert med sukrose) | ||
| NaH2PO4 | 125 | |||
| Hepes | 25 | |||
| Glukose | 10 | |||
| Hanks ' balanserte salt løsning | HBSS | Sigma (katalognummer H9394). | ||
| Dulbecco ' s fosfat-bufret Saline | DPBS | Gibco (katalognummer 14287-080) | ||
| Organotypic kultur medium | OTC medium | varme-deaktivert hest serum | 20 | 34 ° c, 5% CO2, pH 7,4, under dyrking tilstand |
| Mem | 79 prosent | ~ 320 mOsm/L | ||
| L-glutamin | 1 | |||
| Insulin | 0,01 mg/mL | |||
| Nacl | 14,5 | |||
| MgSO4 | 2 | |||
| CaCl2 | 1,44 | |||
| Askorbinsyre | 0,00125 prosent | |||
| D-glukose | 13 |
Tabell 1: løsnings sammensetning.
- På dagen for forberedelser, tilsett glukose til ACSF, Legg den på is og begynn bobler med 95% O2/5% co2 i minst 30 min for å resultere i en pH på 7,4.
- Disseksjon og kutting
- Ofre musen (BalbC, begge kjønn) på postnatal dager 6 til 8 ved rask halshogging og plassere hodet i et glass Petri parabolen inneholder iskald ACSF.
- Utsett skallen ved å kutte huden fra baksiden til bakre spissen av nese benet. Deretter forsiktig klippe skallen fra foramen Magnum ved hjelp av en kirurgisk saks og utsett hjernen.
Merk: Kontroller at prosedyren er i samsvar med retningslinjene for institusjonen. - Fjern hjernen og plassere den på en filter membran i en iskald Petri parabolen fylt med ACSF.
- Skill halvkuler og utføre en parasagittal kutt i en vinkel på 45 °. Fix en halvkule på vibratome vev scenen med superlim. Umiddelbart overføre vevet blokken til vibratome badet inneholder iskald ACSF (boblet med 5% CO2/95% O2). Endelig justere vevet. Hold den andre halvkule i iskald ACSF til kutting.
- Juster vibratome for å kutte skiver ved 250-400 μm. kutting på 250 μm vil gi ca 12 skiver per dyr (400 μm: ~ 7 skiver).
- Etter å kutte stykket (figur 1A), identifisere hippocampus formasjon basert på dens typiske morfologiske utseende (figur 1) og isolere den ved hjelp av sprøyte nåler (23 gauge, 1 "), holde den delen av cerebral cortex tilstøtende til hippocampus.
Merk: Bevare mektig mens dyrking bidrar til å bevare integriteten til hippocampus. Imidlertid kan hippocampus bli isolert og kultivert uten cortex hvis nødvendig. - Plasser stykket på en mesh i varmet, ACSF (34 ° c, boblet med 5% CO2/95% O2) til alle skiver er samlet.
- Overfør sektorene til det laminær strømnings kabinettet for å fortsette under sterile forhold.
Figur 1: representative overføring bilder av akutte og organotypic hjernen skive forberedelser. Sammenligning av en akutt isolert parasagittal hjernen SKIVE (a) og en parasagittal organotypic hjernen skive opprettholdes i kultur for 12 dager (B) ved hjelp av Wide-feltet translumination mikroskopi. DG = dentate gyrus; CA1/3 = CA1/CA3-region av hippocampus; E-CTX = Entorhinal cortex; CTX = (neo-) cortex. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. dyrking skiver
- Forsiktig overføre skiver fra ACSF til en av de pre-varmet Petri retter fylt med sterile Hank ' s saltløsning ved hjelp av en invertert sterilt glass Pasteur pipette.
Merk: Sterilisering av vevet oppnås ved fortynning (trinn 3,2). Overfør så lite ACSF som mulig til Petri parabolen. - Endre pipette og Overfør skiver til den andre Petri parabolen. Gjenta prosessen 5 ganger totalt. Overfør så lite HBSS som mulig til følgende Petri retter.
- Forsiktig plassere en skive om gangen på toppen av kulturen setter inn. Gjenta prosessen for hver sektor. Unngå turbulenser i pipette og vente til stykket utforkjøringer til spissen av Pasteur pipette. Man kan plassere opp til 4 skiver på en enkelt membran.
- Forsiktig fjerne overflødig Hank ' s løsning fra toppen av innsatsen ved hjelp av en fin spiss.
- Behold kulturene (figur 2) i en inkubator i grensesnittet mellom gass (carbogen, 95% O2 /5% co2) og væsken ved 37 ° c til dagen for eksperimentet. Bytt medium hver 2-3 dager.
Figur 2: prinsippet om bånd-basert ATP Imaging i kultivert organotypic hjerne skiver ved hjelp av genetisk kodet sensor ATeam 1.03YEMK. Skjematisk fremstilling av protokollen som presenteres i dette arbeidet. Kort, parasagittal organotypic skiver, kultivert for 1-3 dager, er transduced med en adeno-assosiert viral vektor som inneholder enten den astrocytt-spesifikke hGFAP-eller Nevron-spesifikke hSyn-promoter og sekvensen for uttrykk for ATeam 1.03YEMK. Utvannet alikvoter av disse vektorer (1:2-1:4) er direkte brukt på toppen av en skive, som opprettholdes under dyrking forhold i minst 6 dager. Endringer i intracellulære ATP-nivåer kan deretter vises i celler som uttrykker sensoren ved spennende det på 434 NM og ved å anskaffe fluorescens utslipp samtidig på 527 (Acceptor) og 475 (donor) NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. uttrykk for ATP-sensorer med en Aadeno-assosiert viral Vector (figur 2)
Merk: Sørg for å oppfylle alle krav til håndtering av genmodifiserte organismer!
- For å håndtere viral vektor, alikvot adeno-assosiert viral vektorer (AAV2/5) ved 1-2 μL å unngå gjentatt frysing og tine. Oppbevar alikvoter ved-80 ° c.
- Plasser en kolbe som inneholder 10% blekemiddel på den sterile benken for å forkaste alt brukt rest materiale som var i kontakt med vektoren.
- For Transduction, Forbered en fortynning av 1 μL av vektoren med 2-3 μL av DPBS. Lager løsninger viser normalt en fysisk titer i størrelsesorden 1012 virale genomer per ml (VG/ml).
- Overfør et innlegg som inneholder en kultivert skive inn i den sterile hetten.
- Uten å berøre vevet, Påfør 0,5 μL av den fortynnede vektoren direkte til toppen av hver skive.
Merk: Bedre uttrykk i de dypere lag av vevet oppnås ved transducing kultivert skiver på 1-3 dager in vitro (DIV). Transduction av eldre kulturer kan resultere i et dominerende uttrykk av celler i omkringliggende gliacellene arr eller et lavt uttrykk i neurons, henholdsvis. - Til slutt plasserer skiver tilbake i inkubator og vedlikeholde dem i minst 6 dager. Ikke endre mediet på dagen for Transduction.
4. fjerning av gliacellene Scar (Figur 3)
- Like før du starter et eksperiment, overføre en innsats som inneholder kultivert skiver inn i den sterile hetten og plassere den i en 30 mm parabol, som inneholder 1 mL OCT medium eller MEM.
- Plasser parabolen under stereoscope og fokus på overflaten av stykket.
- Bruk to sterile sprøyte nåler (23 G, 1 ") for å lage en kort kryss-kutt rett på de smale kantene av en valgt SKIVE (Figur 3). Denne prosedyren vil frigjøre spenningen i overflaten opprettet av gliacellene arr forårsaker det å trekke tilbake, og dermed utsette de underliggende lagene (se figur 5).
Merk: Det første vev laget (gliacellene arr) er hovedsakelig dannet av reaktiv astrocytter. I bredt felt Imaging, dette tette vevet laget vil resultere i ytterligere spredning av lyset, noe som resulterer i uskarpe bilder. Fjerne arret er dermed en fordel å få bedre synlighet av de dypere lag, som inneholder riktig organotypic vev. Således, vær forsiktig med å utføre dette kuttet utelukkende på kanten og i det øvre laget av stykket preparatet bare og ikke å skade vevet under. Vi observerte ikke forskjeller mellom data innhentet i OTCs med gliacellene arr med de fra arr-fri OTCs (data ikke vist). - Fjern den klargjorte sektoren fra innsatsen. For dette formål, bruk en steril skalpell og avgiftsdirektoratet det ved å lage rette parallelle kutt til membranen, danner en firkant eller en trekant med SKIVE i midten, mens du holder kantene av membranen med pinsett. Hvis innsatsen vertene flere skiver, overføre den tilbake til den opprinnelige platen og inn i inkubator. Overflaten spenning av mediet vil hindre lekkasje på overflaten av membranen.
Figur 3: skjematisk illustrasjon av den mekaniske fjerningen av det gliacellene arret. Figuren viser en hippocampus skive kultur som er dekket av et gliacellene arr (blåaktig ellipsoiden). Ved en tid klipping av tips av to sprøyte pinner på den minste pol av kulturen og på kanten av gliacellene arr (blå stiplet linje), vil arret flip til side. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. bånd-basert ATP tenkelig (skikkelsen 4)
- Før eksperimentet, forberede E-ACSF og boble den med 95% O2/5% co2 i minst 30 min for å få en pH på 7,4. Slå på den fluorescerende lyskilden (xenon-lampe) på monokromator (Figur 4). Start før du tar ut stykket fra inkubator.
Merk: Behold saltvanns boblet med 95% O2 og 5% co2 under hele eksperimentet. - Overfør stykket inn i en eksperimentell kammer som er stadig perfusert med fersk carbogenated E-ACSF ved hjelp av en peristaltisk pumpe (Figur 4). Deretter reparerer du sektoren med et rutenett. Plasser kammeret på scenen for mikroskopet og koble til Gass bestandig laboratorie slange anbefales for
Merk: Eksperimenter kan utføres ved romtemperatur eller i nærheten av fysiologisk temperatur, avhengig av eksperimentell design. Kontroller stabiliteten og påliteligheten til luftstrømmen for å unngå endringer i fokuset forårsaket av bevegelse av vevet og/eller endringer i skjær stress. Standard-hastighet for skive arbeid, brukt av oss og mange andre laboratorier, er 1,5-2,5 mL/min.
Figur 4: konfigurasjon av bånd avbildnings oppsettet. (A) skjematisk illustrasjon av de ulike komponentene og deres romlig ordning som kreves for bånd Imaging setup. Ordningen består av en monokromator med en xenon lampe som lyskilde, en oppreist fast-Stage mikroskop (1), et bilde-splitter system (2), en digital CCD eller CMOS-kamera for time-lapse opptak (3), og en eksperimentell bad tilpasset for stabil konstant-(4). Badekaret av en peristaltisk pumpe med justerbar strømningshastighet. (B) bilde av det eksperimentelle arbeidsområdet. Det bånd tenkelig setup er montert på en vibrasjon-dempet bord bærer en x/y-translational scene, i hvilket det eksperimentelle bad er lagt ned i. Tall: se (A). (C) skjematisk visning av lys veien fra monokromator til det digitale kameraet. Indikert er plasseringen av de ulike filtrene og dichroic speilet. Tall: se (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bring den kultivert skive i fokus ved hjelp av overføring lys. Identifiser området der eksperimenter skal utføres (for eksempel: CA1-regionen i hippocampus). Før du starter bilde eksperimenter, må du vente i minst 15 minutter for at sektorene skal kunne tilpasse seg saltvanns forholdene. For konfigurasjon av det eksperimentelle oppsettet, se Figur 4.
- Slå på kameraet og bildebehandlingsprogrammet. Deretter velger du riktig filter kube.
- Opphisse donor fluorescerende protein (eCFP) ved 435/17 NM (~ 435 NM). Angi eksponeringstid mellom 40 til 90 MS.
Merk: Sterk eksponering av skiver til fluorescerende lys kan resultere i fototoksisk effekter. - Eksitasjon ved 435 NM resulterer i utslipp ved både 475 NM (eCFP; giver) og 527 NM (Venus; Acceptor). Split fluorescens utslipp på 500 NM med en utslipps bilde splitter og ansette band pass filtre på 483/32 og 542/27 til ytterligere isolere donor og Acceptor fluorescens. Sterkt uttrykk kan resultere i metning av detektoren. I dette tilfellet kan du bruke et nøytralt tetthets filter for å redusere intensiteten i eksitasjon.
- Velg en region av interesse (ROI) tilsynelatende blottet for mobilnettet fluorescens for bakgrunnen subtraksjon. Deretter oppretter du ROIs opptegning celle organer.
- Angi hyppigheten for bildeinnhenting og den totale opptakstiden. For lange eksperimenter (> 30 min) anbefales en anskaffelses frekvens på 0,2 – 0,5 Hz for å forhindre Phototoksisitet.
- Start opptaket. Det anbefales å spille inn minst 5 min under Baseline forhold for å sikre stabiliteten av preparatet.
Merk: Juster fokus på cellen under opptaket om nødvendig. - For å indusere endringer i intracellulære ATP, Overfør rør røret fra standard ACSF til en saltvann som inneholder metabolske hemmere (f. eks CIS, se tabell 1 og nedenfor). Alternativt kan du bruke en saltvann med forhøyet kalium konsentrasjon for å etterligne frigjøring av kalium fra aktive neurons.
Merk: Søknad ved bad er en relativt langsom prosess, som globalt fungerer på hele preparatet. Legg merke til den tiden der den nye løsningen faktisk begynte å gå inn i eksperimentell bad. Avhengig av avstanden mellom kammeret og saltvanns reservoaret, så vel som på hastigheten til en annen, må forsinkelsestiden vurderes.
6. høyoppløselig dokumentasjon av Cellular ATeam fluorescens
- Rett etter opptakene overfører du Innspillings kammeret som inneholder sektor kulturen, til det konfokalmikroskopi laser skanne mikroskopet.
Merk: Vær spesielt forsiktig. På grunn av potensielle photoskade, utføre dette trinnet bare etter eksperimenter. For dokumentasjonsformål kan man bytte E-ACSF med H-ACSF. Derfor er det ikke nødvendigvis nødvendig med et - Ta z-stabler med den høyeste z-oppløsningen som er mulig ved den gitte optiske konfigurasjonen.
- Bruk en deconvolution algoritme for å øke bildeoppløsningen.
Representative Results
AAV vektorer er et pålitelig verktøy for å selektivt uttrykke utenlandske gener i celler i levende vev16. Direkte anvendelse av AAVs som inneholder sekvens kassetten til ATeam 1.03YEMK og en spesifikk promoter resulterer i et høyt uttrykk for sensoren i den valgte celletypen. På DIV 14 (~ 10 dager etter en Transduction), neurons uttrykker ATeam under den menneskelige synapsin arrangøren er funnet ved høy tetthet i mektig av kultivert vev skiver på dybder på opptil 50 μm under skive overflaten (figur 5a). Sammenlignbare resultater kan oppnås i hippocampus (figur 5B).
Figur 5: visualisering av neurons uttrykke ATeam 1.03YEMK i kultivert parasagittal organotypic hjerne skiver. Bilder til venstre tilsvarer utvidet fokus anslag av 43 optiske seksjoner (1,05 μm hver) av kortikale vev (A) og (B) av 70 optiske seksjoner (0,6 μm hver) av hippocampus vev. Bilder til høyre representerer volum visningen av samme projeksjon. Celler er fargekodet i henhold til dybden i forhold til skive overflaten som angitt av Fargeskalaen til høyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For måling av ATP nivåer i astrocytter, ATeam 1.03YEMK uttrykkes under kontroll av den menneskelige gliacellene fibrillary surt PROTEIN (GFAP) promoter. Dette resulterer i effektiv Transduction av celler i både mektig og hippocampus av kultivert vev skiver (figur 6). Spesielt kan to forskjellige morfologiske fenotyper skilles, avhengig av dybden i forhold til overflaten av skive forberedelser. I det første, overfladiske laget, er celler preget av tykke primære prosesser som er hovedsakelig arrangert parallelt med overflaten. Disse cellene viser sterkt overlappende domener, og skaper en tett meshwork av tilsynelatende reaktiv astrocytter (figur 6). I dypere lag (30-60 μm fra overflaten), transduced astrocytter Exhibit fine cellulære prosesser som danner stort sett sfæriske domener og deres morfologi ligner på astrocytter in situ som rapportert tidligere19,20,21 (figur 6). For å få bedre Transduction av dypere-lags astrocytter samt bedre optisk tilgang til disse dypere lag, kan gliacellene arrvev fjernes som beskrevet i trinn 4.
Figur 6: visualisering av astrocytter uttrykker Ateam 1.03YEMK i kultivert parasagittal organotypic hjerne skiver. Bildet til venstre tilsvarer en utvidet fokus projeksjon av 191 optiske seksjoner (0,45 μm hver). For illustrasjon hensikt, det gliacellene arr var utelukket fra det prosjektering av astrocytter. Bilder til høyre representerer volum visningen av samme projeksjon før og etter fjerning av gliacellene arr. Celler er fargekodet i henhold til dybden i forhold til skive overflaten som angitt av fargeskalaer til høyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vellykket uttrykk for ATeam 1.03YEMK tillater dynamisk måling av endringer i ATP nivåer i neurons eller astrocytter, avhengig av arrangøren som brukes (se ovenfor). Eksperimenter ble utført i en eksperimentell bad stadig perfusert med E-ACSF (boblet med 95% O2/5% co2). I organotypic skiver uttrykker ATeam 1.03YEMK i hippocampus neurons, regioner av interesse (ROIs) ble valgt før du starter innspillingen, som representerer somata av pyramideformet celler (figur 7A). Videre ble det valgt en region for bakgrunns subtraksjon (figur 7a). Utslipp av Venus samt eCFP fluorescens ble deretter samlet for hver av disse ROIs separat og avbildet som fluorescens utslippsnivå over tid (figur 7B). Etter innspillingen fluorescens under kontroll forhold i flere minutter for å sikre en stabil Baseline, cellulær metabolisme ble hemmet ved å utsette stykket forberedelse til en glukose-fri saltvann, som 5 mM natrium Natriumazid (NaN3) ble lagt i ett minutt (figur 7B). Dette manipulasjon indusert motsatte endringer i utslipps intensiteten av bånd pair (figur 7B, venstre paneler), med en reduksjon av Venus (527 NM) og en økning på eCFP (475 NM) utslipp. Beregning av bånd ratio ved å dele den fluorescens utslipp av Venus av eCFP (FVenus/feCFP) resulterte i signaler som reflekterer de RELATIVE endringene i intracellulære ATP nivåer, den såkalte "ATeam bånd ratio" (figur 7B, høyre panel). I alle innspilte neurons (n = 70 celler i N = 5 skiver), NaN3 forårsaket en reversibel nedgang i ATeam bånd ratio, noe som indikerer en reversibel nedgang i intracellulære ATP nivåer ved hemming av cellulær metabolisme.
Figur 7: demonstrasjon av tid forfalle ATEAM bånd ratio Imaging. (A) øverst til venstre: bred-Field fluorescens bilde av pyramideformet lag og stratum RADIATUM av CA1 regionen av en kultivert organotypic hippocampus skive uttrykker Ateam 1.03YEMK i neurons. Øverst til høyre: forstørret visning av eske delen som angitt til venstre. Hvite linjer avgrense regioner av interesse (ROIs) 1-3 representerer celle organer av CA1 pyramideformet neurons valgt for analyse i (B). BG representerer AVKASTNINGEN valgt for bakgrunnen korreksjon. Bunn: pseudo-fargede bilder som representerer fluorescens utslipp av Venus (grønn), eCFP (lilla) og forholdet mellom Venus/eCFP. (B) tidsforløp innspilling i ROIs 1-3, som representerer neuronal celle organer (se A). Spor på venstre Vis normalisert fluorescens utslipp av Venus (grønn) og eCFP (magenta). Spor til høyre viser tilsvarende ATeam bånd ratio. Merk at blod med 5 mM NaN3 i fravær av ekstracellulære glukose i 1 minutt (grå bar) induserer en reversibel nedgang i ATeam bånd-forholdet, noe som indikerer en reduksjon i intracellulære ATP-konsentrasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å sikre stabiliteten av preparatet og sensoren under langsiktige eksperiment vilkår, skiver uttrykke ATeam i neurons eller astrocytter ble stadig perfusert med ACSF for lengre perioder (> 50 min; n = 12 celler hver, N = 3 OTCs fra 3 hjerner). Under disse forholdene, ATeam bånd forholdet endret ikke (Figur 8). Utsette forberedelsene til CIS inneholder metabolske hemmere ("kjemisk iskemi", se tabell 1), i kontrast, igjen resulterte i forventet fall i ATeam bånd ratio som observert ovenfor.
Figur 8: planlagte eksperimenter som sysselsetter ATeam. Langsiktig ATeam bånd ratio Imaging i 14 forskjellige celler under Baseline forhold i neurons (topp) og astrocytter (nederst). Data ble tatt under sammenlignbare forhold som andre eksperimentelle data. På slutten av hver måling, kjemisk iskemi ble elicited ved å være med CIS som indikert av pilen. Merk: Baseline ATeam bånd prosenter er stabile over tid under Baseline forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Deretter analyserte vi responsen av neurons og astrocytter uttrykker ATeam 1.03YEMK til en økning i ekstracellulære kalium konsentrasjon. Etter å etablere en stabil Baseline, neurons ble perfusert med en saltvann der kalium konsentrasjonen ble økt fra 3 til 8 mM i 3 minutter (figur 9a). Dette manipulasjon gjorde imidlertid ikke resultere i en synlig endring i ATeam bånd ratio (n = 56 celler i N = 5 skiver). For å sikre at sensoren reagerte på en endring i ATP nivåer, ble skiver deretter igjen utsatt for en vedvarende periode av kjemiske iskemi elicited ved å erstatte E-ACSF av CIS. Kjemisk iskemi resulterte i en rask nedgang i ATeam bånd ratio til et nytt, stabilt nivå, indikerer nominell nedbryting av ATP etter 2-3 min (figur 9a).
Figur 9: representative eksperimenter som illustrerer endringer i ATP-nivåer i neurons og astrocytter. (A,B): bilder på venstre Vis ATeam fluorescens fra neurons og ASTROCYTTER ligger i hippocampus CA1 regionen organotypic skiver. Spor på høyre representerer tidsforløp innspillinger av ATeam bånd ratio innhentet fra en ROI plassert over en enkelt celle kroppen. I begge eksperimenter ble skiver først utsatt for en økning i ekstracellulære kalium konsentrasjon i 3 minutter (se bar), etterfulgt av en endelig eksponering for kjemiske iskemi. Merk at mens neurons ikke reagerer på høyden av ekstracellulære kalium (A), astrocytter reagere med en økning i ATP (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den samme eksperimentelle protokollen ble utført med skiver, der ATeam 1.03YEMK ble uttrykt i astrocytter. I motsetning til det som ble observert i neurons, astrocytter reagerte på økningen i ekstracellulære kalium ved en reversibel økning i ATeam bånd ratio, noe som indikerer en økning i intracellulære ATP nivåer (n = 70 celler i N = 5 skiver) (figur 9B). Påfølgende eksponering for kjemiske iskemi resulterte, som forventet, i et stort fall i ATeam bånd ratio, indikasjon på nominell reduksjon av intracellulære ATP (figur 9B).
Discussion
Her viser vi en prosedyre for celle-type spesifikke uttrykk for ATeam 1.03YEMK, et bånd-basert, genetisk kodet nanosensor14, for måling av endringer i ATP nivåer i astrocytter eller neurons i organotypic vev skive kulturer av musen hjernen15. I eksemplarisk innspillinger, viser vi at en økning i den ekstracellulære kalium konsentrasjonen ikke resulterer i en endring i ATP konsentrasjoner i neurons, mens astrocytic ATP nivåer stiger som svar på denne manipulasjon. Videre våre resultater viser at ved hemming av cellulære metabolisme, ATeam 1.03YEMK bånd ratio raskt synker i begge celletyper, noe som indikerer en rask nedgang i intracellulære ATP.
Uttrykk for ATeam 1.03YEMK i organotypic skive kulturer krever vedlikehold av vevet i kulturen under kontrollerte forhold i minst 7-10 dager. Alternativt kan Ateam 1.03YEMK også være ansatt for måling av ATP i akutt isolert hjernevev skiver og i optiske nerver av mus13,15. Målinger i akutt isolert vev, men nødvendig generering av transgene dyr eller en stereotactic anvendelse av viral vektorer i hjernen, som involverer dyr eksperimentering og strenge dyr omsorg protokoller. I denne forbindelse Ateam 1.03YEMK uttrykk i organotypic vev skive kulturer representerer en nyttig og verdifullt alternativ22,23. I mange år nå, organotypic tissue skive kulturer tjene som en etablert modell system for å studere neural egenskaper, tilkobling og utvikling24,25,26. De ikke bare opprettholde den generelle vev arkitektur og laminering (figur 1), men også vert for fortrinnsrett egenskaper cellekulturer som overlegen tilgjengelighet og direkte kontroll av eksperimentelle forhold. Organotypic vev skive kulturer er også rutinemessig ansatt for å uttrykke utenlandske gener ved hjelp av viral vektorer27. Flere typer viral vektorer har blitt rapportert å levere transgenes i hjernevevet16,28. Adenoviral vektorer induserer høye uttrykk i gliacellene celler, men ikke hippocampus neurons16, og kan generere gliacellene reaktivitet17. Adeno-assosiert viral vektorer som brukes her fremstå som et godt alternativ15, og deres effektivitet har også vært vist i vivo29.
Mens hovedsakelig brukes til studiet av neuronal egenskaper, nyere studier har fastslått at organotypic vev skive kulturer kan også være ansatt for analyse av astrocytter. Kultivert skiver er vanligvis dekket av et lag av reaktive astrocytter19,30 (figur 5), men astrocytter viser en mer innfødt, ikke-reaktiv morfologi og cytoarchitecture i dypere lag19,30 (figur 5). I denne studien beskriver vi en prosedyre for mekanisk fjerning av ytre gliacellene arr, som resulterer i en bedre eksperimentell og optisk tilgjengelighet av innfødte astrocytter innenfor de riktige organotypic vevs lag. Videre, dens fjerning forbedrer uttrykket effekt i dypere lag av organotypic skiver; Hvis gliacellene arr ikke er fjernet, Transduction av AAVs kan tendens til å være begrenset til overfladiske celle lag.
Flere eksterne mekaniske faktorer må vurderes når du utfører eksperimenter i vev skiver. En variasjon i Bad-hastighet kan indusere bevegelser av hele preparatet og/eller indusere endringer i fokus, noe som resulterer i kunstige forbigående endringer av sensorsignalet. Videre har både astrocytter og neurons blitt rapportert å reagere på mekaniske deformasjon som pålagt av høye takst32,33. I våre hender, ved hjelp av en pålitelig peristaltisk pumpe, sammen med å opprettholde små og stabile volumer av saltvann mellom vevet og målet (menisk) resulterer i et stabilt bånd-signal under Baseline forhold ved bruk av bruk her (1.5-2.5 mL/min; Figur 8).
I denne studien viser vi også at båndbasert avbildning med ATeam 1.03YEMK kan benyttes til å overvåke ATP-nivåer i neurons og astrocytter. En alternativ betyr innført tidligere for måling av Cellular ATP er den såkalte luciferin-luciferase analysen34,35,36,37. Denne tilnærmingen er imidlertid basert på Imaging av bioluminesens og gir bare en ganske lav Temporal og romlig oppløsning delvis på grunn av høy bakgrunnsstøy nivåer. En annen metode rutinemessig ansatt de siste årene var Imaging av endringer i intracellulære magnesium konsentrasjon ved hjelp av ion-sensitive fluoroforen magnesium grønn38,39,40. Denne tilnærmingen er knyttet til observasjon at et forbruk av ATP resulterer i utgivelsen av co-faktor magnesium. Bildebehandling med magnesium grønn gir dermed bare et sekundært estimat av endringer i ATP-nivåer. Videre er magnesium grønn også følsom for endringer i intracellulære kalsium, innføre en annen vanskelighet når tolke resultater oppnådd med denne metoden.
Den nylige utviklingen av genetisk-kodet nanosensors for direkte bildebehandling av cellulære metabolitter, derfor representerte et stort skritt fremover11,12. Flere forskjellige sensorer ble generert som kan benyttes for måling av intracellulære ATP36,41,42,43. Blant dem er de ratiometrisk fluorescerende ATP indikatoren "QUEEN"41 samt PercevalHR, som sanser ATP: ADP ratio42. Mens sistnevnte sonde er et verdifullt verktøy for studiet av energi status av celler, krever det samtidig måling av endringer i pH42.
ATeam er en nanosensor hvorav det finnes flere varianter, som – blant annet – er forskjellige i deres bindings affinitet for ATP14. In vitro, ATeam 1.03YEMK utstillinger en Kd på 1,2 mm ved 37 ° c, som er nær mobilnettet ATP nivåer bestemmes i ulike neuronal celletyper, alt fra hypothalamus og lillehjernen34 tilhippocampus 37,44,45. Ved Cuvette målinger resulterte senke temperaturen med 10 ° c i en signifikant reduksjon i bindings affinitet til ATeam 1.03YEMK til ATP, noe som tyder på at det kanskje ikke er ideelt for cellulær bildebehandling ved romtemperatur14. Våre tidligere studie15, men viste at atferden og responsen av Ateam 1.03YEMK uttrykt i neurons og astrocytter til ulike manipulasjoner ligner på nær fysiologiske og ved romtemperatur, noe som indikerer at sensoren gir pålitelig bestemmelse av intracellulære ATP nivåer under begge forhold. I tillegg adressert våre tidligere eksperimenter pH-følsomheten til ATeam 1.03YEMK uttrykt i cellene15, viser at det er ufølsom for endringer i intracellulære pH med om lag 0,1-0,2 pH-enheter. Hvis Kd i den lave mm-serien er en bekymring, kan alternative ATeam-varianter brukes14, blant dem rød-forskjøvet varianter av ATeam ("Go-ATeam")43.
Våre eksperimenter bruker ATeam 1.03YEMK demonstrere at en økning i ekstracellulære kalium konsentrasjon av noen få mm bare (fra 3 til 8 mm) resulterer i en forbigående økning i Ateam 1.03YEMK ratio i astrocytter i organotypic Slice kultur. Denne observasjonen bekrefter tidligere studier15,46 og tydelig indikerer at astrocytter svare på utgivelsen av kalium av aktive neurons med en økning i deres ATP produksjon, mest sannsynlig som en konsekvens av en stimulering av na+/K+-ATPase og na+/HCO3- cotransporter, henholdsvis47,48. I motsetning til dette, nevroner ikke viser et svar, som er i tråd med tidligere arbeid så vel15. Begge celle typene reagerte imidlertid raskt og sterkt på hemming av cellulær Glykolysen og mitokondrie åndedrett som vist før15. Under forhold av kjemiske iskemi, ATeam bånd prosenter falt til et nytt stabilt nivå, noe som indikerer en nominell nedbryting av mobilnettet ATP. Sistnevnte resultat antyder at både neurons samt astrocytter viser et relevant forbruk av ATP også under steady-state forhold uten ekstra stimulering av Synaptic aktivering eller anvendelse av nevrotransmittere. Til sammen konkluderer vi med at båndbasert avbildning med genetisk kodet nanosensors, blant dem ATeam 1.03YEMK, vil gi en verdifull tilnærming for å belyse de cellulære prosessene som er ansvarlige for endringer i intracellulære ATP-nivåer og cellulær ATP-forbruk under ulike forhold.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. Forfatterne fikk økonomisk støtte muliggjør åpen tilgang publikasjon av Nikon mikroskop Solutions, Düsseldorf, Tyskland, som produserer instrumenter som brukes i videoen artikkelen. Selskapet var hverken involvert i utformingen av eksperimentene som ble presentert her, heller ikke i utførelsen, heller ikke i data håndteringen, heller ikke i manuskriptet som skrev.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Claudia Rodrigo og Simone Durry for ekspert teknisk assistanse. Vi takker Dr. Niklas J. Gerkau og M.Sc. Joel Nelson for assistanse i utarbeidelsen av organotypic skive kulturer. Forskning i forfatterens laboratorium ble finansiert av den tyske Research Association (DFG; FOR 2795: ro 2327/13-1 og SPP 1757: ro 2327/8-2 til CRR; og SPP 1757: Young Glia oppstart midler til RL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
| 36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
| Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
| band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
| Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
| Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
| D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
| HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
| HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
| Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
| Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
| Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
| IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
| Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
| L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
| Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
| Microscope stage | custom build | ||
| Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
| Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
| Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
| NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
| Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
| WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |
References
- Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
- Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
- Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
- Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
- Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
- Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
- Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241 (2017).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
- Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
- Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
- Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
- Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623 (2018).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
- Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
- Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
- Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
- Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
- Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
- Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
- Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605 (2013).
- Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
- Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
- Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
- Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
- Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
- Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
- Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
- Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
- Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
- Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
- Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
- Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550 (2013).
- Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
- Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
- Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
- Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
- Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141 (2016).
- Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).
