Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des genetisch codierten FRET-basierten Sensors ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen des Mausvorhirns. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor für die dynamische Bildgebung von zellulären ATP-Spiegeln in Neuronen und Astrozyten verwendet wird.
Abstract
Die neuronale Aktivität im Zentralnervensystem (ZNS) weckt eine hohe Nachfrage nach zellulärer Energie, die durch den Abbau von Adenosintriphosphat (ATP) entsproche. Ein großer Teil von ATP wird benötigt, um Ionengradienten über Plasmamembranen, die durch elektrische Signalisierung von Neuronen abgebaut werden, neu zu installieren. Es gibt Hinweise darauf, dass Astrozyten - während sie selbst keine schnellen elektrischen Signale erzeugen - eine erhöhte Produktion von ATP als Reaktion auf neuronale Aktivität durchlaufen und aktive Neuronen unterstützen, indem sie ihnen Energiemetaboliten zur Verfügung stellen. Die jüngste Entwicklung genetisch kodierter Sensoren für verschiedene Metaboliten ermöglicht nun die Untersuchung solcher metabolischen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des ATP-empfindlichen Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungssensors (FRET-) Sensor ATeam1.03YEMK in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maus-Hippocampus und des Kortex mit adeno-assoziierten viralen Vektoren (AAV). Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor zur dynamischen Messung von Veränderungen der zellulären ATP-Spiegel in Neuronen und Astrozyten bei Zunahmen des extrazellulären Kaliums und nach Induktion chemischer Ischämie (d. h. einer Hemmung des zellulären Energiestoffwechsels) eingesetzt werden kann.
Introduction
Die exzitatorische elektrische Aktivität von Neuronen basiert weitgehend auf dem Fluss von Kationen wie Natrium (Na+) und Kalium (K+) über ihre Plasmamembranen. Die Aufrechterhaltung der elektrochemischen Gradienten dieser beiden Ionen ist daher für die Signalisierung erforderlich. Dies wird durch die zelluläre Na+/K+-ATPase (NKA) erreicht, eine allgegenwärtig exprimierte elektrogene Transmembranpumpe, die 3 Na+ aus der Zelle im Austausch für 2 K+ aus dem extrazellulären Raum extrudiert, was den Verbrauch eines Moleküls ATP pro Transportzyklus1erfordert. Neben dem NKA gibt es noch einige weitere ATP-verbrauchende Ionentransporter, darunter die Plasmamembran Ca2+-ATPase, die für die intrazelluläre Ca2+ Homöostase und deren Export nach aktivitätsinduziertem Zustrom2von entscheidender Bedeutung ist. In präsynaptischen Vesikeln erzeugt ein Vakuolar-Typ H+-ATPase (v-ATPase) den Protonengradienten, der für die Aufnahme des Neurotransmitters in dieses Fach erforderlich ist3.
Während die Aktivität von Neuronen daher eine erhebliche Menge an ATP4erfordert, weisen sie keine signifikante Kapazität für die Speicherung von Energie auf. Stattdessen scheinen sie auf metabolische Wechselwirkungen mit benachbarten Astrozyten zu verlassen, die wichtigsten Glykogenspeicher im Gehirn5. Es wurde vorgeschlagen, dass astrozytisches Glykogen in der Tat eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des neuronalen Energiebedarfs spielt; und ein Schlüsselphänomen in dieser vorgeschlagenen neurometabolischen Kopplung zwischen den beiden Zelltypen ist die Fähigkeit der Astrozyten, ihre ATP-Produktion als Reaktion auf neuronale Aktivität zu erhöhen6,7,8. Diese Hypothese, bekannt als Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle (ANLS), ist immer noch in der Debatte, weil andere Arbeiten Beweise dafür geliefert haben, dass Neuronen auch ihre eigene Rate der Glykolyse als Reaktion auf Stimulation9,10erhöhen können, was die Notwendigkeit weiterer Methoden und Ansätze zur Untersuchung der Neuro-Glia-Interaktion widerspiegelt.
Die Untersuchung des zellulären Energiestoffwechsels und des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten zur Aufklärung neuro-gliametabolischer Wechselwirkungen wird seit langem durch das Fehlen geeigneter Sonden zum Nachweis von Veränderungen der Metabolitenkonzentrationen in lebenden Zellen im Hirngewebe behindert. Das letzte Jahrzehnt hat jedoch einen Schub in der Entwicklung neuer Werkzeuge und neuer genetisch kodierter Fluoreszenzsonden für verschiedene Metaboliten, einschließlich Sensoren für ATP, Laktat, Pyruvat und andere11,12. Mit diesen Werkzeugen ist es nun möglich, Fragen im Zusammenhang mit dem zellulären ATP-Verbrauch und Veränderungen der zellulären Energieniveaus auf Einzelzellebene und zelltypspezifisch in intaktem Hirngewebe direkt zu behandeln13.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der zytosolischen ATP-Dynamik auf Neuronen und Astrozyten kultivierter organotypischer Gehirnscheiben. Wir zeigen, wie adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) für die zelltypspezifische Expression des genetisch kodierten ATP-Nanosensors ATeam1.03YEMK (14) in Neuronen und Astrozyten von Scheiben des Maushirns verwendet werden, die in der Zellkultur für mehrere Wochen gehalten werden können15. Es wird ein Verfahren beschrieben, wie die Glianarbe entfernt wird, die kultivierte Gewebescheiben bedeckt, was die optische Zugänglichkeit und Bildgebung von Zellen in den darunter liegenden organotypischen Gewebeschichten verbessert. Schließlich zeigen wir, wie ATeam1.03YEMK verwendet werden kann, um FRET-basierte Abbildungvonen von Veränderungen in zellulären ATP-Spiegeln in dieser Zubereitung durchzuführen. Diese Methode hostet die wichtigsten Vorteile, dass es keine chirurgischen Gehirnverfahren erfordert, bietet hohe Expression der Sensor- und Zelltyp-Spezifität in kultivierten Gehirnscheiben, Verringerung der Invasivität oder Stress in den Zellen im Vergleich zu anderen Methoden, wie Transfektion durch Elektroporation oder Transduktion mit anderen viralen Vektoren10,16,17. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf andere FRET-basierte Nanosensoren angewendet werden, darunter Varianten von ATeam1.03, die eine geringere Bindungsaffinität für ATP14bieten.
Protocol
Die vorliegende Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den institutionellen Leitlinien der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf sowie der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/EU) durchgeführt. Alle Experimente mit organotypischen Hirnscheibenkulturen wurden dem Tierschutzamt der Tierpflege- und Einsatzeinrichtung der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf mitgeteilt und genehmigt (institutionelle Aktnummer: O50/05). Gemäß den Empfehlungen der Europäischen Kommission18wurden Tiere bis zu 10 Tagen durch Enthauptung getötet.
1. Vorbereitung von organotypischen Hirnscheibenkulturen (OTCs)
- Am Tag vor oder mindestens 30 min vor dem Eingriff
- Bereiten Sie die Petrischale (unter sterilen Bedingungen) vor. Entfernen Sie den Deckel der 6 Well-Platte und legen Sie 800-850 L OTC-Medium in jeden Brunnen. Bewahren Sie die Platte im Inkubator auf (37 °C, 5% CO2/95%O2), bis erforderlich.
- Bereiten Sie die Wasch-Petri-Gerichte (unter sterilen Bedingungen) vor. Fügen Sie 3 ml HBSS zu jeder 30 mm Petrischale hinzu. Es sind insgesamt 5 Gerichte pro Verfahren erforderlich. Legen Sie sie mindestens 30 min lang in den Inkubator (37 °C, 5% CO2/95%O2) — über Nacht, bis erforderlich.
- Vorbereiten des ACSF (Tabelle 1). Die Saline ohne Glukose bei 4 °C bis zum nächsten Tag aufbewahren.
| Salines und Medien - Formulierung | ||||
| Namen | Abkürzung | Zusammensetzung | Konzentration [mM] | Kommentare |
| Künstliche Cerebrospinal Fluid Lösung | ACSF | Nacl | 125 | Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 2.5 | Fügen Sie Glukose immer direkt vor der Verwendung hinzu. | ||
| CaCl2 | 2 | Nicht mehr als einen Tag mit Glukose lagern | ||
| MgCl2 | 1 | Nr. 310 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 26 | |||
| Glukose | 20 | |||
| Experimentelle ACSF | E-ACSF | Nacl | 136 | Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 3 | Fügen Sie Glukose immer direkt vor der Verwendung hinzu. | ||
| CaCl2 | 2 | Nicht mehr als einen Tag mit Glukose lagern | ||
| MgCl2 | 1 | 320 mOsm/L | ||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Glukose | 5 | |||
| Laktat | 1 | |||
| Chemische Ischämie-Lösung | Cis | Nacl | 136 | Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 3 | Nr. 318 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| 2, 2-Deoxyglucose | 2 | |||
| NaN3 | 5 | |||
| 8 mM Kalium ACSF | 8 mM K+ ACSF | Nacl | 128 | Geblasen mit 5% CO2/95% O2, pH 7.4 |
| Kcl | 8 | 320 mOsm/L | ||
| CaCl2 | 2 | |||
| MgCl2 | 1 | |||
| NaH2PO4 | 1.25 | |||
| NaHCO3 | 24 | |||
| Glukose | 5 | |||
| Laktat | 1 | |||
| Hepes-gepufferter ACSF | H-ACSF | Nacl | 125 | Angepasst auf pH 7,4 mit NaOH |
| Kcl | 3 | Fügen Sie Glukose immer direkt vor der Anwendung hinzu | ||
| CaCl2 | 2 | Nicht mehr als einen Tag mit Glukose lagern | ||
| MgSO4 | 2 | 310 mOsm/L (angepasst mit Saccharose) | ||
| NaH2PO4 | 125 | |||
| Hepes | 25 | |||
| Glukose | 10 | |||
| Hanks' ausgewogene Salzlösung | HBSS | Sigma (Katalognummer H9394). | ||
| Phosphat-gepufferte Saline von Dulbecco | DPBS | Gibco (Katalognummer 14287-080) | ||
| Organotypische Kultur Medium | OTC-Medium | wärmeinaktiviertes Pferdeserum | 20% | 34°C, 5 %CO2, pH 7,4, unter Kultivierungszustand |
| Mem | 79% | 320 mOsm/L | ||
| L-Glutamin | 1 | |||
| Insulin | 0,01 mg/ml | |||
| Nacl | 14.5 | |||
| MgSO4 | 2 | |||
| CaCl2 | 1.44 | |||
| Ascorbinsäure | 0.00125 % | |||
| D-Glucose | 13 |
Tabelle 1: Lösungszusammensetzung.
- Am Tag der Zubereitung die Glukose in den ACSF geben, auf Eis legen und mit 95% O2/5%CO2 für mindestens 30 min sprudeln, um einen pH-Wert von 7,4 zu erzielen.
- Sezier- und Schneiden
- Opfern Sie die Maus (BalbC, beide Geschlechter) an den postnatalen Tagen 6 bis 8 durch schnelle Enthauptung und legen Sie den Kopf in eine gläserne Petrischale mit eiskaltem ACSF.
- Setzen Sie den Schädel aus, indem Sie die Haut von hinten bis zur hinteren Spitze des Nasenbeins schneiden. Dann schneiden Sie vorsichtig den Schädel aus dem Foramen Magnum mit einer chirurgischen Schere und setzen Sie das Gehirn.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Verfahren mit den Leitlinien des Organs im Einklang steht. - Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es auf eine Filtermembran in einer eiskalten Petrischale, die mit ACSF gefüllt ist.
- Trennen Sie die Hemisphären und führen Sie einen parasagittalen Schnitt in einem Winkel von 45° durch. Fix eine Hemisphäre im Vibramgewebe Stadium mit Superkleber. Den Gewebeblock sofort in das Vibrammebad mit eiskaltem ACSF (mit 5% CO2/95% O2) überführen. Richten Sie schließlich das Gewebe aus. Halten Sie die zweite Hemisphäre in eiskaltem ACSF bis zum Schneiden.
- Passen Sie das Vibratome an, um Scheiben auf 250-400 m zu schneiden. Das Schneiden bei 250 m ergibt etwa 12 Scheiben pro Tier (400 m: 7 Scheiben).
- Nach dem Schneiden der Scheibe (Abbildung 1A), identifizieren Sie die Hippocampus-Bildung anhand ihres typischen morphologischen Aussehens (Abbildung 1) und isolieren Sie sie mit hypodermischen Nadeln (23 Gauge, 1"), wobei der Teil der Großhirnrinde neben dem Hippocampus bleibt.
HINWEIS: Die Erhaltung des Neocortex während der Kultivierung trägt dazu bei, die Integrität des Hippocampus zu erhalten. Der Hippocampus kann jedoch bei Bedarf ohne Kortex isoliert und kultiviert werden. - Legen Sie die Scheibe auf ein Netz in erwärmt, ACSF (34 °C, mit 5% CO2/95%O2) geblasen, bis alle Scheiben gesammelt werden.
- Übertragen Sie die Scheiben in den laminaren Strömungsschrank, um unter sterilen Bedingungen fortzufahren.
Abbildung 1: Repräsentative Übertragungsbilder von akuten und organotypischen Hirnscheibenpräparaten. Vergleich einer akut isolierten parasagittalen Hirnscheibe (A) und einer parasagittalen organotypischen Hirnscheibe, die 12 Tage lang in der Kultur gepflegt wurde (B) mittels Weitfeldtransluminationsmikroskopie. DG = dentate gyrus; CA1/3 = CA1/CA3-Region des Hippocampus; E-CTX = Entorhinaler Kortex; CTX = (Neo-) Kortex. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Culturing the Slices
- Übertragen Sie die Scheiben aus dem ACSF vorsichtig in eine der vorgewärmten Petrischalen, die mit steriler Hank-Salzlösung gefüllt sind, mit einer invertierten sterilen Glas-Pasteur-Pipette.
HINWEIS: Die Sterilisation des Gewebes erfolgt durch Verdünnung (Schritt 3.2). Übertragen Sie so wenig ACSF wie möglich auf die Petrischale. - Die Pipette wechseln und die Scheiben in die zweite Petrischale geben. Wiederholen Sie den Vorgang insgesamt 5 Mal. Übertragen Sie so wenig HBSS wie möglich auf die folgenden Petri-Gerichte.
- Legen Sie vorsichtig eine Scheibe nach der anderen auf die Oberseite des Kultureinsatzes. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Slice. Vermeiden Sie Turbulenzen in der Pipette und warten Sie, bis die Scheibe zur Spitze der Pasteur Pipette absteigt. Man kann bis zu 4 Scheiben auf eine einzelne Membran legen.
- Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Hank-Lösung von der Oberseite des Einsatzes mit einer feinen Spitze.
- Bewahren Sie die Kulturen (Abbildung 2) in einem Inkubator an der Schnittstelle zwischen Gas (Carbogen, 95% O2 /5%CO2) und der Flüssigkeit bei 37 °C bis zum Tag des Experiments auf. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage.
Abbildung 2: Prinzip der FRET-basierten ATP-Bildgebung in kultivierten organotypischen Gehirnscheiben mit dem genetisch codierten Sensor ATeam1.03YEMK. Schematische Darstellung des in dieser Arbeit vorgestellten Protokolls. Kurz gesagt, parasagittale organotypische Scheiben, die 1-3 Tage lang kultiviert wurden, werden mit einem adeno-assoziierten viralen Vektor transduziert, der entweder das astrozytenspezifische hGFAP- oder den neuronspezifischen hSyn-Promotor und die Sequenz für die Expression von ATeam1.03YEMKenthält. Verdünnte Aliquots dieser Vektoren (1:2-1:4) werden direkt auf die Oberseite einer Scheibe aufgetragen, die unter Kultivierungsbedingungen für mindestens 6 weitere Tage gepflegt wird. Veränderungen der intrazellulären ATP-Spiegel können dann in Zellen visualisiert werden, die den Sensor exemiten, indem er ihn bei 434 nm spannend wird und indem die Fluoreszenzemission gleichzeitig bei 527 (Akzeptor) und 475 (Spender) nm erreicht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Expression von ATP-Sensoren mit einem Aadeno-assoziierten Viralvektor (Abbildung 2)
HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Anforderungen für den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen zu erfüllen!
- Um den viralen Vektor zu behandeln, aliquot adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV2/5) bei 1-2 l, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 °C auf.
- Legen Sie einen Kolben mit 10 % Bleichmittel auf die sterile Bank, um alle verwendeten Reststoffe, die mit dem Vektor in Berührung kam, zu entsorgen.
- Für die Transduktion eine Verdünnung des Vektors um 1 l mit 2-3 l DPBS vorbereiten. Stocklösungen weisen normalerweise einen physikalischen Titer in der Größenordnung von 1012 viralen Genomen pro ml (vg/mL) auf.
- Übertragen Sie einen Einsatz mit einer kultivierten Scheibe in die sterile Kapuze.
- Ohne das Gewebe zu berühren, tragen Sie 0,5 l des verdünnten Vektors direkt auf die Oberseite jeder Scheibe auf.
HINWEIS: Eine bessere Expression in den tieferen Schichten des Gewebes wird durch die Transdution von kultivierten Scheiben bei 1-3 Tagen in vitro (DIV) erreicht. Die Transduktion älterer Kulturen kann zu einer vorherrschenden Expression von Zellen in der umgebenden Glianarbe bzw. zu einer niedrigen Expression in Neuronen führen. - Schließlich die Scheiben wieder in den Inkubator legen und mindestens 6 Tage lang pflegen. Ändern Sie das Medium am Tag der Transduktion nicht.
4. Entfernung der Glial Narbe (Abbildung 3)
- Kurz vor Beginn eines Experiments einen Einsatz mit kultivierten Scheiben in die sterile Kapuze geben und in eine 30 mm Schale mit 1 ml OCT-Medium oder MEM legen.
- Legen Sie die Schale unter das Stereoskop und konzentrieren Sie sich auf die Oberfläche der Scheibe.
- Verwenden Sie zwei sterile hypodermische Nadeln (23 G, 1"), um einen kurzen Querschnitt direkt an den schmalen Kanten einer ausgewählten Scheibe zu machen (Abbildung 3). Dieses Verfahren löst die Spannung in der Oberfläche, die durch die Glianarbe erzeugt wird, wodurch sie sich zurückzieht, wodurch die darunter liegenden Schichten freigelegt werden (siehe Abbildung 5).
HINWEIS: Die erste Gewebeschicht (Glianarbe) wird hauptsächlich durch reaktive Astrozyten gebildet. In der Großfeld-Bildgebung führt diese dichte Gewebeschicht zu einer zusätzlichen Streuung des Lichts, was zu verschwommenen Bildern führt. Das Entfernen der Narbe ist daher vorteilhaft, um eine bessere Sichtbarkeit der tieferen Schichten zu erhalten, die das richtige organotypische Gewebe enthalten. Achten Sie daher darauf, diesen Schnitt ausschließlich am Rand und in der oberen Schicht der Scheibenpräparation durchzuführen und das darunter liegende Gewebe nicht zu beschädigen. Wir haben keine Unterschiede zwischen den in OTCs mit Glialnarben erhaltenen Daten und denen von narbenfreien OTCs beobachtet (Daten werden nicht angezeigt). - Entfernen Sie das vorbereitete Slice aus der Einlage. Zu diesem Zweck verwenden Sie ein steriles Skalpell und verbrauchen es, indem Sie gerade parallele Schnitte zur Membran machen, ein Quadrat oder ein Dreieck mit der Scheibe in der Mitte bilden, während Sie die Ränder der Membran mit einer Pinzette halten. Wenn der Einsatz zusätzliche Scheiben enthält, übertragen Sie ihn zurück auf die Originalplatte und in den Inkubator. Die Oberflächenspannung des Mediums verhindert, dass es auf die Oberfläche der Membran austritt.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der mechanischen Entfernung der Glianarbe. Die Abbildung zeigt eine Hippocampus-Scheibenkultur, die von einer Glianarbe (blaues Ellipsoid) bedeckt ist. Wenn man einmal die Spitzen zweier Spritzennadeln am kleinsten Pol der Kultur und am Rand der Glianarbe (blaue gestrichelte Linie) schert, kippt die Narbe zur Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
5. FRET-basierte ATP-Bildgebung (Abbildung 4)
- Vor dem Experiment E-ACSF vorbereiten und mit 95% O2/5%CO2 für mindestens 30 min blasen, um einen pH-Wert von 7,4 zu erhalten. Schalten Sie die Leuchtstofflichtquelle (Xenon-Lampe) des Monochromators ein (Abbildung 4). Starten Sie die Perfusion kurz vor dem Herausnehmen der Scheibe aus dem Inkubator.
HINWEIS: Halten Sie die Salinmiten mit 95%O2 und 5%CO2 während des gesamten Experiments blasen. - Übertragen Sie die Scheibe mit einer peristaltischen Pumpe in eine Versuchskammer, die ständig mit frisch kariertem E-ACSF durchforsst wird (Abbildung 4). Fixieren Sie dann das Segment mit einem Raster. Legen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und verbinden Sie das Perfusionssystem. Für die Durchblutung werden gasdichte Laborschläuche empfohlen.
HINWEIS: Experimente können bei Raumtemperatur oder bei physiologischer Temperatur durchgeführt werden, je nach versuchsweiseer Konstruktion. Überprüfen Sie die Stabilität und Zuverlässigkeit des Durchblutungsflusses, um Fokusänderungen zu vermeiden, die durch Die Bewegung des Gewebes und/oder Veränderungen der Scherspannung verursacht werden. Die Standard-Perfusionsgeschwindigkeiten für Scheibenarbeiten, die von uns und vielen anderen Laboratorien verwendet werden, sind 1,5-2,5 ml/min.
Abbildung 4: Konfiguration des FRET-Imaging-Setups. (A) Schematische Darstellung der verschiedenen Komponenten und ihrer räumlichen Anordnung, die für die FRET-Bildgebungseinrichtung erforderlich sind. Die Anordnung besteht aus einem Monochromator mit einer Xenonlampe als Lichtquelle, einem aufrechten Feststufenmikroskop (1), einem Bildteilersystem (2), einer digitalen CCD- oder CMOS-Kamera für Zeitrafferaufnahmen (3) und einem für stabile Konstanteperfusion angepassten Versuchsbad (4). Die Badperfusion wird durch eine peristaltische Pumpe mit einstellbarer Durchflussrate realisiert. (B) Bild des experimentellen Arbeitsbereichs. Das FRET-Bildgebungs-Setup ist auf einem vibrationsgedämpften Tisch mit einer x/y-translationalen Stufe montiert, in die das Versuchsbad eingebettet ist. Zahlen: siehe (A). (C) Schematische Ansicht des Lichtwegs vom Monochromator zur Digitalkamera. Angezeigt ist die Position der verschiedenen Filter und des dichroitischen Spiegels. Zahlen: siehe (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Bringen Sie die kultivierte Scheibe mit Transmissionslicht in den Fokus. Identifizieren Sie den Bereich, in dem Experimente durchgeführt werden sollen (Beispiel: CA1-Region des Hippocampus). Bevor Sie mit bildgebenden Experimenten beginnen, warten Sie mindestens 15 min, damit sich die Scheiben an die salinen Bedingungen anpassen können. Die Konfiguration des Versuchsaufbaus finden Sie in Abbildung 4.
- Schalten Sie die Kamera und die Bildverarbeitungssoftware ein. Wählen Sie dann den richtigen Filterwürfel aus.
- Erregen Sie das Spenderfluoreszenzprotein (eCFP) bei 435/17 nm ( 435 nm). Stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 40 und 90 ms ein.
HINWEIS: Eine starke Exposition von Scheiben gegenüber dem fluoreszierenden Licht kann zu phototoxischen Wirkungen führen. - Die Anregung bei 435 nm führt zu Einer Emission bei 475 nm (eCFP; Spender) und 527 nm (Venus; Akzeptor). Teilen Sie die Fluoreszenzemission bei 500 nm mit einem Emissionsbildteiler auf und verwenden Sie Bandpassfilter bei 483/32 und 542/27, um die Spender- und Akzeptorfluoreszenz weiter zu isolieren. Starke Expression kann zu einer Sättigung der Detektoren führen. In diesem Fall können Sie einen Neutraldichtefilter verwenden, um die Intensität der Anregung zu reduzieren.
- Wählen Sie eine Region von Interesse (ROI) scheinbar ohne zelluläre Fluoreszenz für Hintergrundsubtraktion. Erstellen Sie dann ROIs, die Zellkörper abbilden.
- Legen Sie die Häufigkeit der Bildaufnahme und die Gesamtaufnahmezeit fest. Für lange (>30 min) Experimente wird eine Erfassungshäufigkeit von 0,2-0,5 Hz empfohlen, um Phototoxizität zu verhindern.
- Starten Sie die Aufzeichnung. Es wird empfohlen, mindestens 5 min unter Basisbedingungen aufzunehmen, um die Stabilität der Zubereitung zu gewährleisten.
HINWEIS: Passen Sie den Fokus der Zelle während der Aufnahme bei Bedarf an. - Um Veränderungen im intrazellulären ATP zu induzieren, übertragen Sie das Perfusionsrohr von Standard-ACSF auf eine Saline, die metabolische Inhibitoren enthält (z. B. CIS, siehe Tabelle 1 und unten). Alternativ können Sie eine Saline mit erhöhter Kaliumkonzentration verwenden, um die Freisetzung von Kalium aus aktiven Neuronen nachzuahmen.
HINWEIS: Die Anwendung durch Badperfusion ist ein relativ langsamer Prozess, der global auf die gesamte Zubereitung wirkt. Beachten Sie die Zeit, zu der die neue Lösung tatsächlich in das Versuchsbad eintrat. Je nach Abstand zwischen Kammer und Stausee der Strandlinie sowie der Geschwindigkeit der Perfusion ist eine Verzögerungszeit zu berücksichtigen.
6. Hochauflösende Dokumentation der zellulären ATeam Fluoreszenz
- Übertragen Sie direkt nach den Aufnahmen die Aufnahmekammer mit der Scheibenkultur an das konfokale Laserscanmikroskop.
HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig. Aufgrund möglicher Photoschäden führen Sie diesen Schritt erst nach Experimenten durch. Zu Dokumentationszwecken kann man den E-ACSF gegen H-ACSF austauschen. Daher ist ein Perfusionssystem nicht unbedingt erforderlich. - Nehmen Sie z-Stacks mit der höchsten z Auflösung, die bei der angegebenen optischen Konfiguration möglich ist.
- Wenden Sie einen Dekonvolutionalgorithmus an, um die Bildauflösung zu erhöhen.
Representative Results
AAV-Vektoren sind ein zuverlässiges Werkzeug, um fremde Gene in Zellen innerhalb lebenden Gewebes selektiv auszudrücken16. Die direkte Anwendung von AAVs, die die Sequenzkassette von ATeam1.03YEMK und einen bestimmten Promotor enthalten, führt zu einem hohen Ausdruck des Sensors im gewählten Zelltyp. Bei DIV 14 (ca. 10 Tage nach einer Transduktion) werden Neuronen, die ATeam unter dem menschlichen Synapsinpromotor exzessiieren, mit hoher Dichte im Neocortex kultivierter Gewebescheiben in Tiefen von bis zu 50 m unter der Schnittoberfläche gefunden (Abbildung 5A). Vergleichbare Ergebnisse können im Hippocampus erzielt werden (Abbildung 5B).
Abbildung 5: Visualisierung von Neuronen, die ATeam1.03YEMK in kultivierten parasagittalen organotypischen Gehirnscheiben exdrücken. Die Bilder auf der linken Seite entsprechen erweiterten Fokusprojektionen von 43 optischen Abschnitten (je 1,05 m) kortikalen Gewebes (A) und (B) von 70 optischen Abschnitten (je 0,6 m) Hippocampusgewebe. Bilder auf der rechten Seite stellen die Lautstärkeansicht derselben Projektion dar. Zellen werden entsprechend ihrer Tiefe relativ zur Schnittfläche farbcodiert, wie durch die Farbskala auf der rechten Seite angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Für die Messung des ATP-Spiegels in Astrozyten wird ATeam1.03YEMK unter der Kontrolle des humanen glialfibrillären sauren Proteins (GFAP) promotorisiert. Dies führt zu einer effizienten Transduktion von Zellen in Neocortex und Hippocampus von kultivierten Gewebescheiben (Abbildung 6). Insbesondere können je nach Tiefe der Scheibenpräparate zwei verschiedene morphologische Phänotypen unterschieden werden. In der ersten, oberflächlichen Schicht zeichnen sich Zellen durch dicke Primärprozesse aus, die überwiegend parallel zur Oberfläche angeordnet sind. Diese Zellen weisen stark überlappende Domänen auf, wodurch ein dichtes Netz scheinbar reaktiver Astrozyten entsteht (Abbildung 6). In tieferen Schichten (30-60 m von der Oberfläche) zeigen transduzierte Astrozyten feine zelluläre Prozesse, die weitgehend sphärische Domänen bilden, und ihre Morphologie ähnelt der von Astrozyten in situ, wie zuvor berichtet19,20,21 ( Abbildung6). Um eine bessere Transduktion von tieferen Astrozyten sowie einen besseren optischen Zugang zu diesen tieferen Schichten zu erhalten, kann das gliale Narbengewebe entfernt werden, wie in Schritt 4 beschrieben.
Abbildung 6: Visualisierung von Astrozyten, die ATeam1.03YEMK in kultivierten parasagittalen organotypischen Gehirnscheiben exdrücken. Das Bild auf der linken Seite entspricht einer erweiterten Fokusprojektion von 191 optischen Abschnitten (je 0,45 m). Zur Veranschaulichung wurde die Glianarbe von der Projektion von Astrozyten ausgeschlossen. Bilder auf der rechten Seite stellen die Lautstärkeansicht derselben Projektion vor und nach dem Entfernen der Glianarbe dar. Zellen werden entsprechend ihrer Tiefe relativ zur Schnittfläche farbcodiert, wie durch die Farbskalen auf der rechten Seite angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die erfolgreiche Expression von ATeam1.03YEMK ermöglicht die dynamische Messung von Veränderungen der ATP-Spiegel in Neuronen oder Astrozyten, abhängig vom verwendeten Promotor (siehe oben). Experimente wurden in einem Versuchsbad durchgeführt, das ständig mit E-ACSF durchdrungen ist (mit 95% O2/5%CO2). In organotypischen Scheiben, die ATeam1.03YEMK in Hippocampus-Neuronen exdrücken, wurden vor Beginn der Aufnahme Interessensgebiete (ROIs) ausgewählt, die die Somata von Pyramidenzellen darstellen (Abbildung 7A). Darüber hinaus wurde eine Region für Hintergrundsubtraktion ausgewählt (Abbildung 7A). Die Emission von Venus sowie eCFP-Fluoreszenz wurde dann für jeden dieser ROIs separat erhoben und im Laufe der Zeit als Fluoreszenzemissionsniveau dargestellt (Abbildung 7B). Nach der Aufzeichnung der Fluoreszenz unter Kontrollbedingungen für mehrere Minuten, um eine stabile Ausgangsbasis zu gewährleisten, wurde der Zellstoffwechsel durch die Exposition der Scheibenzubereitung einer glukosefreien Kochsaline gehemmt, der 5 mM Natriumazid (NaN3) für eine Minute zugesetzt wurde (Abbildung 7B). Diese Manipulation führte zu gegenteiligen Veränderungen der Emissionsintensität des FRET-Paares(Abbildung 7B, linke Paneele), mit einer Abnahme der Venus (527 nm) und einer Erhöhung der eCFP-Emission (475 nm). Die Berechnung des FRET-Verhältnisses durch Division der Fluoreszenzemission der Venus durch die von eCFP (FVenus/FeCFP) führte zu Signalen, die die relativen Veränderungen der intrazellulären ATP-Werte widerspiegeln, das sogenannte "ATeam FRET-Verhältnis"(Abbildung 7B, rechtes Panel). In allen aufgezeichneten Neuronen (n = 70 Zellen in N = 5 Scheiben) verursachte NaN3 eine reversible Abnahme des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf eine reversible Abnahme der intrazellulären ATP-Spiegel bei Hemmung des Zellstoffwechsels hindeutet.
Abbildung 7: Demonstration der Zeitraffer-ATeam FRET-Verhältnis-Bildgebung. (A) Oben links: Weitfeldfluoreszenzbild der Pyramidenschicht und des Stratum radiatum der CA1-Region einer kultivierten organotypischen Hippocampusscheibe, die ATeam1.03YEMK in Neuronen ausdrückt. Oben rechts: Vergrößerte Ansicht des Geschachtelten, wie auf der linken Seite angegeben. Weiße Linien umreißen Interessengebiete (ROIs) 1-3, die Zellkörper von CA1-Pyramidenneuronen darstellen, die für die Analyse in ausgewählt wurden (B). BG stellt den ROI dar, der für die Hintergrundkorrektur ausgewählt wurde. Unten: Pseudofarbene Bilder, die die Fluoreszenzemission von Venus (grün), eCFP (lila) und das Verhältnis von Venus/eCFP darstellen. (B) Zeitrafferaufzeichnung in ROIs 1-3, die neuronale Zellkörper darstellen (siehe A). Spuren auf der linken Seite zeigen eine normalisierte Fluoreszenzemission von Venus (grün) und eCFP (Magenta). Spuren auf der rechten Seite zeigen das entsprechende ATeam FRET Verhältnis. Beachten Sie, dass eine Perfusion mit 5 mM NaN3 in Abwesenheit von extrazellulärer Glukose für 1 Minute (grauer Balken) eine reversible Abnahme des ATeam FRET-Verhältnisses induziert, was auf eine Abnahme der intrazellulären ATP-Konzentration hindeutet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um die Stabilität der Präparation und des Sensors unter langfristigen Versuchsbedingungen zu gewährleisten, wurden Scheiben, die ATeam in Neuronen oder Astrozyten exexzessiver exemitzen, über längere Zeiträume ständig mit ACSF durchdrungen (>50 min; n = 12 Zellen, N = 3 OTCs aus 3 Gehirnen). Unter diesen Bedingungen hat sich das ATeam FRET-Verhältnis nicht geändert (Abbildung 8). Die Exposition der Präparate gegenüber CIS, die metabolische Inhibitoren enthalten ("Chemische Ischämie", siehe Tabelle 1), führte dagegen erneut zu einem erwarteten Rückgang des ATeam-FRET-Verhältnisses, wie oben beobachtet.
Abbildung 8: Basisexperimente mit ATeam. Langfristige ATeam FRET-Verhältnis-Bildgebung in 14 verschiedenen Zellen unter Ausgangsbedingungen in Neuronen (oben) und Astrozyten (unten). Die Daten wurden unter vergleichbaren Bedingungen wie andere experimentelle Daten entnommen. Am Ende jeder Messung wurde chemische Ischämie durch Perfusion mit GUS ausgelöst, wie durch den Pfeil angegeben. HINWEIS: Die Basis-ATeam-FRET-Verhältnisse sind unter Basisbedingungen im Zeitverlauf stabil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Als nächstes analysierten wir die Reaktionen von Neuronen und Astrozyten, die ATeam1.03YEMK auf eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration ausdrücken. Nach der Festlegung einer stabilen Ausgangsbasis wurden neuronen mit einer Saline durchdrungen, bei der die Kaliumkonzentration für 3 Minuten von 3 auf 8 mM erhöht wurde(Abbildung 9A). Diese Manipulation hat jedoch nicht zu einer nachweisbaren Änderung des ATeam FRET-Verhältnisses geführt (n = 56 Zellen in N = 5 Slices). Um sicherzustellen, dass der Sensor auf eine Änderung der ATP-Werte reagierte, wurden die Scheiben dann wieder einer anhaltenden Periode chemischer Ischämie ausgesetzt, die durch den Ersatz von E-ACSF durch CIS ausgelöst wurde. Chemische Ischämie führte zu einem schnellen Rückgang des ATeam FRET-Verhältnisses auf ein neues, stabiles Niveau, was auf eine nominale Erschöpfung des ATP nach 2-3 min hindeutet (Abbildung 9A).
Abbildung 9: Repräsentative Experimente zur Veranschaulichung von Veränderungen des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten. (A,B): Bilder auf der linken Seite zeigen ATeam Fluoreszenz von Neuronen und Astrozyten im Hippocampus CA1 Region von organotypischen Scheiben. Spuren auf der rechten Seite stellen Zeitrafferaufzeichnungen des ATeam FRET-Verhältnisses dar, die aus einem ROI gewonnen werden, der über einem einzelnen Zellkörper positioniert ist. In beiden Experimenten wurden die Scheiben zunächst 3 Minuten lang einer Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration unterzogen (siehe Bar), gefolgt von einer endgültigen Exposition gegenüber chemischer Ischämie. Beachten Sie, dass, während Neuronen nicht auf die Erhöhung des extrazellulären Kaliums (A) reagieren, reagieren Astrozyten mit einer Erhöhung der ATP (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das gleiche experimentelle Protokoll wurde mit Slices durchgeführt, in denen ATeam1.03YEMK in Astrozyten ausgedrückt wurde. Im Gegensatz zu dem, was in Neuronen beobachtet wurde, reagierten Astrozyten auf die Zunahme des extrazellulären Kaliums durch eine reversible Erhöhung des ATeam FRET-Verhältnisses, was auf einen Anstieg der intrazellulären ATP-Spiegel hindeutet (n = 70 Zellen in N = 5 Scheiben) (Abbildung 9B). Die anschließende Exposition gegenüber chemischer Ischämie führte erwartungsgemäß zu einem starken Rückgang des ATeam-FRET-Verhältnisses, was auf eine nominale Erschöpfung des intrazellulären ATP hindeutet (Abbildung 9B).
Discussion
Hier zeigen wir ein Verfahren zur zelltypspezifischen Expression von ATeam1.03YEMK, einem FRET-basierten, genetisch kodierten Nanosensor14, zur Messung von Veränderungen der ATP-Spiegel in Astrozyten oder Neuronen in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maushirns15. In beispielhaften Aufnahmen zeigen wir, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nicht zu einer Veränderung der ATP-Konzentrationen in Neuronen führt, während die astrozytischen ATP-Spiegel als Reaktion auf diese Manipulation steigen. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass bei Hemmung des Zellstoffwechsels das ATeam1.03YEMK FRET-Verhältnis bei beiden Zelltypen rapide abnimmt, was auf eine schnelle Abnahme des intrazellulären ATP hindeutet.
Die Expression von ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen erfordert die Erhaltung des Gewebes in der Kultur unter kontrollierten Bedingungen für mindestens 7-10 Tage. Alternativ kann ATeam1.03YEMK auch zur Messung von ATP in akut isolierten Hirngewebescheiben und in Sehnerven von Mäusen13,15eingesetzt werden. Messungen in akut isoliertem Gewebe erfordern jedoch die Erzeugung transgener Tiere oder eine stereotaktische Anwendung viraler Vektoren in das Gehirn, die Tierversuche und strenge Tierpflegeprotokolle beinhalten. In dieser Hinsicht stellt die ATeam1.03YEMK-Expression in organotypischen Gewebescheibenkulturen eine nützliche und wertvolle Alternative22,23dar. Seit vielen Jahren dienen organotypische Gewebescheibenkulturen als etabliertes Modellsystem zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften, Konnektivität und Entwicklung24,25,26. Sie erhalten nicht nur die allgemeine Gewebearchitektur und Laminierung (Abbildung 1), sondern beherbergen auch die bevorzugten Eigenschaften von Zellkulturen wie überlegene Zugänglichkeit und direkte Kontrolle experimenteller Bedingungen. Organotypische Gewebescheibenkulturen werden auch routinemäßig verwendet, um fremde Gene mit viralen Vektoren auszudrücken27. Mehrere Arten von viralen Vektoren wurden berichtet, transgenes in Gehirngewebe zu liefern16,28. Adenovirale Vektoren induzieren eine hohe Expression in Gliazellen, aber nicht Hippocampus-Neuronen16, und könnte gliare Reaktivität erzeugen17. Adeno-assoziierte virale Vektoren, wie hier verwendet, erscheinen als eine gute Alternative15, und ihre Wirksamkeit wurde auch in vivo29gezeigt.
Während vor allem für die Untersuchung der neuronalen Eigenschaften verwendet, neuere Studien haben festgestellt, dass organotypische Gewebe-Scheibenkulturen auch für die Analyse von Astrozyten verwendet werden können. Kultivierte Scheiben werden in der Regel von einer Schicht reaktiver Astrozyten19,30 (Abbildung 5) abgedeckt, aber Astrozyten zeigen eine nativere, nicht-reaktive Morphologie und Zytoarchitektur in tieferen Schichten19,30 (Abbildung 5). In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Verfahren zur mechanischen Entfernung der äußeren Glianarbe, das zu einer besseren experimentellen und optischen Zugänglichkeit einheimischer Astrozyten innerhalb der richtigen organotypischen Gewebeschichten führt. Darüber hinaus verbessert seine Entfernung die Expression Wirksamkeit in tieferen Schichten der organotypischen Scheiben; Wenn die Glianarbe nicht entfernt wird, kann die Transduktion durch AAVs auf die oberflächlichen Zellschichten beschränkt sein.
Bei der Durchführung von Experimenten in Gewebescheiben müssen mehrere externe mechanische Faktoren berücksichtigt werden. Eine Variation der Durchblutungsgeschwindigkeit des Bades kann Bewegungen der gesamten Zubereitung auslösen und/oder Fokusänderungen auslösen, was zu künstlichen transienten Veränderungen des Sensorsignals führt. Darüber hinaus wurden sowohl Astrozyten als auch Neuronen berichtet, um auf mechanische Verformungen zu reagieren, wie durch hohe Perfusionsratenauferlegt 32,33. In unseren Händen führt die Verwendung einer zuverlässigen Peristaltikpumpe zusammen mit der Aufrechterhaltung kleiner und stabiler Mengen an Saline zwischen Gewebe und Ziel (Meniskus) zu einem stabilen FRET-Signal unter Ausgangsbedingungen bei der hier verwendeten Perfusionsgeschwindigkeit (1,5-2,5 ml/min; Abbildung 8).
In der vorliegenden Studie zeigen wir auch, dass FRET-basierte Bildgebung mit ATeam1.03YEMK zur Überwachung des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten eingesetzt werden kann. Ein alternatives Mittel, das früher für die Messung der zellulären ATP eingeführt wurde, ist der sogenannte Luziferin-Luziferase-Assay34,35,36,37. Dieser Ansatz basiert jedoch auf der Abbildung der Biolumineszenz und bietet nur eine eher geringe zeitliche und räumliche Auflösung, teilweise aufgrund hoher Hintergrundgeräusche. Eine weitere Methode, die in den letzten Jahren routinemäßig angewandt wurde, war die Abbildung von Veränderungen der intrazellulären Magnesiumkonzentration mit dem ionenempfindlichen Fluorophor Magnesium grün38,39,40. Dieser Ansatz bezieht sich auf die Beobachtung, dass ein ATP-Verbrauch zur Freisetzung seines Co-Faktors Magnesium führt. Die Bildgebung mit Magnesiumgrün liefert dabei nur eine sekundäre Schätzung der Veränderungen der ATP-Werte. Darüber hinaus ist Magnesiumgrün auch empfindlich gegenüber Veränderungen des intrazellulären Kalziums, was eine weitere Schwierigkeit bei der Interpretation der mit dieser Methode erzielten Ergebnisse einführt.
Die jüngste Entwicklung von genetisch kodierten Nanosensoren zur direkten Bildgebung zellulärer Metaboliten stellte daher einen großen Schritt nach vorn dar11,12. Es wurden verschiedene Sensoren erzeugt, die zur Messung von intrazellulären ATP36,41,42,43eingesetzt werden können. Dazu gehören der ratiometrische fluoreszierende ATP-Indikator "QUEEN"41 sowie PercevalHR, der das ATP:ADP-Verhältnis42erkennt. Die letztgenannte Sonde ist zwar ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Energiestatus von Zellen, erfordert aber eine gleichzeitige Messung von Veränderungen des pH42.
ATeam ist ein Nanosensor, von dem es mehrere Varianten gibt, die sich unter anderem in ihrer Bindungsaffinität zu ATP14unterscheiden. In vitro weist ATeam1.03YEMK ein Kd von 1,2 mM bei 37 °C auf, das in der Nähe von zellulären ATP-Spiegeln liegt, die in verschiedenen neuronalen Zelltypen bestimmt sind und von Hypothalamus und Kleinhirn34 bis Hippocampus37,44,45. Bei Küvettenmessungen führte die Senkung der Temperatur um 10 °C zu einer signifikanten Abnahme der Bindungsaffinität von ATeam1.03YEMK zu ATP, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise nicht ideal für die zelluläre Bildgebung bei Raumtemperatur14ist. Unsere frühere Studie15zeigte jedoch, dass das Verhalten und die Reaktion von ATeam1.03YEMK, ausgedrückt in Neuronen und Astrozyten, bei verschiedenen Manipulationen bei nahezu physiologischen und Raumtemperatur ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass der Sensor eine zuverlässige Bestimmung der intrazellulären ATP-Spiegel unter beiden Bedingungen ermöglicht. Darüber hinaus befassten sich unsere früheren Experimente mit der pH-Empfindlichkeit von ATeam1.03YEMK in Zellen15, was zeigte, dass es unempfindlich gegen Veränderungen der intrazellulären pH-Einheiten um etwa 0,1-0,2 pH-Einheiten ist. Wenn das Kd im niedrigen mM-Bereich ein Problem ist, könnten alternative ATeam-Varianten14verwendet werden, darunter rot verschobene Varianten von ATeam ("GO-ATeam")43.
Unsere Experimente mit ATeam1.03YEMK zeigen, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nur um wenige mM (von 3 auf 8 mM) zu einer vorübergehenden Erhöhung des ATeam1.03YEMK-Verhältnisses in Astrozyten in der organotypischen Scheibenkultur führt. Diese Beobachtung bestätigt frühere Studien15,46 und zeigt deutlich, dass Astrozyten auf die Freisetzung von Kalium durch aktive Neuronen mit einer Erhöhung ihrer ATP-Produktion reagieren, meist wahrscheinlich als Folge einer Stimulation der Na+/K+-ATPase und der Na+/HCO3- Cotransporter, bzw.47,48. Im Gegensatz dazu zeigten Neuronen keine Antwort, die auch mit früheren Arbeiten im Einklang steht15. Beide Zelltypen reagierten jedoch schnell und stark auf die Hemmung der zellulären Glykolyse und der mitochondrialen Atmung, wie vor15gezeigt. Unter den Bedingungen der chemischen Ischämie fielen die ATeam FRET-Verhältnisse auf ein neues stabiles Niveau, was auf eine nominale Erschöpfung des zellulären ATP hindeutet. Das letztgenannte Ergebnis legt nahe, dass sowohl Neuronen als auch Astrozyten einen relevanten ATP-Verbrauch auch unter stationären Bedingungen ohne zusätzliche Stimulation durch synaptische Aktivierung oder Anwendung von Neurotransmittern aufweisen. Zusammengenommen kommen wir zu dem Schluss, dass FRET-basierte Bildgebung mit genetisch kodierten Nanosensoren, darunter ATeam1.03YEMK, einen wertvollen Ansatz bieten wird, um die zellulären Prozesse aufzuklären, die für Veränderungen der intrazellulären ATP-Spiegel und den zellulären ATP-Verbrauch unter verschiedenen Bedingungen verantwortlich sind.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Die Autoren erhielten finanzielle Unterstützung für die Open-Access-Publikation von Nikon Microscope Solutions, Düsseldorf, Deutschland, die Instrumente produziert, die im Videoartikel verwendet werden. Das Unternehmen war weder an der Gestaltung der hier vorgestellten Experimente, noch an deren Ausführung, an der Datenverarbeitung, noch an der Manuskriptschrift beteiligt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Claudia Roderigo und Simone Durry für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken Dr. Niklas J. Gerkau und M.Sc. Joel Nelson für die Unterstützung bei der Vorbereitung der organotypischen Scheibenkulturen. Die Forschung im Autorenlabor wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; FÜR 2795: Ro 2327/13-1 und SPP 1757: Ro 2327/8-2 zu CRR; und SPP 1757: Young Glia Start-Up-Förderung an RL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
| 36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
| Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
| band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
| Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
| Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
| Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
| D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
| Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
| HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
| HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
| Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
| Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
| Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
| IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
| Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
| L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
| Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
| Microscope stage | custom build | ||
| Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
| Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
| Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
| NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
| Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
| WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |
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