Summary
我们描述了基于基因编码的FRET传感器ATeam1.03YEMK在小鼠前脑的有机切片培养物中细胞型特定表达的协议。此外,我们演示如何使用此传感器对神经元和星形细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。
Abstract
中枢神经系统 (CNS) 中的神经活动唤起了对三磷酸腺苷分解所提供的细胞能量的高需求。在因神经元的电信号而退化的等离子膜上重新安装电梯度需要大量 ATP。有证据表明,星形细胞虽然本身不产生快速的电信号,但会因神经元活动而增加ATP的产生,并通过向它们提供能量代谢物来支持活动神经元。最近针对不同代谢物的遗传编码传感器的发展,使得研究神经元和星形细胞之间的这种代谢相互作用成为可能。在这里,我们描述了ATP敏感荧光共振能量转移-(FRET-)传感器ATeam1.03YEMK在小鼠海马和皮层的器官组织切片培养中使用阿丁相关病毒载体(AAV)的细胞类型特定表达的协议。此外,我们演示了该传感器如何用于动态测量神经元和星形细胞在细胞外钾增加和化学缺血诱导后(即抑制细胞能量代谢)时细胞ATP水平的变化。
Introduction
神经元的兴奋电活动主要基于阳离子的通量,如钠(Na+)和钾(K+)在其血浆膜上。因此,信号需要维护这两个离子的电化学梯度。这是由细胞Na+/K+--ATPase(NKA),一个无处不在的表达电转基因泵,挤出3 Na+从细胞外空间交换2K+,需要消耗一个ATP分子每个传输周期1。除了NKA,还有其他几个ATP消耗的电传递器,包括血浆膜Ca 2+-ATPase,这对细胞内Ca2+平衡及其出口至关重要,在活动引起的流入2。在先发前囊泡中,真空型H+-ATPase(v-ATPase)产生神经递质进入这个腔室3所需的质子梯度。
虽然神经元的活动因此需要大量的ATP4,但它们并不表现出重要的能量储存能力。相反,他们似乎依赖于代谢相互作用与邻近的星形细胞,主要糖原储存在大脑5。有人建议,星形糖原确实在支持神经元能量需求方面起着重要的作用;在这两种细胞类型之间提出的神经代谢耦合中,一个关键现象是星形细胞在响应神经元活性6、7、8时增加其ATP产量的能力。这个假说,被称为星形细胞-神经元乳酸穿梭(ANLS),仍在争论中,因为其他工作已经提供了证据,神经元也可能提高自己的糖解率,以回应刺激9,10,反映了进一步的方法和方法的必要性,以研究神经-胶质相互作用。
长期以来,由于缺乏合适的探针来检测脑组织中活细胞中代谢物浓度的变化,对神经元和星形细胞中的细胞能量代谢和ATP水平的研究一直阻碍阐明神经-胶质代谢相互作用。然而,在过去的十年里,为不同的代谢物,包括ATP、乳酸盐、丙酮和其他11、12的传感器,提供了开发新工具和新的基因编码荧光探针的激增。使用这些工具,现在可以直接解决与细胞ATP消耗和细胞能量水平变化有关的问题,在单个细胞水平和细胞类型特定的方式在完整的脑组织13。
在本工程中,我们描述了一个过程,以可视化细胞ATP动力学的神经元和星形细胞培养的有机脑切片。我们展示如何使用阿不与病毒载体(AAV)进行基因编码的ATP-纳米传感器ATeam1.03YEMK(14)在神经元和星形细胞细胞中的细胞类型特定表达,这些细胞可以在细胞培养中维持数周。介绍了如何去除覆盖培养组织切片的胶质疤痕的过程,这改善了下面器官组织层中细胞的光学可访问性和成像。最后,我们展示了 ATeam1.03YEMK如何用于在此准备中执行基于 FRET 的细胞 ATP 水平变化成像。该方法具有不需要手术脑手术的主要优点,在培养脑切片中提供传感器和细胞类型特异性的高水平表达,减少细胞中的侵入性或压力,与其他方法相比,如电穿孔或转染与其他病毒载体10、16、17。此外,该协议可应用于其他基于FRET的纳米传感器,其中包括ATeam1.03的变种,为ATP14提供较低的绑定亲和力。
Protocol
本研究严格按照杜塞尔多夫海因里希海因大学的体制准则以及欧洲共同体理事会指令(2010/63/EU)进行。所有使用有机脑切片培养物的实验都传达给杜塞尔多夫海因里希海因大学动物护理和使用设施动物福利办公室并获得批准(机构行为编号:O50/05)。根据欧盟委员会18日的建议,10天以下的动物被斩首致死。
1. 组织脑切片培养的制备
- 手术前一天或手术前至少30分钟
- 准备培养皿(在无菌条件下)。取下 6 孔板的盖子,将 800-850 μL 的 OTC 介质放入每个孔中。将板保持在培养箱中(37°C,5% CO2/95% O2),直到需要为止。
- 准备洗涤培养皿(在无菌条件下)。将 3 mL 的 HBSS 添加到每个 30 毫米培养皿中。每个程序总共需要5道菜。将它们放入培养箱(37°C,5% CO2/95% O2)中至少30分钟- 过夜,直到需要为止。
- 准备 ACSF (表 1.将不含葡萄糖的盐水保持在4°C,直到第二天。
Salines 和媒体 - 配方 | ||||
名字 | 缩写 | 组成 | 浓度 [mM] | 评论 |
人工脑脊液溶液 | ACSF | Nacl | 125 | 气泡与 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
氯化钾 | 2.5 | 使用前务必添加葡萄糖。 | ||
CaCl2 | 2 | 不要储存超过一天的葡萄糖 | ||
MgCl2 | 1 | ±310 mOsm/L | ||
NaH2PO4 | 1.25 | |||
NaHCO3 | 26 | |||
葡萄糖 | 20 | |||
实验性ACSF | 电子交流F | Nacl | 136 | 气泡与 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
氯化钾 | 3 | 使用前务必添加葡萄糖。 | ||
CaCl2 | 2 | 不要储存超过一天的葡萄糖 | ||
MgCl2 | 1 | ±320 mOsm/L | ||
NaH2PO4 | 1.25 | |||
NaHCO3 | 24 | |||
葡萄糖 | 5 | |||
乳酸 | 1 | |||
化学缺血溶液 | Cis | Nacl | 136 | 气泡与 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
氯化钾 | 3 | Φ318 mOs/L | ||
CaCl2 | 2 | |||
MgCl2 | 1 | |||
NaH2PO4 | 1.25 | |||
NaHCO3 | 24 | |||
2、2-脱氧糖 | 2 | |||
纳恩3 | 5 | |||
8 mM ACSF 钾 | 8 mM K= ACSF | Nacl | 128 | 气泡与 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
氯化钾 | 8 | ±320 mOsm/L | ||
CaCl2 | 2 | |||
MgCl2 | 1 | |||
NaH2PO4 | 1.25 | |||
NaHCO3 | 24 | |||
葡萄糖 | 5 | |||
乳酸 | 1 | |||
Hepes 缓冲 ACSF | H-ACSF | Nacl | 125 | 使用 NaOH 调节至 pH 7.4 |
氯化钾 | 3 | 使用前务必添加葡萄糖 | ||
CaCl2 | 2 | 不要储存超过一天的葡萄糖 | ||
MgSO4 | 2 | ±310 mOsm/L(用蔗糖调节) | ||
NaH2PO4 | 125 | |||
赫普斯 | 25 | |||
葡萄糖 | 10 | |||
汉克斯的平衡盐溶液 | 哈佛商学院 | 西格玛(目录号 H9394)。 | ||
杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐 | DPBS | 吉布科(目录号14287-080) | ||
组织文化媒介 | 场外交易介质 | 热灭活马血清 | 20% | 34°C, 5 % CO2, pH 7.4, 在培养条件下 |
Mem | 79% | ±320 mOsm/L | ||
L-谷氨酰胺 | 1 | |||
胰岛素 | 0.01毫克/升 | |||
Nacl | 14.5 | |||
MgSO4 | 2 | |||
CaCl2 | 1.44 | |||
抗坏血酸 | 0.00125 % | |||
D-葡萄糖 | 13 |
表 1:解决方案组成。
- 在制备当天,将葡萄糖加入ACSF,将其放在冰上,然后开始冒泡,用95%O2/5%CO2至少30分钟,得出pH值为7.4。
- 解剖和切片
- 在产后6至8天,通过快速斩首牺牲小鼠(BalbC,男女),并将头部放入含有冰冷的ACSF的玻璃培养皿中。
- 通过从背部切割皮肤,直到鼻骨的后尖,露出头骨。然后,用手术剪刀小心地将头骨从前颅上切下来,并露出大脑。
注:验证程序是否符合机构准则。 - 取出大脑,并将其放在充满ACSF的冰冷的培养皿中的过滤膜上。
- 分离半球,以 45° 的角度执行寄生切割。用超胶在颤音组织阶段修复一个半球。立即将组织块转移到含有冰冷的 ACSF 的振动槽中(气泡为 5% CO2/95% O2)。最后对齐组织。将第二半球保持在冰冷的 ACSF 中,直到切片。
- 调整振动体以在250-400μm下切片。在250μm下切片将产生大约12片每只动物(400μm:±7片)。
- 切切切片后(图1A),根据海马的典型形态外观(图1)识别海马形成,并使用皮下针(23量,1)分离,保持大脑皮层部分与海马相邻。
注:在培养的同时保存新皮质有助于保持海马体的完整性。然而,海马可以隔离和培养没有皮层,如果需要的话。 - 将切片放在加热的 ACSF (34 °C, 冒泡 5% CO2/95% O2)的网格上,直到收集所有切片。
- 将切片转移到层流柜,在无菌条件下继续。
图1:急性和器官性脑切片制剂的代表性传播图像。使用广域转光显微镜对急性分离的寄生虫脑切片(A) 和在培养中维持 12 天 (B)的寄生虫器官脑切片进行比较。DG = 变性陀螺仪;CA1/3 = 海马的CA1/CA3区域;E-CTX = 内皮层;CTX = (新)皮层。请点击此处查看此图的较大版本。
2. 栽培切片
- 使用倒制无菌玻璃巴斯德移液器,轻轻地将切片从 ACSF 转移到一个预加热的培养皿中,里面装满了无菌汉克的盐溶液。
注:组织灭菌是通过稀释实现的(步骤3.2)。尽可能少的ACSF到培养皿。 - 更换移液器并将切片转移到第二个培养皿。重复此过程 5 次。将尽可能少的哈佛商学院转移到以下培养皿。
- 一次轻轻地将一个切片放在区域性插入的顶部。对每个切片重复此过程。避免移液器中的湍流,并等待切片下降到巴斯德移液器的尖端。一个可以放置多达4片在一个单一的膜。
- 使用细尖小心地从刀片顶部去除多余的汉克溶液。
- 将培养物(图2)保存在气体(卡博根,95%O2 /5%CO2)和液体在37°C的界面的培养箱中,直到实验当天。每 2-3 天更换一次介质。
图2:使用基因编码传感器ATeam1.03YEMK在培养的有机脑切片中基于FRET的ATP成像原理。本工作中提出的协议的原理表示。简单地说,培养1-3天的寄生虫质切片,用腺相关病毒载体转导,其中含有星形细胞特异性hGFAP-或神经元特异性hSyn-启动子和ATeam1.03YEMK表达序列。这些向量的稀释等分(1:2-1:4)直接应用在切片顶部,在培养条件下至少再保存6天。然后,通过在434nm处刺激传感器并在527(受体)和475(供体)nm上同时获得荧光发射,可以在表达传感器的细胞中可视化细胞ATP水平的变化。请点击此处查看此图的较大版本。
3. 使用 Aadeno 相关病毒载体的 ATP 传感器的表达 (图 2)
注:确保满足处理转基因生物的所有要求!
- 为了处理病毒载体,在1-2 μL处与adeno相关的病毒载体(AAV2/5),以避免反复冻结和解冻。将等分存储在-80°C。
- 将含有 10% 漂白剂的烧瓶放在无菌工作台上,丢弃所有与载体接触的残渣材料。
- 对于转导,用2-3μL的DPBS制备1μL的载体稀释。库存溶液通常表现出每 mL (vg/mL)10 12病毒基因组的物理色位。
- 将包含培养切片的刀片转移到无菌罩中。
- 在不接触组织的情况下,将稀释的载体的0.5 μL直接涂抹到每个切片的顶部。
注:通过在体外1-3天(DIV)转导培养切片,在组织的深层得到更好的表达。对较老的培养物的转导可能导致细胞在周围胶质疤痕中的主要表达,或神经元的低表达。 - 最后,将切片放回培养箱中,并至少再保存 6 天。请勿在转导当天更改介质。
4. 去除胶质疤痕 (图 3)
- 在开始实验之前,将含有培养切片的刀片转移到无菌罩中,并将其放入包含 1 mL 的 OCT 介质或 MEM 的 30 mm 盘中。
- 将盘子放在立体镜下,聚焦在切片表面。
- 使用两个无菌皮下针(23 G,1")在所选切片的狭窄边缘上做一个短的横切(图3)。此过程将释放胶质疤痕在表面产生的张力,导致其缩回,从而暴露底层层(参见图 5)。
注:第一个组织层(胶质疤痕)主要由反应性星形细胞形成。在广域成像中,这种密集的组织层将导致光的额外散射,导致图像模糊。因此,去除疤痕有利于获得更深的层,其中包含适当的器官组织更好的可见性。因此,小心只在切片制备的边缘和上层执行此切割,不要损坏下面的组织。我们没有观察到在有胶质疤痕的OTC中获得的数据与无疤痕OTC的数据(未显示的数据)之间的差异。 - 从插入中取出准备好的切片。为此,使用无菌手术刀,并通过对膜进行直平行切割,在中间形成一个正方形或三角形,同时用钳子固定膜的边缘。"如果刀片承载其他切片,则将其移回原始板并放入培养箱。介质的表面张力将防止其泄漏到膜表面。
图3:机械去除胶质疤痕的图解图。图中显示了由胶质疤痕(蓝色椭圆体)覆盖的海马切片培养物。一次,在培养的最小极点和胶质疤痕的边缘(蓝色虚线)剪切两个注射器针头的尖端,疤痕将翻转到一边。请点击此处查看此图的较大版本。
5. 基于 FRET 的 ATP 成像 (图 4)
- 在实验前,准备E-ACSF,用95%O2/5%CO2将其泡在至少30分钟,以获得7.4的pH值。打开单色器的荧光光源(Xenon 灯)(图 4)。在从培养箱中拿出切片之前,先开始灌注。
注:在整个实验过程中,用 95% O2和 5% CO2保持盐水气泡。 - 将切片转移到一个实验室中,该实验室使用蠕动泵不断注入新鲜卡博格化的E-ACSF(图4)。然后,使用网格修复切片。将腔室置于显微镜台上并连接灌注系统。推荐使用防气实验室油管进行灌注。
注:实验可以在室温或接近生理温度下进行,具体取决于实验设计。检查灌注流的稳定性和可靠性,以避免组织运动和/或剪切应力变化引起的焦点变化。我们和许多其他实验室使用的标准灌注速度为 1.5-2.5 mL/分钟。
图 4:FRET 成像设置的配置。(A) FRET 成像设置所需的不同组件及其空间排列的图解图。该配置包括一个单色器,一个以Xenon灯为光源的单色器,一个直立的固定级显微镜(1),一个图像分割系统(2),一个用于延时记录的数字CCD或CMOS相机(3),以及一个适合稳定恒定灌注的实验浴(4)。浴缸灌注通过具有可调节流速的蠕动泵实现。(B) 实验工作空间的图像。FRET 成像设置安装在带有 x/y 平移阶段的振动阻尼台上,实验浴缸嵌入其中。数字: 参见 (A)(C) 从单色仪到数码相机的光通路的图解视图。指示是不同滤波器和二色镜的位置。数字: 参见 (A)请点击此处查看此图的较大版本。
- 使用透射光将培养切片聚焦。确定应进行实验的区域(例如:海马的 CA1 区域)。在开始成像实验之前,至少等待 15 分钟,使切片适应盐水条件。有关实验设置的配置,请参阅图4。
- 打开相机和成像软件。然后,选择正确的筛选器多维数据集。
- 在 435/17 nm (+435 nm) 处激发供体荧光蛋白 (eCFP)。将曝光时间设置为 40 到 90 毫秒。
注:切片与荧光灯的强烈接触可能会导致光毒性作用。 - 435 nm 的激励导致 475 nm(eCFP;供体)和 527 nm(金星;受体)的排放。使用发射图像分离器在 500 nm 处分离荧光发射,并在 483/32 和 542/27 处采用带通滤波器以进一步分离供体和受体荧光。强烈的表达可能会导致探测器饱和。在这种情况下,您可以使用中性密度滤波器来降低激发强度。
- 选择一个显然没有细胞荧光的区域(ROI)作为背景减法。然后,创建 ROIs 来划分细胞体。
- 设置图像采集频率和总体录制时间。对于长(>30分钟)实验,建议采集频率为0.2-0.5 Hz,以防止光毒性。
- 开始录制。建议在基线条件下至少记录 5 分钟,以确保制备的稳定性。
注:如果需要,在录制过程中调整单元格的焦点。 - 要诱导细胞内ATP的变化,将灌注管从标准ACSF转移到含有代谢抑制剂的盐水(例如CIS,见表1及下表)。或者,使用钾浓度升高的盐水来模拟活性神经元中的钾释放。
注:沐浴灌注的应用是一个相对缓慢的过程,它在全球范围内对整个制备作用。记下新溶液实际开始进入实验浴的时间。根据腔室和盐水储液罐之间的距离以及灌注速度,必须考虑延迟时间。
6. 蜂窝ATeam荧光的高分辨率文档
- 在录音之后,将包含切片培养的录音室转移到共聚焦激光扫描显微镜。
注:特别小心。由于潜在的光损伤,只有在实验后才能执行此步骤。出于文档目的,可以将 E-ACSF 与 H-ACSF 交换。因此,不一定需要灌注系统。 - 以给定光学配置中可能的最高 z 分辨率进行 z 堆栈。
- 应用去卷积算法以提高图像分辨率。
Representative Results
AAV载体是一种可靠的工具,可以选择性地表达活组织16细胞中的外来基因。直接应用含有ATeam1.03YEMK序列盒和特定启动器的AAV,使传感器在所选细胞类型中具有高表达性。在DIV 14(转导后10天),在人类突触素启动子下表达ATeam的神经元在切片表面以下50μm深处的培养组织切片的新皮质中高密度被发现(图5A)。在海马区可以取得可比的结果(图5B)。
图5:在培养的寄生虫质脑切片中表达ATeam1.03YEMK的神经元的可视化。左侧的图像对应于海马组织 70 个光学部分(每个 0.6 μm)的 43个光学部分(每个 1.05 μm)和(B)的扩展焦点投影。右侧的图像表示同一投影的体积视图。单元格根据其相对于切片表面的深度进行颜色编码,如右侧的色阶所示。请点击此处查看此图的较大版本。
对于星形细胞ATP水平的测量,ATeam1.03YEMK在人类胶质纤维酸性蛋白(GFAP)促进剂的控制下表达。这导致培养组织切片的新皮质和海马细胞的有效转导(图6)。值得注意的是,根据切片制剂表面的深度,可以区分两种不同的形态表型。在第一个表面层中,细胞的特点是厚厚的初级过程,主要排列平行于表面。这些细胞表现出强烈的重叠域,形成明显反应的星形细胞的密集网状物(图6)。在更深的层(距表面30-60微米)中,转导的星形细胞表现出精细的细胞过程,这些细胞过程主要形成球形域,其形态类似于星形细胞的原位,如19、20、21(图6)所述。为了获得更深层星形细胞的更好转导,以及更好地接触这些深层的光学访问,可以像步骤 4 中所述去除胶质疤痕组织。
图6:在培养的寄生虫细胞脑切片中表达ATeam1.03YEMK的星形细胞的可视化。左侧的图像对应于 191 个光学部分(每个 0.45 μm)的扩展对焦投影。为了说明原因,胶质疤痕被排除在星形细胞的投影之外。右侧的图像表示在去除胶质疤痕之前和之后同一投影的体积视图。单元格根据其相对于切片表面的深度进行颜色编码,如右侧的色阶所示。请点击此处查看此图的较大版本。
ATeam1.03YEMK的成功表达允许动态测量神经元或星形细胞中 ATP 水平的变化,具体取决于所使用的启动子(见上文)。实验在实验浴中不断注入E-ACSF(泡有95%O2/5%CO2)。在海马神经元中表达ATeam1.03YEMK的器官切片中,在开始记录之前选择了感兴趣的区域(ROIs),表示金字塔细胞的细胞群(图7A)。此外,还选择了背景减法区域(图7A)。然后,分别收集这些ROI的金星发射和eCFP荧光,并描述为随时间的荧光发射水平(图7B)。在控制条件下记录荧光几分钟以确保基线稳定后,通过将切片制剂暴露于无葡萄糖盐水中来抑制细胞代谢,其中5 mM阿齐德钠(NaN3)被添加一分钟(图7B)。这种操作导致FRET对(图7B,左面板)发射强度发生相反的变化,金星(527nm)减少,eCFP(475nm)发射增加。通过将金星的荧光发射除以eCFP(F金星/FeCFP)的荧光发射来计算FRET比率,会产生反映细胞内ATP水平相对变化的信号,即所谓的"ATeam FRET比率"(图7B,右侧面板)。在所有记录的神经元(n = N = 5 切片中的 70 个细胞)中,NaN3导致 ATeam FRET 比率可逆下降,表明细胞内 ATP 水平在细胞代谢抑制后可逆下降。
图7:时间推移证明 团队 FRET 比率成像。(A) 左上:培养的有机海马切片CA1区域的金字塔层和层辐射的广场荧光图像,在神经元中表达ATeam1.03YEMK。右上:放大的盒装部分视图,如左侧所示。白线划定感兴趣的区域 (ROIs) 1-3 表示选择在 (B) 进行分析的 CA1 金字塔神经元的细胞体。BG 表示为背景校正选择的 ROI。底部:代表金星荧光发射(绿色)、eCFP(紫色)和金星/eCFP比例的伪彩色图像。(B) ROIs 1-3 中的时间间隔记录,表示神经元细胞体(参见A)。左侧的轨迹显示金星(绿色)和eCFP(洋红色)的标准化荧光发射。右侧的轨迹显示相应的 ATeam FRET 比率。请注意,在没有细胞外葡萄糖1分钟(灰条)的情况下,用5 mM NaN3灌注会导致ATeam FRET比率的可逆下降,表明细胞内浓度下降。请点击此处查看此图的较大版本。
为了确保长期实验条件下制备和传感器的稳定性,在神经元或星形细胞中表达ATeam的切片会长时间与ACSF注入(>50分钟;n = 每个细胞12个,3个大脑中的N =3个OTC)。在这些情况下,ATeam FRET 比率没有变化 (图 8)。相反,将制剂暴露于含有代谢抑制剂的CIS("化学缺血",见表1),再次导致上述ATeam FRET比率的预期下降。
图 8:使用 ATeam 的基线实验。在神经元(上)和星形细胞(底部)的基线条件下,在14个不同细胞中长期ATeam FRET比率成像。数据是在与其他实验数据类似的条件下采集的。在每次测量结束时,化学缺血通过用按箭头指示的CIS灌注而引起。注: 基线 ATeam FRET 比率在基准条件下随时间而保持稳定。请点击此处查看此图的较大版本。
接下来,我们分析了表达ATeam1.03YEMK的神经元和星形细胞对细胞外钾浓度增加的反应。建立稳定的基线后,神经元被注入盐水,其中钾浓度从3mM增加到8 mM3分钟(图9A)。但是,这种操作并没有导致 ATeam FRET 比率的可检测变化(n = N = 5 切片中的 56 个单元)。为了确保传感器对ATP水平的变化做出反应,切片再次暴露于由CIS取代E-ACSF引起的持续化学缺血期。化学缺血导致 ATeam FRET 比率迅速降至新的稳定水平,表明 ATP 在 2-3 分钟后的名义损耗(图 9A)。
图9:说明神经元和星形细胞ATP水平变化的代表性实验。(A,B): 左侧的图像显示来自位于海马CA1区域的神经元和星形细胞的ATeam荧光。右侧的轨迹表示从定位在单个细胞体上的 ROI 获得的 ATeam FRET 比率的时差记录。在这两项实验中,切片首先在细胞外钾浓度增加3分钟(见bar),然后最后接触化学缺血。请注意,虽然神经元对细胞外钾(A)的升高没有反应,但星形细胞会随着ATP(B)的增加而做出反应。请点击此处查看此图的较大版本。
相同的实验协议对切片进行了执行,其中ATeam1.03YEMK以星形细胞表示。与在神经元中观察到的情况相比,星形细胞通过ATeam FRET比率的可逆增加对细胞外钾的增加做出反应,表明细胞内ATP水平增加(n = N = 5片中的70个细胞)(图9B)。随后暴露于化学缺血,如预期的那样,导致ATeam FRET比率大幅下降,表明细胞内ATP的名义消耗(图9B)。
Discussion
在这里,我们演示了ATeam1.03YEMK细胞型特定表达的过程,这是一种基于FRET的遗传编码纳米传感器14,用于测量小鼠大脑15的细胞组织切片培养物中星形细胞或神经元的ATP水平变化。在示例性录音中,我们表明细胞外钾浓度的增加不会导致神经元ATP浓度的变化,而星形ATP水平会随着这种操作而升高。此外,我们的结果表明,在抑制细胞代谢时,ATeam1.03YEMK FRET比率在两种细胞类型中迅速下降,表明细胞内ATP迅速下降。
ATeam1.03YEMK在有机切片培养物中的表达要求在受控条件下维持培养物中的组织至少7-10天。或者,ATeam1.03YEMK也可用于在急性分离的脑组织切片和小鼠13、15的视神经中测量ATP。然而,在急性分离的组织中进行测量,需要生成转基因动物或将病毒载体的立体定向应用到大脑中,包括动物实验和严格的动物护理协议。在这方面,ATeam1.03YEMK在组织切片培养物中的表达是一种有用和有价值的替代词22,23。多年来,有机组织切片培养作为研究神经特性、连通性和发育的既定模型系统24,25,26。它们不仅保持了一般组织架构和层压(图1),而且承载了细胞培养的优越特性,如优越的可访问性和直接控制实验条件。组织切片培养也经常被用来表达外来基因使用病毒载体27。据报道,几种病毒载体将转基因转化为脑组织16、28。抗病毒载体诱导胶质细胞的高表达,但不是海马神经元16,并可能产生胶质反应17。阿德诺相关的病毒载体在这里使用出现作为一个很好的替代15,其有效性也已显示在体内29。
虽然主要用于研究神经元性质,但最近的研究已经确定,器官组织切片培养也可以用于分析星形细胞。培养的切片通常被一层反应性星形细胞覆盖(图5),但星形细胞在更深的层19、30(图5)中表现出更原生、非反应形态和细胞结构。在本研究中,我们描述了一个机械去除外胶质疤痕的程序,这导致在适当的器官组织层内,本地星形细胞具有更好的实验和光学可及性。此外,其去除提高了器官切片深层的表达功效;如果不去除胶质疤痕,AAV的转导可能倾向于限制在表面细胞层。
在组织切片中执行实验时,需要考虑几个外部机械因素。浴灌注速度的变化可以诱发整个制备的运动和/或引起焦点的变化,导致传感器信号的人工瞬态变化。此外,星形细胞和神经元都报告对机械变形作出反应,如高灌注率32,33。在我们手中,使用可靠的蠕动泵,以及保持组织和客观(半月板)之间的小而稳定的盐水量,在基线条件下,以此处使用的灌注速度(1.5-2.5 mL/min)产生稳定的FRET信号;图 8.
在本研究中,我们还演示了使用 ATeam1.03YEMK进行基于 FRET 的成像可用于监测神经元和星形细胞中的 ATP 水平。较早前为测量细胞ATP而引入的另一种方法是所谓的荧光素-荧光酶测定34、35、36、37。然而,这种方法基于生物发光成像,仅提供相当低的时间和空间分辨率,部分原因是由于背景噪声水平高。近年来使用的另一种常规方法是使用对光敏感的荧光镁绿色38、39、40来成像细胞内镁浓度的变化。这种方法与一种观察结果有关,即ATP的消耗会导致其同因镁的释放。因此,用镁绿色成像只能提供ATP水平变化的二次估计。此外,镁绿色对细胞内钙的变化也十分敏感,在解释使用这种方法获得的结果时,又会引入另一个困难。
因此,最近用于细胞代谢物直接成像的基因编码纳米传感器的发展,标志着11、12向前迈出了一大步。产生了几个不同的传感器,可用于测量细胞内ATP 36,41,42,43。其中包括比例荧光ATP指标"QUEEN"41以及感知ATP:ADP比率42的PercevalHR。虽然后一种探针是研究细胞能量状况的宝贵工具,但它需要同时测量pH42的变化。
ATeam是一种纳米传感器,其中存在多种变体,其中(除其他外)在ATP14的绑定亲和力上有所不同。在体外,ATeam1.03YEMK在37°C时表现出1.2 mM的Kd,接近不同神经元细胞类型确定的细胞ATP水平,从下丘脑和小脑34到海马37,44,45。在比色皿测量中,将温度降低10°C可显著降低ATeam1.03YEMK与ATP的结合亲和力,表明在室温14下,它可能不是细胞成像的理想选择。然而,我们早先的研究15表明,ATeam1.03YEMK在神经元和星形细胞中对不同操作的行为和反应在接近生理和室温下相似,这表明传感器能够可靠地确定在这两种情况下的细胞内ATP水平。此外,我们以前的实验还解决了ATeam1.03YEMK在细胞15内表达的pH敏感性,表明它对细胞内pH的改变不敏感,大约0.1-0.2 pH单位。如果低 mM 范围内的 Kd是一个问题,则可能使用替代 ATeam 变体14,其中包括 ATeam("GO-ATeam")43的红移变型。
我们使用 ATeam1.03YEMK的实验表明,仅将细胞外钾浓度增加几 mM(从 3 mM 到 8 mM)会导致有机体切片培养中的星形细胞中的 ATeam1.03YEMK比暂时增加。这一观察证实了早期的研究15,46,并清楚地表明,星形细胞对钾释放的反应,活性神经元增加其ATP产量,很可能是由于刺激Na+/K+--ATPase和Na +/HCO3-共运,分别47,48。与此相反,神经元没有显示响应,这与以前的工作以及15一致。然而,这两种细胞类型对细胞糖解和线粒体呼吸抑制反应迅速和强烈,如15日之前所示。在化学缺血条件下,ATeam FRET 比率降至一个新的稳定水平,表明细胞 ATP 的名义消耗。后一个结果表明,神经元和星形细胞都表现出ATP的相关消耗也显示在稳定状态条件下,没有额外的刺激,通过突触激活或神经递质的应用。综合起来,我们得出结论,基于FRET的成像与基因编码的纳米传感器,其中包括ATeam1.03YEMK,将提供一个有价值的方法,阐明细胞过程,负责在不同条件下细胞内ATP水平和细胞ATP消费的变化。
Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。作者获得了德国杜塞尔多夫尼康显微镜解决方案公司提供开放访问出版物的财政支持,该解决方案生产视频文章中使用的仪器。该公司既不参与设计此处提供的实验,也不参与执行,也不参与数据处理,也不参与手稿写作。
Acknowledgments
作者感谢克劳迪娅·罗德里戈和西蒙娜·杜里提供专家技术援助。我们感谢尼克拉斯·格考博士和乔尔·纳尔逊M.Sc协助筹备器官切片培养物。作者实验室的研究由德国研究协会(DFG;对于 2795: Ro 2327/13-1 和 SPP 1757: Ro 2327/8-2 到 CRR;和SPP 1757:年轻的胶质启动资金RL)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |
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