Summary
אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.
Abstract
תפקידה של ואסילטורה המוח בפיתוח מערכת העצבים והאטיולוגיה של הפרעות במוח הוא צובר יותר ויותר תשומת לב. המחקרים האחרונים שלנו זיהו אוכלוסייה מיוחדת של תאים כלי דם, תאי האנדותל החדרית, כי לשחק תפקיד קריטי בהגירה והפצה של האינטרנוירונים במוח הקדמי של GABAergic במהלך פיתוח עובריים. זה, ביחד עם הפונקציות האוטונומיות שלהם הסלולר, מרמז על תפקידים חדשניים של תאי המוח הנוירותל בפתולוגיה של הפרעות נפשיות כמו סכיזופרניה, אפילפסיה, ואוטיזם. כאן, תיארנו שלושה שונים בתוך מבחנה מחוץ לספר כי באופן קולקטיבי להעריך את הפונקציות של תאי האנדותל החדרית והאינטראקציה שלהם עם משולבת GABAergic. השימוש באלה אומר, במיוחד בהקשר אנושי, יאפשר לנו לזהות את הקשר בין תאי האנדותל החדרית והפרעות במוח. מאמר זה הם פשוט, עלות נמוכה, הניתנים לצפיה, וניתן להתאים בקלות לכל סוג תא חסיד.
Introduction
תאי האנדותל יוצרים את הציפוי של כלי הדם ומתווכים בתפקודים חשובים הכוללים תחזוקה של חדירות הקיר, רגולציה של זרימת הדם, צבירת טסיות דם והיווצרות כלי דם חדשים. במוח, תאי האנדותל מהווים חלק ממכשול מוחי קריטי ששולט בחוזקה על חילופי חומרים בין המוח לבין מחזור הדם1. המחקרים שלנו בעשור האחרון זיהו תפקידים נוירוגניים הרומן של תאים אנדותל המוח כי יש השלכות משמעותיות על התפתחות המוח והתנהגות2,3,4,5. הראינו כי העכבר מתחלקים מראש המוח הוא vascularized על ידי שני סוגי המשנה ברורים של כלי, כלי הקיבול ואת כלי הקיבול, כי שונים באנטומיה, מקור, ופרופיל התפתחותי2. תאים אנדותל בטנה תת אלה שני כלי הקיבול להראות הבדלים שונים פרופילים גנים שלהם ביטוי. בעוד בתאי האנדותל המהירה ביותר לבטא גנים הקשורים דלקת ותגובה חיסונית, תאים אנדותל המוח מועשר באופן ייחודי ביטוי של גנים הקשורים בדרך כלל נוירוגנזה, הגירה עצבית, כימוטווניות, ו אקסון הדרכה3. תאים המוח הבין-חדרית גם הבית הספר מסלול מאותת הרומן, כי הוא נבדל מתוך מסורתית עצביים המסורתית נגבה מסלול5. במקביל עם הביטוי הגנטי שלה, תאי האנדותל החדרית נמצאו כדי לווסת הגירה והפצה של הביננוירונים GABAergic בקליפת המוח המתפתח. במהלך פיתוח עובריים, תאי האנדותל החדרית עוברים הגירה למרחקים ארוכים לאורך מעבר-הדרגתי של הבנגאני-על כדי להקים את רשת כלי הדם הפריחדרית2,3. מסלול נדידה זה משתקף יום מאוחר יותר על ידי האינטרנוירונים. הגירה האינטרנוירונים אינטראקציה גופנית עם הרשת מראש בנוי כלי דם periventricular ולהשתמש בו כמו מחבל להגיע ליעד הסופי שלהם בקליפת המוח. בנוסף למשחק כמצע פיזי, תאי האנדותל החדרית משמשים כמקור לאותות הניווט לצורך העברת נוירונים. מדריכי הגירה של התאים הבין-מנחים להגירה ומסדיר את דפוסי ההפצה הסופיים4. פגמים בהגירה והפצה משויכים להפרעות נוירופסיכיאטריות כגון אוטיזם, אפילפסיה, סכיזופרניה ודיכאון6,7,8,9,10. לכן, לימוד של פונקציות תא אנדותל המוח והשפעתם על הגירה הבין-תאית בהקשר האנושי הופך קריטי לטיפול בפתוגנזה של הפרעות אלה.
יצרנו תאים אנושיים בעלי כדוריות המוח האנטי-חדרית מתאי גזע עובריים אנושיים במעבדה שלנו11, באמצעות תא גזע המושרה pluriפוטנטי (ipsc) טכנולוגיה12,13. כדי לאמת אם תאי הגוף האנושי הפריבאלי מחקים בנאמנות את תאי האנטי-בתים של העכבר, ועל מנת לאמוד את השפעתם על הגירה בין-חדרית, פיתחנו שלושה בתוך מבחנה: שיטת הגירה ארוכת שנים, שיטת הגירה של תרבות שותפה, ושיטת הכימותרפיה-אטרקציה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים עבור אלה שאומר בפרוטרוט. כל שלושת התוספות מבוססים על השימוש בתוספים לתרבות הסיליקון כדי ליצור טלאי מלבני קטן של תאים (של ממדים קבועים) מוקפים בשטח נטול תאים. מרחק ההעברה מוערך על-ידי מדידת המרחק בין המיקומים הסופיים של תאים מהגבול של התיקון המלבני שהותווה ביום 0. בתוך שיטת ההגירה ארוכת הטווח, תאי האנדותל האנושיים הקיימים מתפעינים כטלאי במרכז המנה 35 מ"מ, והמרחקים שבהם התאים מחושבים במשך זמן ארוך. בשנת שיתוף תרבות הגירה התיקון, תאים אנושיים המוח האנושי שיתוף הזרע עם interneurons אנושיים כמו תיקון אחד בצלחת 35 mm. התקנה זו מאפשרת בדיקה של ההשפעה של אינטראקציות פיזיות ישירות של שני סוגי תאים אלה על שיעור ההגירה של האינטרנוירונים. שיטת הכימותרפיה-אטרקציה מודדת את הגירה של האינטרנוירונים בתגובה לרמזים אטרקטיביים לכימותרפיה המופרשים על-ידי תאי האנדותל האנושיים. האינטרנוירונים הם שנזרע כטלאי מלבני, עם תאי האדם הפריתאלי האנושי ושליטה בתאי האנדותל שאינם הפריקיים שנזרע כטלאים בגודל דומה בכל צד. כל אחד מתיקוני התא מופרדים על-ידי פער ללא תא של 500 μm. תגובה של האינטרנוירונים מוערך על ידי כימות מספר התאים שהועברו לעבר תאים אנדותל החדרית לעומת שליטה בתאי אנדותל שאינם הפריחדרית.
הספק האלה מספקים הערכה איתנה של פונקציות התא האנושי הפריציאלי והשפעתם על הגירה בין-תאית. כיוונון הרומן של שיטת העברת היקף ושיתוף תרבות בינעירוניות מספק שטח פנוי לתא בטווח סנטימטרים (~ 1-1.5 ס מ) כדי לאפשר זיהוי של הגירה למרחקים ארוכים. סיכום של התכונות של בחני שלנו לעומת הפופולרי אחרים בחני מוצגת בטבלה 1. באופן קולקטיבי, בחני המתואר כאן ישמש פלטפורמה להערכת "חולה" תאים אנדותל המוח הביננוירונים שנוצר מ iPSCs של הפרעות בראש כמו סכיזופרניה, אוטיזם או אפילפסיה. מספר זה יכול לשמש גם כדי לקבוע כיצד תנאים שונים (למשל, מעכבי, ליגנדס, RNAi) משפיעים על העברת תאים. לבסוף, מספר זה יכול להיות ממוטב עבור סוגי תאים אחרים כדי למדוד הגירה למרחקים ארוכים, כימותרפיה-הגירה או תא התא ההגירה מתווכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות ואחסנה של תאים אנושיים בעלי המוח האנושי
- שמור על התאים האנושיים בעלי המוח האנושי על ממברדת המרתף מצופה (ראה טבלת חומרים) 6-צלחות היטב בינונית התא הפריטאלי (E6 medium המכיל 50 Ng/Ml-A, 100 Ng/mL FGF2 ו 5 ΜM נגבה) ב 37 ° צ' ו 5% CO2. . שנה בינונית כל יום חלופי
- הפשרת מטריצת קרום המרתף ב 4 ° c, ולעשות פתרון 1:100 על ידי דילול זה בינונית DMEM/F12 בינוני. מעיל כל הבאר של 6-היטב צלחת עם 1 mL של פתרון מטריקס. הצלחות הדגירה ב 37 ° צ' לפחות 1 h לפני השימוש.
- הניחו לתאי האנדותל האנושיים הרגילים להגיע לשטף של 80%-90%. . מרוב מדיום מבאר שטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מ ל של הערוץ הסטרילי 1x לבאר.
- ניתוק תאים על-ידי הוספת 1 mL של פתרון דיסוציאציה של תא (ראה טבלת חומרים) לבאר. מודקון ב 37 ° c עבור 5 דקות. לאחר 5 דקות, להוסיף 1 מ ל של המדיום התא הפריטתל החדרית. העבר את פתרון התאים לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל.
הערה: אנו משתמשים במאקטאז עבור הדיסוציאציה התאית כאן, בניגוד ל טרילקל בסעיפים 3 ו -4. - בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לבשל את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מדיום התא הפריטאלי של המוח.
- ספירת תאים חיים בשיטת האי-הכללה הכחולה. תאי זרעים בלוחות מצופי מטריקס טריים בצפיפות של 1.2 x 105 תאים/cm2. מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- מאגר האדם בתאי האנדותל האנושית על ידי cryopreserving זמנת בינוני בהקפאה (90% המוח תא אנדותל בינונית ו 10% DMSO).
- הנתק ולאסוף תאים הבאים שלבים 1.3 ו 1.4 לעיל. ספירת תאים בפתרון לפי שיטת ההדרה הכחולה של הטריפי.
- בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. ומשהה את הגלולה בגובה 5 x 106 תאים/mL של הקפאת בינונית.
- לחלק 1 מ ל של הקפאת בינונית פלוס תאים לכל קריובקבוקון. מניחים את הבקבוקונים בחדר מלא האיזופנול וקריר לילה ב-80 ° c ב-1 ° c/min. העברת מבחנות למיכל חנקן נוזלי ביום שלמחרת לאחסון ארוך טווח.
2. הכנת תאים בעלי החיים האנושיים לצורך שיטת העריכה
- הניחו לתאי האנדותל האנושיים הרגילים להגיע ל-70%-80%.
- נתק תאים בעקבות השלבים 1.3 עד 1.5 כמתואר לעיל. ספירת תאים בשיטת האי-הכללה הכחולה.
3. הכנת האינטרנוירונים של האדם האנושי לצורך שיטת העריכה
הערה: תא גזע בהשפעת האדם (iPSC)-שמקורם באינטרנוירונים ובמדיום העצבי היו נרכשים מסחרית (ראו טבלת חומרים). הנוירונים מופקים על ידי הבחנה של הייצור האנושי הנגזר של שורה iPSC בעקבות פרוטוקול שפותחה על ידי היצרן. התאים היו מופשרים ומתורבתים בהתאם לפרוטוקול של היצרן.
- הפשרת האינטרנוירונים האנושיים האנושית והתרבות אותם בצלחת 12-באר במשך שבועיים עד שליטה של 70%-80%.
- ביום השימוש, פתרון הדיסוציאציה החמימה של התא (ראה טבלת חומרים) ומידה של מדיום עצבי ב-37 ° c במשך 10 דקות לפני שימוש.
- מרוב בינוני מכל מבנה. המכיל את התאים כביסה תאים עם 1 מ ל של PBS 1x סטרילי לכל טוב.
- ניתוק תאים על-ידי הוספת 0.5 mL של פתרון טרום-מחומם של הדיסוציאציה לכל הטוב ו-מודטה ב-37 ° צ' עבור 5 דקות. הוסף 1 מ ל של בינוני עצבי לבאר. העבר פתרון תא לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל. . בעדינות, כדי לנתק את גושי התאים
- בתאי צנטריפוגה ב 380 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, ומכה את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מדיום עצבי. ספירת תאים חיים בשיטת האי-הכללה הכחולה.
4. הכנת תאים בעלי השליטה האנושית לצורך שיטת שליטה
הערה: שליטה בתאי האנדותל האנושיים הנגזרים ובינוני התאים האנדותל, נרכשומסחרית (לוח חומרים). תאי האנדותל האלה מופקים על-ידי הבחנה של שורה iPSC של האדם הנגזר לגורל אנדותל בעקבות פרוטוקול שפותח על ידי היצרן. התאים היו הופלו ומתורבתים על מצע Fibronectin בהתאם לפרוטוקול של היצרן. פיברוטין-צלחות מצופות הוכנו בעקבות פרוטוקול היצרן.
- הפשרת בקרת התאים האנושיים והתרבות אותם בצלחת 6-באר לשטף של 80%-90%.
- ביום השימוש, פתרון הדיסוציאציה החמה של התאים (ראה טבלת חומרים) ומידה של מדיום אנדותל ב37 ° c במשך 10 דקות לפני שימוש.
- מרוב המדיום. מכיל את התאים כביסה תאים עם 1 מ ל של PBS 1x סטרילי לכל טוב.
- ניתוק תאים על-ידי הוספת 0.5 mL של פתרון טרום-מחמם דיסוציאציה לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הוסף 1 mL של בינונית תא אנדותל כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה. העבר פתרון תא לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל.
- בתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. ומשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל. של מדיום התא האנדותל ספירת תאים חיים בשיטת האי-הכללה הכחולה.
5. הכנת מוסיף תרבות אחת
- הפשרת 1 מ"ג/mL למינציה בתמיסה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c.
- מעיל מספר מתאים של 35 מ"מ מנות עם 0.01% פולי-L-אורלך (1 מ ל לכל מנה). מיכל המטבח בטמפרטורת החדר עבור לפחות 1 h.
- לדלל 1 מ"ג/mL למינציה בפתרון 1:300 במים סטרילי לריכוז הסופי של 3.3 μg/mL מיד לפני השימוש.
- מפחת לגמרי את האורלים. ממנה כל מנה לשטוף כל מנה ביסודיות 3x עם מים סטריליים ומלא לגמרי כדי למנוע את הרעלת התאים פולי-L-המושרה.
- הוסף 1 מ ל של 3.3 μg/mL למינציה בפתרון לכל מנה ו-דגירה ב 37 ° צ' לילה או לפחות 1 h. הסר את התמיסה הלמינציה ממנה מיד לפני השימוש.
הערה: לחלופין, יש לאחסן את המנות המכילות מלמינציה ב-4 ° c. באמצעות שימוש בכלים בחממה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. - חותכים שלושה צדדים של אחד היטב של הוסף תרבות שתי היטב סיליקון (איור 1א) שימוש בלהב סטרילי כדי ליצור הוספה של הכנסה אחת (איור 1B).
הערה: שמרו על הכנס השני היטב המחובר בחוזקה למשטח האריזה המקורית תוך כדי גזירה כדי להבטיח גזירה חלקה ולהגן על ההיסוס של התוספת. - . מרוב הצלחות משוגרות בתמיסה
הערה: אין לשטוף את הכלים באמצעות PBS או מים עקרים לאחר למינציה בדגירה. משטחים רטובים ימנעו הדבקה הדוקה של הוספת התרבות. - הסר את התוספת האחת עם מלקחיים סטריליים והכנס אותה למרכז הכלים פולי-אל-מצופה למינציה. לחץ לאורך קצות התוספת כדי לתקן אותו על פני השטח של המנה.
- הפוך בזהירות את המנה הפוכה כדי לוודא שההוספה מדבקה היטב.
- שמור את המנה הפוכה וסמן את הגבול של תא ההוספה באמצעות סמן שחור קבוע עם קצה דק במיוחד (איור 1ג).
6. שיטת ההגירה למרחקים ארוכים
- השהה את האינטרנוירונים האנושיים בריכוז של 3 x 104 תאים/70 μl של מדיום עצבי. Seed 70 μL של פתרון התא בתוך כל הוספה של תרבות אחת.
הערה: הצפיפות של האינטרנוירונים היא לפי המלצת היצרן. - להשעות את התאים האנושיים המוח האנושי בריכוז של 3 x 104 תאים/70 μl של מדיום התא הפריטאלי המוח. Seed 70 μL של פתרון התא בתוך כל הוספה של תרבות אחת.
הערה: מספר תאי האנדותל האנושי הפריתאלי שנזרע ביחס 1:1 עם מספר הנוירונים שנזרע. - הוסף 1 מ ל של בינוני עצבי בצלחת העצב כדי למלא את האזור סביב הכנס ולמנוע את הציפוי מייבוש. באופן דומה, להוסיף 1 מ ל של מדיום התא הפרידיקל המוח בצלחת תא המוח הפריטאלי.
הערה: הוסף בינוני לאט לאורך קצה המנה כך שההוספה לא תהיה מופרעת. - בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים אינם דולף מתוך תא ההוספה.
- התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 24 שעות דגירה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי התאים מחוברים כראוי ואין דליפה לילה.
- לאחר 48 h של זריעה, להסיר בעדינות את ההכנסה באמצעות tweezer סטרילי. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא נותרת ללא הפרעה (יום 0).
- להסיר בינוני ממנה תא העצב ולהוסיף 1 מ ל של בינוני עצבי טרי. באופן דומה, להסיר את המדיום מתוך צלחת התא הפריטאלי המוח ולהוסיף 1 מ ל של המדיום החדש של תא אנדותל המוח.
הערה: הגדר מספר נדרש של מנות ותקן עם 4% לחצי הראשון עבור התמונות ביום 0. - התאים הדגירה 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 5 ימים, להסיר בינוני, לתקן את התאים עם 4% כדור הכיוון 10 דקות, ולשטוף את 3x עם 1x PBS.
- כתם נוירונים עם אנטי אדם β-טובולין או אנטי אדם נוגדן MAP2, ותאי האנדותל עם נוגדן CD31 אדם אנטי. בסופו של כתמים חיסוני, להוסיף 1 מ ל של מדיום הרכבה antifade לכל מנה.
7. משותף להעברת תרבות שותפה
- שיתוף השעיה 3 x 104 הביננוירונים gabaergic ו 3 x 104 בתאי האדם הפריבלי האנושית ב-70 μl של שיתוף תרבות בינונית (50% בינונית תחזוקה הפריחדרית ללא נגבה ו 50% בינוני עצבי). הזרע את פתרון התא הזה בתוך תא הוספה אחד היטב. הכינו מספר מתאים של מנות מסוג זה.
הערה: לא נוספה החברה במדיום המשותף לתרבות כדי שלא לכלול את ההשפעה של נגבה אקסוגני על הגירה. - בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים אינם דולף מתוך תא ההוספה.
- באיטיות להוסיף 1 מ ל של שיתוף תרבות בינונית לאורך הצד של הצלחת כדי למנוע את הציפוי מייבוש.
הערה: הוסף בינוני לאט לאורך קצה המנה כך שההוספה לא תהיה מופרעת. - כפקד הראשון, הזרע 3 x 104 האדם הבין-משני GABAergic האנושית רק ב-70 μl של שיתוף תרבות בינונית לכל הוספה היטב. הכינו מספר מתאים של מנות כאלה.
- כפקד שני, co-seed 3 x 104 gabaergic האדם הביננוירונים עם 3 x 104 בקרת תאים אנושיים האדם בשליטה 70 μl של שיתוף תרבות בינונית לכל הוספה היטב. הכינו מספר מתאים של מנות.
- מודאת הצלחות 24 שעות ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 24 שעות דגירה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי תאים מחוברים כראוי אין דליפה.
- לאחר 48 h של זריעה, להסיר בעדינות את ההכנסה באמצעות tweezer סטרילי. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא אינה מופרעת (יום 0).
- הסר בינוני והוסף 1 מ ל של מדיום שיתוף תרבותי טרי.
הערה: הניחו מספר מתאים של מנות לרכישת יום 0. - התאים הדגירה 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- לאחר 5 ימים, להסיר בינוני, לתקן את התאים עם 4% כדור הכיוון 10 דקות, ולשטוף את 3x עם 1x PBS.
- כתם עם אנטי אדם β-טובולין או אנטי אדם נוגדן MAP2 לתייג את הנוירונים. בסופו של כתמים חיסוני, להוסיף 1 מ ל של מדיום הרכבה antifade לכל מנה.
8. הכימותרפיה-שיטת המשיכה
- מניחים שלושה היטב מגוון התרבות במרכז של פולי-L-האורלך/למינציה מצופה 35 mm צלחת באמצעות מלקחיים סטרילית.
- . הפוך את המנה הפוכה סמן את הגבול מסביב לחלק האמצעי של ההוספה באמצעות סמן שחור קבוע עם קצה דק במיוחד.
- Seed 3 x 104 האדם הבין-עצבי האנושי בתוך התא האמצעי ב-70 μl של בינונית עצבית (איור 3א).
- זרעים 104 תאים האדם הפריטאלי האנושי ב 70 μl של בינונית התא הפריטאני ו 104 בקרת תאים אנדותל ב 70 μl של בקרת תא אנדותל בינונית בשני התאים החיצוניים בהתאמה (איור 3א).
- הוסף 1 מ ל של שיתוף תרבות בינונית (50% בינונית תחזוקה המוח ללא נגבה ו 50% בינוני עצבי) לאורך הצד של הצלחת כדי למנוע את ציפוי על הצלחת מייבוש.
- בדקו במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים לא דולף מתוך תא ההוספה.
- התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 24 שעות דגירה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי תאים מחוברים כראוי אין דליפה.
- לאחר 48 h של זריעה, להסיר בעדינות את ההכנסה באמצעות tweezer סטרילי. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא אינה מופרעת (יום 0).
- הסר בינוני והוסף 1 מ ל של מדיום שיתוף תרבותי טרי.
הערה: הנח את מספר המנות הנדרש עבור היום 0 תמונות. - התאים הדגירה עבור 36 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 36 h, משוף בינוני, לתקן תאים עם 4% כדור הייט עבור 10 דקות, ולשטוף 3x עם 1x PBS.
- הכתם האנושי הפנימי של GABAergic עם אנטי אדם β-טובולין או אנטי אדם נוגדן MAP2. בסוף הליך הצביעת, להוסיף 1 מ ל של מדיום הרכבה antifade בכל מנה.
9. הדמיה וניתוח נתונים
- מניחים את הצלחת המוכתם החיסונית מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 4X.
- שמור על קצה אחד ארוך של הגבול המלבני (מורכב בשלב 5.10 לעיל) בשדה התצוגה. קח תמונות של תאים בשטח נטול התאים הסמוכים לגבול זה. השיגו תמונות לאורך הקצה הימני והשמאלי של הגבול המלבני (איור 2ב').
הערה: תאים הממוקמים באלכסון ביחס למלבן אינם נחשבים בשל אי-בהירות בבחירת הקצה הקצר או הארוך כסימן התחלה. כמו כן, מספר התאים המתנודדים לאורך הקצה הקצר הם לעתים קרובות פחות משמעותית (ייתכן שבגלל מספר נמוך יותר של תאים מתחילים לאורך הקצה הקצר) ואינם נחשבים. - פתח את התמונות ב-ImageJ. חשב מרחק בין כל תא לבין סימון הגבול (איור 2ד) באמצעות imagej.
- להערכת הגירה במונחים של מספרי תאים, קבעו מרחק מסוים מהגבול בתמונה שנרכשה ב-ImageJ. ספור את מספר התאים הנמצאים במרחק זה. חישוב מספר ממוצע, סטיית תקן ומשמעות סטטיסטית באמצעות תוכנה מתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השלבים להגדרת הכנסת התרבות האחת בתוך מנה של 35 מ"מ מוצגים באיור 1. שיטת ההעברה למרחקים ארוכים ושיתוף העברת התרבות המשותף השתמשו בתוספת אחת היטב כדי לזרע את מספר התאים הרצוי במרכז פולי-אל-כלים/למינציה בציפוי 35 מ"מ. ביום 0, התאים היו נוכחים כטלאי מלבני (איור 2א, ג). ביום 0 תמונות, שורת היום 0 יכולה להיות מזוהה בקלות על-ידי הקצה החד של שכבת התא (קו מנוקד לבן באיור 2ג). על-ידי 48 h, תאים הועברו לשטח ללא תא (איור 2B, D). בתמונות שלאחר היום 0, הגבול השחור שצויר סביב התותב (בחלק האחורי של המנה) ניתן להבחין בבירור כפער שחור. קצה הפער הוקצה כשורת היום 0 (קו מנוקד לבן באיור 2ד). כפי שהוזכר בשלב 9.2, רק התאים שנפלו באזור הסמוך ימינה ושמאלה קצוות של שכבת התא (האזור הצהוב באיור 2ב) נחשבו לניתוח נתונים. המרחק שנסע בתא נמדד על-ידי חישוב המרחק בין התא (חץ לבן באיור 2ד) ושורת היום 0. כימיקלים אימונוציטוטוקכימיים עם אנטי אקטיבי Caspase 3 נוגדן, סמן של אפופטוזיס, הראה לא אות האפוטוטיות בתאים הנזרע (איור 2E). בשנת הגירה התרבות שיתוף, כאשר הביננוירונים היו שיתוף הזרע עם התאים האנושיים המוח אנדותל, נוירונים נסעו מרחקים רחוקים יותר לעומת כאשר הביננוירונים הופרה לבד או כאשר הזרע עם שליטה בתאי בקרה (איור 2F). כמו כן, עבור אותו טווח המרחק, מספר גבוה יותר של הביננוירונים היגרו כאשר הזרע עם שיתוף עם תאים אנדותל המוח בהשוואה לאינטרנוירונים בשתי הקבוצות האחרות. זה מראה כי, כמו העכבר הפנימי בתאי האנדותל, תאי האנדותל של האדם המוח האנושי לקדם הגירה הבין-חדרית.
בתוך הטיפול הכימותרפיה-משיכה, באמצעות שלוש היטב מוסיף התרבות, האינטרנוירונים האנושי הופרה כתיקון מלבני קטן 35 mm פולי-L-האורלך/למינציה בצלחת תרבות מצופה. תאים אנדותל המוח ושליטה בתאי האנדותל שאינם הפריעיים הופרה כטלאים משני צדי התיקון העצבי, עם הפער בין כל תיקון להיות 500 יקרומטר (איור 3א). מספר האינטרנוירונים שהיגרו לעבר תאי האנדותל החדרית לעומת תאי השליטה האנדותל היה כימות אחרי 36 h. מספר גבוה באופן משמעותי של האינטרנוירונים הועברו לעבר התאים הפריתאל בהשוואה לתאים אנדותל (איור 3B, C), ומאשרת כי האינטרנוירונים gabaergic להגיב באופן סלקטיבי רמזים אטרקטיבי המופרש על ידי האדם בתאי אנדותל המוח האנושי.
איור 1: הכנת הכנסת התרבות. (א) הכנסת תרבות של שתי היטב. (ב) הוספה אחת היטב קבוע במרכז של צלחת 35 מ"מ. (ג) קו המתאר של הטלאי המלבני כפי שנצפה לאחר הסרת ההוספה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הסכמה ושיטת הנציגים של הגירה. (א) סכימת שכבת התא (מלבןאדום) ביום 0. (ב) סכימת תאים מגירה לשטח ללא תא. נקודות אדומות מציינות תאים נודדים. האזור הצהוב מסמן את האזור המהווה תמונה עבור רכישת נתונים. התיבה המנוקדת ב-A ו- B מתאימה לאזור המוצג בחלוניות C ו- D. (ג,ד) הנציגה תמונות פלורסנט של אנטי β-טובולין נוגדן המסומנים interneurons ביום 0 (ג) ויום 2 (ד) של שיטת ההגירה. הקו הלבן המנוקד מסמן יום 0. הקו הצהוב ב -D מציין את המרחק שנסע תא (מסומן על ידי החץ הלבן) ב 48 h. (E) נוירונים (ביום 0) הם מסומנים עם אנטי-β-טובולין נוגדנים (אדום) ו אנטי פעיל caspase 3 נוגדנים (ירוק), אשר לסמן תאים אפוטוטיים. גרעינים הם מוכתמים DAPI (כחול). תאים אפוטוטיים לא זוהו בתאי הזריעה. (ו) גרף מיום 5 של שיתוף התרבות המשותף, שבו מספר הנוירונים שהועברו מותווה כנגד המרחק. בהשוואה לתאי נוירונים שעברו הזרע לבדם או שיתוף הנזרע עם תאים אנדותל שליטה, שיתוף הגומלין בין התאים בתאי האנדותל הפריחדרית הועברו במספרים גבוהים יותר, וגם נסעו רחוק יותר. הנתונים מייצגים משמעות ± S. D (n = 5; * *p< 0.01, * * *p< 0.001, מבחן t של הסטודנט). קנה מידה ברים = 100 μm. IN = הביננוירונים; PV EC = תאי האנדותל החדרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכימותרפיה-שיטת המשיכה. (א) סכמות של הטיפול בכימותרפיה-משיכה. באמצעות הוספת שלוש היטב התרבות, interneurons (ב) הופרה באמצע (מלבן מנוקד ירוק), בעוד תאים הפריקטאל (PV ECs; מלבן מנוקד כתום) ולשלוט בתאי האנדותל (ECs; מלבן מנוקד צהוב) הופרה משני הצדדים. (ב) תמונות של β-טובולין המסומנים הביננוירונים מראה הגירה איתנה לעבר תאים אנדותל המוח הפריציאלי אך לא לכיוון תאי השליטה האנדותל. (ג) קוונפיקציה של תגובה מושכת כימותרפיה של האינטרנוירונים. מספר גבוה באופן משמעותי של נוירונים הועברו לעבר תאי האנדותל החדרית מאשר לכיוון תאי השליטה האנדותל. הנתונים מייצגים משמעות ± S. D (n = 5; *p < 0.05, מבחן t של הסטודנט). קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| קצת | יתרונות | גבלות |
| שיטת בוידן 16,17 | · מבחינה טכנית לא תובענית · מתאים לתאים מחסיד וללא מחסיד · ניתן לשנות כדי ללמוד את ההשפעה של איתות הפרדרין או כימותרפיה מושכים על הגירה התא |
· שיטת נקודת קצה. לא מתאים לדימות בזמן אמת. · לא מתאים לחקר ההשפעה של האינטראקציה הישירה בתא התא על הגירה |
| שיטת שריטות18 | · נקודת קצה או קינטית · מבחינה טכנית לא תובענית |
· מספר ההגירה אורך של כמה מאות מיקרומטר. לא מתאים לחקר הגירה למרחקים ארוכים בטווח של 1-2 ס מ. · לא מתאים לתאים ההשעיה · וריאציות באזור הטיוטה |
| שיטת הגירה למרחקים ארוכים | · נקודת קצה או קינטי · מאפשר לימוד הגירה למרחקים ארוכים בין 1.5 ל -2 ס מ · מבחינה טכנית לא תובענית |
· לא מתאים לתאים ההשעיה |
| העברת תרבות שותפה | · נקודת קצה או קינטי · מאפשר ללמוד את ההשפעה של מגע ישיר בתאי התא בנדידה · מאפשר אורך הגירה של עד 1.5 עד 2 ס מ · מבחינה טכנית לא תובענית |
· לא מתאים לתאים ההשעיה |
| B | יתרונות | גבלות |
| שיטת בוידן | · מבחינה טכנית לא תובענית · מתאים לתאים מחסיד וללא מחסיד |
· שיטת נקודת קצה. לא מתאים להדמיה חיה. · מעבר ריכוז תלול |
| שיטת מתחת-צמח19 | · מבחינה טכנית לא תובענית · שניים או יותר אותות מושכים כימותרפיה יכולים להיות מוכנים בקבוצה אחת |
· לא מתאים לתאים חסיד. . מוגבלת בעיקר לתאי דם · הדמיה של תאים קשים בצמח |
| שיטת נימי הגירה קאמרית20,21 | · נקודת קצה או קינטית · מתאים לתאי מחסיד או השעיה |
· זקוק לחדרים מיוחדים |
| מכשיר מיקרופלואידיק22 | · יוצר מעבר הדרגתי של ריכוז בשליטה ויציבה · מתן אפשרות לרזולוציה ברמת תא בודד |
· זקוק למכשירים וכלים מתוחכמים · מבחינה טכנית, עקומת למידה תלולה · דימות מורכב וניתוח נתונים |
| כימותרפיה-שיטת המשיכה | · נקודת קצה או קינטי · הדרגה הדרגתית של ריכוז · מתאים להדמיה בזמן אמת או פלורסנט · מבחינה טכנית לא תובענית |
· לא מתאים לתאים ההשעיה |
טבלה 1: השוואת שיטות שיטה. (א) השוואה בין משותף להגירה מחוץ לבית הספר באמצעות שיטת ההגירה הרחוקה ושיתוף התרבות המשותפת. (ב) השוואת כימוכיוניות משותפת באמצעות שיטת הכימותרפיה-משיכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, תיארנו שלושה בתוך מבחנה שאומרת שביחד מספקים הערכה כמותית של המאפיינים הייחודיים לתא האנושי. מאמר זה יהיה בעל ערך בהשגת תובנות מכניסטיות לאינטראקציה של תאים אנושיים המוח האנושי עם האינטרנוירונים האנושיים. ניסויים באמצעות ליגרים, מעכבי, או תאים עם האתר הספציפי של הגן או ביטוי יתר יזהה או לאמת שחקנים מולקולריים המתווכים תא אנדותל מונחה הגירה או מאפייני נדידה מרחוק של תאים אנדותל המוח. שינויים אלה יכולים גם להיות שונה כדי לבצע את מחקרי הגירה בתאי הזמן החיים. יתר על כן, יש ראיות לאינטראקציה של תאים אנדותל עם תאים אחרים מאשר אינטרנוירונים. מחקרים מהקבוצה שלנו ואחרים השפיעו על ההשפעה של תאי האנדותל הפריטלאלי על מעצבי ההקרנה הנוירונים והתפשטות של תאים מקודמן העצבי5,14,15. זה יהיה מעניין לבחון את האינטראקציות האפשריות בעזרת הגדרות השימוש שלנו. בסופו של דבר, מאמר זה ישמש כפלטפורמה להערכת תאי שורש המוח הנגועים. העבודה שלנו הקימה קשרים הרומן האוטונומי בין הרשת הפריחדרית וסקולרית והמקור של הפרעות נוירופסיכיאטריות כמו סכיזופרניה, אפילפסיה, אוטיזם, ודיכאון הגדולות3,5. מאמר זה יהיה יקר ערך בזיהוי פגמים פוטנציאליים בהגירה למרחקים ארוכים, כימותרפיה, או איתות juxtracrine של תאים הנגועים-הנוירותל החולה בתנאי הפרעת הפרעה פסיכיאטרית.
אלה מאמר הם פשוטים, הניתנים להתרבות, ואת העלות הנמוכה, והם יכולים להיות שונה כדי למדוד הגירה התא ואפקטים של שיתוף התרבות או הכימותרפיה אטרקטיבי רמזים על הגירה סוגי תאים שונים, למעט תאים שאינם חסיד. ישנם כמה שלבים קריטיים שיש לבצע כדי להשיג תוצאות מדויקות ומיותחים. ראשית, חיוני למטב את מספר התאים של הזריעה עבור כל שיטת המשך. מספר התאים שניתן לזריעה בתא יחיד צריך להיות תלוי בסוג התא, ברמה הרצויה של השטף, ובגורמים ספציפיים לצורך כגון יחס שיתוף תרבות. שנית, יש צורך למטב את המדיום של תרבות התא עבור כל שיטת העיבוד. בטיפול שיתוף תרבות העברה והטיפול בטיפול בכימותרפיה, כאשר יותר מסוג תא אחד נזרע במנה אחת, מדיום הטיפול צריך להיות תורם לכל סוגי התאים. בניסויים הטייסים, בדקנו את השפעת המדיום המשותף על הכדאיות (שימוש בשיטת ההדרה הכחולה) ומורפולוגיה (באמצעות אימונוציטוכימיה) של כל סוג תא. אנו מתורבתים האדם מתורבת נוירונים בינוניים עם שיתוף תרבות בינונית במשך שבוע אחד ולא נצפתה הבדל משמעותי הכדאיות והמבנה של נוירונים במדיום שיתוף תרבות בהשוואה לנוירונים תרבותיים במדיום עצבי. בצורה דומה, תאי האנדותל החדרית והשליטה בתאי האנדותל, מתורבתים בתווך התרבות המשותף עבור שני מעברים, לא הראו וריאציה משמעותית של הישרדות התא ומורפולוגיה. שלישית, מאחר ששיעור ההעברה משתנה בין סוגי תאים שונים, חשוב לקבוע את מסגרת הזמן עבור כל אחד מהנבחנים עבור סוג התא (s) שנלמד. רביעית, זה קריטי להתמודד עם מוסיף התרבות בזהירות. יש לתקן את התוספות בחוזקה על הצלחת על-ידי לחיצה עדינה עם קצה האצבע. התבשיל צריך להיות מתהפך כדי לוודא כי ההכנסה לא זז. יש לנקוט גם בזמן הסרת ההוספה כדי לא להפריע לשכבת התא. לבסוף, מומלץ להגדיל את גודל המדגם כדי להפחית את השונות הניסיונית.
לסיכום, התנאים הללו ירחיב באופן משמעותי את הבנתנו את הביולוגיה של התא האנושי הטיפולי הרחב ותפקידה על התפתחות המוח במצבים נורמליים ונגועים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מחברים לא מצהירים על ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי פרסים מן המכון הלאומי לבריאות הנפש (R01MH110438) והמכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (R01NS100808) ל AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
- Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
- Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
- Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
- Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
- Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
- Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
- Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
- Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
- Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
- Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).
