Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60294
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Department of Neurology, Düsseldorf University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven een protocol voor cel-type specifieke uitdrukking van de genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk in organotypische segment culturen van de muis forebrain. Bovendien, we laten zien hoe deze sensor gebruiken voor dynamische beeldvorming van cellulaire ATP niveaus in neuronen en astrocyten.

Abstract

Neuronale activiteit in het centrale zenuwstelsel (CNS) roept een hoge vraag op cellulaire energie geleverd door de afbraak van adenosinetrifosfaat (ATP). Een groot deel van de ATP is nodig voor het opnieuw installeren van ionen gradiënten over plasma membranen aangetast door elektrische signalering van neuronen. Er is bewijs dat astrocyten-terwijl het niet genereren van snelle elektrische signalen zelf-verhoogde productie van ATP in reactie op Neuronale activiteit ondergaan en ondersteunen van actieve neuronen door het verstrekken van energie metabolieten aan hen. De recente ontwikkeling van genetisch gecodeerde sensoren voor verschillende metabolieten maakt nu de studie van dergelijke metabole interacties tussen neuronen en astrocyten mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor cel-type specifieke uitdrukking van de ATP-gevoelige fluorescentie resonantie energie overdracht-(FRET-) sensor ATeam 1.03Yemk in organotypische weefsel segment culturen van de muis Hippocampus en cortex met behulp van adeno-geassocieerde virale vectoren (Aav). Bovendien, we demonstreren hoe deze sensor kan worden gebruikt voor dynamische meting van veranderingen in cellulaire ATP niveaus in neuronen en astrocyten bij verhogingen van extracellulaire kalium en na inductie van chemische ischemie (dat wil zeggen, een remming van cellulaire energie metabolisme).

Introduction

Excitatory elektrische activiteit van neuronen is grotendeels gebaseerd op de flux van kationen zoals natrium (na+) en kalium (K+) over hun plasma membranen. Het onderhoud van de elektrochemische gradiënten van deze twee ionen is dus vereist voor signalering. Dit wordt bereikt door de cellulaire na+/k+-ATPASE (NKA), een alomtegenwoordige elektrogene transmembraan pomp, die 3 na+ uit de cel uitextrudeert in ruil voor 2 K+ uit de extracellulaire ruimte, waarbij het verbruik van één molecuul ATP per transport cyclus1vereist is. Naast de NKA, er zijn verschillende andere ATP-consumeren Ion transporters met inbegrip van het plasma membraan CA2 +-ATPase, die is van vitaal belang voor intracellulaire CA2 + homeostase en de uitvoer volgende activiteit-geïnduceerde toestroom2. In presynaptische blaasjes creëert een vacuolar-type H+-ATPase (v-ATPase) de Proton gradiënt die nodig is voor de opname van de neurotransmitter in dit compartiment3.

Terwijl de activiteit van neuronen dus vereist een aanzienlijke hoeveelheid ATP4, ze vertonen geen significante capaciteit voor de opslag van energie. In plaats daarvan lijken ze te vertrouwen op metabole interacties met naburige astrocyten, de belangrijkste glycogeen winkels in de hersenen5. Er is gesuggereerd dat astrocytische glycogeen inderdaad een belangrijke rol speelt bij de ondersteuning van neuronale energiebehoeften; en een belangrijk fenomeen in deze voorgestelde neuro-metabole koppeling tussen de twee celtypen is de capaciteit van astrocyten om hun ATP-productie te verhogen in reactie op Neuronale activiteit6,7,8. Deze hypothese, bekend als de astrocyten-neuron lactaat shuttle (anls), wordt nog steeds in debat gebracht, omdat ander werk bewijs heeft geleverd dat neuronen ook hun eigen tarief van glycolyse kunnen verhogen in reactie op stimulatie9,10, wat de noodzaak van verdere methoden en benaderingen voor het bestuderen van de neuro-glia-interactie weerspiegelt.

Onderzoek van cellulaire energiemetabolisme en ATP niveaus in neuronen en astrocyten tot opheldering neuro-glia metabole interacties is al lang belemmerd door het ontbreken van geschikte sondes voor de opsporing van veranderingen in de metaboliet concentraties in levende cellen in hersenweefsel. Het laatste decennium, echter, heeft een toename van de ontwikkeling van nieuwe instrumenten en nieuwe genetisch gecodeerde fluorescentie sondes voor verschillende metabolieten, met inbegrip van sensoren voor ATP, lactaat, pyruvaat en anderen11,12. Met behulp van deze hulpmiddelen, het is nu mogelijk om direct adres vragen met betrekking tot cellulaire ATP consumptie en veranderingen in cellulaire energie niveaus op het niveau van de enkele cel en in een cel-type specifieke manier in intact hersenweefsel13.

In het huidige werk beschrijven we een procedure om de cytosolische ATP-dynamiek op neuronen en astrocyten van gekweekte organotypische hersen segmenten te visualiseren. We laten zien hoe te gebruiken adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV) voor cel-type specifieke uitdrukking van de genetisch gecodeerde ATP-nano sensor ATeam 1.03Yemk (14) in neuronen en astrocyten van plakjes muis hersenen die kunnen worden gehandhaafd in celcultuur voor enkele weken15. Een procedure voor het verwijderen van het gliacellen litteken dat de gekweekte weefsel plakjes bedekt, wordt beschreven, die de optische toegankelijkheid en beeldvorming van cellen in de organotypic weefsellagen eronder verbetert. Tot slot laten we zien hoe ATeam 1.03Yemk kan worden gebruikt om op fret gebaseerde beeldvorming van veranderingen in cellulaire ATP-niveaus in deze voorbereiding uit te voeren. Deze methode herbergt de grote voordelen die het vereist geen chirurgische hersen procedures, biedt hoge niveaus van expressie van de sensor en celtype specificiteit in gekweekte hersen plakjes, het verminderen van invasiviteit of stress in de cellen in vergelijking met andere methoden, zoals transfectie door elektroporation of transductie met andere virale vectoren10,16,17. Daarnaast kan dit protocol worden toegepast op andere op FRET gebaseerde nano sensoren, waaronder varianten van ATeam 1.03 die een lagere bindingsaffiniteit bieden voor ATP14.

Protocol

De huidige studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf en de richtlijn van de Europese Gemeenschap (2010/63/EU). Alle experimenten met organotypische hersen slice culturen werden meegedeeld aan en goedgekeurd door het dierenwelzijns Bureau bij de Dierenverzorgings-en gebruiks faciliteit van de Heinrich Heine Universiteit in Düsseldorf (instellings nummer: O50/05). In overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Commissie18, werden dieren tot 10 dagen oud gedood door onthoofding.

1. bereiding van Organotypische hersen slice culturen (Otc's)

  1. De dag vóór of ten minste 30 minuten voorafgaand aan de procedure
    1. Bereid de Petri schaal (onder steriele omstandigheden). Verwijder de deksel van de 6-put en plaats 800-850 μL van het OTC-medium in elke put. Bewaar de plaat in de incubator (37 °C, 5% CO2/95% O2) tot dat nodig is.
    2. Bereid de wassen Petri schalen (onder steriele omstandigheden). Voeg 3 mL HBSS toe aan elke 30 mm Petri schaaltje. Er zijn in totaal 5 gerechten per procedure vereist. Plaats ze in de incubator (37 °C, 5% CO2/95% O2) gedurende ten minste 30 minuten — 's nachts tot het nodig is.
    3. Bereid de ACSF (tabel 1). Houd de zoutoplossing zonder glucose bij 4 °C tot de volgende dag.
Salines en media-formulering
Naam Afkorting Samenstelling Concentratie [mM] Opmerkingen
Kunstmatige cerebrospinale vloeistof oplossing ACSF Nacl 125 Bubbled met 5% CO2/95% O2, pH 7,4
Kcl 2,5 Altijd toevoegen van glucose vlak voor gebruik.
CaCl2 2 Niet bewaren voor meer dan één dag met glucose
MgCl2 1 ~ 310 mOsm/L
NaH2po4 1,25
NaHCO3 26
Glucose 20
Experimentele ACSF E-ACSF Nacl 136 Bubbled met 5% CO2/95% O2, pH 7,4
Kcl 3 Altijd toevoegen van glucose vlak voor gebruik.
CaCl2 2 Niet bewaren voor meer dan één dag met glucose
MgCl2 1 ~ 320 mOsm/L
NaH2po4 1,25
NaHCO3 24
Glucose 5
Lactaat 1
Chemische ischemie oplossing Gos Nacl 136 Bubbled met 5% CO2/95% O2, pH 7,4
Kcl 3 ~ 318 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
NaH2po4 1,25
NaHCO3 24
2, 2-Deoxyglucose 2
NaN3 5
8 mM kalium ACSF 8 mM K+ acsf Nacl 128 Bubbled met 5% CO2/95% O2, pH 7,4
Kcl 8 ~ 320 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
NaH2po4 1,25
NaHCO3 24
Glucose 5
Lactaat 1
HEPES-gebufferde ACSF H-ACSF Nacl 125 Aangepast aan pH 7,4 met NaOH
Kcl 3 Altijd toevoegen van glucose direct voor gebruik
CaCl2 2 Niet bewaren voor meer dan één dag met glucose
MgSO4 2 ~ 310 mOsm/L (aangepast met sacharose)
NaH2po4 125
HEPES 25
Glucose 10
Hanks ' gebalanceerde zoutoplossing HBSS Sigma (catalogus nummer H9394).
Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing DPBS Gibco (catalogus nummer 14287-080)
Organotypische kweek medium OTC-medium warmtegeïnactiveerd paarden serum 20 34 °c, 5% Co2, pH 7,4, onder kweek toestand
Mem 79% ~ 320 mOsm/L
L-glutamine 1
Insuline 0,01 mg/mL
Nacl 14,5
MgSO4 2
CaCl2 1,44
Ascorbinezuur 0,00125%
D-glucose 13

Tabel 1: samenstelling van de oplossing.

  1. Op de dag van de bereiding, voeg de glucose aan de ACSF, plaats het op ijs en beginnen borrelen met 95% O2/5% Co2 voor ten minste 30 min te resulteren in een pH van 7,4.
  2. Dissectie en snijden
    1. Offer de muis (BalbC, beide geslachten) op postnatale dagen 6 tot 8 door snelle onthoofding en plaats het hoofd in een glazen Petri schaaltje met ijskoude ACSF.
    2. Stel de schedel bloot door de huid van achteren te snijden tot het achterste uiteinde van het neusbeen. Snijd vervolgens voorzichtig de schedel van het foramen magnum met behulp van een chirurgische schaar en bloot de hersenen.
      Opmerking: Nagaan of de procedure in overeenstemming is met de richtsnoeren van de instelling.
    3. Verwijder de hersenen en plaats deze op een filtermembraan in een ijskoude Petri schaaltje gevuld met ACSF.
    4. Scheid de hemisferen en voer een parasagittale snede onder een hoek van 45 °. Bevestig een halve bol op het vibratome weefsel stadium met superlijm. Breng het weefsel blok onmiddellijk over naar het vibratome bad met ijskoude ACSF (borrelen met 5% CO2/95% O2). Ten slotte uitlijnen van het weefsel. Houd de tweede halve bol in ijskoude ACSF tot slicing.
    5. Pas de vibratome aan om segmenten te snijden met 250-400 μm. snijden bij 250 μm zal ongeveer 12 sneetjes per dier opleveren (400 μm: ~ 7 segmenten).
    6. Na het snijden van het segment (Figuur 1A), identificeren van de hippocampal formatie op basis van de typische morfologische verschijning (Figuur 1) en isoleren met behulp van hypodermische naalden (23 gauge, 1 "), het houden van het deel van de hersenschors grenzend aan de hippocampus.
      Opmerking: Behoud van de neocortex terwijl kweek helpt om de integriteit van de Hippocampus te behouden. Echter, de Hippocampus kan worden geïsoleerd en gekweekt zonder cortex indien nodig.
    7. Plaats het segment op een gaas in warmed, ACSF (34 °C, borrelen met 5% CO2/95% O2) totdat alle segmenten worden verzameld.
    8. Breng de segmenten over naar de laminaire flowkast om verder te gaan onder steriele omstandigheden.

Figure 1
Figuur 1: representatieve transmissie beelden van acute en organotypische hersen preparaten. Vergelijking van een acuut geïsoleerd parasagitale hersen segment (a) en een parasagitale organotypische hersen slice, gehandhaafd gedurende 12 dagen (B) met behulp van translumination microscopie in brede velden. DG = dentaat gyrus; CA1/3 = CA1/CA3-regio van de hippocampus; E-CTX = Entorhinale cortex; CTX = (neo-) cortex. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. culturing van de plakjes

  1. Breng de plakjes van de ACSF voorzichtig over in een van de voorverwarmde Petri schaaltjes gevuld met steriele Hank zoutoplossing met behulp van een omgekeerde steriele glazen Pasteur pipet.
    Opmerking: Sterilisatie van het weefsel wordt bereikt door verdunning (stap 3,2). Breng zo weinig mogelijk ACSF naar de Petri schaal.
  2. Verander de pipet en breng de segmenten over naar de tweede Petri schaal. Herhaal het proces 5 keer in het algemeen. Breng zo weinig mogelijk HBSS naar de volgende Petri schalen.
  3. Plaats één segment tegelijk zachtjes op de bovenkant van de kweek wissel. Herhaal het proces voor elk segment. Vermijd turbulenties in de pipet en wacht tot het segment afdaalt tot het uiteinde van de Pasteur-pipet. Men mag maximaal 4 plakjes op één membraan plaatsen.
  4. Verwijder voorzichtig de overtollige Hank-oplossing vanaf de bovenkant van de wisselplaat met behulp van een fijne tip.
  5. Bewaar de culturen (Figuur 2) in een incubator op het raakvlak tussen gas (carbogen, 95% O2 /5% Co2) en de vloeistof bij 37 °c tot de dag van het experiment. Vervang het medium elke 2-3 dagen.

Figure 2
Figuur 2: principe van op FRET gebaseerde ATP-beeldvorming in gekweekte organotypische hersen segmenten met behulp van de genetisch gecodeerde sensor ATeam 1.03Yemk. Schematische weergave van het protocol dat in dit werk wordt gepresenteerd. Kort, parasagitale organotypic plakjes, gekweekt voor 1-3 dagen, zijn getransduceerde met een adeno-geassocieerde virale vector die ofwel, de astrocyte-specifieke hGFAP-of de neuron-specifieke hSyn-promotor en de volgorde voor de uitdrukking van ATeam 1.03Yemk. Verdunde aliquots van deze vectoren (1:2-1:4) worden direct toegepast op de bovenkant van een segment, dat gedurende ten minste 6 dagen onder kweekomstandigheden wordt gehandhaafd. Veranderingen in intracellulaire ATP niveaus kunnen vervolgens worden gevisualiseerd in cellen die de sensor uitdrukken door het spannend op 434 nm en door het verkrijgen van fluorescentie-emissie tegelijkertijd bij 527 (acceptor) en 475 (donor) nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. expressie van ATP-sensoren met een Aadeno-geassocieerde virale vector (Figuur 2)

Opmerking: Zorg ervoor dat u voldoet aan alle eisen voor de omgang met genetisch gemodificeerde organismen!

  1. Voor het behandelen van de virale vector, aliquot adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV2/5) bij 1-2 μL om herhaald invriezen en ontdooien te voorkomen. Bewaar de aliquots bij-80 °C.
  2. Plaats een kolf met 10% bleekwater op de steriele Bank om alle gebruikte restmateriaal te verwijderen dat in aanraking was geweest met de vector.
  3. Bereid voor transductie een verdunning van 1 μL van de vector met 2-3 μL DPBS. Stock oplossingen vertonen normaalgesproken een fysieke titer in de magnitude van 1012 virale genomen per ml (VG/ml).
  4. Breng een insert met een gekweekte slice over in de steriele kap.
  5. Zonder het weefsel aan te raken, breng 0,5 μL van de verdunde vector rechtstreeks aan op de bovenkant van elk segment.
    Opmerking: Betere expressie in de diepere lagen van het weefsel wordt verkregen door het transduceren van gekweekte plakjes op 1-3 dagen in vitro (DIV). Transductie van oudere culturen kan resulteren in een overheersende uitdrukking van cellen in het omringende gliacellen litteken of een lage expressie in neuronen, respectievelijk.
  6. Plaats de plakjes tot slot terug in de incubator en onderhoud ze ten minste 6 dagen. Verander het medium niet op de dag van de transductie.

4. verwijdering van het gliale litteken (Figuur 3)

  1. Vlak voor het begin van een experiment, breng een insert met gekweekte plakjes in de steriele kap en plaats het in een schotel van 30 mm, bevattende 1 mL medium of MEM.
  2. Plaats de schaal onder de stereoscoop en concentreer u op het oppervlak van het segment.
  3. Gebruik twee steriele hypodermische naalden (23 G, 1 ") om een korte dwarsdoorsnede te maken op de smalle randen van een gekozen segment (Figuur 3). Met deze procedure wordt de spanning in het oppervlak dat door het gliale litteken wordt veroorzaakt, vrijgegeven waardoor het wordt teruggetrokken, waardoor de onderliggende lagen worden blootgesteld (Zie Figuur 5).
    Opmerking: De eerste weefsellaag (glial SCAR) wordt voornamelijk gevormd door reactieve astrocyten. Bij breedbeeld beeldvorming zal deze dichte weefsellaag resulteren in extra verstrooiing van het licht, wat resulteert in wazige beelden. Het verwijderen van het litteken is dus voordelig om beter zicht te krijgen op de diepere lagen, die het juiste organotypische weefsel bevatten. Dus, wees voorzichtig om deze cut uitsluitend aan de rand en in de bovenste laag van het voorbereiding van het segment uit te voeren en niet om het weefsel eronder te beschadigen. We hebben geen verschillen gezien tussen gegevens die zijn verkregen in Otc's met gliacellen SCAR met die van litteken vrije Otc's (gegevens niet weergegeven).
  4. Verwijder het voorbereide segment uit de insert. Hiertoe gebruikt u een steriel scalpel en verlaagt u deze door rechte parallelle sneden naar het membraan te maken, een vierkant of driehoekje te vormen met het segment in het midden, terwijl u de randen van het membraan vasthoudt met een pincet. Als het insert extra segmenten herbergt, breng het dan terug naar de oorspronkelijke plaat en in de incubator. De oppervlaktespanning van het medium zal de lekkage op het oppervlak van het membraan voorkomen.

Figure 3
Figuur 3: Schematische illustratie van de mechanische verwijdering van het gliale litteken. De figuur toont een hippocampal segment cultuur die wordt bedekt door een gliacellen litteken (blueish ellipsoïde). Door één keer de uiteinden van twee spuit naalden op de kleinste pool van de cultuur en aan de rand van het gliale litteken (blauwe stippellijn) af te knippen, zal het litteken opzij schuiven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

5. op FRET gebaseerde ATP-beeldvorming (Figuur 4)

  1. Bereid vóór het experiment E-ACSF voor en bel het met 95% O2/5% Co2 gedurende ten minste 30 minuten om een pH van 7,4 te verkrijgen. Schakel de fluorescerende lichtbron (Xenon lamp) van de Monochromator in (Figuur 4). Start de perfusie vlak voordat u het segment uit de incubator neemt.
    Opmerking: Houd de zoutoplossing borrelen met 95% O2 en 5% Co2 tijdens het hele experiment.
  2. Breng het segment over in een experimentele kamer die voortdurend wordt geperfectioneerd met vers carbogenated E-ACSF met behulp van een peristaltische pomp (Figuur 4). Vervolgens repareert u het segment met een raster. Plaats de kamer op de Microscoop en sluit het perfusie systeem aan. Gasbestendige laboratorium slangen worden aanbevolen voor perfusie.
    Opmerking: Experimenten kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of in de buurt van fysiologische temperatuur, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Controleer de stabiliteit en betrouwbaarheid van de perfusie stroom om veranderingen van focus veroorzaakt door beweging van het weefsel en/of veranderingen in shear stress te voorkomen. Standaard perfusie snelheden voor segment werk, gebruikt door ons en vele andere laboratoria, zijn 1,5-2,5 mL/min.

Figure 4
Afbeelding 4: configuratie van de fret Imaging Setup. (A) Schematische illustratie van de verschillende componenten en hun ruimtelijke ordening vereist voor de fret Imaging Setup. De regeling bestaat uit een Monochromator met een Xenon lamp als lichtbron, een rechtopstaande vaste Microscoop (1), een beeldsplitsings systeem (2), een digitale CCD of CMOS camera voor timelapse-opname (3), en een experimenteel Bad aangepast voor stabiele constante perfusie (4). De badperfusie wordt gerealiseerd door een peristaltische pomp met instelbaar debiet. (B) beeld van de experimentele werkruimte. De FRET Imaging Setup is gemonteerd op een trillingsgedeuteerde tafel met een x/y-translationeel stadium, waarin het experimentele bad is ingebed. Getallen: Zie (A). C) Schematische weergave van de lichtpad van de Monochromator naar de digitale camera. Aangegeven is de positie van de verschillende filters en de dichroïde spiegel. Getallen: Zie (A). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Breng het gekweekte segment scherp met behulp van transmissie licht. Identificeer het gebied waar experimenten moeten worden uitgevoerd (voorbeeld: CA1-regio van de hippocampus). Voordat u begint met Imaging experimenten, wacht u ten minste 15 minuten om segmenten aan te passen aan de zoute omstandigheden. Voor de configuratie van de experimentele opstelling, Zie Figuur 4.
  2. Schakel de camera en de imaging software in. Selecteer vervolgens de juiste filter kubus.
  3. Prikkel het donor fluorescerende eiwit (eCFP) met 435/17 nm (~ 435 nm). Stel de belichtingstijd in tussen 40 en 90 MS.
    Opmerking: Een sterke blootstelling van plakjes aan het fluorescerende licht kan tot fototoxische effecten leiden.
  4. Excitatie bij 435 nm resulteert in emissie bij zowel 475 nm (eCFP; donor) als 527 nm (Venus; acceptor). Splits de fluorescentie-emissie op 500 nm met een emissie beeld splitter en gebruik band pass filters op 483/32 en 542/27 om donor en acceptor fluorescentie verder te isoleren. Sterke expressie kan resulteren in verzadiging van de detectoren. In dit geval u een neutraal dichtheids filter gebruiken om de intensiteit van excitatie te verminderen.
  5. Selecteer een regio van belang (ROI) blijkbaar verstoken van cellulaire fluorescentie voor achtergrond aftrekken. Maak vervolgens ROIs afbakenen cellichamen.
  6. Stel de frequentie van de beeld verwerving en de totale opnametijd in. Voor lange (> 30 min) experimenten wordt een overnamefrequentie van 0,2-0,5 Hz aanbevolen om fototoxiciteit te voorkomen.
  7. Start de opname. Het wordt aanbevolen om ten minste 5 minuten onder Baseline voorwaarden te registreren om de stabiliteit van het preparaat te garanderen.
    Opmerking: Pas indien nodig de scherpstelling van de cel aan tijdens de opname.
  8. Voor het induceren van veranderingen in intracellulaire ATP, overdracht van de perfusie buis van standaard ACSF naar een zoutoplossing die metabole remmers (bv. CIS, Zie tabel 1 en hieronder). Alternatief, gebruik een zoutoplossing met verhoogde kaliumconcentratie te imiteren afgifte van kalium uit actieve neuronen.
    Opmerking: Toepassing door Bath perfusie is een relatief traag proces, dat wereldwijd werkt op de hele voorbereiding. Noteer het tijdstip waarop de nieuwe oplossing daadwerkelijk is begonnen met het experimentele bad in te gaan. Afhankelijk van de afstand tussen de kamer en het reservoir van de zoutoplossing, evenals op de snelheid van de perfusie, moet een vertragingstijd worden overwogen.

6. hoge resolutie documentatie van cellulaire ATeam fluorescentie

  1. Breng direct na de opnames de opname kamer met de segment cultuur over naar de confocale laser scan Microscoop.
    Opmerking: Wees bijzonder voorzichtig. Als gevolg van mogelijke foto schade, voer deze stap pas na experimenten. Voor documentatiedoeleinden kan men de E-ACSF uitwisselen met H-ACSF. Daarom is een perfusie systeem niet noodzakelijkerwijs vereist.
  2. Neem z-stacks bij de hoogste z-resolutie die mogelijk is bij de gegeven optische configuratie.
  3. Pas een deconvolutie-algoritme toe om de beeldresolutie te verhogen.

Representative Results

AAV-vectoren zijn een betrouwbaar hulpmiddel om vreemde genen in cellen binnen levend weefsel selectief uit te drukken16. Directe toepassing van AAVs met de sequentie cassette van ATeam 1.03Yemk en een specifieke promotor resulteert in een hoge expressie van de sensor in het gekozen celtype. Bij DIV 14 (~ 10 dagen na een transductie) worden neuronen die ATeam uitdrukken onder de humane synapsin promotor gevonden bij hoge dichtheid in de neocortex van gekweekte weefsel plakjes op diepten tot 50 μm onder het segment oppervlak (Figuur 5a). Vergelijkbare resultaten kunnen worden behaald in de Hippocampus (Figuur 5B).

Figure 5
Figuur 5: visualisatie van neuronen die ATeam 1.03Yemk uitdrukken in gekweekte parasagitale organotypische hersen schijfjes. Afbeeldingen links corresponderen met uitgebreide focus projecties van 43 optische secties (1,05 μm elk) van corticale weefsel (A) en (B) van 70 optische secties (0,6 μm per stuk) van hippocampal weefsel. Afbeeldingen aan de rechterkant vertegenwoordigen de volume weergave van dezelfde projectie. Cellen zijn kleurgecodeerd op basis van hun diepte ten opzichte van het segment oppervlak, zoals aangegeven door de kleur schaal aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Voor de meting van de ATP-niveaus in astrocyten, wordt ATeam 1.03Yemk uitgedrukt onder de controle van de promotor van het humaan gliacellen fibrillair zure eiwit (GFAP). Dit resulteert in een efficiënte transductie van cellen in zowel neocortex en Hippocampus van gekweekte weefsel segmenten (Figuur 6). Met name kunnen twee verschillende morfologische fenotypes worden onderscheiden, afhankelijk van de diepte ten opzichte van het oppervlak van segment preparaten. In de eerste, oppervlakkige laag, cellen worden gekenmerkt door dikke primaire processen die overwegend parallel aan het oppervlak zijn gerangschikt. Deze cellen vertonen sterk overlappende domeinen, waardoor een dicht gevlochten van ogenschijnlijk reactieve astrocyten ontstaat (Figuur 6). In diepere lagen (30-60 μm van het oppervlak) vertonen getransduceerde astrocyten fijne cellulaire processen die grotendeels sferische domeinen vormen en hun morfologie lijkt op die van astrocyten in situ zoals gerapporteerd eerder19,20,21 (Figuur 6). Om een betere transductie van diepere-Layer astrocyten en een betere optische toegang tot deze diepere lagen te verkrijgen, kan het gliacellen littekenweefsel worden verwijderd zoals beschreven in stap 4.

Figure 6
Figuur 6: visualisatie van astrocyten die ATeam 1.03Yemk uitdrukken in gekweekte parasagitale organotypische hersen schijfjes. De afbeelding links correspondeert met een uitgebreide focus projectie van 191 optische secties (0,45 μm per stuk). Ter illustratie werd het gliacellen litteken uitgesloten van de projectie van astrocyten. Afbeeldingen rechts vertegenwoordigen de volume weergave van dezelfde projectie voor en na verwijdering van het gliale litteken. Cellen zijn kleurgecodeerd op basis van hun diepte ten opzichte van het segment oppervlak, zoals aangegeven door de kleurschalen aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Succesvolle uitdrukking van ATeam 1.03Yemk maakt de dynamische meting van veranderingen in de ATP-niveaus in neuronen of astrocyten mogelijk, afhankelijk van de gebruikte promotor (zie hierboven). Experimenten werden uitgevoerd in een experimenteel Bad voortdurend geperfundeerd met E-acsf (bubbled met 95% O2/5% Co2). In organotypische plakjes uitdrukken ATeam 1.03Yemk in hippocampal neuronen, regio's van belang (Rois) werden geselecteerd voor het starten van de opname, die de somata van piramidale cellen (Figuur 7A). Bovendien werd een regio voor achtergrond aftrekken gekozen (Figuur 7a). De emissie van Venus en eCFP fluorescentie werd vervolgens voor elk van deze ROIs afzonderlijk verzameld en in de loop van de tijd als fluorescentie-emissieniveau afgebeeld (Figuur 7B). Na het opnemen van fluorescentie onder controle omstandigheden gedurende enkele minuten om een stabiele Baseline te waarborgen, werd het cellulaire metabolisme geremd door de voorbereiding van het segment bloot te stellen aan een glucose-vrije zoutoplossing, waaraan 5 mM natrium natriumazide (NaN3) voor één minuut werd toegevoegd (Figuur 7B). Deze manipulatie veroorzaakte tegengestelde veranderingen in de emissie-intensiteit van het FRET paar (Figuur 7B, linker panelen), met een afname van Venus (527 nm) en een toename van de ecfp (475 nm) emissie. Het berekenen van de FRET ratio door het delen van de fluorescentie emissie van Venus door die van eCFP (FVenus/fecfp) resulteerde in signalen die de relatieve veranderingen in de intracellulaire ATP-niveaus weerspiegelen, de zogenaamde "ateam fret ratio" (Figuur 7B, rechter paneel). In alle opgenomen neuronen (n = 70 cellen in N = 5 plakjes) veroorzaakte NaN3 een omkeerbare afname van de ATEAM fret ratio, wat duidt op een omkeerbare afname van INTRACELLULAIRE ATP niveaus bij remming van cellulair metabolisme.

Figure 7
Afbeelding 7: demonstratie van time lapse ATeam fret ratio Imaging. (A) linksboven: breed-veld fluorescentie beeld van de piramidale laag en stratum radiatum van de Ca1-regio van een gekweekte organotypic hippocampal segment dat ateam 1.03yemk in neuronen uitdrukt. Rechtsboven: vergrote weergave van boxed sectie zoals aangegeven aan de linkerkant. Witte lijnen afbakenen gebieden van belang (ROIs) 1-3 vertegenwoordigen van cellichamen van CA1 piramidale neuronen gekozen voor analyse in (B). BG vertegenwoordigt de ROI die is gekozen voor achtergrondcorrectie. Bodem: pseudo-gekleurde beelden die de fluorescentie-emissie van Venus (groen), eCFP (paars) en de verhouding van Venus/eCFP vertegenwoordigen. B) timelapse-opname in rois 1-3, die neuronale cellichamen vertegenwoordigt (Zie A). Sporen op de linker Toon genormaliseerde fluorescentie emissie van Venus (groen) en eCFP (magenta). Sporen aan de rechterkant tonen de corresponderende ATeam FRET ratio. Merk op dat perfusie met 5 mM NaN3 bij afwezigheid van extracellulaire glucose gedurende 1 minuut (grijze balk) een omkeerbare afname van de ATEAM fret ratio induceert, wat duidt op een afname van de INTRACELLULAIRE ATP-concentratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Om de stabiliteit van het preparaat en de sensor onder lange termijn experiment omstandigheden te waarborgen, werden plakjes die ATeam in neuronen of astrocyten uitdrukken voortdurend geperfectiongebruikt met ACSF gedurende langere perioden (> 50 min; n = 12 cellen elk, N = 3 Otc's uit 3 hersenen). Onder deze omstandigheden is de ATeam FRET ratio niet veranderd (Figuur 8). Blootstelling van de preparaten aan CIS met metabole remmers ("chemische ischemie", Zie tabel 1), in tegenstelling tot, resulteerde weer in de verwachte daling van de ATEAM fret ratio zoals hierboven waargenomen.

Figure 8
Figuur 8: basis experimenten met ATeam. Long-term ATeam FRET ratio imaging in 14 verschillende cellen onder Baseline condities in neuronen (boven) en astrocyten (onder). Gegevens werden onder vergelijkbare omstandigheden genomen als andere experimentele gegevens. Aan het einde van elke meting werd chemische ischemie opgewekt door perfusie met CIS zoals aangegeven door de pijl. Opmerking: Baseline ATeam FRET ratio's zijn stabiel in de tijd onder Baseline condities. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Vervolgens analyseerden we de reacties van neuronen en astrocyten die ATeam 1.03Yemk uitdrukken in een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie. Na het vaststellen van een stabiele Baseline werden neuronen geperfectiongebruikt met een zoutoplossing waarbij de kaliumconcentratie gedurende 3 minuten werd verhoogd van 3 naar 8 mM (Figuur 9a). Deze manipulatie leidt echter niet tot een detecteerbare verandering in de ATeam FRET ratio (n = 56 cellen in N = 5 segmenten). Om ervoor te zorgen dat de sensor reageerde op een verandering in de ATP-niveaus, werden de segmenten vervolgens weer blootgesteld aan een aanhoudende periode van chemische ischemie die werd opgewekt door E-ACSF door CIS te vervangen. Chemische ischemie resulteerde in een snelle afname van de ATeam FRET ratio naar een nieuw, stabiel niveau, wat duidt op de nominale uitputting van ATP na 2-3 min (Figuur 9a).

Figure 9
Figuur 9: representatieve experimenten ter illustratie van veranderingen in de ATP-niveaus in neuronen en astrocyten. (A,B): afbeeldingen op de linker Toon ateam fluorescentie van neuronen en astrocyten gelegen in de hippocampal Ca1 regio van organotypic plakjes. Sporen aan de rechterkant vertegenwoordigen timelapse-opnames van de ATeam FRET ratio verkregen uit een ROI gepositioneerd over een enkel cellichaam. In beide experimenten werden plakjes voor het eerst blootgesteld aan een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie gedurende 3 minuten (Zie bar), gevolgd door een uiteindelijke blootstelling aan chemische ischemie. Merk op dat terwijl neuronen niet reageren op de verhoging van extracellulair kalium (A), astrocyten reageren met een toename in ATP (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Hetzelfde experimentele protocol werd uitgevoerd met plakjes, waarin ATeam 1.03Yemk werd uitgedrukt in astrocyten. In tegenstelling tot wat in neuronen werd waargenomen, reageerden astrocyten op de toename van het extracellulaire kalium door een omkeerbare toename van de ATeam-FRET ratio, wat duidt op een toename van de intracellulaire ATP-niveaus (n = 70 cellen in N = 5 segmenten) (Figuur 9B). De daaropvolgende blootstelling aan chemische ischemie resulteerde, zoals verwacht, in een grote daling van de ATeam FRET ratio, indicatief voor de nominale depletie van intracellulaire ATP (Figuur 9B).

Discussion

Hier tonen we een procedure voor de Cell-Type specifieke uitdrukking van ATeam 1.03Yemk, een op fret gebaseerde, genetisch gecodeerde nano sensor14, voor het meten van veranderingen in de ATP-niveaus in astrocyten of neuronen in organotypische weefselsegment culturen van de muis hersenen15. In voorbeeldige opnames tonen we aan dat een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie niet resulteert in een verandering in de ATP concentraties in neuronen, terwijl astrocytische ATP niveaus stijgen in reactie op deze manipulatie. Bovendien, onze resultaten tonen aan dat bij remming van cellulaire metabolisme, ATeam 1.03Yemk fret ratio snel daalt in beide celtypen, wat duidt op een snelle afname van de INTRACELLULAIRE ATP.

Uitdrukking van ATeam 1.03Yemk in organotypische segment culturen vereist onderhoud van het weefsel in cultuur onder gecontroleerde omstandigheden gedurende ten minste 7-10 dagen. Als alternatief kan ateam 1.03yemk ook worden gebruikt voor het meten van ATP in acuut geïsoleerde hersenweefsel plakjes en in optische zenuwen van muizen13,15. Metingen in acuut geïsoleerd weefsel vereisen echter de aanmaak van transgene dieren of een stereotactische toepassing van virale vectoren in de hersenen, waarbij dierproeven en strikte dierenzorg protocollen worden betrokken. In dit opzicht vertegenwoordigt ateam 1.03yemk expressie in organotypische weefselsegment culturen een nuttig en waardevol alternatief22,23. Voor vele jaren, organotypic weefsel segment culturen dienen als een gevestigde modelsysteem om neurale eigenschappen te bestuderen, connectiviteit en ontwikkeling24,25,26. Ze onderhouden niet alleen de algemene weefsel architectuur en laminatie (Figuur 1), maar hosten ook de preferentiële eigenschappen van celculturen zoals superieure toegankelijkheid en directe controle van experimentele omstandigheden. Organotypische weefselsegment culturen worden ook routinematig gebruikt om vreemde genen uit te drukken met behulp van virale vectoren27. Er zijn verschillende soorten virale vectoren gemeld om transgenen te leveren in hersenweefsel16,28. Adenovirale vectoren induceren hoge expressie in gliacellen, maar niet hippocampal neuronen16, en zou kunnen genereren gliacellen reactiviteit17. Adeno-geassocieerde virale vectoren zoals hier gebruikt ontstaan als een goed alternatief15, en hun effectiviteit is ook aangetoond in vivo29.

Terwijl voornamelijk wordt gebruikt voor de studie van neuronale eigenschappen, recente studies hebben vastgesteld dat organotypic weefsel segment culturen kunnen ook worden toegepast voor de analyse van astrocyten. Gekweekte plakjes worden meestal bedekt met een laag reactieve astrocyten19,30 (Figuur 5), maar astrocyten vertonen een meer inheemse, niet-reactieve morfologie en cytoarchitectuur in diepere lagen19,30 (Figuur 5). In de huidige studie beschrijven we een procedure voor het mechanisch verwijderen van het buitenste gliale litteken, wat resulteert in een betere experimentele en optische toegankelijkheid van inheemse astrocyten binnen de juiste organotypische weefsellagen. Bovendien, de verwijdering ervan verbetert de expressie werkzaamheid in diepere lagen van de organotypische plakjes; Als het gliale litteken niet wordt verwijderd, kan de transductie door AAVs de neiging hebben om beperkt te zijn tot de oppervlakkige cellagen.

Verschillende externe mechanische factoren moeten worden overwogen bij het uitvoeren van experimenten in weefsel segmenten. Een variatie in Bath perfusie Velocity kan bewegingen van het hele preparaat induceren en/of veranderingen in focus induceren, wat resulteert in kunstmatige voorbijgaande veranderingen van het sensorsignaal. Bovendien zijn zowel astrocyten als neuronen gemeld om te reageren op mechanische vervorming zoals opgelegd door hoge perfusie snelheden32,33. In onze handen, met behulp van een betrouwbare peristaltische pomp, samen met het handhaven van kleine en stabiele volumes van zoutoplossing tussen het weefsel en de doelstelling (meniscus) resulteert in een stabiele FRET-signaal onder Baseline voorwaarden bij de perfusie snelheid gebruikt hier (1.5-2.5 mL/min; Figuur 8).

In de huidige studie tonen we ook aan dat op FRET gebaseerde beeldvorming met ATeam 1.03Yemk kan worden gebruikt om de ATP-niveaus in neuronen en astrocyten te bewaken. Een alternatieve manier eerder geïntroduceerd voor meting van cellulaire ATP is de zogenaamde luciferin-Luciferase assay34,35,36,37. Deze benadering is echter gebaseerd op beeldvorming van bioluminescentie en biedt slechts een tamelijk lage temporale en ruimtelijke resolutie, deels door een hoog achtergrondgeluid. Een andere methode die in de afgelopen jaren routinematig werd gebruikt, was de beeldvorming van veranderingen in de intracellulaire magnesiumconcentratie met behulp van de iongevoelige de magnesium Green38,39,40. Deze benadering heeft betrekking op de constatering dat een consumptie van ATP resulteert in de afgifte van haar co-factor magnesium. Beeldvorming met magnesium groen zorgt daardoor alleen voor een secundaire schatting van de veranderingen in de ATP-niveaus. Bovendien, magnesium groen is ook gevoelig voor veranderingen in intracellulaire calcium, het introduceren van een andere moeilijkheid bij het interpreteren van de resultaten verkregen met deze methode.

De recente ontwikkeling van genetisch gecodeerde nano sensoren voor directe beeldvorming van cellulaire metabolieten betekende daarom een grote stap voorwaarts11,12. Verschillende sensoren werden gegenereerd die kunnen worden gebruikt voor de meting van intracellulaire ATP36,41,42,43. Onder deze zijn de ratiometrische fluorescerende ATP indicator "Koningin"41 evenals PercevalHR, die DETECTEERT de ATP: ADP ratio42. Terwijl de laatste sonde een waardevol instrument is voor de studie van de energiestatus van cellen, vereist het gelijktijdige meting van veranderingen in pH42.

ATeam is een nano-sensor waarvan verschillende varianten bestaan, die – onder andere – verschillen in hun bindingsaffiniteit voor ATP14. In vitro, ATeam 1.03Yemk vertoont een Kd van 1,2 mm bij 37 ° c, die dicht bij cellulaire ATP niveaus bepaald in verschillende neuronale celtypen, variërend van de hypothalamus en cerebellum34 tot hippocampus37,44,45. Bij kuvette metingen resulteerde de verlaging van de temperatuur met 10 °C in een significante afname van de bindingsaffiniteit van ATeam 1.03Yemk naar ATP, wat suggereert dat het mogelijk niet ideaal is voor cellulaire beeldvorming bij kamertemperatuur14. Onze eerdere studie15, echter, toonde aan dat het gedrag en de reactie van ateam 1.03yemk uitgedrukt in neuronen en astrocyten aan verschillende manipulaties is vergelijkbaar in de buurt van fysiologische en op kamertemperatuur, wat aangeeft dat de sensor kan betrouwbare bepaling van intracellulaire ATP niveaus onder beide omstandigheden. Daarnaast hebben onze vorige experimenten de pH-gevoeligheid van ATeam 1.03Yemk , uitgedrukt in cellen15, behandeld, waaruit blijkt dat het ongevoelig is voor veranderingen in intracellulaire pH met ongeveer 0,1-0,2 pH-eenheden. Als de Kd in de lage mm bereik is een probleem, alternatieve ateam varianten kunnen worden gebruikt14, onder hen rood verplaatste varianten van ATEAM ("go-ateam")43.

Onze experimenten met ATeam 1.03yemk tonen aan dat een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie met slechts enkele mm (van 3 tot 8 mm) resulteert in een voorbijgaande toename van de Ateam 1.03yemk ratio in astrocyten in de organotypische segment cultuur. Deze observatie bevestigt eerdere studies15,46 en geeft duidelijk aan dat astrocyten reageren op het vrijkomen van kalium door actieve neuronen met een toename van hun ATP-productie, meestal waarschijnlijk als gevolg van een stimulatie van de na+/k+-ATPase en de na+/HCO3- cotransporter, respectievelijk47,48. In tegenstelling tot deze, neuronen niet tonen een reactie, die in lijn is met eerdere werk ook15. Beide celtypen, echter, snel en sterk gereageerd op remming van cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling zoals aangegeven vóór15. Onder de voorwaarden van chemische ischemie, ATeam FRET ratio's daalde naar een nieuw stabiel niveau, wat duidt op een nominale uitputting van cellulaire ATP. Het laatste resultaat suggereert dat zowel neuronen als astrocyten vertonen een relevante consumptie van ATP ook onder steady-state omstandigheden zonder extra stimulatie door synaptische activering of toepassing van neurotransmitters. Samen, concluderen we dat FRET-based Imaging met genetisch gecodeerde nano sensoren, onder hen ATeam 1.03Yemk, een waardevolle benadering zal bieden om de cellulaire processen te verhelderend die verantwoordelijk zijn voor veranderingen in INTRACELLULAIRE ATP-niveaus en cellulaire ATP-verbruik onder verschillende omstandigheden.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. De auteurs ontvingen financiële steun om Open Access te publiceren door Nikon Microscoop Solutions, Düsseldorf, Duitsland, die instrumenten produceert die gebruikt worden in het video artikel. Het bedrijf was niet betrokken bij het ontwerpen van de hier gepresenteerde experimenten, noch in de uitvoering ervan, noch in de verwerking van gegevens, noch in het schrijven van het manuscript.

Acknowledgments

De auteurs willen Claudia Roderigo en Simone Durry bedanken voor hun deskundige technische assistentie. We danken Dr. Niklas J. Gerkau en M.Sc. Joel Nelson voor hulp bij de voorbereiding van de organotypische segment culturen. Het onderzoek in het laboratorium van de auteur werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksvereniging (DFG; VOOR 2795: ro 2327/13-1 en SPP 1757: ro 2327/8-2 naar CRR; en SPP 1757: jonge glia start-up financiering voor RL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxyglucose Alfa Aesar L07338 Non-metabolizable glucose analog
36-IMA-410-019 Argon laser Melles Griot 488 nm wavelength argon
Ascorbic acid Carl Roth 3525.1 Antioxidant, Vitamin C
band pass filters 483/32 AHF Analysentechnik AG Splitter compatible emmision filter
band pass filters 542/27 AHF Analysentechnik AG Splitter compatible emmision filter
Beamsplitter T 455 LP AHF Analysentechnik AG Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR AHF Analysentechnik AG Splitter dichroic
Confocal laser scannig microscope C1 Nikon Microscope Solutions Modular confocal microscope system C1
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) OriginLab corporation Scientific graphing and data analysis software
D-glucose monohydrate Caelo 2580-1kg
DPBS GIBCO/Life 14190250 Dulbecco's phosphate-buffered saline
Eclipse E 600FN upright microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 upright microscope Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber custom build Perfusion chamber for live-cell imaging
EZ-C1 Silver Version 3.91 Nikon Microscope Solutions Imaging software for confocal microscope
Hanks' Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H9394 With Phenol Red for pH monitoring
HERAcell 150 Thermo Scientific CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine
HERAsafe KS/KSP Thermo Scientific Safety Cabinet
Horse serum GIBCO/Life 26050088 Heat inactivated
Huygens Professional SVI Imaging Deconvolution software
Image J 1.52i Wayne Rasban national Institute of Health Image processing Software available in the public domain
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Insulin from bovine pancreas
IP serie peristaltic pump Ismatec High-precisionmulti-channel pump
Layout software, Illustrator CS6 Adobe Vector graphics editor
L-glutamine GIBCO/Life 25030024
Microm HM 650 V Thermo Scientific Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too.
Microscope stage custom build
Microsoft Excel 16 Microsoft Spreadsheet software for basic data processing
Millicell culture insert Merck Millipore PICM0RG50 Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich M7278 Synthetic cell culture media
Monochromator Polychrome V Thermo Scientific/FEI Ultra fast switching monochromator
NaN3 (Sodium Azide) Sigma-Aldrich S-8032 Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin.
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 Nikon Microscope Solutions Water Immersion Microscope Objective
NIS Elements 4.50 advanced Research Nikon Microscope Solutions Imaging software. Upgraded version for FRET imaging
ORCA-Flash4.0 Hamamatsu Photonics Digital CMOS camera
Perfusion tubing Pro Liquid GmbH Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0 Adobe Image processing software
Sodium L-lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) ETH Zürich v244 Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) ETH Zürich v307 Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D.
WVIEW GEMINI optic system Hamamatsu Photonics Emission Image Splitter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  3. Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
  4. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
  5. Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
  6. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
  7. Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
  8. Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
  9. Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
  10. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
  11. Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
  12. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
  13. Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241 (2017).
  14. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
  15. Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
  16. Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
  17. Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
  18. Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
  19. Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
  20. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623 (2018).
  21. Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
  22. Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
  23. Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
  24. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  25. Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
  26. Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
  27. Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
  28. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  29. Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
  30. Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605 (2013).
  31. Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
  32. Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
  33. Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
  34. Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
  35. Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
  36. Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
  37. Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
  38. Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
  39. Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
  40. Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
  41. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
  42. Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550 (2013).
  43. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
  44. Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
  45. Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
  46. Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
  47. Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141 (2016).
  48. Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).

Tags

Neurowetenschappen uitgave 154 neurowetenschappen organotypic brain slice astrocyte neuron AAV Hippocampus cortex FRET
Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03<sup>Yemk</sup>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerchundi, R., Kafitz, K. W.,… More

Lerchundi, R., Kafitz, K. W., Färfers, M., Beyer, F., Huang, N., Rose, C. R. Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (154), e60294, doi:10.3791/60294 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter