Summary
Vi presentiamo tre semplici saggi in vitro: il saggio di migrazione a lunga distanza, il saggio di co-cultura sulla migrazione e l'analisi chemio-attrazione-che valutano collettivamente le funzioni delle cellule staminali umane derivate cellule endoteliali periventricolari e le loro interazione con gli interneuroni GABAergic.
Abstract
Ruolo della vascolatura cerebrale nello sviluppo del sistema nervoso e nell'eziologia dei disturbi cerebrali sta guadagnando sempre più attenzione. I nostri studi recenti hanno identificato una popolazione speciale di cellule vascolari, le cellule endoteliali periventricolari, che svolgono un ruolo fondamentale nella migrazione e distribuzione di interneuroni GABAergici del prosencefalo cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Questo, unito alle loro funzioni autonome alle cellule, allude a nuovi ruoli di cellule endoteliali periventricolari nella patologia dei disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia, l'epilessia e l'autismo. Qui, abbiamo descritto tre diversi saggi in vitro che valutano collettivamente le funzioni delle cellule endoteliali periventriculari e la loro interazione con gli interneuroni GABAergici. L'uso di questi saggi, in particolare in un contesto umano, ci permetterà di identificare il legame tra le cellule endoteliali periventricolari e i disturbi cerebrali. Questi saggi sono semplici, a basso costo e riproducibili e possono essere facilmente adattati a qualsiasi tipo di cellula aderente.
Introduction
Le cellule endoteliali formano il rivestimento dei vasi sanguigni e mediano importanti funzioni che includono il mantenimento della permeabilità della parete del vaso, la regolazione del flusso sanguigno, l'aggregazione delle piastrine e la formazione di nuovi vasi sanguigni. Nel cervello, le cellule endoteliali fanno parte di una barriera emato-encefalica critica che controlla strettamente lo scambio di materiali tra il cervello e il flusso sanguigno1. I nostri studi nell'ultimo decennio hanno identificato nuovi ruoli neurogenici delle cellule endoteliali cerebrali che hanno implicazioni significative per lo sviluppo e il comportamento del cervello2,3,4,5. Abbiamo dimostrato che il prosencefalo embrionale del topo è vascolarizzato da due distinti sottotipi di vasi, i vasi di pial e i vasi periventricolari, che differiscono per anatomia, origine e profilo di sviluppo2. Le cellule endoteliali che rivestono questi due sottotipi di vasi mostrano differenze distinte nei loro profili di espressione genica. Mentre le cellule endoteliali piale esprimono per lo più geni legati all'infiammazione e alla risposta immunitaria, le cellule endoteliali periventricolari sono arricchite in modo univoco nell'espressione di geni comunemente associati a neurogenesi, migrazione neuronale, chemiotassi e guida degli assoni3. Le cellule endoteliali periventriculari ospitano anche un nuovo percorso di segnalazione GABA che è distinto dal tradizionale percorso di segnalazione neuronale GABA5. Concomitante con la sua espressione genica, sono state trovate cellule endoteliali periventricolari per regolare la migrazione e la distribuzione di interneuroni GABAergici nella neocorteccia in via di sviluppo. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule endoteliali periventriculari subiscono una migrazione a lunga distanza lungo un gradiente ventrale-dorsale per stabilire la rete vascolare periventricolare2,3. Questa rotta migratoria si rispecchia un giorno dopo dagli interneuroni. Gli interneuroni che migrano interagiscono fisicamente con la rete vascolare periventricolare preformata e la usano come guida per raggiungere la loro destinazione finale nella neocorteccia. Oltre ad agire come substrato fisico, le cellule endoteliali periventricolari servono come fonte di segnali di navigazione per i neuroni che migrano. Guide endotiliariche GABA semeggiate da cellule interneuroni e regola i loro schemi di distribuzione finale4. I difetti nella migrazione e distribuzione di interneuroni sono associati a disturbi neuropsichiatrici come autismo, epilessia, schizofrenia e depressione6,7,8,9,10. Pertanto, lo studio delle funzioni endoteliali periventricolari e la loro influenza sulla migrazione interneurone nel contesto umano diventa fondamentale per affrontare la patogenesi di questi disturbi.
Abbiamo generato cellule endoteliali periventricolari umane da cellule staminali embrionali umane nel nostro laboratorio11, utilizzando la tecnologia indotta di cellule staminali pluripotenti (iPSC)12,13. Per verificare se le cellule endoteliali periventriculari umane imitano fedelmente le cellule endoteliali periventricolari del topo e per valutare quantitativamente la loro influenza sulla migrazione interneurone, abbiamo sviluppato tre saggi in vitro: un saggio di migrazione a lunga distanza, un test di migrazione co-culturale e un'attrazione chemio-attrazione. Qui descriviamo i protocolli per questi saggi in dettaglio. Tutti e tre i saggi si basano sull'uso di inserti di coltura del silicone per creare una piccola patch rettangolare di celle (di dimensioni fisse) circondate da spazio senza celle. La distanza di migrazione viene valutata misurando la distanza tra le posizioni finali delle celle dal bordo della patch rettangolare che è stata delineata il giorno 0. Nel test sulla migrazione a lunga distanza, le cellule endoteliali periventricolari umane vengono semimate come patch al centro di un piatto di 35 mm e vengono calcolate le distanze percorse dalle cellule per un lungo intervallo di tempo. Nel saggio di migrazione co-culturale, le cellule endoteliali periventranti umane sono co-semiseme con interneuroni umani come una patch in un piatto da 35 mm. Questa configurazione consente di esaminare l'effetto delle interazioni fisiche dirette di questi due tipi di cellule sul tasso di migrazione degli interneuroni. Il saggio chemio-attrazione misura la migrazione degli interneuroni in risposta a segnali chemio-attraenti secreti dalle cellule endoteliali periventriculari umane. Gli interneuroni sono semi come una macchia rettangolare, con cellule endoteliali periventrapicolari umane e controllano le cellule endoteliali non periventriculari come cerotti di dimensioni simili su entrambi i lati. Ciascuna delle patch cellulari è separata da uno spazio privo di cellule di 500 m. La risposta degli interneuroni viene valutata quantificando il numero di cellule migrate verso cellule endoteliali periventricolari rispetto al controllo delle cellule endoteliali non periventricolari.
Questi saggi forniscono una solida valutazione delle funzioni endoteliali periventricolari umane e della loro influenza sulla migrazione degli interneuroni. La nuova configurazione del saggio a lunga distanza e della analisi della migrazione co-culturale fornisce uno spazio senza cellule nell'intervallo di centimetri (1-1,5 cm) per consentire il rilevamento della migrazione a lunga distanza. Una sintesi delle caratteristiche dei nostri saggi rispetto ad altri saggi popolari è presentata nella Tabella 1. Collettivamente, i saggi qui descritti serviranno come piattaforma per valutare le cellule endoteliali periventricolari "malattie" e gli interneuroni generati da iPSC di disturbi cerebrali come la schizofrenia, l'autismo o l'epilessia. Questi saggi possono anche essere utilizzati per determinare in che modo le diverse condizioni (ad esempio inibitori, ligando, RNAi) influenzano la migrazione cellulare. Infine, questi saggi possono essere ottimizzati per altri tipi di cellule per misurare la migrazione a lunga distanza, la chemio-attrazione o la migrazione mediata cellulare.
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Protocol
1. Cultura e conservazione delle cellule endoteliali umane
- Mantenere le cellule endoteliali periventricolari umane su una matrice a membrana sotterranea rivestita a matrice (vedi Tabella dei materiali)di 6 pozzetti in mezzo a cellule endoteliali periventricolari (mezzo E6 contenente 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 gannive GABA) a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Cambia mezzo ogni giorno alternativo.
- Scongelare la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi centigradi e creare una soluzione 1:100 diluindola in un mezzo DMEM/F12 freddo. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di 6 pozze con soluzione a matrice da 1 mL. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi per almeno 1 h prima dell'uso.
- Consentire alle cellule endoteliali periventrapiche umane di raggiungere una confluenza dell'80%-90%. Mezzo aspirato dal pozzo. Lavare i pozzetti una volta con 1 mL di sterile 1x PBS per pozzo.
- Scollegare le celle aggiungendo 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare (vedere Tabella dei materiali) per ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Dopo 5 min, aggiungere 1 mL di mezzo di cellule endoteliali periventricolari. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 mL.
NOTA: Qui usiamo Accutase per la dissociazione cellulare, a differenza di TrypLE nelle sezioni 3 e 4. - Centrifuga cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il super-atante e respendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo cellulare periventricolare.
- Contare le celle vive utilizzando il metodo di esclusione blu trypan. Celle di semi in piastre fresche rivestite a matrice ad una densità di 1,2 x 105 celle/cm2. Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.
- Conservare le cellule endoteliali periventricolari umane crioconservando nel mezzo di congelamento (90% di misura periventricolare di cellule endoteliali e 10% DMSO).
- Dissociare e raccogliere le cellule seguendo i passaggi 1.3 e 1.4 sopra. Contare le celle nella soluzione con il metodo di esclusione blu trypan.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare a 5 x 106 cellule / mL di mezzo di congelamento.
- Distribuisci 1 mL di mezzo di congelamento più cellule per crioviale. Posizionare le fiale nella camera piena di isopropanolo e raffreddare durante la notte a -80 gradi centigradi a 1 oM/min. Trasferire le fiale in un serbatoio di azoto liquido il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.
2. Preparazione delle cellule endoteliali periventriculari umane per il saggio
- Consentire alle cellule endoteliali periventrapiche umane di raggiungere il 70%-80% di confluenza.
- Dissociare le cellule seguendo i passaggi da 1,3 a 1,5 come descritto in precedenza. Contare le celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan.
3. Preparazione di interneuroni GABAergici umani per il saggio
NOTA: sono stati acquistati commercialmente interneuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) derivate dall'uomo (iPSC) e il mezzo neuronale è stato acquistato commercialmente (cfr. tabella dei materiali). I neuroni sono generati differenziando una linea iPSC derivata dal fibroblasto umano seguendo un protocollo sviluppato dal produttore. Le cellule sono state scongelate e coltivate secondo il protocollo del produttore.
- Scongelare gli interneuroni GABAergici umani e li coltura in 12-bene piastra per due settimane ad una confluenza di 70%-80%.
- Il giorno dell'apputato, soluzione di dissociazione delle cellule calde (vedi Tabella dei materiali)e un mezzo neuronale a 37 gradi centigradi per 10 min prima dell'uso.
- Mezzo aspirato da ogni pozzo contenente le cellule. Lavare le cellule con 1 mL di sterile 1x PBS per pozzo.
- Scollegare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata per pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Aggiungere 1 mL di mezzo neuronale per pozzo. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 mL. Triturare delicatamente per dissociare i grumi cellulari.
- Centrifugare le cellule a 380 x g per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il super-natante e rispendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo neuronale. Contare le celle vive utilizzando il metodo di esclusione blu trypan.
4. Preparazione del controllo delle cellule endoteliali umane per il saggio
NOTA: Sono state acquistate commercialmente le cellule endoteliali di origine endoteliale di controllo e il mezzo di cellule endoteliali (Tabella dei materiali). Queste cellule endoteliali sono generate differenziando una linea iPSC derivata dal fibroblasto umano al destino endoteliale a seguito di un protocollo sviluppato dal produttore. Le cellule sono state scongelate e coltivate sul substrato fibronectino secondo il protocollo del produttore. Le lastre rivestite di fibronectina sono state preparate seguendo il protocollo del produttore.
- Lo sisma controlla le cellule endoteliali umane e le coltura in 6-po placca ad una confluenza di 80%-90%.
- Il giorno del saggio, soluzione di dissociazione delle cellule calde (vedi Tabella dei materiali)e un grado di mezzo endoteliale a 37 gradi centigradi per 10 min prima dell'uso.
- Aspirare il mezzo da ogni pozzo contenente le cellule. Lavare le cellule con 1 mL di sterile 1x PBS per pozzo.
- Staccare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata per pozzo. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 mL di mezzo a cellule endoteliali per bene per neutralizzare la soluzione di dissociazione. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo cellaele endoteliale. Contare le celle vive utilizzando il metodo di esclusione blu trypan.
5. Preparazione di inserti di cultura in un solo pozzo
- Soluzione di laminina scongelata da 1 mg/mL a temperatura ambiente o pernottamento a 4 gradi centigradi.
- Rivestire un numero adeguato di piatti da 35 mm con soluzione poli-l-ornitaria dello 0,01% (1 mL per piatto). Incubare i piatti a temperatura ambiente per almeno 1 h.
- Diluire la soluzione di laminina 1 mg/mL 1:300 in acqua sterile ad una concentrazione finale di 3,3 g/mL immediatamente prima dell'uso.
- Completamente aspirato poli-L-ornitina da ogni piatto. Sciacquare accuratamente ogni piatto 3x con acqua sterile e aspirare completamente per evitare la tossicità cellulare indotta da poli-l-ornitina.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di laminina da 3,3 g/mL a ciascun piatto e incubare a 37 gradi durante la notte o almeno 1 h. Rimuovere la soluzione di laminina dal piatto immediatamente prima dell'uso.
NOTA: In alternativa, conservare i piatti contenenti laminina in 4 gradi centigradi. Prima dell'uso, i piatti in un incubatore a coltura cellulare a 37 gradi centigradi. - Tagliare tre lati di un pozzo di un inserto a coltura in silicone a due pozzetti (Figura 1A) utilizzando una lama sterile per generare un inserto a uno ben (Figura 1B).
NOTA: Tenere saldamente fissato l'inserto a due pozzetto sulla superficie dell'imballaggio originale durante il taglio per garantire un taglio uniforme e proteggere l'adesivo dell'inserto. - Soluzione di laminina aspirata dai piatti.
NOTA: Non lavare i piatti con PBS sterile o acqua dopo l'incubazione della laminina. Le superfici umide impediranno una stretta adesione all'inserto della coltura. - Rimuovere l'inserto monocolore con una pinzetta sterile e metterlo al centro del piatto rivestito poli-l-ornina/laminin. Premere lungo i bordi dell'inserto per fissarlo alla superficie del piatto.
- Capovolgere con attenzione il piatto per verificare che l'inserto sia saldamente aderente.
- Tenere il piatto a testa in giù e contrassegnare il contorno del vano inserto utilizzando un pennarello nero permanente con una punta ultrafine (Figura 1C).
6. Analisi della migrazione a lunga distanza
- Sospendere gli interneuroni GABAergici umani ad una concentrazione di 3 x 104 cellule/70 - L di mezzo neuronale. Seme 70 - L di soluzione cellulare all'interno di ogni inserto di coltura one-well.
NOTA: La densità di seeding degli interneuroni è come da raccomandazione del produttore. - Sospendere le cellule endoteliali periventricolari umane ad una concentrazione di 3 x 104 cellule/70 -L di mezzo di cellule endoteliali periventricolari. Seme 70 - L di soluzione cellulare all'interno di ogni inserto di coltura one-well.
NOTA: Il numero di cellule endoteliali periventriculari umane seminato ad un rapporto 1:1 con il numero di neuroni semi. - Aggiungere 1 mL di mezzo neuronale nella parabola neuronale per riempire l'area intorno all'inserto ed evitare che il rivestimento si allofa. Allo stesso modo, aggiungere 1 mL di mezzo di cellule endoteliali periventricolari nella parabola di cellule endoteliali periventricolari.
NOTA: Aggiungere il supporto lentamente lungo il bordo del piatto in modo che l'inserto non sia disturbato. - Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dal vano inserto.
- Incubare le cellule per 24 h a 37 e 5% di CO2. Dopo 24 h incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule siano attaccate correttamente e che non vi sia alcuna perdita durante la notte.
- Dopo 48 h di seeding, rimuovere delicatamente l'inserto con una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare rimanga indisturbato (giorno 0).
- Rimuovere il mezzo dal piatto neuronale e aggiungere 1 mL di mezzo neuronale fresco. Allo stesso modo, rimuovere il mezzo dalla parabola di cellule endoteliali periventricolari e aggiungere 1 mL di mezzo di cellule endoteliali periventricolari fresche.
NOTA: Mettere da parte un numero richiesto di piatti e correggere con 4% PFA per le immagini del giorno 0. - Incubare le cellule per 5 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2. Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo, fissare le celle con 4% PFA per 10 min, e lavare 3x con 1x PBS.
- Neuroni macchiati con anti-umano z-Tubulino o anti-umano MAP2 anticorpo, e cellule endoteliali con anticorpo CD31 anti-umano. Alla fine dell'immunostaining, aggiungere 1 mL di supporto di montaggio antifade ad ogni piatto.
7. Analisi migrazioni di co-cultura
- Co-sospende 3 x 104 interneuroni GABAergici e 3 x 104 cellule endotiliarie periventriculari umane in 70 - L di mezzo di co-coltura (mezzo di manutenzione periventricolacolare 50% senza GABA e 50% medio neuronale). Semina questa soluzione cellulare all'interno del vano di inserto di un pozzo. Preparare un numero appropriato di tali piatti di esempio.
NOTA: GABA non è stato aggiunto nel mezzo di co-cultura per escludere l'effetto di GABA esogeno sulla migrazione. - Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dal vano inserto.
- Aggiungere lentamente 1 mL di mezzo di cocoltura lungo il lato del piatto per evitare che il rivestimento si allievi.
NOTA: Aggiungere il supporto lentamente lungo il bordo del piatto in modo che l'inserto non sia disturbato. - Come primo controllo, seme 3 x 104 interneuroni GABAergici umani solo in 70 - L di mezzo di co-cultura per inserto un-bene. Preparare un numero appropriato di tali piatti.
- Come secondo controllo, co-seme 3 x 104 interneuroni umani GABAergic con 3 x 104 controllare le cellule endoteliali umane in 70 : L di mezzo di co-coltura per un unico bene inserto. Preparare un numero adeguato di piatti.
- Incubare i piatti per 24 h a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2. Dopo 24 h incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule siano attaccate correttamente e che non vi sia perdita.
- Dopo 48 h di seeding, rimuovere delicatamente l'inserto con una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare non sia disturbato (giorno 0).
- Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di fresco mezzo di co-coltura.
NOTA: Mettere da parte un numero appropriato di piatti per l'acquisizione di immagini del giorno 0. - Incubare le cellule per 5 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.
- Dopo 5 giorni, rimuovere il mezzo, fissare le celle con 4% PFA per 10 min, e lavare 3x con 1x PBS.
- Macchie con anticorpi MAP2 anti-umani o anti-umani per etichettare i neuroni. Alla fine dell'immunostaining, aggiungere 1 mL di supporto di montaggio antifade ad ogni piatto.
8. Chemio-attrazione Assay
- Posizionare un inserto di coltura a tre ben al centro di un piatto rivestito in poli-L-ornina/laminina da 35 mm utilizzando una pinzetta sterile.
- Capovolgere il piatto. Contrassegnare il contorno intorno al vano centrale dell'inserto utilizzando un pennarello nero permanente con punta ultra fine.
- Seme 3 x 104 interneuroni GABAergici umani nel compartimento medio in 70 : L di mezzo neuronale (Figura 3A).
- Seme 104 cellule endoteliali periventriculari umane in 70 -L di mezzo di cella endoteliale periventricolari e 104 celle endoteliali di controllo in 70 : l di controllo endoteliale medio cella nei due compartimenti esterni rispettivamente (Figura 3A).
- Aggiungere 1 mL di mezzo di co-cultura (50% mezzo di manutenzione periventricolare senza GABA e 50% medio neuronale) lungo il lato del piatto per evitare che il rivestimento sul piatto si asciughi.
- Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dal vano inserto.
- Incubare le cellule per 24 h a 37 e 5% di CO2. Dopo 24 h incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule siano attaccate correttamente e che non vi sia perdita.
- Dopo 48 h di seeding, rimuovere delicatamente l'inserto con una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare non sia disturbato (giorno 0).
- Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di fresco mezzo di co-coltura.
NOTA: Mettere da parte il numero richiesto di piatti per le immagini del giorno 0. - Incubare le cellule per 36 h a 37 e 5% di CO2. Dopo 36 h, mezzo aspirato, fissare le celle con 4% PFA per 10 min, e lavare 3x con 1x PBS.
- Macchia interneuroni gabAergici umani con anti-uomo z-Tubulino o anticorpo MAP2 anti-umano. Alla fine della procedura di colorazione, aggiungere 1 mL di supporto di montaggio antifade in ogni piatto.
9. Imaging e analisi dei dati
- Collocare il pinto di analisi immuno-colorato al microscopio con ingrandimento 4X.
- Mantenere un bordo lungo del contorno rettangolare (realizzato nel passaggio 5.10 sopra) nel campo visivo. Scattare immagini di celle nello spazio senza celle adiacente a tale contorno. Acquisire immagini lungo il bordo lungo destro e il bordo lungo sinistro del contorno rettangolare (Figura 2B).
NOTA: le celle posizionate in diagonale rispetto al rettangolo non vengono considerate a causa dell'ambiguità nella selezione del bordo corto o lungo come contrassegno iniziale. Inoltre, il numero di celle che migrano attraverso il bordo corto sono spesso significativamente inferiori (probabilmente a causa del minor numero di celle iniziali lungo il bordo corto) e non vengono considerate. - Aprire le immagini in ImageJ. Calcolare la distanza tra ogni cella e il segno dicontorno( Figura 2D) utilizzando ImageJ.
- Per valutare la migrazione in termini di numeri di cella, impostare una distanza specifica dal contorno nell'immagine acquisita in ImageJ. Contare il numero di celle presenti entro questa distanza. Calcola il numero medio, la deviazione standard e la significatività statistica utilizzando un software appropriato.
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Representative Results
I passaggi per impostare un inserto di coltura a un solo pozzo all'interno di un piatto da 35 mm sono illustrati nella Figura 1. L'analisi della migrazione a lunga distanza e il test sulla migrazione co-culturale hanno utilizzato un inserto monogrado per sedare il numero desiderato di cellule al centro di un piatto rivestito di poli-L-ornina/laminina 35 mm. Il giorno 0, le celle erano presenti come patch rettangolare (Figura 2A,C). Nelle immagini del giorno 0, la linea del giorno 0 potrebbe essere facilmente identificata dal bordo appuntito del livello della cella (linea tratteggiata bianca nella Figura 2C). A 48 h, le celle erano migrate nello spazio libero dalle celle (Figura 2B,D). Nelle immagini del giorno 0, il bordo nero disegnato intorno all'inserto (nella parte posteriore del piatto) potrebbe essere chiaramente osservato come una fessura nera. Il bordo dello spazio è stato assegnato come la linea del giorno 0 (linea tratteggiata bianca nella figura 2D). Come accennato nel passaggio 9.2, solo le celle che cadevano nell'area adiacente ai bordi lunghi destro e sinistro del livello della cella (area gialla nella figura 2B) sono state considerate per l'analisi dei dati. La distanza percorsa da una cella è stata misurata calcolando la distanza tra la cella (freccia bianca nella figura 2D) e la linea del giorno 0. La colorazione immunocitochimica con anticorpo caspase 3 anti-attivo, un marcatore di apoptosi, non ha mostrato alcun segnale apoptotico nelle cellule semi (Figura 2E). Nel saggio di migrazione co-culturale, quando gli interneuroni erano co-seminati con cellule endoteliali periventriculari umane, i neuroni viaggiavano più lontano rispetto a quando gli interneuroni erano seminati da soli o quando co-semiati con cellule endoteliali di controllo (Figura 2F). Inoltre, per lo stesso intervallo di distanza, un numero maggiore di interneuroni è migrato quando co-seme con cellule endoteliali periventricolari rispetto agli interneuroni negli altri due gruppi. Questo dimostra che, come le cellule endoteliali periventricolari del topo, le cellule endoteliali periventriculari umane promuovono la migrazione degli interneuroni umani.
Nel saggio chemio-attrazione, utilizzando inserti di tre-bene cultura, gli interneuroni umani sono stati seminati come una piccola patch rettangolare in un piatto di coltura rivestito poli-L-ornina /laminina da 35 mm. Le cellule endoteliali periventricolari e le cellule endoteliali di controllo sono state seminate come patch su entrambi i lati della patch neuronale, con il divario tra ogni patch di 500 m (Figura 3A). Il numero di interneuroni che sono migrati verso cellule endoteliali periventricolari rispetto alle cellule endoteliali di controllo è stato quantificato dopo 36 h. Un numero significativamente più elevato di interneuroni è migrato verso cellule endoteliali periventricolari rispetto alle cellule endoteliali di controllo (Figura 3B,C), confermando che gli interneuroni GABAergici rispondono in modo selettivo a segnali chemio-attraenti secreti dalle cellule endoteliali periventricolari umane.
Figura 1: Preparazione dell'inserimento delle impostazioni cultura. (A) Un inserto di coltura a due bengeti. (B) Un inserto monocolore fissato al centro di un piatto di 35 mm. (C) Il contorno della patch rettangolare come osservato dopo la rimozione dell'inserto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema e risultato rappresentativo del analisi della migrazione. (A) Schema del livello cella (rettangolo rosso) il giorno 0. (B) Schema delle celle che migrano nello spazio libero dalle celle. I punti rossi indicano le celle di migrazione. L'area gialla contrassegna l'area di immagine per l'acquisizione dei dati. La casella tratteggiata in A e B corrisponde all'area visualizzata nei pannelli C e D. (C,D) Immagini fluorescenti rappresentative degli anticorpi anti-tubulina etichettati interneuroni il giorno 0 (C) e il giorno 2 (D) del saggio di migrazione. La linea tratteggiata bianca indica il giorno 0. La linea gialla in D indica la distanza percorsa da una cella (contrassegnata da una freccia bianca) in 48 h. (E) I neuroni (giorno 0) sono co-etichettati con anticorpi anti-Tubulina (rosso) e anticorpi caspasi 3 (verdi) che segnano le cellule apoptotiche. I nuclei sono macchiati di DAPI (blu). Le cellule apoptotiche non sono state rilevate nelle cellule semi. (F) Grafico del quinto giorno del saggio di cocultura, in cui il numero di interneuroni migrati è tracciato rispetto alla distanza percorsa. In confronto agli interneuroni che sono stati seminati da soli o co-semi stati con cellule endoteliali di controllo, gli interneuroni co-seminato con cellule endoteliali periventricolari migrano in numero maggiore, e hanno anche viaggiato più lontano. I dati rappresentano la media : S.D (n : 5 ; ,p<0.01, p<0.001, test t di Student). Barre di scala : 100 m. IN - interneuroni; PV EC - cellule endoteliali periventricolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Saggio di chemio-attrazione. (A) Schema del saggio chemio-attrazione. Utilizzando un inserto a tre colture, gli interneuroni (IN) sono stati seminati al centro (rettangolo punteggiato verde), mentre le cellule endoteliali periventricolari (PV EC; rettangolo punteggiato arancione) e le cellule endoteliali di controllo (EC; rettangolo giallo punteggiato) sono state seminate su entrambi i lati. (B) Immagini di interneuroni etichettati con z-Tubulina che mostrano una forte migrazione verso le cellule endoteliali periventricolari, ma non verso le cellule endoteliche di controllo. (C) Quantificazione della risposta chemio-attraente degli interneuroni. Un numero significativamente più elevato di neuroni è migrato verso le cellule endoteliali periventricolari piuttosto che verso le cellule endoteliali di controllo. I dati rappresentano la media : S.D (n : 5;p < 0,05, test t di Student). Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Un | Vantaggi | Limitazioni |
| Boyden camera assay16,17 | · Tecnicamente non impegnativo · Adatto per cellule aderenti e non aderenti · Può essere modificato per studiare l'effetto della segnalazione paracrina o della chemio-attraente sulla migrazione cellulare |
· Asdetto endpoint. Non adatto per l'imaging in tempo reale. · Non adatto per lo studio dell'effetto dell'interazione diretta cellula-cellula sulla migrazione |
| Ansaggiograffio 18 | · Endpoint o cinetica · Tecnicamente non impegnativo |
· Secondo dice la lunghezza della migrazione di poche centinaia di micrometri. Non adatto per lo studio della migrazione a lunga distanza nell'intervallo di 1-2 cm. · Non adatto per le celle di sospensione · Variazioni nell'area scratch |
| Analisi della migrazione a lunga distanza | · Punto finale o cinetica · Permette lo studio della migrazione a lunga distanza tra 1,5 e 2 cm · Tecnicamente non impegnativo |
· Non adatto per le celle di sospensione |
| Analisi della migrazione co-culturale | · Punto finale o cinetica · Permette di studiare l'effetto del contatto diretto cella-cellula sulla migrazione · Consente una lunghezza di migrazione fino a 1,5-2 cm · Tecnicamente non impegnativo |
· Non adatto per le celle di sospensione |
| B | Vantaggi | Limitazioni |
| Boyden chamber assay | · Tecnicamente non impegnativo · Adatto per cellule aderenti e non aderenti |
· Asdetto endpoint. Non adatto per l'imaging dal vivo. · Gradiente di concentrazione ripida |
| Assay sotto-agarose19 | · Tecnicamente non impegnativo · Due o più segnali chemio-attraenti possono essere |
· Non adatto per cellule aderenti. Limitato principalmente alle cellule del sangue. · Difficile visualizzazione delle cellule in agarose |
| Analisi della migrazione della camera capillare20,21 | · Endpoint o cinetica · Adatto per cellule aderenti o sospese |
· Ha bisogno di camere speciali |
| Dispositivo microfluidico22 | · Genera un gradiente di concentrazione controllabile e stabile · Consente la risoluzione a livello di cella singola |
· Ha bisogno di dispositivi e strumenti sofisticati · Curva di apprendimento tecnicamente impegnativa e ripida · Immagini complesse e analisi dei dati |
| Saggio di chemio-attrazione | · Punto finale o cinetica · Sfumatura di concentrazione graduale · Adatto per immagini in tempo reale o fluorescenti · Tecnicamente non impegnativo |
· Non adatto per le celle di sospensione |
Tabella 1: Confronto dei metodi di prova. (A) Confronto dei comuni analisi della migrazione in vitro con il saggio sulla migrazione a lunga distanza e il saggio di cocultura. (B) Confronto dei comuni saggi di chemiotassiconsi con il saggio chemio-attrazione.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto tre saggi in vitro che insieme forniscono una valutazione quantitativa delle proprietà endoteliali periventriculari umane. Questi saggi saranno preziosi per ottenere intuizioni meccanicistiche sull'interazione delle cellule endoteliali periventriculari umane con gli interneuroni umani. Gli esperimenti che utilizzano ligandi, inibitori o cellule con knockdown o sovraespressione specifici del gene identificheranno o convalideranno i giocatori molecolari che mediano la migrazione di interneuroni guidati dalle cellule endoteliali o le proprietà migratorie a lunga distanza delle cellule endoteliali periventricolari. Questi saggi possono anche essere modificati per eseguire studi di migrazione time-lapse live-cell. Inoltre, ci sono prove per l'interazione delle cellule endoteliali con cellule diverse dagli interneuroni. Studi del nostro gruppo e di altri hanno alluso all'influenza delle cellule endoteliali periventricolari sul patterning dei neuroni di proiezione e sulla proliferazione delle cellule precursori neurali5,14,15. Sarebbe interessante testare queste possibili interazioni utilizzando le nostre impostazioni di saggio. Infine, questi saggi serviranno da piattaforma per la valutazione delle cellule endoteliali periventricolari malate. Il nostro lavoro ha stabilito nuovi legami autonomi tra la rete vascolare periventricolare e l'origine di disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia, l'epilessia, l'autismo e la depressione maggiore3,5. Questi saggi saranno preziosi nell'identificare potenziali difetti nella migrazione a lunga distanza, nella chemio-attrazione o nella segnalazione della juxtracrina delle cellule endoteliali malattie-periventricolari in queste condizioni di disturbo neuropsichiatrico.
Questi saggi sono semplici, riproducibili e a basso costo, e possono essere modificati per misurare la migrazione cellulare e gli effetti della co-coltura o dei segnali chemio-attraenti sulla migrazione in vari tipi di cellule, ad eccezione delle cellule non aderenti. Ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguiti per ottenere risultati accurati e riproducibili. In primo luogo, è fondamentale per ottimizzare il numero di cella di seeding per ogni saggio. Il numero di cellule da semare in un singolo compartimento dovrebbe dipendere dal tipo di cellula, dal livello di confluenza desiderato e da fattori specifici dell'assaggio come il rapporto co-cultura. In secondo luogo, è necessario ottimizzare il mezzo di coltura cellulare per ogni saggio. Nell'analisi della migrazione co-culturale e nell'analisi chemio-attrazione, in cui più di un tipo di cellula è seminato in un unico piatto, il mezzo di analisi dovrebbe essere favorevole a tutti i tipi di cellule. Negli esperimenti pilota, abbiamo esaminato l'effetto del mezzo di co-cultura sulla vitalità (utilizzando il metodo di esclusione blu trypan) e la morfologia (utilizzando l'immunocitochimica) di ogni tipo di cellula. Abbiamo coltivato neuroni gabAergici umani con mezzo di co-cultura per una settimana e osservato alcuna differenza significativa in vitalità e morfologia dei neuroni nel mezzo di co-cultura rispetto ai neuroni coltivati nel mezzo neuronale. In modo simile, le cellule endoteliali periventricolari e le cellule endoteliali di controllo, coltivate nel mezzo di co-coltura per due passaggi, non hanno mostrato alcuna variazione significativa nella sopravvivenza cellulare e nella morfologia. In terzo luogo, poiché il tasso di migrazione varia tra i diversi tipi di cellule, è importante determinare l'intervallo di tempo per ogni saggio per i tipi di cellule in fase di studio. In quarto luogo, è fondamentale gestire con attenzione gli inserti di coltura. Gli inserti devono essere fissati saldamente sul piatto premendo delicatamente con la punta delle dita. Il piatto deve essere capovolto per verificare che l'inserto non si muova. Prestare attenzione anche durante la rimozione dell'inserto in modo da non disturbare lo strato della cellula. Infine, si raccomanda di aumentare le dimensioni del campione per ridurre la variabilità sperimentale.
In conclusione, questi saggi espanderanno significativamente la nostra comprensione della biologia endoteliale periventricolaria umana e il suo ruolo sullo sviluppo del cervello in condizioni normali e malate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da premi dal National Institute of Mental Health (R01MH110438) e dall'Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus (R01NS100808) ad AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
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