Summary
Мы описываем протокол для клеточного типа специфического выражения генетически закодированного датчика ATeam1.03YEMK на органотипических срезах культур передних мозгов мыши. Кроме того, мы показываем, как использовать этот датчик для динамической визуализации клеточных уровней АТФ в нейронах и астроцитах.
Abstract
Нейронная активность в центральной нервной системе (ЦНС) вызывает высокий спрос на клеточную энергию, обеспечиваемую распадом аденозинтрифосфата (АТФ). Значительная доля АТФ необходима для переустановки ионных градиентов по плазменным мембранам, деградированным электрической сигнализацией нейронов. Существует доказательство того, что астроциты - хотя и не генерации быстрых электрических сигналов сами - проходят увеличение производства АТФ в ответ на активность нейронов и поддержки активных нейронов, обеспечивая метаболиты энергии к ним. Недавнее развитие генетически закодированных датчиков для различных метаболитов теперь позволяет изучать такие метаболические взаимодействия между нейронами и астроцитами. Здесь мы описываем протокол для клеточного типа специфического выражения ATP-чувствительной флуоресценции Резонансная энергия Передачи - (FRET-) датчик ATeam1.03YEMK в орханнотипической ткани ломтик культур мыши гиппокампа и коры головного мозга с использованием адено-связанных вирусных векторов (AAV). Кроме того, мы демонстрируем, как этот датчик может быть использован для динамического измерения изменений в уровнях клеточного АТФ в нейронах и астроцитах при увеличении внеклеточного калия и после индукции химической ишемии (т.е. ингибирования клеточного энергетического метаболизма).
Introduction
Возбуждая электрическую активность нейронов в значительной степени основана на потоке катионов, таких как натрий (Na)и калий (K)через их плазменные мембраны. Таким образом, для сигнализации требуется поддержание электрохимических градиентов этих двух ионов. Это достигается с помощью клеточного Na/K-ATPase (NKA), повсеместно выраженного электрогенного трансмембранного насоса, который выдавливает 3 Naиз клетки в обмен на 2 Kq из внеклеточного пространства, требующего потребления одной молекулы АТФ на транспортный цикл1. В дополнение к NKA, Есть несколько других АТС-потребителей ионных транспортеров, включая плазменную мембрану Ca 2 "ATPase, которая имеет жизненно важное значение для внутриклеточного Ca2" гомеостаз и его экспорт после деятельности индуцированного притока2. В пресинаптических пузырьках, вакуолярного типа H-ATPase(v-ATPase) создает градиент протона, необходимый для поглощения нейромедиатора в этом отсеке3.
Хотя активность нейронов, таким образом, требует значительного количества АТФ4, они не обладают значительной емкостью для хранения энергии. Вместо этого, они, кажется, полагаются на метаболические взаимодействия с соседними астроцитами, основными магазинами гликогена в мозге5. Было высказано предположение, что астроцитарный гликоген действительно играет важную роль в поддержке нейрональных потребностей энергии; и ключевым явлением в этой предлагаемой нейро-метаболических связей между двумя типами клеток является способность астроцитов увеличить их производство АТФ в ответ на нейронную активность6,7,8. Эта гипотеза, известная как астроцит-нейрон лактат ный шаттл (ANLS), все еще обсуждается, потому что другие работы предоставили доказательства того, что нейроны могут также увеличить свою собственную скорость гликолиза в ответ на стимуляцию9,10, отражая необходимость дальнейших методов и подходов к изучению взаимодействия нейро-глии.
Исследование клеточного энергетического метаболизма и уровней АТФ в нейронах и астроцитах для выяснения нейро-глиаметационных взаимодействий уже давно препятствует отсутствием подходящих зондов для обнаружения изменений концентрации метаболитов в живых клетках в тканях мозга. Последнее десятилетие, однако, обеспечило всплеск в разработке новых инструментов и новых генетически закодированных флуоресцентных зондов для различных метаболитов, в том числе датчики для АТФ, лактата, пирувата и других11,12. Используя эти инструменты, теперь можно непосредственно решать вопросы, связанные с потреблением клеточного АТФ и изменения в уровнях клеточной энергии на уровне одной клетки и в клеточном типе специфическим образом в нетронутой ткани мозга13.
В настоящей работе мы описываем процедуру визуализации цитозической динамики АТФ на нейронах и астроцитах культивированных органотипических срезов мозга. Мы показываем, как использовать адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) для клеточного типа специфического выражения генетически закодированного ATP-nanosensor ATeam1.03YEMK (14) в нейронах и астроцитах ломтиков мозга мыши, которые могут поддерживаться в клеточной культуре в течение нескольких недель15. Описана процедура удаления глиального шрама, который покрывает культивированные кусочки ткани, что улучшает оптическую доступность и визуализацию клеток в слоях органотипической ткани под ним. Наконец, мы покажем, как ATeam1.03YEMK может быть использован для выполнения FRET на основе изображений изменений в сотовых уровнях АТФ в этом препарате. Этот метод содержит основные преимущества, которые он не требует хирургических процедур мозга, обеспечивает высокий уровень экспрессии датчика и клеточного типа специфичности в культивированных ломтиках мозга, снижение инвазивности или стресса в клетках по сравнению с другими методами, как трансфекция путем электропорации или трансдукции с другими вирусными векторами10,16,17. Кроме того, этот протокол может быть применен к другим наносенсорам на основе FRET, среди которых варианты ATeam1.03, которые обеспечивают более низкую связывающую близость к ATP14.
Protocol
Настоящее исследование проводилось в строгом соответствии с институциональными руководящими принципами Университета Генриха Гейне дюссельдорфа, а также Директивой Совета Европейского сообщества (2010/63/ЕС). Все эксперименты с использованием органотипических культур среза мозга были доведены до сведения и одобрены Управлением по защите животных в Фонде по уходу за животными и использованию Университета Генриха Гейне дюссельдорф (институциональный номер акта: O50/05). В соответствии с рекомендациями Европейской комиссии18, животные до 10 дней были убиты путем обезглавливания.
1. Подготовка органотипических культур ломтикмозга (OTCs)
- За день до или не менее 30 мин до процедуры
- Приготовить чашку Петри (в стерильных условиях). Снимите крышку 6 хорошо пластины и место 800-850 Л otC среды в каждой скважине. Держите тарелку в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2/95% O2) до тех пор, пока требуется.
- Приготовьте стиральную посуду Петри (в стерильных условиях). Добавьте 3 мл HBSS к каждому 30 мм чашке Петри. В общей сложности 5 блюд на процедуру не требуется. Поместите их в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2/95% O2) в течение по крайней мере 30 минут - на ночь до тех пор, пока требуется.
- Подготовьте ACSF(Таблица 1). Держите солин без глюкозы при 4 градусах По Цельсию до следующего дня.
| Салины и СМИ - Формулировка | ||||
| Имя | Сокращение | Состав | Концентрация (мМ) | Комментарии |
| Искусственный спинномозговой жидкий раствор | ACSF | Nacl | 125 | Пузыристый с 5% CO2/95% O2, рН 7.4 |
| Kcl | 2.5 | Всегда добавляйте глюкозу прямо перед использованием. | ||
| CaCl2 | 2 | Не храните более одного дня с глюкозой | ||
| MgCl2 | 1 | 310 мОзм/л | ||
| 2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 26 | |||
| Глюкозы | 20 | |||
| Экспериментальный ACSF | E-ACSF | Nacl | 136 | Пузыристый с 5% CO2/95% O2, рН 7.4 |
| Kcl | 3 | Всегда добавляйте глюкозу прямо перед использованием. | ||
| CaCl2 | 2 | Не храните более одного дня с глюкозой | ||
| MgCl2 | 1 | 320 мОзм/л | ||
| 2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Глюкозы | 5 | |||
| Лактат | 1 | |||
| Химическое решение ишемии | Снг | Nacl | 136 | Пузыристый с 5% CO2/95% O2, рН 7.4 |
| Kcl | 3 | 318 мОзм/Л | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| 2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| 2, 2-Дезоксиглюкоза | 2 | |||
| NaN3 | 5 | |||
| 8 мМ калий ACSF | 8 мМ Ки ACSF | Nacl | 128 | Пузыристый с 5% CO2/95% O2, рН 7.4 |
| Kcl | 8 | 320 мОзм/л | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| 2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Глюкозы | 5 | |||
| Лактат | 1 | |||
| Hepes-буферизированный ACSF | H-ACSF | Nacl | 125 | Скорректировано до рН 7.4 с NaOH |
| Kcl | 3 | Всегда добавляйте глюкозу прямо перед использованием | ||
| CaCl2 | 2 | Не храните более одного дня с глюкозой | ||
| MgSO4 | 2 | 310 мОзм/л (с поправкой на сахарозу) | ||
| 2PO4 | 125 | |||
| Хепес | 25 | |||
| Глюкозы | 10 | |||
| Сбалансированное решение для соли Хэнкса | HBSS | Сигма (номер каталога H9394). | ||
| Фолбекко фосфат-буферный солин | DPBS | Гибко (каталог No 14287-080) | ||
| Органотипическая Культура Средний | Внебиржевой среды | тепло-инактивированной сыворотки лошади | 20% | 34 градусов по Цельсию, 5 % CO2,рН 7,4, при культивировании |
| Mem | 79% | 320 мОзм/л | ||
| L-глутамин | 1 | |||
| Инсулина | 0,01 мг/мл | |||
| Nacl | 14.5 | |||
| MgSO4 | 2 | |||
| CaCl2 | 1.44 | |||
| Аскорбиновая кислота | 0.00125 % | |||
| D-глюкоза | 13 |
Таблица 1: Состав решения.
- В день приготовления, добавить глюкозу в ACSF, поместите его на лед и начать восходящей с 95% O2/5% CO2, по крайней мере 30 мин, чтобы привести к рН 7,4.
- Рассечение и нарезка
- Пожертвуйте мышью (BalbC, оба пола) в послеродовые дни 6 до 8 путем быстрого обезглавливания и поместите голову в стеклянную чашку Петри, содержащую ледяной ACSF.
- Разоблачить череп, разрезая кожу со спины до задней кончик носовой кости. Затем осторожно вырежьте череп из фораменмага с помощью хирургических ножниц и разоблачите мозг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удостоверьте, что процедура соответствует руководящим принципам учреждения. - Удалить мозг и поместить его на мембрану фильтра в ледяной чашке Петри заполнены ACSF.
- Разделите полушария и выполните паразитадальный разрез под углом 45 градусов. Исправить одно полушарие на стадии вибратом ткани с помощью суперклея. Немедленно перенесите тканевой блок в ванну вибратом, содержащуюледяной ACSF (пузырь с 5% CO 2/95% O2). Наконец выровнять ткани. Держите второе полушарие в ледяной ACSF до нарезки.
- Отрегулируйте вибратом, чтобы нарезать ломтики на 250-400 мкм. Нарезка на 250 мкм даст около 12 ломтиков на животное (400 мкм: 7 ломтиков).
- После резки ломтик(Рисунок 1А),определить гиппокампа формирования на основе его типичный морфологический вид(Рисунок 1) и изолировать его с помощью подкожных игл (23 калибра, 1), сохраняя часть коры головного мозга, прилегающих к гиппокампа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение неокортекса при культивирование помогает сохранить целостность гиппокампа. Тем не менее, гиппокамп может быть изолирован и культивируется без коры головного мозга, если это необходимо. - Поместите ломтик на сетку в разогретую, ACSF (34 градуса по Цельсию, пузыриться с 5% CO2/95% O2) до тех пор, пока все ломтики собраны.
- Перенесите ломтики в ламинарный шкаф для продолжения в стерильных условиях.
Рисунок 1: Представитель передачи изображений острых и органотипических препаратов ломтик мозга. Сравнение остро изолированных паразиттального ломтика мозга (A) и паразиттального органотипического ломтика мозга поддерживается в культуре в течение 12 дней (B) с помощью широкоугольной транслюминарной микроскопии. ГД - зубная извилина; CA1/3 - CA1/CA3-регион гиппокампа; E-CTX - энторхинальная кора; CTX (нео-) кора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
2. Культирование ломтиков
- Аккуратно перенесите ломтики из ACSF в одну из предварительно разогретых блюд Петри, наполненную стерильным раствором соли Хэнка, используя перевернутое стерильное стекло Пастера пипетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизация тканей достигается путем разбавления (шаг 3.2). Перенесите как можно меньше ACSF в чашку Петри. - Измените пипетку и перенесите ломтики на вторую чашку Петри. Повторите процесс 5 раз в целом. Перенесите как можно меньше HBSS на следующие блюда Петри.
- Аккуратно поместите один ломтик за один раз в верхней части культуры вставки. Повторите процесс для каждого среза. Избегайте турбулентности в пипетке и подождите, пока ломтик спуски к кончику пипетки Пастера. Можно поместить до 4 ломтиков на одну мембрану.
- Тщательно удалите излишки раствора Хэнка из верхней части вставки с помощью тонкого наконечника.
- Держите культуры(рисунок 2) в инкубаторе на стыке газа (карбоген, 95% O2 /5% CO2)и жидкости при 37 градусах Цельсия до дня эксперимента. Замените среду каждые 2-3 дня.
Рисунок 2: Принцип ФРЕТ-изображений AtP в культурных органотипических ломтиков мозга с помощью генетически закодированного датчика ATeam1.03YEMK. Схематическое представление протокола, представленного в этой работе. Кратко, parasagittal organotypic ломтики, культивируется в течение 1-3 дней, трансцируются с адено-ассоциированных вирусный вектор, содержащий либо, астроцитов конкретных hGFAP- или нейрон конкретных hSyn-промоутер и последовательность для выражения ATeam1.03YEMK. Разбавленные аликвоты этих векторов (1:2-1:4) непосредственно наносятся на верхнюю часть ломтика, который поддерживается в условиях культивирования еще как минимум 6 дней. Изменения внутриклеточного уровня АТФ могут быть визуализированы в клетках, выражающих датчик, возбуждая его на уровне 434 нм и приобретая флуоресценцию одновременно на 527 (приемщик) и 475 (донор) нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
3. Выражение датчиков АТС с аадено-ассоциированным вирусным вектором(рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы соответствовать всем требованиям для обработки генетически модифицированных организмов!
- Для обработки вирусного вектора, аликвот адено-ассоциированных вирусных векторов (AAV2/5) на 1-2 Зл, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания. Храните аликвоты при -80 градусах по Цельсию.
- Поместите колбу, содержащую 10% отбеливателя на стерильную скамейку, чтобы отказаться от всего используемого остаточного материала, который был в контакте с вектором.
- Для трансдукции приготовьте разбавление 1 л переносчика с 2-3 Л DPBS. Фондовые растворы обычно демонстрируют физический титр в величине 1012 вирусных геномов на мл (vg/mL).
- Перенесите вставку, содержащую культурный кусочек, в стерильный капюшон.
- Не касаясь ткани, нанесите 0,5 л разбавленного вектора непосредственно к верхней части каждого ломтика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшее выражение в более глубоких слоях ткани получается путем претворения культивированных ломтиков на 1-3 дня в пробирке (DIV). Трансдукция старых культур может привести к преобладающей экспрессии клеток в окружающих глиальных шрам или низкое выражение в нейронах, соответственно. - Наконец, поместите ломтики обратно в инкубатор и поддерживать их, по крайней мере 6 дней. Не меняйте среду в день трансдукции.
4. Удаление глиального шрама(рисунок 3)
- Непосредственно перед началом эксперимента перенесите вставку, содержащую культивированные ломтики, в стерильный капюшон и поместите ее в 30-мм тарелку, содержащую 1 мл oct medium или MEM.
- Поместите блюдо под стереоскоп и сосредоточьтесь на поверхности ломтика.
- Используйте две стерильные подкожные иглы (23 G, 1), чтобы сделать короткий крест-вырезать прямо на узких краях выбранного ломтика(рисунок 3). Эта процедура позволит освободить напряжение на поверхности, созданной глиальный шрам заставляя его втягиваться, тем самым подвергая основные слои (см. Рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Первый слой ткани (глиальный шрам) в основном формируется реактивными астроцитами. При широкоугольной визуализации этот плотный слой тканей приведет к дополнительному рассеянию света, что приведет к размытым изображениям. Удаление шрама, таким образом, выгодно, чтобы получить лучшую видимость более глубоких слоев, которые содержат надлежащие оргаторотипические ткани. Таким образом, будьте осторожны, чтобы выполнить этот разрез исключительно на краю и в верхнем слое среза подготовки только и не повредить ткани под ним. Мы не наблюдали различий между данными, полученными в OTCs с глиальным шрамом с данными от OTCs без шрамов (данные не показаны). - Удалите подготовленный ломтик из вставки. Для этого используйте стерильный скальпель и вырезайте его, делая прямые параллельные разрезы мембраны, образуя квадрат или треугольник с ломтиком в центре, удерживая при этом края мембраны пинцетом. Если вставить упор на дополнительные ломтики, перенесите его обратно в оригинальную пластину и в инкубатор. Поверхностное натяжение среды предотвратит его утечку на поверхность мембраны.
Рисунок 3: Схематическая иллюстрация механического удаления глиального шрама. На рисунке показана гиппокампа срез культуры, которая покрыта глиальный шрам (синий эллипсоид). Одним разом стрижка двух шприц игл на самом маленьком полюсе культуры и на краю глиального шрама (синяя пунктирная линия) шрам будет отворачиваться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
5. ФРЕТ на основе ATP изображений (Рисунок 4)
- Перед экспериментом, подготовить E-ACSF и пузырь его с 95% O2/5% CO2, по крайней мере 30 мин, чтобы получить рН 7,4. Включите флуоресцентный источник света (ксеноновые лампы) монохроматора(рисунок 4). Начните перфузию непосредственно перед вынимаем ломтик из инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите солин пузыриться с 95% O2 и 5% CO2 в течение всего эксперимента. - Перенесите ломтик в экспериментальную камеру, которая постоянно пронизана свежевыжатой e-ACSF с помощью перистальтического насоса(рисунок 4). Затем почините срез сеткой. Поместите камеру на сцену микроскопа и соедините перфузионную систему. Для перфузии рекомендуется газонепроницаемые лабораторные трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты могут проводиться при комнатной температуре или вблизи физиологической температуры, в зависимости от экспериментальной конструкции. Проверьте стабильность и надежность перфузионного потока, чтобы избежать изменений фокусировки, вызванной движением ткани и/или изменениями в стрессе сдвига. Стандартные перфузионные скорости для среза, используемые нами и многими другими лабораториями, составляют 1,5-2,5 мл/мин.
Рисунок 4: Конфигурация установки визуализации FRET. (A) Схематическая иллюстрация различных компонентов и их пространственного расположения, необходимого для установки визуализации FRET. Расположение состоит из монохроматора с ксеноонной лампой в качестве источника света, вертикального фиксированного сценического микроскопа (1), системы сплиттера изображений (2), цифровой CCD или камеры CMOS для замедленной записи (3) и экспериментальной ванны, адаптированной для стабильной постоянной перфузии (4). Перфузия ванны реализуется перистальтический насос с регулируемой скоростью потока. (B) Изображение экспериментального рабочего пространства. Установка изображения FRET установлена на вибрационно-смоченном столе, несущем x/y-переводческую стадию, в которую встроена экспериментальная ванна. Цифры: см. (A). (C) Схематический вид светового пути от монохроматора к цифровой камере. Показано положение различных фильтров и дихроического зеркала. Цифры: см. (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Принесите культивированный кусок в фокус с помощью света передачи. Определите область, где должны проводиться эксперименты (пример: область CA1 гиппокампа). Перед началом экспериментов по визуализации подождите не менее 15 минут, чтобы ломтики адаптировались к сольящим условиям. Для конфигурации экспериментальной установки см. Рисунок 4.
- Включите камеру и программное обеспечение для визуализации. Затем выберите правильный кубик фильтра.
- Возбуждайте донора флуоресцентным белком (eCFP) на уровне 435/17 нм (435 нм). Установите время экспозиции от 40 до 90 мс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное воздействие ломтиков на флуоресцентный свет может привести к фототоксическим эффектам. - Возбуждение на уровне 435 нм приводит к выбросам как на уровне 475 нм (eCFP; донор) и 527 нм (Венера; принимающий). Разделите излучение флуоресценции на 500 нм с сплиттером изображений и наиспользуйте фильтры пропусков диапазона на 483/32 и 542/27 для дальнейшей изоляции донора и приемного флуоресценции. Сильное выражение может привести к насыщению детекторов. В этом случае можно использовать фильтр нейтральной плотности для снижения интенсивности возбуждения.
- Выберите область интереса (ROI), по-видимому, лишенную клеточной флуоресценции для фонового вычитания. Затем создайте ROIs, разграничивая тела клеток.
- Установите частоту приобретения изображения и общее время записи. Для длительных экспериментов (30 мин) для предотвращения фототоксичности рекомендуется частота приобретения 0,2-0,5 Гц.
- Начните запись. Для обеспечения стабильности препарата рекомендуется записывать не менее 5 мин в базовых условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте фокус ячейки во время записи. - Чтобы вызвать изменения внутриклеточного АТФ, перенесите перфузионную трубку из стандартного ACSF в солевый, содержащий метаболические ингибиторы (например, СНГ, см. таблицу 1 и ниже). Кроме того, используйте солен с повышенной концентрацией калия, чтобы имитировать высвобождение калия из активных нейронов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение перфузии ванны является относительно медленным процессом, который глобально действует на весь препарат. Принять к сведению время, когда новое решение фактически начал входить в экспериментальную ванну. В зависимости от расстояния между камерой и солевым резервуаром, а также от скорости перфузии, необходимо учитывать время задержки.
6. Высокое разрешение Документация сотовых ATeam Флуоресценция
- Непосредственно после записи, передача камеры записи, содержащей срез культуры конфокальный лазерный скан микроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь. Из-за потенциального фотоповреждения выполните этот шаг только после экспериментов. Для целей документации можно обменять E-ACSF на H-ACSF. Таким образом, перфузионная система не обязательно требуется. - Возьмите z-стеки с самым высоким z разрешением возможно в данной оптической конфигурации.
- Применяйте алгоритм деконволюции для увеличения разрешения изображения.
Representative Results
Векторы AAV являются надежным инструментом для выборочного выражения чужеродных генов в клетках живой ткани16. Прямое применение AAVs, содержащего последовательность кассеты ATeam1.03YEMK и конкретный промоутер приводит к высокой экспрессии датчика в выбранном типе ячейки. На DIV 14 (10 дней после трансдукции), нейроны, выражающие ATeam под человека синапсин промоутер находятся при высокой плотности в неокортекс культивированных ломтиков ткани на глубинах до 50 мкм ниже поверхности ломтика (Рисунок 5A). Сопоставимые результаты могут быть достигнуты в гиппокампе(рисунок 5B).
Рисунок 5: Визуализация нейронов, выражающих ATeam1.03YEMK в культурных паразитических органотипических ломтиках мозга. Изображения слева соответствуют расширенным фокус-проекциям 43 оптических секций (1,05 мкм каждый) корковой ткани(A)и (B) 70 оптических секций (0,6 мкм каждый) гиппокампальной ткани. Изображения справа представляют вид громкости одной и той же проекции. Клетки закодированы в соответствии с их глубиной относительно поверхности среза, как показано в цветовой шкале справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для измерения уровня АТФ в астроцитах, ATeam1.03YEMK выражается под контролем человека глиальных фибриллачного кислотного белка (GFAP) промоутер. Это приводит к эффективному трансдукции клеток как в неокортексе, так и в гиппокампе культивированных ломтиков тканей(рисунок 6). Примечательно, что два различных морфологических фенотипа можно выделить, в зависимости от глубины относительно поверхности срезанных препаратов. В первом, поверхностном слое клетки характеризуются толстыми первичными процессами, которые преимущественно расположены параллельно поверхности. Эти клетки демонстрируют сильно перекрывающиеся домены, создавая плотную сетку из кажущееся реактивными астроцитами(рисунок 6). В более глубоких слоях (30-60 мкм от поверхности), трансиндуцированных астроцитов экспонат тонкой клеточной процессов, которые образуют в значительной степени сферических доменов и их морфологии напоминает, что астроцитов на месте, как сообщалось ранее19,20,21 (Рисунок 6). Чтобы получить лучшую трансдукцию астроцитов более глубокого слоя, а также лучший оптический доступ к этим более глубоким слоям, глиальная рубцовая ткань может быть удалена, как описано в шаге 4.
Рисунок 6: Визуализация астроцитов, выражающих ATeam1.03YEMK в культурных паразитических органотипических ломтиках мозга. Изображение слева соответствует расширенной фокусной проекции 191 оптической секции (0,45 мкм каждая). Для иллюстрации, глиальный шрам был исключен из проекции астроцитов. Изображения справа представляют вид громкости одной и той же проекции до и после удаления глиального шрама. Клетки закодированы в соответствии с их глубиной относительно поверхности среза, как показано на цветовые чешуйки справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Успешное выражение ATeam1.03YEMK позволяет динамическое измерение изменений уровней АТФ в нейронах или астроцитах, в зависимости от используемого промотора (см. выше). Эксперименты проводились в экспериментальной ванне, постоянно пронизаваемой E-ACSF (пузыристый с 95% O2/5% CO2). В органотипических ломтиках, выражающих ATeam1.03YEMK в гиппокампе нейронов, области интереса (ROIs) были выбраны перед началом записи, представляющих somata пирамидальных клеток(Рисунок 7A). Кроме того, был выбран регион для фонового вычитания(рисунок 7А). Выбросы Венеры, а также ФЛуоресценция eCFP затем был собран для каждого из этих ROIs отдельно и изображается как уровень выбросов флуоресценции с течением времени(рисунок 7B). После записи флуоресценции в условиях контроля в течение нескольких минут, чтобы обеспечить стабильный базовый, клеточный метаболизм был ингибирован, подвергая срез подготовки к глюкозе свободного солевого раствора, к которому 5 мМ натрия азид (NaN3) был добавлен в течение одной минуты(Рисунок 7B). Эта манипуляция вызвала противоположные изменения в интенсивности выбросов пары FRET(рисунок 7B, левые панели), с уменьшением Венеры (527 нм) и увеличением выбросов eCFP (475 нм). Расчет соотношения ФРЕТ путем деления флуоресценции выбросов Венеры на eCFP (FVenus/FeCFP) привел к сигналам, которые отражают относительные изменения внутриклеточного уровня АТФ, так называемое "коэффициент ATeam FRET"(рисунок 7B, правая панель). Во всех зарегистрированных нейронах (n 70 клеток в N и 5 ломтиках), NaN3 вызвало обратимое снижение соотношения ATeam FRET, что указывает на обратимое снижение внутриклеточного уровня АТФ при ингибировании клеточного метаболизма.
Рисунок 7: Демонстрация промежуток времени ATeam FRET соотношение изображений. (A) Вверху слева: Широкое поле флуоресценции изображение пирамидального слоя и слоя радиат ca1 региона культивированных органотипических гиппокампа ломтик выражения ATeam1.03YEMK в нейронах. Вверху справа: Увеличенный вид коробочного раздела, указанный слева. Белые линии разграничения регионов, представляющих интерес (ROIs) 1-3 представляющих клеточные тела CA1 пирамидальных нейронов, выбранных для анализа в (B). BG представляет рентабельность инвестиций, выбранную для коррекции фона. Внизу: Псевдоцветные изображения, представляющие флуоресценцию выбросов Венеры (зеленый), eCFP (фиолетовый) и соотношение Венеры / eCFP. (B) Промежуток времени записи в ROIs 1-3, представляющих нейрональных клеточных органов (см. A). Следы слева показывают нормализованное излучение флуоресценции Венеры (зеленый) и eCFP (магента). Следы справа показывают соответствующее соотношение ATeam FRET. Отметим, что перфузия с 5 мМ NaN3 при отсутствии внеклеточной глюкозы в течение 1 минуты (серый бар) вызывает обратимое снижение соотношения ATeam FRET, что указывает на снижение внутриклеточной концентрации АТФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для обеспечения стабильности препарата и датчика в условиях длительного эксперимента, ломтики, выражающие ATeam в нейронах или астроцитах, постоянно пронизаны ACSF в течение длительных периодов времени (nogt;50 мин; n - 12 клеток каждый, N - 3 OTCs из 3 мозгов). В этих условиях соотношение ATeam FRET не изменилось(рисунок 8). Разоблачение препаратов в СНГ, содержащих метаболические ингибиторы ("Химическая ишемия", см. таблицу 1),напротив, вновь привело к ожидаемому снижению соотношения ATeam FRET, как это наблюдалось выше.
Рисунок 8: Базовые эксперименты с использованием ATeam. Долгосрочная визуализация соотношения ATeam FRET в 14 различных клетках в базовых условиях в нейронах (вверху) и астроцитах (внизу). Данные были взяты в сопоставимых условиях, как и другие экспериментальные данные. В конце каждого измерения химическая ишемия вызывалась перфузией с СНГ, о чем свидетельствует стрелка. ПРИМЕЧАНИЕ: Базовые коэффициенты ATeam FRET стабильны с течением времени в базовых условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Далее мы проанализировали реакцию нейронов и астроцитов, выражающих ATeam1.03YEMK на повышение внеклеточной концентрации калия. После установления стабильного базового, нейроны были проникнуты сольников, в котором концентрация калия была увеличена с 3 до 8 мм в течение 3 минут(рисунок 9A). Эта манипуляция, однако, не привела к обнаруживаемым изменениям в соотношении ATeam FRET (n no 56 ячеек в n и 5 срезах). Для того, чтобы датчик отреагировал на изменение уровней АТФ, ломтики затем снова подвергались длительному периоду химической ишемии, вызванной заменой E-ACSF в СНГ. Химическая ишемия привела к быстрому снижению соотношения ATeam FRET к новому, стабильному уровню, что указывает на номинальное истощение АТФ после 2-3 мин(рисунок 9А).
Рисунок 9: Представитель экспериментов, иллюстрирующих изменения в уровнях АТФ в нейронах и астроцитах. (A,B): Изображения слева показывают ATeam флуоресценции от нейронов и астроцитов, расположенных в гиппокампе CA1 области органотипических ломтиков. Следы справа представляют записи промежуток времени соотношения ATeam FRET, полученные из рентабельности инвестиций, расположенных на одном клеточном теле. В обоих экспериментах, ломтики были сначала подвергаются увеличению концентрации внеклеточного калия в течение 3 минут (см. бар), а затем окончательное воздействие химической ишемии. Обратите внимание, что в то время как нейроны не реагируют на повышение внеклеточного калия (A), астроциты реагируют с увеличением АТФ (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Тот же экспериментальный протокол был выполнен с ломтиками, в которых ATeam1.03YEMK был выражен в астроцитах. В отличие от того, что наблюдалось в нейронах, астроциты реагировали на увеличение внеклеточного калия обратимым увеличением соотношения ATeam FRET, что указывает на увеличение внутриклеточного уровня АТФ (n - 70 клеток в N и 5 ломтиках)(рисунок 9B). Последующее воздействие химической ишемии привело, как и ожидалось, в значительное падение соотношения ATeam FRET, что свидетельствует о номинальном истощении внутриклеточного АТФ(рисунок 9B).
Discussion
Здесь мы демонстрируем процедуру для клеточного типа специфического выражения ATeam1.03YEMK, FRET-основанный, genetically закодированный nanosensor14,для измерения изменений в уровнях ATP в астроцитах или неветрах в organotypic культурах ломтика ткани мозга мыши15. В примерных записях мы показываем, что увеличение концентрации внеклеточного калия не приводит к изменению концентраций АТФ в нейронах, в то время как астроцитарные уровни АТФ повышаются в ответ на эту манипуляцию. Более того, наши результаты показывают, что при ингибировании клеточного метаболизма, соотношение ATeam1.03YEMK FRET быстро падает в обоих типах клеток, что свидетельствует о быстром снижении внутриклеточного АТФ.
Выражение ATeam1.03YEMK в органотипических срезах культур требует поддержания тканей в культуре в контролируемых условиях не менее 7-10 дней. Кроме того, ATeam1.03YEMK также может быть использован для измерения АТФ в остро изолированных ломтиков ткани мозга и в зрительных нервах мышей13,15. Измерения в остро изолированных тканях, однако, требуют генерации трансгенных животных или стереотактического применения вирусных переносчиков в мозг, включая эксперименты с животными и строгие протоколы по уходу за животными. В этой связи выражение ATeam1.03YEMK в органотипических культурах среза тканей представляет собой полезную и ценную альтернативу22,23. На протяжении многих лет, органотипические культуры среза ткани служат установленной модельной системой для изучения нервных свойств, подключения и развития24,25,26. Они не только поддерживают общую архитектуру тканей и ламинирование(рисунок 1),но и размещают преференциальные свойства клеточных культур, таких как превосходная доступность и прямой контроль экспериментальных условий. Органотипические культуры среза тканей также регулярно используются для выражения чужих генов с помощью вирусных векторов27. Несколько типов вирусных векторов, как сообщается, доставить трансгены в ткани мозга16,28. Аденовирусные векторы вызывают высокую экспрессию в глиальных клетках, но не гиппокампа нейронов16, и может генерировать глиальной реактивности17. Адено-ассоциированных вирусных векторов, используемых здесь появляются в качестве хорошей альтернативы15, и их эффективность также была показана в vivo29.
Хотя в основном используется для изучения нейронных свойств, последние исследования установили, что органотипические культуры кусок ткани также могут быть использованы для анализа астроцитов. Культурные ломтики, как правило, покрыты слоем реактивных астроцитов19,30 (Рисунок 5), но астроциты обладают более родной, нереактивной морфологии и цитоархитектуры в более глубоких слоях19,30 (Рисунок 5). В настоящем исследовании мы описываем процедуру механического удаления внешнего глиального шрама, что приводит к лучшей экспериментальной и оптической доступности родных астроцитов в надлежащих органотипических слоях ткани. Кроме того, его удаление повышает эффективность выражения в более глубоких слоях органотипических ломтиков; если глиальный шрам не удаляется, трансдукция AAVs может, как правило, ограничивается поверхностными слоями клеток.
При проведении экспериментов на фрагментах тканей необходимо учитывать несколько внешних механических факторов. Изменение скорости перфузии ванны может вызвать движения всего препарата и/или вызвать изменения в фокусе, что приводит к искусственным переходным изменениям сигнала датчика. Кроме того, как астроциты и нейроны, как сообщается, реагировать на механические деформации, такие как введенные высокой скоростью перфузии32,33. В наших руках, используя надежный перистальтический насос, вместе с поддержанием небольших и стабильных объемов сольника между тканью и объективным (мениска) приводит к стабильному FRET-сигналу в базовых условиях при используемой здесь скорости перфузии (1,5-2,5 мл/мин) Рисунок 8).
В настоящем исследовании мы также демонстрируем, что изображения на основе ФРЕТ с ATeam1.03YEMK могут быть использованы для мониторинга уровней АТФ в нейронах и астроцитах. Альтернативным средством, введенным ранее для измерения клеточного АТФ, является так называемый люциферин-люцифераза, ассссы34,35,36,37. Этот подход, однако, основан на визуализации биолюминесценции и обеспечивает лишь довольно низкое временное и пространственное разрешение отчасти из-за высокого уровня фонового шума. Другой метод обычно используется в последние годы была визуализация изменений в концентрации внутриклеточного магния с использованием ионночувствительного фторофора магния зеленый38,39,40. Такой подход связан с наблюдением, что потребление АТС приводит к высвобождению его кофакторного магния. Изображение с магнием зеленый таким образом только обеспечивает вторичную оценку изменений в уровнях АТС. Кроме того, магний зеленый также чувствителен к изменениям внутриклеточного кальция, вводя еще одну трудность при интерпретации результатов, полученных с помощью этого метода.
Недавнее развитие генетически закодированных наносенсоров для прямого изображения клеточных метаболитов, таким образом, представляет собой большой шаг вперед11,12. Было создано несколько различных датчиков, которые могут быть использованы для измерения внутриклеточного АТБ36,41,42,43. Среди них коэффициентеметрический флуоресцентный индикатор АТФ "КУЭН"41, а также PercevalHR, который чувствует соотношение ATP:ADP42. Хотя последний зонд является ценным инструментом для изучения энергетического статуса клеток, он требует одновременного измерения изменений в рН42.
ATeam является наносенсор, из которых существует несколько вариантов, которые - среди прочего - отличаются по своей связывающей сродство к ATP14. In vitro, ATeam1.03YEMK экспонаты Kd 1,2 мМ при 37 градусах Цельсия, который близок к клеточным уровням АТФ определяется в различных типах нейрональных клеток, начиная от гипоталамуса и мозжечка34 до гиппокампа37,44,45. В измерениях cuvette, снижение температуры на 10 градусов по Цельсию привело к значительному снижению связывающей сродства ATeam1.03YEMK к АТФ, предполагая, что это не может быть идеальным для клеточной визуализации при комнатной температуре14. Наше предыдущее исследование15, однако, показали, что поведение и реакция ATeam1.03YEMK, выраженных в нейронах и астроцитах на различные манипуляции, аналогична при почти физиологической и комнатной температуре, указывая, что датчик позволяет надежно определить внутриклеточные уровни АТФ в обоих условиях. Кроме того, наши предыдущие эксперименты касались рН-чувствительности ATeam1.03YEMK, выраженной внутри клеток15, показывая, что он нечувствительн к изменениям внутриклеточного рН примерно на 0,1-0,2 рН единиц. Если Kd в диапазоне низких мМ вызывает озабоченность, альтернативные варианты ATeam могут быть использованы14, среди них красно-сдвинутые варианты ATeam ("GO-ATeam")43.
Наши эксперименты с использованием ATeam1.03YEMK показывают, что увеличение концентрации внеклеточного калия только на несколько мМ (от 3 до 8 мм) приводит к переходному увеличению соотношения ATeam1.03YEMK в астроцитах в органотипической культуре среза. Это наблюдение подтверждает более ранние исследования15,46 и ясно указывает на то, что астроциты реагировать на освобождение калия активными нейронами с увеличением их производства АТФ, в основном, вероятно, как следствие стимуляцииNaq /K-ATPaseи Naq/HCO3- cotransporter, соответственно47,48. В отличие от этого, нейроны не показали ответ, который в соответствии с предыдущей работой, а15. Оба типа клеток, однако, быстро и сильно реагировали на ингибирование клеточного гликолиза и митохондриального дыхания, как показано до15. В условиях химической ишемии коэффициенты ATeam FRET упали до нового стабильного уровня, что свидетельствует о номинальном истощении клеточного АТФ. Последний результат свидетельствует о том, что как нейроны, а также астроциты обладают соответствующим потреблением АТФ также при стабильном состоянии условиях без дополнительной стимуляции синаптической активации или применения нейротрансмиттеров. В совокупности мы пришли к выводу, что фрет-изображение с генетически закодированными наносенсорами, среди которых ATeam1.03YEMK, обеспечит ценный подход к разъяснению клеточных процессов, которые отвечают за изменения внутриклеточного уровня АТФ и потребления клеточного АТФ в различных условиях.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах. Авторы получили финансовую поддержку, позволяющую опубликовать открытый доступ от Nikon Microscope Solutions, Дюссельдорф, Германия, которая производит инструменты, используемые в видеостатье. Компания не участвовала ни в разработке представленных здесь экспериментов, ни в их выполнении, ни в обработке данных, ни в написании рукописей.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Клаудию Родериго и Симону Дюрри за квалифицированную техническую помощь. Мы благодарим д-ра Никласа Дж. Геркау и M.Sc Джоэла Нельсона за помощь в подготовке орханотипических культур. Исследования в авторской лаборатории финансировались Немецкой исследовательской ассоциацией (DFG; ДЛЯ 2795: Ro 2327/13-1 и SPP 1757: Ro 2327/8-2 к CRR; и SPP 1757: Молодая Глия Start-Up финансирования RL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
| 36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
| Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
| band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
| Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
| Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
| D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
| HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
| HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
| Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
| Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
| Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
| IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
| Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
| L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
| Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
| Microscope stage | custom build | ||
| Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
| Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
| Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
| NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
| Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
| WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |
References
- Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
- Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
- Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
- Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
- Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
- Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
- Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241 (2017).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
- Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
- Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
- Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
- Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623 (2018).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
- Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
- Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
- Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
- Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
- Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
- Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
- Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605 (2013).
- Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
- Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
- Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
- Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
- Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
- Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
- Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
- Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
- Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
- Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
- Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
- Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550 (2013).
- Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
- Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
- Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
- Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
- Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141 (2016).
- Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).
