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Neuroscience

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Published: January 23, 2020 doi: 10.3791/60295
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

Summary

Wir präsentieren drei einfache In-vitro-Assays – den Fernmigrations-Assay, den Co-Kultur-Migrations-Assay und den Chemo-Attraktions-Assay,der die Funktionen menschlicher Stammzell abgeleiteter periventrikulärer Endothelzellen und deren Interaktion mit GABAerge Interneurons.

Abstract

Die Rolle der Gehirnvaskulatur bei der Entwicklung des Nervensystems und der Ätiologie von Hirnerkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit. Unsere jüngsten Studien haben eine spezielle Population von Gefäßzellen identifiziert, die periventrikulären Endothelzellen, die eine entscheidende Rolle bei der Migration und Verteilung von Vorhirn GABAerge Interneurons während der embryonalen Entwicklung spielen. Dies, gepaart mit ihren zellautonomen Funktionen, spielt auf neue Rollen von periventrikulären Endothelzellen in der Pathologie neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus an. Hier haben wir drei verschiedene In-vitro-Assays beschrieben, die gemeinsam die Funktionen periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit GABAergen Interneuronen bewerten. Die Verwendung dieser Assays, insbesondere im menschlichen Kontext, wird es uns ermöglichen, den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen zu identifizieren. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und reproduzierbar und können leicht an jeden haftenden Zelltyp angepasst werden.

Introduction

Endothelzellen bilden die Auskleidung der Blutgefäße und vermitteln wichtige Funktionen, die die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Thrombozytenaggregation und die Bildung neuer Blutgefäße umfassen. Im Gehirn sind Endothelzellen Teil einer kritischen Blut-Hirn-Schranke, die den Materialaustausch zwischen dem Gehirn und dem Blutkreislauf streng steuert1. Unsere Studien in den letzten zehn Jahren haben neue neurogene Rollen von Gehirn endothel Zellen identifiziert, die signifikante Auswirkungen auf die Entwicklung des Gehirns und Verhaltenhaben 2,3,4,5. Wir haben gezeigt, dass das embryonale Vorderhirn der Maus durch zwei verschiedene Subtypen von Gefäßen, die pialen Gefäße und die periventrikulären Gefäße, die sich in Anatomie, Herkunft und Entwicklungsprofilunterscheiden,vaskularisiert wird 2 . Endothelzellen, die diese beiden Gefäßsubtypen aussäumen, weisen deutliche Unterschiede in ihren Genexpressionsprofilen auf. Während piale Endothelzellen meist Gene exprimieren, die mit Entzündungen und Immunantwort zusammenhängen, sind periventrikuläre Endothelzellen einzigartig angereichert in der Expression von Genen, die häufig mit Neurogenese, neuronaler Migration, Chemotaxis und Axonführung assoziiert sind3. Periventrikuläre Endothelzellen beherbergen auch einen neuartigen GABA-Signalweg, der sich vom traditionellen neuronalen GABA-Signalweg5unterscheidet. Gleichzeitig mit seiner Genexpression, periventrikuläre Endothelzellen wurden gefunden, um Migration und Verteilung von GABAergen Interneuronen in der sich entwickelnden Neocortex zu regulieren. Während der embryonalen Entwicklung durchlaufen periventrikuläre Endothelzellen eine Fernmigration entlang eines ventral-dorsalen Gradienten, um das periventrikuläre Gefäßnetz2,3zu etablieren. Diese Migrationsroute wird einen Tag später von Interneuren gespiegelt. Migrierende Interneuroner interagieren physisch mit dem vorgebildeten periventrikulären Gefäßnetz und nutzen es als Leitlinie, um ihr endgültiges Ziel im Neocortex zu erreichen. Periventrikuläre Endothelzellen dienen nicht nur als physikalisches Substrat, sondern dienen auch als Quelle für Navigationshinweise für die Migration von Neuronen. Periventrikuläre endotheliale Zellsekretierte GABA leitet interneuron Migration und reguliert ihre endgültigen Verteilungsmuster4. Defekte in interneuron Migration und Verteilung sind mit neuropsychiatrischen Störungen wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression6,7,8,9,10verbunden. Daher wird die Untersuchung der periventrikulären Endothelzellfunktionen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration im menschlichen Kontext entscheidend für die Bekämpfung der Pathogenese dieser Störungen.

Wir haben menschliche periventrikuläre Endothelzellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen in unserem Labor11mit induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie (iPSC)12,13erzeugt. Um zu validieren, ob menschliche periventrikuläre Endothelzellen die periventrikulären Endothelzellen der Maus originalgetreu imitieren und ihren Einfluss auf die interneuronische Migration quantitativ bewerten können, entwickelten wir drei In-vitro-Assays: einen Fernmigrationstest, einen Co-Kultur-Migrationstest und einen Chemo-Attraktions-Assay. Hier beschreiben wir Protokolle für diese Assays im Detail. Alle drei Assays basieren auf der Verwendung von Silikonkultureinsätzen, um einen kleinen rechteckigen Zellfleck (mit festen Abmessungen) zu erstellen, der von zellfreiem Raum umgeben ist. Der Migrationsabstand wird ausgewertet, indem der Abstand zwischen den endlaufenden Positionen von Zellen vom Rand des rechteckigen Patches gemessen wird, der am Tag 0 umrissen wurde. Im Fernwanderungstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen als Pflaster in der Mitte einer 35-mm-Schale ausgesät, und die von den Zellen über einen langen Zeitraum zurückgelegten Entfernungen werden berechnet. Im Co-Kultur-Migrationstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen als ein Pflaster in einer 35-mm-Schale mitgesät. Diese Einrichtung ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen direkter physischer Wechselwirkungen dieser beiden Zelltypen auf die Migrationsrate von Interneuronen. Der Chemo-Attraktionstest misst die Migration von Interneuronen als Reaktion auf chemoattraktive Hinweise, die von menschlichen periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden. Interneuronen werden als rechteckiges Pflaster mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen gesät und kontrollieren nicht-periventrikuläre Endothelzellen, die als ähnlich große Pflaster auf beiden Seiten gesät werden. Jede der Zellpflaster wird durch einen zellfreien Spalt von 500 m getrennt. Die Reaktion von Interneuronen wird durch Quantifizierung der Anzahl der Zellen, die zu periventrikulären endothelialen Zellen gewandert sind, im Vergleich zur Kontrolle nicht-periventrikulärer endotheliale Zellen bewertet.

Diese Assays liefern eine robuste Bewertung der funktionen der humanen periventrikulären Endothelzellen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration. Die neuartige Einrichtung des Fernassays und des Co-Kultur-Migrations-Assays bietet zellfreien Raum im Bereich von Zentimetern (1-1,5 cm), um die Erkennung von Fernmigration zu ermöglichen. Eine Zusammenfassung der Merkmale unserer Assays im Vergleich zu anderen populären Assays ist in Tabelle 1dargestellt. Gemeinsam werden die hier beschriebenen Assays als Plattform für die Bewertung "kranker" periventrikulärer Endothelzellen und Interneuronen dienen, die aus iPSCs von Hirnerkrankungen wie Schizophrenie, Autismus oder Epilepsie erzeugt werden. Diese Assays können auch verwendet werden, um zu bestimmen, wie unterschiedliche Bedingungen (z. B. Inhibitoren, Liganden, RNAi) die Zellmigration beeinflussen. Schließlich können diese Assays für andere Zelltypen optimiert werden, um die Migration über die Ferne, die Chemo-Attraktion oder die zellzellvermittelte Migration zu messen.

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Protocol

1. Kultur und Lagerung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen

  1. Bewahren Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen auf Kellermembranmatrix-beschichtet (siehe Materialtabelle) 6-Well-Platten in periventrikulärem Endothelzellmedium (E6-Medium mit 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 und 5 'M GABA) bei 37 °C und 5%CO2. Wechseln Sie das Medium jeden alternativen Tag.
  2. Kellermembranmatrix in 4 °C auftauen und eine 1:100-Lösung herstellen, indem man sie in kaltem DMEM/F12-Medium verdünnt. Beschichten Sie jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 1 ml Matrixlösung. Platten bei 37 °C für mindestens 1 h vor Gebrauch inkubieren.
  3. Lassen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen eine Konfluenz von 80%-90% erreichen. Aspirieren Medium aus dem Brunnen. Waschen Sie die Brunnen einmal mit 1 ml sterilen 1x PBS pro Brunnen.
  4. Trennen Sie Zellen, indem Sie 1 ml Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle)pro Brunnen hinzufügen. Bei 37 °C für 5 min inkubieren. Nach 5 min 1 ml periventrikuläres Endothelzellmedium hinzufügen. Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml konisches Rohr.
    HINWEIS: Wir verwenden Hier Accutase zur Zelldissoziation, im Gegensatz zu TrypLE in den Abschnitten 3 und 4.
  5. Zentrifugenzellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur, aspirieren sie den Überstand und setzen das Zellpellet in 1 ml periventrikulärem Endothelzellmedium wieder auf.
  6. Zählen Sie lebende Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode. Samenzellen in frischen Matrixplatten mit einer Dichte von 1,2 x 105 Zellen/cm2. Bei 37 °C und 5%CO2inkubieren.
  7. Speichern Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen durch Kryokonservierung im Gefriermedium (90% periventrikuläres Endothelzellmedium und 10% DMSO).
    1. Dissoziieren und sammeln Sie Zellen nach den Schritten 1.3 und 1.4 oben. Zählen Sie Zellen in der Lösung nach der Trypan-Blau-Ausschlussmethode.
    2. Zentrifugenzellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet bei 5 x 106 Zellen/ml Gefriermedium wieder aufsetzen.
    3. 1 ml Gefriermedium plus Zellen pro Kryovial abgeben. Die Fläschchen in isopropanolgefüllte Kammer legen und über Nacht bei -80 °C bei 1 °C/min abkühlen lassen. Fläschchen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in einen flüssigen Stickstofftank geben.

2. Herstellung von humanen periventrikulären Endothelzellen für Assay

  1. Lassen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen 70%-80% Konfluenz erreichen.
  2. Dissoziate Zellen nach den Schritten 1.3 bis 1.5 wie oben beschrieben. Zählen Sie Zellen mit der Trypan Blue-Ausschlussmethode.

3. Vorbereitung von Human GABAergic Interneurons für Assay

HINWEIS: Humaninduzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete GABAerge Interneurons und das neuronale Medium wurden kommerziell erworben (siehe Tabelle der Materialien). Die Neuronen werden durch Differenzierung einer menschlichen fibroblasten abgeleiteten iPSC-Linie nach einem vom Hersteller entwickelten Protokoll erzeugt. Die Zellen wurden nach dem Herstellerprotokoll aufgetaut und kultiviert.

  1. Tauen Sie menschliche GABAerge interneurons und Kultur sie in 12-Well-Platte für zwei Wochen zu einer Konfluenz von 70%-80%.
  2. Am Tag des Assays, warme Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und ein Aliquot des neuronalen Mediums bei 37 °C für 10 min vor Gebrauch.
  3. Aspirieren Sie Medium aus jedem Brunnen, der die Zellen enthält. Waschen Sie Zellen mit 1 ml sterilem 1x PBS pro Brunnen.
  4. Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 0,5 ml vorgewärmter Dissoziationslösung pro Brunnen und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 min. Fügen Sie 1 ml neuronales Medium pro Brunnen hinzu. Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml konisches Rohr. Sanft trituieren, um Zellklumpen zu dissoziieren.
  5. Zentrifugenzellen bei 380 x g für 5 min bei Raumtemperatur, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml neuronalen Mediums wieder auf. Zählen Sie lebende Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode.

4. Vorbereitung der Kontrolle humaner Endothelzellen für Assay

HINWEIS: Kontrolle der menschlichen iPSC-abgeleiteten Endothelzellen und des Endothelzellmediums wurden kommerziell erworben (Tabelle der Materialien). Diese Endothelzellen werden durch Differenzierung einer menschlichen fibroblastenabgeleiteten iPSC-Linie zum endotheliaalen Schicksal nach einem vom Hersteller entwickelten Protokoll erzeugt. Die Zellen wurden aufdemoniert und kultiviert auf Fibronectin Substrat nach Herstellerprotokoll. Fibronectin-beschichtete Platten wurden nach dem Herstellerprotokoll hergestellt.

  1. Tauen Kontrolle menschlichen Endothelzellen und Kultur sie in 6-Well-Platte zu einer Konfluenz von 80%-90%.
  2. Am Tag des Assays, warme Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und ein Aliquot von endothelialem Medium bei 37 °C für 10 min vor Gebrauch.
  3. Aspirieren Sie das Medium aus jedem Brunnen, der die Zellen enthält. Waschen Sie Zellen mit 1 ml sterilem 1x PBS pro Brunnen.
  4. Lösen Sie Zellen, indem Sie 0,5 ml vorgewärmte Dissoziationslösung pro Brunnen hinzufügen. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 1 ml Endothelzellmedium pro Brunnen hinzu, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml konisches Rohr.
  5. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Endothelzellmedium wieder auf. Zählen Sie lebende Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode.

5. Vorbereitung von Ein-Gut-Kultur-Einlagen

  1. 1 mg/ml Lamininlösung bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C auftauen.
  2. Beschichten Sie eine entsprechende Anzahl von 35 mm Geschirr mit 0,01% Poly-L-Ornithin-Lösung (1 ml pro Schale). Inkubieren Sie die Gerichte bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.
  3. 1 mg/ml Lamininlösung 1:300 in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 3,3 g/ml unmittelbar vor Gebrauch verdünnen.
  4. Vollständig ansaugen Poly-L-Ornithin e.V. aus jeder Schale. Spülen Sie jede Schale gründlich 3x mit sterilem Wasser und aspirieren Sie vollständig, um Poly-L-Ornithin-induzierte Zelltoxizität zu vermeiden.
  5. Fügen Sie jeder Schale 1 ml 3,3 g/ml Lamininlösung hinzu und brüten bei 37 °C über Nacht oder mindestens 1 h. Lamininlösung unmittelbar vor Gebrauch aus der Schale entfernen.
    HINWEIS: Alternativ können Sie die laminhaltigen Gerichte in 4 °C aufbewahren. Die Gerichte vor gebrauchen in einem 37 °C Zellkultur-Inkubator ausstatten.
  6. Schneiden Sie drei Seiten eines Brunnens eines Zwei-Well-Silikonkultureinsatzes (Abbildung 1A) mit einer sterilen Klinge, um einen Ein-Gut-Einsatz zu erzeugen (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Halten Sie den Zwei-Well-Einsatz fest an der Oberfläche der Originalverpackung befestigt, während Sie schneiden, um einen glatten Schnitt zu gewährleisten und die Klebekraft des Einsatzes zu schützen.
  7. Aspirieren Laminin Lösung aus den Gerichten.
    HINWEIS: Waschen Sie das Geschirr nicht mit sterilem PBS oder Wasser nach der Laminininkubation. Nasse Oberflächen verhindern eine enge Haftung des Kultureinsatzes.
  8. Entfernen Sie den Ein-Gut-Einsatz mit steriler Pinzette und legen Sie ihn in die Mitte der Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten Schale. Drücken Sie entlang der Ränder des Einsatzes, um ihn an der Oberfläche der Schale zu befestigen.
  9. Drehen Sie die Schale vorsichtig auf den Kopf, um zu überprüfen, ob der Einsatz fest verkrüpliegt ist.
  10. Halten Sie die Schale auf den Kopf und markieren Sie die Begrenzung des Einsatzfachs mit einem permanenten schwarzen Marker mit einer ultrafeinen Spitze (Abbildung 1C).

6. Fernmigrations-Assay

  1. Setzen Sie menschliche GABAerge Interneuronen in einer Konzentration von 3 x 104 Zellen/70 l neuronalen Mediums aus. Samen 70 l Zelllösung in jedem Ein-Gut-Kultur-Einsatz.
    HINWEIS: Die Saatdichte von Interneurons ist gemäß herstellerischer Empfehlung.
  2. Setzen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen in einer Konzentration von 3 x 104 Zellen/70 L periventrikuläres endothelialem Zellmedium aus. Samen 70 l Zelllösung in jedem Ein-Gut-Kultur-Einsatz.
    ANMERKUNG: Die Anzahl der menschlichen periventrikulären Endothelzellen, die im Verhältnis 1:1 mit der Anzahl der gesäten Neuronen gesät werden.
  3. Fügen Sie 1 ml neuronales Medium in der Neuronenschale hinzu, um den Bereich um den Einsatz zu füllen und das Trocknen der Beschichtung zu verhindern. In ähnlicher Weise fügen Sie 1 ml periventrikuläres endothelialezellisches Medium in periventrikulärer endothelialen Zellschale hinzu.
    HINWEIS: Fügen Sie Medium langsam entlang der Kante der Schale, so dass der Einsatz nicht gestört wird.
  4. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob Zellen nicht aus dem Einsatzfach austreten.
  5. Inkubationszellen für 24 h bei 37 °C und 5%CO2. Überprüfen Sie nach 24 h Inkubation unter dem Mikroskop, ob die Zellen richtig befestigt sind und es kein Leck über Nacht gibt.
  6. Nach 48 h Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellschicht ungestört bleibt (Tag 0).
  7. Entfernen Sie Medium aus der Neuronschale und fügen Sie 1 ml frisches neuronales Medium hinzu. In ähnlicher Weise entfernen Sie das Medium aus der periventrikulären endothelialen Zellschale und fügen Sie 1 ml frisches periventrikuläres Endothelzellmedium hinzu.
    HINWEIS: Legen Sie eine erforderliche Anzahl von Gerichten beiseite und fixieren Sie mit 4% PFA für Tag 0 Bilder.
  8. Inkubieren Sie Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5%CO2. Nach 5 Tagen, entfernen Sie Medium, fixieren Sie Zellen mit 4% PFA für 10 min, und waschen Sie 3x mit 1x PBS.
  9. Färben Sie Neuronen mit antihumanem -Tubulin oder antihumanem MAP2-Antikörper und Endothelzellen mit antihumanem CD31-Antikörper. Am Ende der Immunostainierung 1 ml Antifade-Montagemedium zu jeder Schale hinzufügen.

7. Co-Kultur Migration Assay

  1. Co-suspend 3 x 104 GABAerge Interneurons und 3 x 104 menschliche periventrikuläre Endothelzellen in 70 l Co-Kulturmedium (50% periventrikuläres Erhaltungsmedium ohne GABA und 50% neuronales Medium). Säen Sie diese Zelllösung im Ein-Gut-Einsatzfach. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von solchen Assay-Gerichte.
    HINWEIS: GABA wurde nicht in der Co-Kultur-Medium hinzugefügt, um die Wirkung von exogenen GABA auf die Migration auszuschließen.
  2. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob Zellen nicht aus dem Einsatzfach austreten.
  3. Fügen Sie langsam 1 ml Co-Kulturmedium entlang der Seite der Schale hinzu, um das Trocknen der Beschichtung zu verhindern.
    HINWEIS: Fügen Sie Medium langsam entlang der Kante der Schale, so dass der Einsatz nicht gestört wird.
  4. Als erste Kontrolle, Samen 3 x 104 menschliche GABAerge interneurons nur in 70 l Co-Kultur-Medium pro Ein-Gut-Einsatz. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl solcher Gerichte zu.
  5. Als zweite Kontrolle steuern Co-Samen 3 x 104 GABAerge humane Interneuronen mit 3 x 104 menschlichen Endothelzellen in 70 l Co-Kulturmedium pro Ein-Well-Einsatz. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von Gerichten zu.
  6. Inkubieren Sie die Gerichte für 24 h bei 37 °C und 5%CO2. Überprüfen Sie nach 24 h Inkubation unter dem Mikroskop, ob die Zellen richtig befestigt sind und kein Leck vorliegt.
  7. Nach 48 h Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellschicht nicht gestört ist (Tag 0).
  8. Entfernen Sie Medium und fügen Sie 1 ml frische Co-Kultur-Medium.
    HINWEIS: Legen Sie eine angemessene Anzahl von Gerichten für den Erwerb von Tag 0 Bilder beiseite.
  9. Inkubieren Sie Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5%CO2.
  10. Nach 5 Tagen, entfernen Sie Medium, fixieren Sie Zellen mit 4% PFA für 10 min, und waschen Sie 3x mit 1x PBS.
  11. Stain mit antihumanem -Tubulin oder antihumanem MAP2-Antikörper zur Kennzeichnung der Neuronen. Am Ende der Immunostainierung 1 ml Antifade-Montagemedium zu jeder Schale hinzufügen.

8. Chemo-Attraktion Assay

  1. Legen Sie einen Drei-Brunnen-Kultureinsatz in die Mitte einer Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten 35-mm-Schale mit steriler Pinzette.
  2. Drehen Sie die Schale auf den Kopf. Markieren Sie die Begrenzung um das mittlere Fach des Einsatzes mit einem permanenten schwarzen Marker mit ultrafeiner Spitze.
  3. Samen 3 x 104 menschliche GABAerge Interneurons im mittleren Fach in 70 l neuronalen Mediums(Abbildung 3A).
  4. Samen 104 menschliche periventrikuläre Endothelzellen in 70 l periventrikuläres Endothelzellmedium und 104 steuern Endothelzellen in 70 l Kontrollendothelzellmedium in den beiden äußeren Kompartimenten(Abbildung 3A).
  5. Fügen Sie 1 ml Co-Kulturmedium (50% periventrikuläres Pflegemedium ohne GABA und 50% neuronales Medium) an der Seite der Schale hinzu, um das Trocknen der Beschichtung auf der Schale zu verhindern.
  6. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob Zellen nicht aus dem Einsatzfach austreten.
  7. Inkubationszellen für 24 h bei 37 °C und 5%CO2. Überprüfen Sie nach 24 h Inkubation unter dem Mikroskop, ob die Zellen richtig befestigt sind und kein Leck vorliegt.
  8. Nach 48 h Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellschicht nicht gestört ist (Tag 0).
  9. Entfernen Sie Medium und fügen Sie 1 ml frische Co-Kultur-Medium.
    HINWEIS: Legen Sie die erforderliche Anzahl von Gerichten für Tag 0 Bilder beiseite.
  10. Inkubationszellen für 36 h bei 37 °C und 5%CO2. Nach 36 h, Aspiratmedium, fixieren Zellen mit 4% PFA für 10 min, und waschen 3x mit 1x PBS.
  11. Stain humane GABAerge Interneuronen mit antihumanem -Tubulin oder antihumanem MAP2-Antikörper. Am Ende des Färbevorgangs 1 ml Antifade-Montagemedium in jede Schale geben.

9. Imaging und Datenanalyse

  1. Stellen Sie die immunbefleckte Assayschale bei 4X Vergrößerung unter ein Mikroskop.
  2. Bewahren Sie eine lange Kante der rechteckigen Begrenzung (in Schritt 5.10 oben) im Sichtfeld auf. Erstellen Sie Bilder von Zellen im zellfreien Raum neben dieser Grenze. Erfassen Sie Bilder entlang der rechten langen Kante und der linken langen Kante der rechteckigen Begrenzung (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Zellen, die diagonal in Bezug auf das Rechteck positioniert sind, werden aufgrund von Mehrdeutigkeitbeisangaben bei der Auswahl der kurz- oder langen Kante als Startmarke nicht berücksichtigt. Außerdem ist die Anzahl der Zellen, die über die kurze Kante migrieren, oft deutlich geringer (möglicherweise aufgrund einer geringeren Anzahl von Startzellen entlang der kurzen Kante) und wird nicht berücksichtigt.
  3. Öffnen Sie die Bilder in ImageJ. Berechnen Sie den Abstand zwischen jeder Zelle und der Begrenzungsmarke (Abbildung 2D) mit ImageJ.
  4. Um die Migration anhand von Zellenzahlen zu bewerten, legen Sie einen bestimmten Abstand von der Grenze im erfassten Bild in ImageJ fest. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die in dieser Entfernung vorhanden sind. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl, die Standardabweichung und die statistische Signifikanz mit der entsprechenden Software.

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Representative Results

Die Schritte zum Einrichten eines Ein-Brunnen-Kultureinsatzes in einer 35-mm-Schale sind in Abbildung 1dargestellt. Der Fernmigrationstest und der Co-Kultur-Migrationstest verwendeten einen Ein-Gut-Einsatz, um die gewünschte Anzahl von Zellen in der Mitte einer Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten 35-mm-Schale auszusäen. Am Tag 0 waren Zellen als rechteckiges Pflaster vorhanden (Abbildung 2A,C). In Bildern des Tages 0 konnte die Tageslinie 0 leicht durch die scharfe Kante der Zellenebene identifiziert werden (weiße gepunktete Linie in Abbildung 2C). Bis 48 h waren Zellen in den zellfreien Raum ausgewandert (Abbildung 2B,D). In Den-Tag-0-Bildern konnte der schwarze Rahmen, der um den Einsatz (auf der Rückseite der Schale) gezeichnet wurde, deutlich als schwarzer Spalt beobachtet werden. Die Kante der Lücke wurde als Tageslinie 0 (weiße gepunktete Linie in Abbildung 2D)zugewiesen. Wie in Schritt 9.2 erwähnt, wurden nur die Zellen berücksichtigt, die in den Bereich fielen, der an die rechten und linken Langkanten der Zellschicht angrenzte (gelber Bereich in Abbildung 2B) für die Datenanalyse. Die von einer Zelle zurückgelegte Entfernung wurde gemessen, indem der Abstand zwischen der Zelle (weißer Pfeil in Abbildung 2D)und der Tageslinie 0 berechnet wurde. Immunzytochemische Färbung mit antiaktivem Caspase 3-Antikörper, einem Marker der Apoptose, zeigte kein apoptotisches Signal in den Samenzellen (Abbildung 2E). Im Co-Kultur-Migrationstest, als Interneuronen mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen ko-saatiert wurden, legten Neuronen weiter entfernt ezielflich als bei der Allatierung von Interneuronen oder bei co-seeded mit Kontrollendothelzellen (Abbildung 2F). Auch für den gleichen Entfernungsbereich wanderte eine höhere Anzahl von Interneuren aus, wenn sie mit periventrikulären Endothelzellen ko-saatiert wurden, im Vergleich zu Interneuronen in den anderen beiden Gruppen. Dies zeigt, dass, wie Maus periventrikuläre Endothelzellen, menschliche periventrikuläre Endothelzellen die migration von Humaninterneuron fördern.

Im Chemo-Attraktions-Assay wurden mit Drei-Brunnen-Kultureinsätzen menschliche Interneuronen als kleines rechteckiges Pflaster in einer 35 mm Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten Kulturschale gesät. Periventrikuläre Endothelzellen und Kontroll-nicht-periventrikuläre Endothelzellen wurden als Pflaster auf beiden Seiten des neuronalen Pflasters gesät, wobei der Abstand zwischen den einzelnen Pflastern 500 m betrug(Abbildung 3A). Die Anzahl der Interneuronen, die zu periventrikulären Endothelzellen im Vergleich zu Kontrollen von Endothelzellen migrierten, wurde nach 36 h quantifiziert. Eine signifikant höhere Anzahl von Interneuren wanderte in periventrikuläre Endothelzellen im Vergleich zu Kontrollen von Endothelzellen (Abbildung 3B,C), was bestätigt, dass GABAerge Interneuronen selektiv auf chemoattraktive Cues reagieren, die von menschlichen periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden.

Figure 1
Abbildung 1: Vorbereitung des Kultureinsatzes. (A) Ein Zwei-Brunnen-Kultureinsatz. (B) Ein Ein-Gut-Einsatz in der Mitte einer 35 mm Schale befestigt. (C) Der Umriss des rechteckigen Patches, wie nach dem Entfernen des Einsatzes beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schema und repräsentatives Ergebnis des Migrationstestes. (A) Schema der Zellenebene (rotes Rechteck) am Tag 0. (B) Schema der Zellen, die in den zellfreien Raum migriert werden. Rote Punkte zeigen migrierende Zellen an. Der gelbe Bereich markiert den Bereich, der für die Datenerfassung abgebildet wird. Die gepunktete Box in A und B entspricht dem Bereich, der in den Panels C und Ddargestellt ist. (C,D) Repräsentative fluoreszierende Bilder von Anti---Tubulin-Antikörpern mit der Bezeichnung Interneurons am Tag 0 (C) und Tag 2 (D) des Migrationstestes. Die weiße gepunktete Linie markiert Tag 0. Die gelbe Linie in D gibt die Entfernung an, die eine Zelle (markiert durch weißen Pfeil) in 48 h zurücklegte. (E) Neuronen (am Tag 0) sind mit Anti--Tubulin-Antikörpern (rot) und antiaktiven Caspase-3-Antikörpern (grün) gekennzeichnet, die apoptotische Zellen markieren. Kerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Apoptotische Zellen wurden in säenden Zellen nicht nachgewiesen. (F) Schaubild vom 5. Tag des Co-Kultur-Assays, in dem die Zahl der interneurons, die ausgewandert sind, gegen zurückgelegte Entfernungen dargestellt wird. Im Vergleich zu Interneuronen, die allein oder mit Kontroll-Endothelzellen gesät wurden, wanderten Interneuronen, die mit periventrikulären Endothelzellen ausgesät wurden, in größerer Zahl aus und reisten auch weiter. Die Daten sind für den Mittelwert s.D. (n = 5; **p<0.01, ***p< 0.001, Student es t test). Skalenstäbe = 100 m IN = Interneurons; PV EC = periventrikuläre Endothelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Chemo-Attraktion assay. (A) Schema des Chemo-Attraktions-Assays. Mit hilfe eines Drei-Brunnen-Kultureinsatzes wurden Interneuronen (IN) in der Mitte (grün gepunktetes Rechteck) gesät, während periventrikuläre Endothelzellen (PV-ECs; orange gepunktetes Rechteck) und Kontroll-Endothelzellen (ECs; gelb gepunktetes Rechteck) auf beiden Seiten gesät wurden. (B) Bilder von interneuronen Interneuronen mit Derinbeschriftung, die eine robuste Migration in richtungsitravenkuläre Endothelzellen, nicht aber zur Kontrolle von Endothelzellen zeigen. (C) Quantifizierung der chemoattraktiven Reaktion von Interneuronen. Eine signifikant höhere Anzahl von Neuronen wanderte in periventrikuläre Endothelzellen als in Richtung Kontrolle von Endothelzellen. Die Daten stellen den Mittelwert s.D. (n = 5; *p < 0,05, Schüler-t-Test) dar. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Eine Vorteile Einschränkungen
Boyden Kammer-Assay16,17 · Technisch nicht anspruchsvoll
· Geeignet für anhantibe und nicht haftende Zellen
· Kann modifiziert werden, um die Wirkung von Parakrinsignalisierung oder Chemo-Peuifika auf die Zellmigration zu untersuchen		 · Endpunkt-Assay. Nicht geeignet für Echtzeit-Bildgebung.
· Nicht geeignet für die Untersuchung der Wirkung der direkten Zell-Zell-Interaktion auf die Migration
Scratch-Test18 · Endpunkt oder kinetisch
· Technisch nicht anspruchsvoll		 · Assays Migrationslänge von ein paar hundert Mikrometern. Nicht geeignet für die Untersuchung der Fernmigration im Bereich von 1-2 cm.
· Nicht geeignet für Suspensionszellen
· Variationen im Kratzbereich
Fernmigrationstest · Endpunkt oder kinetisch
· Ermöglicht das Studium der Fernmigration zwischen 1,5 und 2 cm
· Technisch nicht anspruchsvoll		 · Nicht geeignet für Suspensionszellen
Co-Kultur-Migrationstest · Endpunkt oder kinetisch
· Ermöglicht die Untersuchung der Wirkung des direkten Zell-Zell-Kontakts auf die Migration
· Ermöglicht Migrationslänge von bis zu 1,5 bis 2 cm
· Technisch nicht anspruchsvoll		 · Nicht geeignet für Suspensionszellen
B Vorteile Einschränkungen
Boyden Chamber Assay · Technisch nicht anspruchsvoll
· Geeignet für anhantibe und nicht haftende Zellen		 · Endpunkt-Assay. Nicht geeignet für Live-Bildgebung.
· Steiler Konzentrationsgradient
Unter-Agarose-Assay19 · Technisch nicht anspruchsvoll
· Zwei oder mehr chemoattraktive Signale können in einem Setup		 · Nicht geeignet für anhimante Zellen. Beschränkt vor allem auf Blutzellen.
· Schwierige Visualisierung von Zellen in Agarose
Kapillarkammer-Migrationstest20,21 · Endpunkt oder kinetisch
· Geeignet für Haft- oder Suspensionszellen		 · Benötigt spezielle Kammern
Mikrofluidische Vorrichtung22 · Erzeugt steuerbaren und stabilen Konzentrationsgradienten
· Ermöglicht die Auflösung auf Einer-Zellen-Ebene		 · Benötigt ausgeklügelte Geräte und Tools
· Technisch anspruchsvolle und steile Lernkurve
· Komplexe Bildgebung und Datenanalyse
Chemo-Attraktion Assay · Endpunkt oder kinetisch
· Allmählicher Konzentrationsgradient
· Geeignet für Echtzeit- oder Fluoreszenz-Bildgebung
· Technisch nicht anspruchsvoll		 · Nicht geeignet für Suspensionszellen

Tabelle 1: Vergleich der Assaymethoden. (A) Vergleich gängiger In-vitro-Migrationstests mit dem Fernmigrationstest und dem Co-Kultur-Assay. (B) Vergleich der häufigen Chemotaxis-Assays mit dem Chemo-Attraktions-Assay.

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Discussion

Hier haben wir drei In-vitro-Assays beschrieben, die zusammen eine quantitative Bewertung der periventrikulären endothelialen zellspezifischen Eigenschaften des Menschen ermöglichen. Diese Assays werden wertvoll sein, um mechanistische Einblicke in die Wechselwirkung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu gewinnen. Experimente mit Liganden, Inhibitoren oder Zellen mit genspezifischem Knockdown oder Überexpression werden molekulare Akteure identifizieren oder validieren, die endotheliale zellgesteuerte Interneuron-Migration oder Migrationseigenschaften von periventrikulären Endothelzellen vermitteln. Diese Assays können auch geändert werden, um Live-Zell-Zeitraffer-Migrationsstudien durchzuführen. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf die Wechselwirkung von Endothelzellen mit anderen Zellen als Interneuronen. Studien aus unserer Gruppe und andere haben auf den Einfluss periventrikulärer Endothelzellen auf die Musterung von Projektionsneuronen und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen5,14,15angespielt. Es wäre von Interesse, diese möglichen Interaktionen mit unseren Assay-Einstellungen zu testen. Schließlich werden diese Assays als Plattform für die Bewertung von erkrankten periventrikulären Endothelzellen dienen. Unsere Arbeit hat neue autonome Verbindungen zwischen dem periventrikulären Gefäßnetz und dem Ursprung neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie, Autismus und schwerer Depression3,5hergestellt. Diese Assays werden bei der Identifizierung potenzieller Defekte bei der Migration über die Ferse, Chemo-Attraktion oder Juxtracrin-Signalisierung von erkrankten periventrikulären Endothelzellen in diesen neuropsychiatrischen Erkrankungen von unschätzbarem Wert sein.

Diese Assays sind einfach, reproduzierbar und kostengünstig, und sie können modifiziert werden, um die Zellmigration und die Auswirkungen von Co-Kultur oder chemo-attraktiven Hinweisen auf die Migration in verschiedenen Zelltypen zu messen, mit Ausnahme von nicht anhaftenden Zellen. Es gibt einige wichtige Schritte, die befolgt werden müssen, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Zunächst ist es wichtig, die Aussaatzellennummer für jeden Assay zu optimieren. Die Anzahl der Zellen, die in einem einzigen Fach ausgesät werden sollen, sollte vom Zelltyp, dem gewünschten Grad der Konfluenz und assayspezifischen Faktoren wie dem Co-Kultur-Verhältnis abhängen. Zweitens ist es notwendig, das Zellkulturmedium für jeden Test zu optimieren. Im Co-Kultur-Migrationstest und beim Chemo-Attraktions-Assay, bei dem mehr als ein Zelltyp in einem einzigen Gericht gesät wird, sollte das Assaymedium allen Zelltypen förderlich sein. In Pilotversuchen untersuchten wir die Wirkung von Co-Kulturmedium auf die Lebensfähigkeit (mit Trypan-Blau-Ausschlussmethode) und die Morphologie (mit Immunzytochemie) jedes Zelltyps. Wir kultivierten menschliche GABAerge Neuronen mit Co-Kultur Medium für eine Woche und beobachteten keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit und Morphologie von Neuronen in Co-Kultur-Medium im Vergleich zu Neuronen kultiviert in neuronalen Medium. In ähnlicher Weise zeigten periventrikuläre Endothelzellen und Kontroll-Endothelzellen, die in Co-Kultur-Medium für zwei Passagen kultiviert wurden, keine signifikanten Unterschiede im Zellüberleben und in der Morphologie. Drittens ist es wichtig, da die Migrationsrate zwischen den verschiedenen Zelltypen variiert, und es ist wichtig, den Zeitrahmen für jeden Test für den untersuchten Zelltyp zu bestimmen. Viertens ist es wichtig, die Kultureinsätze sorgfältig zu behandeln. Die Einsätze sollten durch sanftes Drücken mit der Fingerspitze fest an der Schale befestigt werden. Die Schale sollte auf den Kopf gestellt werden, um sicherzustellen, dass sich der Einsatz nicht bewegt. Auch beim Entfernen des Einsatzes ist Vorsicht geboten, um die Zellschicht nicht zu stören. Schließlich wird empfohlen, die Stichprobengröße zu erhöhen, um die experimentelle Variabilität zu verringern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Assays unser Verständnis der menschlichen periventrikulären Endothelzellbiologie und ihrer Rolle bei der Entwicklung des Gehirns unter normalen und kranken Bedingungen erheblich erweitern werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen des National Institute of Mental Health (R01MH110438) und des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) an AV unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase dissociation solution Millipore Sigma SCR005 Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody Biolegend 802001
Anti-human CD31 antibody Millipore Sigma CBL468
Anti- MAP2 antibody Neuromics CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody Millipore Sigma AB3623
Control human endothelial cells Cellular Dynamics R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement Cellular Dynamics M1019
Cryogenic vials Fisher Scientific 03-337-7Y
DMEMF/12 medium Thermofisher Scientific 11320033
DMSO Sigma-Aldrich D2650
E6 medium Thermofisher Scientific A1516401
FGF2 Thermofisher Scientific PHG0261
Fibronectin Thermofisher Scientific 33016-015
Freezing Container Thermofisher Scientific 5100
GABA Sigma-Aldrich A2129
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Human GABAergic neurons Cellular Dynamics R1013
Human GABAergic neurons base medium Cellular Dynamics M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement Cellular Dynamics M1032
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 356230 Basement membrane matrix
Mounting Medium Vector laboratories H-1200
poly-L-ornithin Sigma p4957
PBS Thermofisher Scientific 14190
Trypan blue Thermofisher Scientific 15250061
TrypLE Thermofisher Scientific 12563011 Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A Peprotech 100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit Lifeline Cell Technologies LL-0003 Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert ibidi 80209
3-well silicone culture-Insert ibidi 80369
35 mm dish Corning 430165
15-ml conical tube Fisher Scientific 07-200-886
4% PFA solution Fisher Scientific AAJ19943K2
6-well tissue culture plate Fisher Scientific 14-832-11
Inverted phase contrast microscope Zeiss Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope Olympus FSX-100

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 155 Endothelzellen Interneuronen Zellmigration neurovaskuläre Wechselwirkungen Kokultur Chemo-Attraktion
Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen
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Datta, D., Vasudevan, A. Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons. J. Vis. Exp. (155), e60295, doi:10.3791/60295 (2020).

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