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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/60296
Automatic Translation
*1,4, *1, 1, 2, 1, 1, 1,4, 3, 3, 3, 5, 2,6, 7, 5, 8, 1,2,3
1Department of Neurology and Neuropathology, Golgi-Cenci Foundation, 2Laboratory of Neurobiology and Neurogenetic, Golgi-Cenci Foundation, 3Department of Neuropsychology and Social Sciences, Golgi-Cenci Foundation, 4Department of Rehabilitation, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 5Genomic and Post-Genomic Center, IRCCS Mondino Foundation, 6Department of Brain and Behavioral Sciences, University of Pavia, 7Department of Pathology, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 8Department of Neurological Science, IRCCS Mondino Foundation, University of Pavia
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルは、脳の寄付プログラムと脳の適切な特性を通じて個々の脳老化軌道を追跡する方法を記述する。脳のドナーは、連続多次元評価を含む長期的な縦断的研究に関与しています。プロトコルは、脳処理の詳細な説明と正確な診断方法論が含まれています。

Abstract

絶え間なく高齢化が進む中で、神経変性疾患の罹患率は上昇すると予想される。病気のメカニズムを理解することは、予防的および治癒的な手段を見つけるための鍵です。これを達成するための最も効果的な方法は、病気と健康な脳組織の直接検査を通じて.著者らは、前死的な脳の寄付プログラムに登録された個人によって寄付された良質の脳組織を取得、処理、特徴付け、保存するためのプロトコルを提示する。寄付プログラムには、人々に対する対面共感的なアプローチ、補完的な臨床、生物学的、社会的、ライフスタイル情報のコレクション、および正常な老化と認知機能の低下の個々の軌道を追跡するための時間の経過とともに連続的な多次元評価が含まれています。多くの神経疾患は非対称であるため、私たちの脳バンクは新鮮な標本をスライスするためのユニークなプロトコルを提供しています。両半球の脳の部分は、交互に凍結される (-80 °C) またはホルマリンで固定;一方の半球の固定スライスは、もう一方の半球の凍結スライスに対応します。このアプローチにより、全ての凍結物質の完全な組織学的特徴を得ることができ、オミクス研究は両半球の組織学的に明確に定義された組織に対して行われ、神経変性疾患メカニズムのより完全な評価を提供する。これらの疾患の正しい、明確な診断は、臨床症候群と神経病理学的評価を組み合わせることによってのみ達成され、しばしば病因を解釈するために必要な重要な病因的手がかりを追加する。この方法は、限られた地理的領域のみをカバーするため、時間がかかり、コストがかかり、制限される可能性があります。その制限に関係なく、それが提供する高度な特性評価はやりがいがあります。私たちの究極の目標は、神経病理学的に検証された疫学研究の重要性を強調しながら、最初のイタリア脳銀行を設立することです。

Introduction

WHOによると、現在約5,000万人が認知症に苦しんでいますが、2050年までに3倍に増加すると予測されています。アルツハイマー病は認知症の主な原因であり、続いて脳血管疾患および他の老化性疾患が続く。2017年、WHOは、認知症に対する意識を高め、それに対する世界的な行動計画を奨励するために、グローバル認知症観測所を開発しました。各個人は、独自の脳老化軌道を持っているので、治療の検索は、神経変性疾患の病因の複雑さのために困難な場合があります。おそらく、各人は、パーソナライズされたアプローチを必要とする脳組織に書かれた彼女または彼自身の病因を所有しています。このように、脳組織の研究は、神経変性のメカニズムを理解するための鍵となります。

神経科学の歴史を振り返ってみると、人間の脳を直接調べなければ、最も印象的で画期的な発見は決して起こりにくいというのが分かります。時間を通じて、研究される脳組織の源は、粗い切離、ランダムな「偶然の出会い」、そして場合によっては違法な取引から、組織化された脳コレクションと戦略的な現代の脳バンクに変わりました。多くの倫理的側面の検討は、現代の脳バンクと過去の脳コレクションを区別する主な要因の1つです。最初の本物の近代的なブレインバンク(B)は、20世紀後半に設立されました。ニコラス・コルセリスとウォレス・トゥルテロットは、現代のブレインバンキングのパイオニアと考えることができます。英国では、コルセリスは、様々な精神および神経疾患に影響を受けた1000以上の十分に文書化された脳を保持するコレクションを組み立てました2.さらに、コルセリスは生化学的検査のために氷の中に新鮮な脳組織を保存する必要性を明らかにするのに役立ちました3.一方、米国では、ウォレス・トゥルテロッテは、潜在的な脳ドナーの勧誘を容易にし、収集された脳が完全な医学的および神経学的歴史44、5を伴うことを確実にするために、前死的な脳の寄付プログラムを導入しました。脳コレクションと現代のBBの歴史的概要については、カルロスらを参照してください。6.

では、なぜ私たちはまだ人間の脳を必要としているのでしょうか?脳疾患は、神経病理学的検査の後に明確な診断を与えることができる。神経病理学は臨床診断に挑戦し、臨床症状の正しい解釈および新しいシンドロミック変異体の組織学的基盤の発見への鍵である。確かに、診断は病理学的な画像に基づいて再定義することができる。それにもかかわらず、最近の革新的な神経イメージング技術の開発により、検死率は過去数十年間で低下している。脳イメージングを通じて、脳内の形態学的、機能的および代謝的変化、ならびにタンパク質の誤折の程度を、in vivoで評価することができる。しかし、生体内の神経イメージングやその他のバイオマーカー研究は、微妙な細胞および分子変化を検出することができないため、病理学的画像の「推定値」しか与えることができない。分子イメージングの進歩と新しいバイオマーカー、標的分子、トレーサー7(アミロイド、TAU、ミクログリアトレーサー)の発見は、臨床評価およびバイオマーカー検査から得られたデータの解釈に人間の脳をさらに不可欠なものにします。また、オミクス技術(ゲノミクス、エピゲノム、および 転写学、メタボロミクス、プロテオミクス、リピドミクスなど)は、疾患メカニズムを理解し、リスク遺伝子を発見するための新たな可能性を開き、新しい診断および予後マーカー、および潜在的な薬物標的,,,,23,,,88、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、202、12,13,14,15,16,17,1821,2219,2091011

これらの目的のために、現代のBは、科学界33、2424のためにそれらを利用できるように、よく特徴付け、高品質の脳組織をアーカイブします。Bによって供給される脳は、完全な臨床歴を伴うべきである。BBの活動には、以下が含まれます: (1) 脳の寄付プログラムに病気や健康な個人の認識と募集;理想的な条件は、完全な臨床、ライフスタイル、社会史、およびバイオマーカープロファイルを得るために生涯を通じてドナーの多分野フォローアップを達成することです。実際、認知予備と脳の構造は、ライフスタイルと社会教育因子25、26に依存するので、26これらの情報は、手元の総データを豊かにします。(2) ドナーの終焉に続く脳(大脳、小脳および脳幹からなる)および関連組織(例えば、脊髄、脳神経および神経節など)の取得は、標準化された法的および倫理的規制を遵守しながらすべて。(3)脳の適切な処理(解剖、固定、凍結)は、標準化された手術プロトコルで定義されるように、高品質の組織を得て、将来の研究での使用を可能にする。(4) 詳細な神経病理学的特徴付けにより、最終的な確定診断を提供する。(5) 研究コミュニティへの組織材料の貯蔵と流通27,,28.

すべてのBは、凍結およびホルマリン固定パラフィン埋め込み組織の両方を保存します。各 BB には独自のプロトコルがあります。生物医学研究所(ニュージャージー州)29のビヘミスフェリック切断プロトコルやデラメクールの脳血管病理30の研究など、特定の研究を除いて、世界最大のBは、単に中間線(サジタル平面)に沿って大脳、小脳、脳幹を切断します。半分は新鮮に解剖され、生化学的研究のために凍結され、もう一方は組織病理学的評価のためにホルマリンに固定される。したがって、生化学的および病理的な解析は、各半球で別々に行われます。どちら側が固定または凍結(側面)に関する決定は、特異バンク31、32、33、34、35に依存します。31,32,33,34,35多くの神経疾患は非対称的であるように、私たちのBBは新鮮な脳をスライスするためのユニークなプロトコルを提供しています:脳幹と各半球の隣接するセクションは交互に固定され、凍結されています。一方の半球の固定スライスは、もう一方の半球の凍結スライスに対応します。この方法により、脳組織の使用が最適化され、すべての凍結物質の完全な組織学的特徴付けが両半球のすべての領域から組織学的および生化学的情報を得て比較する可能性を得ることができる。

私たちの脳銀行プロジェクトのフレームは、アッビアテグラッソの町です。アッビアテグラッソは、イタリア北部のミラノ市の南西約22kmの小さな町です。人口は約32,600人です。ゴルジ・チェンチ財団(GC)の本拠地です。GC財団は大規模なリハビリテーション老人病院(ASPゴルジ・レダエリ)の一部であり、高齢者の老化とケアに関する研究に焦点を当てた研究所です。特に、精神老化、それに影響を与える社会的および行動的要因、および年齢依存性神経認知障害(NCD)の基礎となる生物学および病理学を研究することに焦点を当てています。2009年、GC財団は1321人の参加者(対象科目1644人中:初期回答率80.3%)を含む新しい縦断研究を開始しました。1935年から1939年(70歳から75歳)の間に生まれ、白人民族の同じ地理的地域に住んでいます。この研究はInveCe.Ab(インベ・チアメント・セ・レブレルアブ・ビアテグラッソ;英語:脳老化アッビアテグラッソ、ClinicalTrials.gov、NCT01345110)と呼ばれ、現在進行中です。InveCe.Abは、行動、心理社会的、臨床的および生物学的変数36を含むその可能なリスクまたは保護要因とともに、認知症の発生率、有病率および自然史を評価するために、最大均質性および最も変動性の低いコホートを得ることを計画している。コホートの特性を図 1および表 1に示します。疫学的データは、欧州の人口37、38および38InveCe.Abの参加者の認知症傾向と一致しており、正常な老化から神経認知障害までの軌道を研究するための良好なモデルを表す均質な遺伝的および環境的特徴を有する。実際、均質な集団は、適切な統計的力に達するためにより少ない被験者を必要とする。InveCe.Abの方法論は、すでに他の36の他の場所で報告されていますが、血液サンプリング(代謝パネル、代謝パネル、)を含む同じ評価セットを使用して、定期的なチェック(2〜3年ごと)を通じて多次元アプローチに下線を引くことを重要です。 ホモシステインおよびビタミン、アポリポタンパク質E(APOE)および認知および老化に関連する他の遺伝的多型をプロファイリングするためのDNA抽出、人為的測定(体重、身長および腰)、ウォーキングテスト(デュアルタスクテスト)、ライフスタイルを評価するためのインタビュー(地中海ダイエット、身体活動および認知関与のレベル)および社会的要因(社会的関与、孤独)、神経学的評価および一般的な臨床検査このような縦方向のデータを死後の神経病理学的データと比較することは、研究にとって非常に重要であろう。そこで、私たちのチーム、特にミケラ・マンジェリ博士は、上記の神経病理学的アプローチを考え出しました。2014年以来、2回目のフォローアップの間に、InveCe.Ab参加者は彼らの脳を寄付するように求められたので、アッビアテグラッソ脳銀行(ABB)の誕生をもたらしました。ABBのコアドナーはInveCe.Ab参加者ですが、ABBは現在他のボランティアドナーに開放されています。彼らは、異なる神経疾患に苦しむ数人の患者やABBプロジェクトについて学び、同じ地理的領域(アッビアテグラッソとその周辺)に属する成人ボランティアが住むASPゴルジ・レダエリの患者です。すべてのドナーは同じ評価プロトコルを受ける。

著者らは、正常な老化の個々の軌跡とNCDへの進行の可能性を追跡し、そのようなドナーから得られた脳を正確に管理、処理、特徴付ける方法を提案する。また、脳の幸福に関する定期的な神経学的評価、セミナー、教育活動に参加し、研究目的で脳の寄付意識を高めることを目的としています。

Protocol

当社の機関の人間研究倫理委員会とBNE行動規範に沿って、ABBは倫理基準39、40,40に従って活動を行います。脳の収穫手順は、InveCe.Ab研究36の文脈でパビア大学の倫理委員会に提出され、承認されました。研究手続きは、1964年のヘルシンキ宣言と以下の改正に概説された原則に従った。同意書は完全かつ容易に理解できる。寄付プログラムへの参加は個人的な決定であり、完全な意識が必要です。同意書に署名する能力がないと判断された場合、法定後見人または近親者(NOK)からの承認が保証されます。表 2 は、脳の寄付に関する包含および除外基準を示しています。研究は、フェデラツィオーンアルツハイマーイタリアの監督の下で行われました.

1. 脳寄贈プログラムへの採用

  1. 脳の寄付に関心を示した被験者とそのNOKおよび/または法的保護者を招集し、プロジェクト(寄付プログラムの範囲、脳の除去、保全、使用および配布のプロセス)、任意の時点でプログラムから撤退する権利、匿名性の保護、およびフォローアップ戦略を提示します。追加のバイオマーカー調査と遺伝子検査の可能性について議論する。潜在的なドナーまたは彼のNOKが結果について知らされることを望んでいることに注意してください。
  2. 財団とドナーの両方の金銭的利益の欠如を含むすべての経済的側面を説明する(脳は利他的に寄付され、配布される)。家族は葬儀、埋葬または火葬のものをカバーしながら、ABBは体の輸送の費用をカバーしていることを彼らに知らせます。
  3. 受け入れた場合は、寄付プログラムへの参加に同意の署名を得ます。匿名性を保証するために、寄付者に個別の数値コードを与えます。縦断研究に参加している人の識別番号を書き留め、脳バンクがドナーの2つのサブグループを簡単に分離するための別のコードを提供する(参加者または非参加者は縦方向研究の参加者; 表3を参照)。
  4. 寄付者としての地位を宣言し、彼の死をブレインバンクに通知するために電話番号(利用可能な24時間365日利用可能)を表示する身分証明書を寄付者に渡します。

2. ドナー評価と連続フォローアップ

注:以下の試験の一部に対してのみ同意を与えることができ、すべてではありません。すべての臨床評価は、神経科医、神経学の専門知識を持つ老人科医、3人の心理学者を含む同じチームによって行われます。新しい症状が発症したり、認知機能の低下が進行した場合、フォローアップの間隔を短くすることができます。

  1. InveCe.Ab研究の場合と同様に、自律性の程度(ADL、IADL)、個人的な習慣、社会的およびライフスタイルの要因を含むライフスタイル社会アンケートを取得します。遺伝的、感染性、毒性、代謝、自己免疫、心血管、外傷性、変性、腫瘍性、および神経疾患に関する情報を持つ家族、医療および神経学的な歴史を収集します。以前の臨床検査を収集し、薬理学的治療をリストします。
  2. 脳神経機能、眼道眼炎、視野、筋力と緊張、感性、腱反射、四肢および原始的な反射、髄膜炎、姿勢、歩行、動き、協調、スフィンクテクデリック機能、および焦点またはバビンスキー徴候の存在を含む広範な神経運動評価を行う。言語、精神状態、行動の変化を評価する。
  3. グローバル認知と特定の認知領域の完全な神経心理学的評価を含む広範な神経認知評価を行う:言語および視覚記憶、注意、精神運動速度、言語、意味記憶、執行機能、および視空間能力(詳細については表4)。 うつ病(CES-Dスケール)の存在を考えてみましょう。
  4. 血液化学分析(表5)とDNA、血漿および末梢血単核細胞(PBMC)の分離と保存の両方に使用される血液サンプルを取得します。APOEジェノタイピング(rs429358およびrs7412)を決定する(より広範な遺伝的プロファイリングがInveCe.Ab参加者で決定された; 表6を参照)。ECG(心臓変動、心房細動)および安静状態の脳波を定量分析(QEEG)に登録します。
  5. 脳脊髄液(CSF)TAU、ホスホタウおよびβ-アミロイド、および脳イメージング(生体内変性、虚血または炎症を検出するMRI)を含む任意のバイオマーカー検査を検討してください。FDG-PET代謝障害を検出する;PIB-PETは、アルツハイマー病の病態生理に関連する脳アミロイドーシスを検出する。
  6. 脳のドナーのその後の検診プログラムを計画します。異なる年齢層に応じて時間間隔を設定する(10歳ごと、65~74歳:3年ごと、75歳以上:2年ごと)
  7. DSM-Vに従って臨床診断および/または神経認知診断を割り当てる。臨床認知症評価(CDR)スコアで臨床認知症ステージングを分類します。死亡前の最後の期間に CDR を更新します。
  8. 紙に似たデータベースをグラフィカルに準備します。収集したすべてのデータをブレインバンクデータベースに挿入します。間違いをチェックするために別の事務員による改訂を計画します。

3. 死亡時と脳の除去

注:イタリアの法律は、死を確認するために収縮期が20分以上続かなければならないことを確立しています。少なくとも20分間のフラット心電図(ECG)の登録(タナトグラフィーと名付けられた)により、死亡24時間以内に解剖を行うことができる(DPR 285/90アート8及び1993年12月29日法)。<24時間の死後の時間は、全体的な組織の質を維持するための良いターゲットです。死後の時間が30時間の場合、解剖はキャンセルされます( 表2を参照)。検死チームは、病理学者、神経生物学者および/または神経生物学者、看護師、解剖室技術者および研修生で構成されています。最初の2人のチームメンバーはまた、神経病理学的診断を行います。死体の取り扱いおよび解剖の間に、適切な衣類(コート、手袋、眼鏡およびヘアネット)の使用が必須である。本セクションでは、当研究室で通常使用されている主な工具や装置について説明します。読者は、自分の裁量で使用する楽器を選択することができます。ここで利用される材料の詳細な説明については、 資料表を参照してください。

  1. 家族が選んだ葬儀代理店がABB施設に遺体を持ち込むようにしてください。心臓活動が欠けている必要がある間に、タナトグラフィーを行う。もしそうなら、死亡証明書に署名し、検死手続きを開始します。
  2. 死体を検死室に運ぶ。頭の最も広い部分のレベルで頭蓋骨の円周を測定します。鼻からイニオンまでの測定で後部の直径(APD)を得るが、一方の耳から他方の耳までの距離は横直径(TD)を生じる。式を使用して頭蓋指数(CI)を計算します: CI = TD/APD x 100.
  3. 鋭いメスを使用して、一方の側の乳突起プロセスの先端から他方に、頂点の上を通過する、コロナ平面上の頭皮切開を行います。髪、皮膚、皮下組織を切り取り、頭皮の2つの折り目を頭蓋骨の下から慎重に分離します。黄色の眼窩上脂肪が見えるまで切開を行い、頭皮を前に反射させます。他の部分を後で引っ張ります。
  4. メスと鉗子を使用して、側側側側側側の側頭筋の小さなサンプルを採取し、1つを4%ホルムアルデヒドに入れ、もう一方を凍結する(セクション7参照)。
  5. 正面側のVカットに続く電気鋸を使用して頭蓋骨を切ります。頭蓋骨を取り除き、髄を切ります。硬膜のサンプル片は、いずれも4%ホルムアルデヒドに固定され、凍結している(セクション7参照)。
  6. コーパス梁を通して20G3.5イン針を挿入して、第3心室に到達することにより、約10mLのCSFを得る。CSFの外観、色、濁度を評価し、pHを測定します。次に、それぞれ約1mLの10個のアリコートを作り、-80°Cで保管します。
  7. 頭前葉の両方を繊細に引っ張って脳を持ち上げ、眼圧神経、内頸動脈(ICA)、第3、第4、第5、第6頭脳神経の両方を切断する。後窩に到達するために、テトリウムをカットし、椎骨動脈と下脳神経を切断します。メスを可能な限り深く奥数に挿入し、髄質の最も大きな部分を切断します。この時点で、脳全体を穏やかに取り除きます。
  8. メスで、メッケルの洞窟の上に骨を突き刺し、両側からガッセリアン神経節を得る。1つのガングリオンを4%ホルムアルデヒドで固定し、もう一方を凍結します(セクション7を参照)。外科用マレットとノミを使用して骨のセラ・ターシカを骨折して下垂体を取り除き、4%ホルムアルデヒドに固定する。
  9. 頭蓋骨と脳全体に巨視的な変化と血管の変化がないか検査します。測定テープを使用して、横方向および後部の直径を得る脳を測定する。ウィリスの円を注意して取り出し、解剖学的に評価します(図2E)解剖学的変異体、病変または血管狭窄の存在について評価します。
  10. 凸から2〜4cm2のレプトメニンゲを1〜22個取り、20%のウシ胎児血清(FBS)、1%のペン/ストレップ、1%グルタミンおよび1%非本質的アミノ酸(以前に公表された、いくつかの修正を含む)4°Cで完全な高グルコースダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)培地に保存する。
    1. 線維芽細胞培養液を得るために、レプトメニンジュを10cmのペトリ皿に置き、リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、毎回液体を廃棄する。
    2. メスとピペットチップを使用して、レプトメニンゲを約2mmまたは3mmの小片に切り、ゼラチンを0.5%でコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに3〜4個のシードを入れ、それぞれ2mLの完全な培地に1%のアンホテリシンBを加えて充填します(培養の不妊を保証するためにバイオセーフティキャビネットで処理を行います)。
    3. プレートを37°C、5%CO2インキュ2ベーターに少なくとも1週間置き、3~4日ごとに培地を交換します。ウェルが合流の約70%にあるときに生殖不能1xトリプシンで細胞をトリプシン化する。レプトメニンゲ皮線維芽細胞をT75フラスコに入れ、完全な培地の12 mLで満たします。5日後、900 μLのFBSと100 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)でトリプシン化して保存します。
  11. 大脳、小脳、脳幹を分離して検査し、個別に体重を増やします。松葉腺を脱いで4%ホルムアルデヒドに固定します。嗅球と視神経を取り除き、側面とは無関係に各ペアの1つを固定または凍結します。大脳、小脳、脳幹を氷の中で少なくとも2~4時間氷中に保管し、組織の混乱を最小限に抑え、組織の柔らかさを軽減するために解剖の準備を整えます。
  12. 収穫後、死体に適切な注意と注意を払ってください。スーパー接着接着剤を使用して骨を取り付け直し、外科用針と非吸収性縫合糸を使用して頭皮を縫い戻します。
  13. 死体を優しく扱うことで,亡くなった人に敬意と感謝の気持ちを表す。死体は愛する人に見える開いた棺に入れられるので、顔をきれいにして剃り、髪を洗って乾かしてください。
    注: 死体の再構成は技術者によって行われます。プロトコルはここで一時停止することができます。

4. ABB解剖プロトコル

注:同じ病理学者および/または神経科医は、発煙フードの下で脳幹、小脳および大脳をスライスします。神経生物学者は、切除後にスライスを配置します。脳のセクションを扱っていない研修生は、その後の組織処理段階でガイドとして機能するためにデータベースにアップロードされる写真で全体の手順を文書化します。

  1. 解剖ナイフを使用して、 脳幹 を軸に切り、上方のコリカルを通して、鼻孔中脳のレベルで最初のカットを行い、実質的なニグラ(SN)を露出させる2つのスライスを得る。
  2. 残りのカットを行い、8mmの脳幹スライスを取得して約10個のセクションを得ます。第4心室の上部マージン付近の露孔ポンを通過して、軌跡コエリュラス(LC)を観察し、第4心室の劣ったアコースティック・ストリアの上にある延髄を通って、迷走体の側側運動核(DMNV)を含むスライスを有するように注意してください。
  3. ロストロコーダルセンスのすべてのスライスに、BS(脳幹)の後にアラビア数字を付けてセクションを識別します。最後の脳幹セクションの後に、SC(脊髄)の後に数字1-nを使用します。取り除かれる脊髄メタメアの数に応じて約2〜4個のSCスライスが得られる(図2H-I)。
  4. 固定または固定するすべてのセクションにラベルを付け、写真アーカイブの写真を撮ります (図 2)。次に、以下の手順(手順 4.7 および 4.8)に従って、すべてのスライスを固定してフリーズします。
  5. 矢状平面上の小脳を切り取り、2つの小脳半球をベルミのレベルで分離する。各半球から5つのスライスを得るために矢状の断面を行う(図2F–G)。
  6. vermis からのすべてのスライスに CBR または CBL (それぞれ右および左小脳用) の名前を付け、アラビア数字を使用してセクションを識別します。固定または固定するすべてのセクションに交互にラベルを付け、アーカイブの写真を撮ります(図2)。次に、以下に示すように、すべてのスライスを固定してフリーズします。
  7. 大 脳 の2つの半球をコーパス・カオブサム(図2A–B)で分離し、コロナ平面上で単独でスライスします。前頭葉、側頭柱、前部チングレート、前部コミュニケール、マイナートの核、大脳基底核を通って、視性気孔とマミラリー体の間を通過する平面で最初のカットを行います。
  8. 約1cmの後部に歩行し、大脳基底核、前視床、視床下部および扁桃体を露出する第2カットを行う。スライスを続けて前領域と後部領域を解剖し、1cmのスライスを取得し、各半球に対して15〜20のセクションを得る。
  9. 平らなサーフェス上にスライスを設定します。前部から後頭部まで、前のスライスを上向きに連続した部分で、前眼柱方向の元の位置に従ってそれらを置きます。
  10. 両半球の断面を比較して、固定または凍結材料として保持する各半球の代替断面を選択します。前頭葉および側頭葉、帯状葉、大脳基底核、マイナートの核基底核、扁桃体、視床、海馬および内皮質、後頭側頭回、頭頂および後頭葉を含む組織病理学のために固定され、処理される主なセクションを認識する。
  11. 後部の意味ですべてのスライスに L (左) または R (右) の後にアラビア数字の後にアラビア数字の名前を付け、スライスを固定するか、または凍結するかを示すラベルを付けます (図 2A-D)。セクションを識別するには、写真アーカイブの写真を撮ります。次に、セクション 7 と 8 で説明されているように、すべてのスライスを固定してフリーズします。

5. 脳・血管検査と巨視的病理評価(肉眼で)

  1. 髄膜変化、びまんまたは局在性皮質萎縮、海馬萎縮、心室肥大、小脳萎縮、脳幹萎縮、実質的なニグラパラー、白質の変化(種類および位置を指定)を考慮した一般的な巨視的検査を行う。
  2. アテローム性動脈硬化症と閉塞を考慮したウィリスの円を調べます。スコアを割り当てる=1は50%以上の狭窄無しのアテロームの存在下で、スコア=2は少なくとも1つの動脈が50%以上閉塞している場合、スコア=3は2以上の動脈が50%以上閉塞した場合=3である。他の頭蓋内血管における病理の有無を評価する。
  3. 毛質血管病変を検出するには、脳半球、小脳および脳幹を調べる。ラクナー病変(直径<10mm)、虚血性または出血性梗塞および出血(直径>10mm)を考慮してください。存在する場合は、ミリメートル、数、および位置でサイズを指定します。また、くも膜下出血の有無についても考える。

6. 組織の品質管理

注: アゴナルファクタースコア(AFS)は 0と2の範囲であり、組織の品質の評価に重要です。AFSを決定するには、死亡時に発生する臨床状態(特に脳アシドーシスを決定する状態)と、アゴナル状態(突然死または長期の苦しみ)の持続期間を考慮する。AFS > 1 の場合、脳組織は最適な品質の 43ではない可能性があります。また 、脳とCSF pHを考慮してください。pH < 6 の場合、脳組織は最適な品質の 43,44ではない可能性があります。

  1. 低酸素症、長引くアシドーシス、機械的換気、多臓器不全、高熱、重度の頭蓋外傷、神経毒性物質の摂取、重度の脱水症状、重度の低血糖、てんかん状態および長期昏睡を含む脳組織に損傷を与える可能性のある状態によって死亡が引き起こされたかどうかを確認する。これらの条件のいずれかが存在する場合は、1 点を割り当てます。
  2. アゴナル状態の持続期間を確認する(死が1時間以内に起こる場合は急速 に、死が1〜24時間の間に起こった場合 は中間体 、1日以上続く場合は 遅い )。中間または遅い死が起こった場合は、1ポイントを割り当てます。
  3. AFSスコアを計算し、各ローブと小脳部の脳スライス上の表面pHメーターによって電極pH針および組織pHによってCSF pHを測定する。

7. 組織凍結

  1. すべての組織を氷の中で凍結し、4°Cに保ちます。 その後、すぐにそれらを凍結します。あらかじめ冷凍されたアルミトレイに置きます。インターロックされたアルミニウム板で覆い、平らに保ちます。-120°Cの液体窒素に3分間入れます。
  2. 対応する識別コードとスライス番号がラベル付けされたビニール袋の中にスライスを入れます。ビニール袋を3つの極低温ボックス(右半球、左半球、脳幹)に分け、-80°Cで保管します。

8. 組織固定

  1. スライスをガーゼで1つずつ包み、10%リン酸緩衝ホルマリン溶液にスライスを入れます。1日後、ホルマリン溶液を新鮮な溶液に置き換えます。4°Cの冷たい部屋に5日間ほど放置してください。
  2. すべてのスライスを全体として保持し、海馬と扁桃体を含むスライスのみを2つの部分に分割します(図3)。両方のスライスの上部には前頭葉(図3のR10a-L9a)が含まれます。下の部分は、それぞれ(1)扁桃体、側頭葉および大脳基底核(図3BBのL9b)、海馬と側頭葉の一部(図3AのR10b)を含む。これは、様々な構造間の関係を維持するために作られています。
  3. すべてのセクションをリン酸バッファーに少なくとも 2 日間入れて、クロスリンク製品を洗い流して取り除きます。
    メモ: プロトコルはここで一時停止することができます。

9.脱水、クリアリング、パラフィン埋め込み、スライド準備

  1. エチルアルコール濃度を70%から100%、キシレンと2セットの溶融パラフィンワックスを調製します。脱水、クリア手順、パラフィン浸潤(マクロ(大脳と小脳スライス)とマイクロサンプル(脳幹スライスおよび他の小さなサンプル)のための2つの異なる組織処理プロトコルを使用して、脱水、クリアプロシージャとパラフィン浸潤のための自動プロセッサに脳のセクションを配置します。 表 7)。パラフィンワックスに組織を金属またはプラスチック型に埋め込みます。
  2. 神経病理学的特徴評価のための モンティンの指標を適用する関心のあるすべての領域を評価するためにスライスするセクションを選択してください(表8)。次に、選択したセクションをスライスします。
  3. マクロセクションにはスレッジミクロトーム、小セクションには回転式ミクロトームを使用します。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色用に5μmのスライスをカットし、他の染色および免疫体化学のために8μmスライスをカットします。3種類の異なる種類の組織学的スライドにスライスを置きます:最大のスライスの場合は8.5 cm x 11 cm、ミディアムスライスの場合は5 cm x 7.5 cm、最小のスライスにはクラシックな2.5 cm x 7.5 cm。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

10. 脱パラフィン法、組織染色、免疫組織化学(IHC)

  1. 脱パラフィンを行い、水性色素溶液との反応を可能にします。キシレンを使用して、アルコール濃度を減少させます(各ステップで5分)。蒸留水で5分間水分補給します。
  2. 建築および構造組織の異常を評価するために、次の組織学的染色を使用し、細胞形態:H&E(血管微小病変および炎症)、クレシルバイオレット(NISSL;神経細胞喪失)、ルクソルファストブルー(LFB;脱髄用)、ガリヤ(陰尿プラークおよび神経ピル糸用)。
  3. 特定の標的構造の存在を強調するために免疫組織化学(IHC)を使用する。抗NeuNおよび抗GFAPは、神経およびグリアコンパートメントを識別するために使用されます。4G8、AT8、α-SYNおよびTDP-43は、神経変性疾患に凝集するタンパク質を同定するために使用される(材料表)。
    1. 3%H2O2を10分間用いて2脱蝋した切片をPBSですすいだ。クエン酸緩衝液0.01 M pH6(2、1、2分間のマイクロ波)で4G8、α-SYN、TDP-43およびNeuN抗原の検索処理を行う。4G8およびα-SYNに70%のギ酸を使用してください。5%の正常なヤギの血清の30分間のプレインキュベート。
    2. 一次抗体を用いて4°Cで一晩インキュベートする。翌日、PBSの2次抗体(Envision+システムHRP標識ポリマー)でインキュベーションする前に、PBSで1:2の希釈液でPBSの切片を室温で1時間洗い上げます。
    3. PBSで数回洗浄し、顕微鏡下で反応の開発を見てジアミノベンジジン(液体DAB +基質クロモーゲンシステム)とクロモーゲン系でインキュベート(倍率4-10倍)。最後に、PBSでセクションを洗浄します。ヘマトキシリンのセクションに対抗し、脱水し、DPX取付けでカバースリップ。
      注: 表 8 は 、標準プロトコルをまとめたものです。選択したセクションで特殊/特定の汚れや反応が使用されている間、すべてのセクションでH&E染色を行います。選択したケースには、追加の領域または反応が必要です。 材料表 は、IHCに使用される抗体の詳細を示しています。

11. 基本的な神経病理学的特徴付け

注:非特異的脳組織の変化、血管病理、アルツハイマー病(AD)病理、非AD TAUopathies、結核症、タールDNA結合タンパク質(TDP-43)病理および海馬病変が検討されている。カメラに接続された光学顕微鏡を使用して、鏡状の顕微鏡病変を検出します。組織学的評価は、神経学の教授、神経科医、病理学者を含む神経病理学の訓練を受けた人員の同じチームによって行われます。これは、変更されたモンティンのアプローチ45(表8)を含む:(1)TAU堆積物に関連する前頭側頭葉変性(FTLD)の病理学的特徴を構成する異種非ADTAUopathies:ピック病、 非流暢な原発性進行性失語症(TAU-nfPPA)、進行性核上麻痺(PSP)46、4746および47コルチコ・バサル変性(CBD)48.48また、非AD TAUopathiesは、老化に関連する疾患を含み、一次加齢関連TAUopathy(PART)49、加齢関連TAUアストログリオパシー(ARTAG)50、アージロフィル性穀物疾患48など、明確な臨床的意義を有しない。4950(2)パーキンソン病(PD)およびレビー小体型認知症(LBD)に関連するレビー型シヌクレノパチー(LTS)。LTSを検索するには、次の階層ステップを適用します: 最初に、嗅球、脳幹、扁桃体/側頭皮質;前の領域が陽性である場合、辺縁系構造(海馬形成、内皮質、前帯状性)、中前頭回、下頭頂小胞および後頭側皮質45を加える。皮質LBDの臨床的特徴(すなわち、変動および/または幻覚)が存在する場合は、最初のステップのために辺縁系構造およびアイソコルテックスを検討する。(3) TDP-43沈着物、TDP-43沈着物に関連するFTLDの病理学的特徴:前頭側頭型認知症(bvFTD)、意味性認知症(SDまたはsvFTD)、TDP-nfPPAおよびFTD-運動ニューロン疾患(FTD-MND)。TDP-43のIHCは、扁桃体、海馬、内皮質および中前頭回のセクションで行われます。臨床的FTLDが疑われる場合には、他のセクション51を調べることを検討する。

  1. GFAP および NeuN の H&E、NISSL、LFB、および IHC を使用して、選択したセクションで 非特異的な脳組織の変化 を評価します。ニューロンの希ファクション、バルーンニューロン、海綿状症、神経膠腫、ミエリン喪失、炎症性または腫瘍浸潤の有無を考えてみましょう。これらの変更の一般的な場所を指定します。
  2. 顕微鏡血管病変を検出するには、少なくとも2つの半球マクロセクション(最初に前頭葉と側頭葉を持つマンミラリー体(シャルコットカット)を通過するH&EおよびLFBスライドを調べ、 大脳基底核、前視床、扁桃体、および後頭葉を通過する第2の、海馬形成の「ジェノレート」セクション、1つの小脳部、および脳幹の3つの主要セクション(立体ニグラ、イカス・コエルールスおよびDMNVを通じて)。
    1. 動脈硬化症、リポヤリン症、血管周囲の膨張、白質損失、レプトメニンゲザルおよび/または毛細血管脳アミロイド血管症を含む小さな血管疾患を検出します。グレーディング (0 – 3) と一般的な場所42、52を指定します。ヘモシジン漏れ、マイクロブリード、微小梗塞の有無を考えてみましょう。
    2. 階層デラメクールのスキーム(血管壁の変化- 小血管疾患 - 巨視梗塞)を使用して、認知障害に対する血管損傷の寄与を評価する。この評価では、前頭葉と側頭葉部、大脳基底核と海馬(スコア0〜20)30を考慮してください。30また、脳血管疾患がVCINGスコア(低中級-高)を用いて認知障害に寄与した確率を推定し、中等度から重度の動脈硬化症およびアミロイド血管症を含む後頭葉の半球巨視梗塞および小血管疾患を考慮して得られる。
  3. アミロイド広がりにIHC(4G8)を用いて AD病理 を評価する。Thal のステージ (1 – 5)54、ア マイロイドスコアリング (0 –3)45)、およびサイトごとの形態 (拡散、焦点、コレスド) を定義します。
    1. IHC(AT8)を用いてADタウ病理を評価し、部位(神経原線維のもつれ、神経毛糸、ネリティックプラーク)ごとに流行している形態を記述する。Braakのステージを定義する(I-VI +;陽性サインは、Braakの階層に従わない過リン酸化タウ病理の追加領域の存在を示す)55および集合スコアリング(0-3)45。45
    2. ガリヤス染色とCERADスコアを使用してネリティクスプラークを評価する (0-3)56.次に、Amyloid-B raak-C ERADスコアを用いてAD臨床B症候群に対応するC神経病理学的特徴の確率を定義する(ABCスコア0–3):低中級高45なし。
  4. AT8 IHCを使用して、一般的な位置および独特の形態学的画像を指定する非AD TAU病理の有無に気づく。このような炎の形や球状のもつれ、球状球状のインクルージョン(すなわち、ピックの体)57、神経糸、ジストロフィー性ニューライト、アージロフィル粒子などの神経介在物を考えてみましょう。および、例えば房状アストロサイト、いばらのアストロサイト、天体のプラーク、コイル状の体、球状包物58、59,59のようなグリアインクルージョン。
  5. 上記のノートの領域でLTS(レビーボディ、淡いボディとLewy神経突起)を検出するためにα-syn IHCを使用してください。陽性の場合、マキースのグレーディング(0-4)を適用して病変の重症度を評価する。次に、地形分布(嗅球、脳幹優勢、辺縁性優勢、新皮質)61のためにビーチのステージ(I-IV)を使用してください。ビーチとブラークのステージを比較して、LBDとAD病理60、61、6261の関係60を62定義します。
  6. 多重系萎縮症(MSA)の病的特徴であるグリア細胞質インクルージョン(GCI;非Lewy型グリア性核内症)の有無を考え、それらの流行位置63を指定する。
  7. 上記のノートの領域でTDP-43堆積物を検出するためにTDP-43 IHCを使用してください。部位ごとに流行している形態を特定する:ニューロン細胞質インクルージョン(NCI)、遠位神経突起インクルージョン(DN)、核インクルージョン(NII)。パターンを定義します: A (主要な NCI と DN: bvFTD および nfPPA)。B (優勢な NCI: FTD-MND);C (主長い DN: svPPA および bvFTD)51,,64.ネルソンのスキームを使用して、ADケース65、66,66におけるTDP-43の存在を定義します。
  8. 海馬は、海馬とソマーのセクター(CA1)から始まるを評価します。Rauramaaのスコア(0-4):マイクロ梗塞とマクロ梗塞のそれぞれ1-2を使用します。3-4それぞれ中等度および重度の神経喪失に対応し、海馬萎縮(海馬性硬化症:HS)。病理学的タンパク質沈着物の有無を指摘する(頻度の減少順:pTAU、TDP-43、α-syn)67.
  9. 神経病理学的診断を定義し、データベース内のすべての病理学的データを入力します。
    注:ドナーの生物学的材料と賢明なデータが保管されている部屋は常にロックされており、セキュリティとプライバシーの両方を保証するために、許可された人員のみが入ることを許可されています。凍結した生物材料は-80°Cのロックされたフリーザーに貯蔵され、ホルマリン固定パラフィン埋め込まれた組織は室温でロックされたクローゼットに貯蔵される。デュアルモーターフリーザーを使用し、バックアップフリーザーも存在します。さらに、冷凍庫が常に動作していることを確認するために、彼らはアラームをオフに設定する24時間365日の監視システムが提供されています。停電時には非常用発電機も設置されています。参加者は、プライバシーを確保するために数値コードで匿名化されます。承認されていない人員がドナーの身元と賢明なデータに戻ることは不可能です。すべての情報は、パスワードで保護されたデータベースに収集されます。同様に、これらのデータのハードコピーはロックされたアーカイブに保管されます。

Representative Results

脳ドナーと脳の収穫データ
2014年、ドナー募集は2回目のInveCe.Abフォローアップ中に始まり、対象となる1061人のうち1010人が参加しました(回答率:93%。 図 1)。InveCe.Ab縦断研究との関連で、参加者1010人中290人(28.7%)寄付者として登録することに合意しました(すでに登録されている160人と登録する意思を表明した130人)。教育レベルは、非ドナーよりもドナーが高く(私たちのドナーの66%は中高レベルの教育を受けています:8年以上の学校)、文化と教育の重要性を示しています。多くの「健康な」個人はまた、脳の寄付プログラムに興味を示しました。私たちの「コントロール」のほとんどは、彼らが病気とその親戚に同情することができ、神経疾患のより良い理解につながる研究に何らかの形で貢献したいと告白します。生の間に定期的に血液や骨髄の寄付プログラムに従事する無私の人々は、死後に臓器を寄付することに既に同意している人々と同様に、脳の寄付のアイデアに対してよりオープンです。彼らは、生きている受取人がいなくても、彼らの寄付は研究にとって非常に重要であるという事実を認識しています。脳の寄付に寄与するもう一つの要因は、火葬される好みです。現在、ABBドナー人口には合計427人(290人のInveCe.Ab参加者+137人のボランティアまたはASPゴルジ・レダエリ老年病院の患者)が含まれており、そのうち75%が70歳以上です。女性の明確な優位性があります (64%)精神に無傷の高齢者(約85%)。これまでに、死亡したドナー40人のうち27人の脳が収穫されている(解剖率67%)。13人の被験者は、ABBに死亡を報告しなかった、脳破壊につながる重傷、危険な感染疾患および1 CJD症例を含む様々な理由で解剖されていない。4人の被験者が同意を取り消しました。これまで、収穫された27頭の脳のうち24頭が明確な臨床病理学的診断を伴う完全な神経病理学的特徴付けを受け、残りの3つの脳はまだ検査中である(表3)。ABBからの追加の脳収穫データが含まれます: 死亡時の平均年齢 (81 歳);平均死後の間隔(10.37時間);平均 CSF pH (6.64);平均組織pH(6.07);平均脳の体重 (1012.86 gr);AFSは死亡した被験者の90%に1人であった。

神経生理学的バイオマーカー(QEEG)
QEEG は多次元アプローチの一部です。これは、軽度の神経認知障害(軽度NCDまたはMCI)から主要な神経認知障害(主要NCDまたは認知症)への変換を検出する可能性が高い、簡単で非侵襲的で安価な方法です。多次元アプローチを通じて、平易なQEEG検査が行われ、認知症のバイオマーカーとしての役割がテストされます。36人の脳ドナー(18人の正常な高齢者(NOLD)、11人の軽度NCDおよび7主要NCDの予備シリーズに関する我々のデータは、明確な神経病理学的診断を伴う9つ、軽度NCD(p:0,002)およびNOLD(p:0,033)と比較して、主要NCDで平均アルファリズム率が有意に低かっていることを示している。逆に、低速のEEG周波数(シータ/デルタ)は、NOLD/マイルドNCDよりもメジャーNCDで有意に高かった( 図4の例を参照)。脳のリズム分布は、病因診断に関係なく、NOLD/軽度のNCD被験者を主要NDC患者と区別することができ、脳のリズムは病変の種類に関係なく変性病変の負担の影響を受けていることを示唆しています。実際、9人中7人が検査を受けた脳は、混合病理による認知症を示す。病理の性質に関する特異性は低いように見え、脳の電気リズムは、その分子的性質よりも病変の負担と地形の影響を受けているように見える(Poloni,et al. AD/PD 2019年紀要、リスボン、未発表)。

象徴的なケース
ABB プロトコルは、場合によっては有用で必要な場合があります。例として、非対称病理の存在(図5)があります。私たちのプロトコルは、このタイプの病理の同定と適切な特性に非常に適しています。ここまで、非対称的な関与を持つ4つの脳を調べ、その一部を図5に示した。マクロスコープ的には、右側の萎縮(図5A)が、左側と比較して、右側の冠状部に重度の心室拡張を伴う1つのケース(図5C)に存在する(図5B)。別の症例は右半球の梗塞を示し(図5D)、もう1つは右マミラリー体の透明な萎縮を示す(図5E)。顕微鏡レベルでは、FTLDの1例は、左に比べて右前頭側でより強い非対称的なTDP-43陽性を示す(図5F,G)。

マクロセクション (図 6A,C) は、全体のビューを取得するために使用されます。LFB染色は、4G8およびAT8(図6B)の両方についてミエリン損失(図6D)およびIHCを同定するのに役立ち、肉眼で半球における免疫反応性の分布を評価することを可能にする。ABBシリーズでは、関連する個人の脳を比較することができます。

図7では、ホモ接合双生児の脳の断面の顕微鏡画像を並べて比較しやすくする(ツイン1(BB137):図7、A、C、E、G、I、K対ツイン2(BB138:図7B、F、H、J、L)。同様の以前の研究68と同様に、両方の双子を臨床および神経病理学的評価によって比較した。双子は複数の病因のために主要NCDの同じ診断を報告したが、彼らはそれぞれ83歳(72歳で認知症発症)と85歳(76歳で認知症発症)で2歳離れて死亡した。彼らの脳は非常によく似た神経病理学的画像を有し、アミロイド血管症に関連する高いAD病理を有する。4G8免疫反応性は、皮質全体に拡散する(図7A,B)と大脳基底核(図7C,D)を拡散、緻密、および熱入れプラークで有する。また、皮質と小脳の腹腔血管とレプトメニンゲ血管の両方で明らかに検出されます(図7A,B,G-J)。高倍率では、capCAAは明らかに明らかである(図7G,H)。AT8免疫陽性プラーク、もつれおよび糸は両脳の頭頂皮質に拡散する(図7E、F、L)。アミロイドおよびNFT病理負担に関しては、ツイン1はタールステージ3(モンティンA2)とブラークステージ5(モンティンB3)と見なされ、ツイン2はタールステージ5(モンティンA3)およびブラークステージ6(モンティンB3)とみなされます。彼らは同じ年の教育と同じようなライフスタイルを持っていました。しかし、一方(BB137)は結婚し、もう一方は独身(BB138)だった間すぐに未亡人になりました。彼らは、同じ開始および同じ病気の経過と同じ経過で、異なる程度の臨床病理変動を示したが、異なる時間枠で示された。これは、遺伝的成分が疾患の発症において重要な役割を果たしているが、エピジェネティックおよび環境的構成要素がわずかに異なる症状を決定する上で基本的であるという事実を裏付けている。

場合によっては、臨床像は神経病理学的特徴に対応していない。 図8では、2つの異なる症例がAD症例として臨床的に定義された。神経病理学的分析は、中間AD病理に加えて、α-synのびまん性陽性を示す。最初のケースでは、重度のLTS(Beach IV)画像は、ジリュウシンポリ(図8A)およびSN中に神経メラニンに囲まれた細胞質インクルージョンとして均質に見られるレビー体を示しています(図8B,C)。第2のケースでは、レウィ神経突起に関連するLewy体は扁桃体(図8D,E)およびマイナートの核(図8F,G)に拡散して分布し、辺縁性LTS診断を示唆している。実際、病変の地形は、その分子的性質ではなく、臨床症状を生み出す。

Figure 1
図 1: Inve.Ce.Ab スタディのフローチャートベースラインでは、認知症の全体的な有病率は3%であった。フォローアップの過程で、有病率は4.4%(1st)69、7.1%(2nd)、10.9%(3rd)でした。st69ndrd8年間の発生率は15 p/1000/年(95%CI:13-18 p/1000/年)でした。ドナー募集は2014年に開始されました(2回目のフォローアップ中)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:大脳(A)、小脳(F)および脳幹(H)の解剖プロトコル。 ウィリスと単一半球の円は、( E) および (B) に示されています。右(C)と左側(D)のコロナカットは、番号付けされ、代わりに固定(「F」)と凍結(「C」)です。矢状小脳切片(G)および脳幹軸切片(I)が示されている。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:固定右(A)および左(B)前頭葉のコロナスライスを示す。
海馬と側頭葉(A、R10b)は、右側のスライスの前頭葉(A、R10a)から分割されます。反対のスライスでは、扁桃体と大脳基底核(B、L9b)は前頭葉(B、L9a)から分けられる。スケールバー: 1.7 cm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:NOLDおよび主要NCD被験者における相対スペクトルパワー分布この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:非対称病理の代表的な画像。(A) 最初の場合: 右萎縮を伴う脳。コロナスライス(B)および(C)は、セクション10〜12(C、矢印)で特に明らかな右側心室拡張を示す。セクション (B) および (C) では、"F" は固定済み、"C" は凍結の場合を表します (イタリア語: congelato)。(D) 第2例:右半球の重度の梗塞。(E)第3例:右骨髄体(矢印)の萎縮。(F, G)第4の症例:顕微鏡画像は、前頭側頭型認知症の場合に左皮質(F)と比較して、前頭側皮質(G)におけるより強いTDP-43免疫反応性を示す。スケールバー:183 μm(F、G)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: マクロセクション(A, C)固定前頭側頭葉(A)および新鮮な頭頂葉(C)のコロナスライス。(B)AT8抗体で免疫標識された組織学的前頭側側セクション。B免疫反応性は皮質全体に明らかに分布するが、側頭葉ではより強い。(D) LFBで染色された組織学的頭頂部。矢印は、白質の脱髄の領域を示しています。スケールバー:1.55cm(B、D)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:双子。2つのホモ接合双生児の脳間の比較: BB137 (A, C, E, G, I, K) BB138 (B, D, F, H, J, L).神経病理学的な写真は非常に似ています。(A)および(B)は、アミロイドプラーク、レプトメニンゲザル(矢印)およびパレンキマル(矢印)血管を有する後頭葉の4G8陽性の拡散を示す。毛細管アミロイド血管症(アスタリスク)は、高倍率(G)および(H)でよく認識される。4G8は、大脳基底核(C、D)および小脳のレプトメニンゲザル血管(I、J:矢印)の周りにJ拡散的に分布する。AT8免疫反応性は、頭頂皮質のもつれ、糸およびプラーク(矢印)を識別する(E, F).ガリヤス染色(K)は、AT8抗体(L)のようにネリン性プラークを明らかにする。スケールバー:470 μm(A~F;I-J);90 μm (G–H;K-L)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:臨床と神経病理学の診断この図では、神経病理学的診断が臨床診断と異なる2つの異なる症例が報告されている。α-synに対する免疫反応性は、予期しない結果である。(A–C)最初の例:回のシンポリ(A)は、SN(B-矢印)でレビー体の均質な分布を示す。SNのニューロンでは、ニューロメラニンに囲まれた二重レビー体が示されている(C)。(D–G)第2のケース:α-synの拡散陽性は扁桃体(D、E)およびマイナート核(F、G)で検出可能である。細胞体とLewy神経突起(アスタリスク)は十分にマークされています。スケールバー:154 μm(A、D、F)。37 μm (B, E, G);20 μm (C)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図 9: 譲渡契約テンプレートこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

N %
性別 男性 607 45.9
女性 714 54.1
出生コホート 1935 236 17.8
1936 219 16.6
1937 264 20.0
1938 305 23.1
1939 297 22.5
婚姻状況 結婚 872 66.1
同棲 13 1.0
別居/離婚 29 2.2
未亡人 325 24.6
単一 80 6.1
プライマリライフ職業 ブルーカラー労働者 666 50.6
ホワイトカラー労働者 459 34.9
主婦 191 14.5
教育の年 ≤5年 754 57.2
>5年 565 42.8

表1:InveCe.Ab研究参加者の社会人口統計学的特徴。

包含基準 除外基準
18歳以上の全ての個人 寄付を露骨に拒否する人
アビアテグラッソの領土内に住む人々 ロンバルディア州外に住む人々
自分で同意を与えるボランティア 潜在的なドナーと脳の寄付に関するNOKの希望の間の不一致
NOKの許可で決定できない科目 脳の一貫性を大きく破壊する状況
自然の原因による死 プリオン病の可能性が排除されない限り、<2年の臨床コース
殺人や自殺による死亡、検視官の報告書の必要性
事後分析間隔 >30 時間

表2:脳の寄付の基準

N° セックス コードBB コードインベセ 年齢 エドゥ (yrs) 臨床診断 Cdr Afs PM (時間) pH組織 pH酒 神経病理学的診断
1 F BB 37 87 5 AD (BPSD) によるメジャー NCD 5 2 29 Nd Nd 高いAD病理学、中程度のSVD、TDP43+、ctx LTS、HS
2 F BB 105 94 5 ADによるメジャーNCD 5 1 5 5.72 6.78 高いAD病理学、穏やかなSVD、HS
3 F BB 137 83 3 複数の病因によるメジャー NCD (AD-VaD) 5 1 16 Nd Nd 高AD病理、中等度のSVD、後頭梗塞、CAA-capCAA
4 M BB 181 71 13 AD (BPSD) によるメジャー NCD 5 2 3 Nd Nd 重度のLTS(ビーチIV)、中間AD病理学、軽度のSVD、mCAA
5 M BB 115 I 636 78 18 ADによるメジャーNCD 5 1 6 Nd Nd 中間AD、中等度のSVD、炎症、ILBD(ビーチIIa)、HS
6 F BB 23 I 65 79 3 血管疾患による主要NCD 5 1 14 Nd Nd 重度および広範囲にわたる CAA、中間 AD 病理
7 M BB 102 I 412 79 8 血管疾患による主要NCD 3 1 8 Nd Nd 血管性認知症、ILBD
8 M BB 224 I 16 80 3 複数の病因によるメジャーNCD 5 1 11 Nd 5.99 中等度のSVD、低AD病理学、ILBD(ビーチIIa)、HS
9 F BB 47 78 5 メジャー NCD から複数の病因 (LBD-VaD BPSD) 5 0 8 Nd Nd 高いAD病理学、BGタウ病理、ARTAG、軽度のSVD、HS
10 F BB 153 I 965 79 5 軽度-NCD(広範囲転移による大腸癌による死亡) 0.5 1 8 Nd 6.73 低AD病理、中程度のBG-SVD
11 M BB 118 I 1211 79 13 NOLD (肝臓癌による死亡) 0 2 3 Nd 6.51 中程度のSVD
12 M BB 236 I 521 80 3 AD (BPSD) によるメジャー NCD 4 1 15 Nd 6.15 高AD病理、重度のBG-SVD(いくつかのマイクロブリード)、HS
13 F BB 138 85 3 複数の病因によるメジャー NCD (AD-VaD BPSD) 4 0 15 Nd 6.75 高AD病理、中等度のSVD、CAA、辺縁性TDP43
14 M BB 109 I 876 79 8 NOLD (脳腫瘍による死亡 - GBL) 0 1 16 Nd 6.4 低AD病理、ILBD(ビーチIIa)、軽度のSVD
15 F BB 271 84 8 AD (BPSD) によるメジャー NCD 4 1 2 Nd 6.7 中間AD、辺縁性LTS、中程度のBG-SVD、mCAA、TDP
16 F BB 71 I 1080 79 8 NOLD (心不全による死亡) 0 0 6 Nd 6.26 中程度のBG-SVD、ILBD、エイミーTDP、低AD
17 F BB 189 I 858 80 5 AD (BPSD) によるメジャー NCD 3 0 20 Nd 6.42 中間 AD, CAA-capCAA, TDP43, 中程度の BG-SVD, HS
18 F BB 278 I 924 80 5 LBD (BPSD) によるメジャー NCD 3 1 5 6.02 7.05 中間AD、辺縁性LTS(ビーチIV)、辺縁性TDP、HS
19 F BB 247 104 8 複数の病因によるメジャー-NCD(おそらく混合病理) 3 0 6 6.48 7.22 タウ病理(パートアルタグ)、HS
20 M BB 85 I 19 83 10 LBD (BPSD) によるメジャー NCD 3 1 9 6.26 7.3 重度の辺縁性LTS、中間AD、中等度のSVD、重度のCAA-capCAA、HS
21 F BB 14 I 222 82 8 複数の病因によるメジャー NCD (AD-VaD) 2 1 11 5.59 6.4 中級AD病理、中等度のSVD
22 F BB 282 76 8 主要前頭側頭型 NCD (nfPPA BPSD) 3 1 10 6.07 6.39 TDP (タイプ A),ILBD,中程度のSVD,低AD,HS
23 F BB 154 I 1079 80 5 NOLD (広範囲転移による癌による死亡) 0 1 5 6.49 6.9 中等度のSVD, CAA, 低 AD, 辺縁性脳炎
24 F BB 290 65 13 主要前頭側頭型 NCD (bvFTD BPSD) 5 1 12 5.73 6.42 TDP (タイプ A)
25 F BB 210 89 8 AD (BPSD) によるメジャー NCD 5 1 15 5.94 6.4 進行中
26 M BB 293 75 18 主要前頭側頭型NCD (bvFTD BPSD) 5 1 8 6.14 6.83 進行中
27 F BB 99 I 1370 79 9 NOLD (敗血症性ショックによる死亡) 0 2 14 6.3 7.12 進行中
M/F 意味 意味 意味 意味 意味 意味 意味
0.5 81 7.7 3.2 1.0 10.4 6.1 6.6

表3:ABBシリーズの臨床/神経病理学的診断 BB: ブレインバンク;edu (年): 教育年;CDR: 臨床認知症評価 (0 = 認知症なし; 0.5 = 軽度認知障害; 1 = 軽度認知症; 2 = 中等度の認知症; 3 = 重度の認知症; 4 = 非常に重度の認知症; 5 = 末期認知症);AFS: アゴナルファクタースコア;PM (hrs): 死後の時間;nd: 行われていない。M/F: オス/メス;BPSD: 認知症の行動と心理的症状;VaD: 血管性認知症;NOLD: 普通の高齢者;GBL: 神経膠芽腫;nfPPA: 非流暢な原発性進行性失語症;bvFTD: 前頭側頭型認知症の行動変異;SVD: 小さな血管疾患;LTS: レビー型シヌクレノパチー;HS: 海馬性硬化症;CAA: 脳アミロイドアンギオパチー;キャプカア: 毛細血管 CAA;mCAA: 髄膜 CAA;ILBD: 付随レビー体疾患;BG:大脳大脳神経節;ARTAG: 年齢関連 TAU アストロ - グリオパシー;一部: 一次年齢関連のTAUopathy;エイミー:アミダラ。

ドメイン テスト名
うつ病 疫学研究センターうつ病尺度 (CES-D) [2]
グローバル認知 ミニ精神状態検査 (MMSE) [1]
言葉と視覚記憶 自由でキュード選択的な思い出テスト [3]
コルシテスト [4]
レイ・オステルリース・コンプレックスフィギュア (ROCF) リコール [5]
注意/精神運動速度 トレイルメイキングA [6]
注意マトリックス [4]
言語セマンティックメモリ 意味的な言葉の流暢さ(色、動物、果物、都市)[4]
エグゼクティブ機能 トレイルメイキングB [6]
レイヴンの色付きマトリックス [7]
ヴィスア空間能力 時計の描画テスト (CDT) [8]
レイ・オステルリース・コンプレックスフィギュア (ROCF) コピー [5]

表4:脳ドナーに対する神経心理学的評価

代謝 産物
完全な血数
コレステロール HDL および LDL
トリグリセリド
グルコース
糖化ヘモグロビン (HbA1c)
ホモシステイン
コバラミン(ビタミンB12)
葉酸
アルブミン
尿素
クレアチニン
トランスアミナーゼ(ALTおよびAST)
ガンマグルタミルトランスレファーゼ
甲状腺刺激ホルモン (TSH)
ビタミンD(25-ヒドロキシビタミンD)
C反応性タンパク質(CRP)
電解 質

表5:脳ドナーのための代謝パネル。

遺伝子名 データベースSNP
アポリポプロテインE(アポエ) rs429358
rs7412
カタラーゼ (CAT) rs1001179
スーパーオキシドジスムターゼ2(SOD2) rs4880
アンジオテンジノゲン (AGT) rs699
サーチュイン2(サート2) rs10410544
外ミトコンドリア膜40のトランスロケース(TOMM40) rs2075650
ブリッジインテグレーター 1 (BIN1) rs7561528
カテコール-O-メチルトランスレセファーゼ(COMT) rs4680
メチレンテトラヒドロホウ酸還元体(MTHFR) rs1801133
rs1801131
脳由来神経栄養因子(BDNF) rs6265
溶質キャリアファミリー6、メンバー4(SLC6A4または5HTT) ヒドロキシトリプタミントランスポーター遺伝子結合多型領域(5-HTTLPR)
rs25531

表 6: InveCe.Ab 脳ドナーについて分析された SNP.

プロセス ソリューション 期間
マクロサンプル マイクロサンプル
固定 10%バッファホルマリン 4°Cで8日間 4°Cで8日間
洗浄 リン酸緩衝液 室温で2-15日 室温で2-15日
洗浄 H2O ウォッシュ 2-3時間、水道水 2-3時間、水道水
脱水 エチルアルコール 70% 24時間 8時間
脱水 エチルアルコール 80% 24時間 4時間
脱水 エチルアルコール 90% 60時間(通常は週末に) 4時間
脱水 エチルアルコール 95% 12時間 4時間
脱水 エチルアルコール 95% 12時間 4時間
脱水 エチルアルコール 100% 6時間 4時間
脱水 エチルアルコール 100% 6時間 4時間
クリア キシレンI 12時間 10時間
クリア キシレンII 12時間 10時間
浸潤 パラフィンI 12時間 11時間
浸潤 パラフィンII 12時間 11時間
埋め込み パラフィンワックス

表7:ABB組織処理プロトコル。

地域 H&E クレシルバイオレット Lfb ガリヤス 4G8 AT8 α-SYN TDP-43 ノイン GFAP
脳幹
迷柱の「髄質-ドーサル運動核」 X X X
ポンス - ローカス・コルールス X X X
中脳 - 実質的なニグラ X X X X
小脳
小脳皮質とデンテート核 X X X X
大脳
中前頭回 X X X X X X X
大脳基底核 + マイナート核 X X X X X X
シングレート、前 X X X X X X X
扁 桃 体 X X X X X X
視床と視床下核 X X
上側および中側頭のジャイリ X X X X X X X X X
海馬と内皮質 X X X X X X X X X X
下頭頂小葉 X X X X X X X
後頭皮質 X X X X X
嗅球 X X

表8:評価領域、染色および免疫体化学。

Discussion

プロトコルの重要なステップ
私たちの目的は、縦断観察から導き出された詳細な歴史を持つ被験者から来る良質の組織を取得し、特徴付け、保存することです。この目標を達成するためには、次の重要な側面に対処する必要があります。上記のように、プロトコルは、最初の重要なステップであるドナーの募集から始まります。その後、ドナーはフォローアッププログラムを継続し、脳の実際の寄付まで時間の経過とともにプロジェクトへの接着を維持することが必要です。死亡時には、ABBのスタッフが24時間以内に検死チームを招集するために速やかに通知を受ける必要があり、適切な組織品質にとって重要である。大脳半球の新鮮な切断は、安定した手と特定のトレーニングを必要とします.凍結が遅いことによる細胞の損傷を避け、クライオスタットとオミックスの良質のスライスを得るためには、すぐに凍結することが重要です。ホルマリン溶液の浸透速度(1mm/時間)を考慮すると、組織抗原性を保ち、単一スライスの浸漬時間は最小限に抑えられる。

メソッドのトラブルシューティング
上記の重要な手順に対処するために、以下のアプローチを提供します。ドナーの募集とフォローアップへの遵守:身体の体の体の体を傷つける恐れ、純粋さと完全性、または死後の痛みを感じる可能性を含む脳の寄付を妨げるいくつかの要因があります。彼らはまだ生きている間に解剖が行われるかもしれないことを心配する人もいます70,,71.葬儀の手配の中断や財政的負担に対する懸念も72です。さらに、医療従事者が死後の処置に関する知識の欠如と潜在的なドナーまたはそのNOKの懸念に対処できないことは、登録を妨げる可能性があります。これらすべての要因は、登録された参加者の数が少なく、時間の経過とともにドナーが失われる可能性が高いと、低レベルの意識を生み出す可能性があります。確かに、ドナー採用プログラムは、意識を広め、信頼を植え付け、人々に高いフォローアップ参加率を登録し、維持するよう説得するのに効率的であるべきです。私たちの経験では、これは潜在的なドナーの慎重な選択とBBの目的の徹底的な説明によって行われます。健康な人と神経変性疾患の影響を受ける人々とその家族の両方の恐怖とニーズに対処する教育活動と共感的なアプローチを提供しています。私たちは、潜在的なドナーが直接アプローチされたときに同意を与える可能性が高いことがわかります。対面アプローチは、脳の寄付とフォローアップ評価への登録の高い割合を達成するための基本である相互信頼と尊敬に基づいて関係を作成します。倫理観が強い高い訓練を受けたスタッフは、まず潜在的なドナーにアプローチし、死後に脳を寄付する可能性について議論し、人間の脳組織の価値を神経科学研究に説明し、死後の処置に関する疑念を明らかにする。好意的な口コミも同様に重要です。脳の収穫後、死体を再構成するために適切な注意と注意が与えられる。死体を優しく扱うことで、亡くなった人に敬意と感謝を示す必要があります。数ヶ月後、家族が要請するたびに神経病理学的分析の結果を伝える会議が予定されている。

死亡と脳の収穫の時間:人が受け入れると、彼らはドナーになり、24時間/日、7日/週(私たちに接続されているASPゴルジ・レダエリ老年病院の受け入れ番号)に連絡する番号の身分証明書が与えられます。また、入院時に使用する親族に粘着タグが付いています。この地域の葬儀機関は以前、検死チームが召喚されるABB施設に遺体を持ち込むという情報を得ていた。検死チームは、病理学者、神経生物学者および/または神経生物学者、および解剖室の技術者で構成され、毎日午前6時から午後11時まで呼び出されます。また、研修生の中には、助けや写真を撮るために頻繁に出席する人もいます。

新しい切断手順の精度と一貫性は、この方法を開発し、神経病理学の経験を持つ同じ2人のオペレータ(神経科医と病理学者)の関与によって保証されます。スライスを凍結すると、あらかじめ冷凍されたアルミニウムトレイに置き、連結されたアルミニウム板で覆われ、平らに保ちます。直後に、液体窒素を3分間、-80°Cで保存する前に入れます。 固定するスライスはガーゼで個別に包まれ、10%リン酸緩衝ホルマリン溶液に浸し、1日後に置換される。その後、彼らは5日以内にホルマリンに保管されます。しかし、ホルマリン溶液が1mm/日で浸透することを考えると、浸漬時間をさらに短縮したいと考えています。

メソッドの制限事項
ここで説明する研究方法は限られた地理的地域のみを対象としており、寄付プログラムに関わる個人は、一般の人々を完全に代表しない特性を持っています。許容以上に、死後の間隔は24時間まで、一部のタンパク質構造、酵素および脳組織のRNAに変化を生じる可能性がある。AFSとpHの決定は、組織の質73を決定するのに完全には十分ではない可能性があり、RNAの完全性に基づいて組織の品質を認証する他の方法を開発しています。

ミクロトーム切断手順に関しては、解剖学的関係を再構築するのに非常に有用であるが、マクロセクションの使用は単純ではなく、いくつかの技術的な困難を提示することに留意すべきである。私たちの方法は困難で時間がかかります。コストは非常に高く、資金は必ずしも容易ではありません。資金は主に公的(ASPゴルジ・レダエリ老年病院)と民間資源(ゴルジ・チェンチ財団)、民間寄付、非営利団体(「フェデラツィオーネ・アルツハイマー・イタリア」など)から行われ、参加を許可しています。

既存/代替方法に関するABB法の意義
当初、私たちの脳の寄付プログラムは、InveCe.Ab縦断研究に参加している個人を対象にしました。その結果、寄付された脳には、長年にわたって収集された詳細な臨床、生物学的、社会的情報が伴います。ABBの強さは、この特徴的な起源から正確に導き出されます。実際、生物学的特徴と環境暴露を共有する社会的、遺伝的関連者のグループを研究することは、統計的分析を強化する。さらに、この研究には、地域社会のニーズの世話と提供(「尋ねる前に与える」行為)が含まれます:人々は一般開業医に知らされる無料の定期検診を受け、秘書の電話番号が相談のために提供され、重度の障害者が自宅で訪問されます。2)参加者、定期的なセミナー(脳の健康、脳の寄付、一般的な健康に関連する)の組織を通じた教育活動における公的役割と一般開業医の関与、テーマ別コースの計画(例えば高齢者向けの情報技術機器の使用)。3)人と会い、対面アプローチを採用する。これらすべての要素は、ABBプロジェクトの強みを構成します。さらに、このプロジェクトは、前死後の評価と死後の神経病理学的評価の両方の経験を得るにつれて、関与する医療従事者の臨床能力を向上させます。この点について、「マイノリティ高齢化研究」の非常に独特の経験について言及したいと思います。この研究には、シカゴ地域に居住するアフリカ系アメリカ人の限られた選択された数(1,357人の対象者のうち784人:57%の回答率)が含まれました。参加者は毎年自宅を訪れ、脳の寄付プログラムに参加するよう求められました。この研究は、脳の寄付プログラムに対する肯定的な反応の高い割合を得る私たちといくつかの類似点を持つ異常なアプローチに基づいています(784人の参加者のうち352人のドナーが登録されました:44%)、解剖率は74非常に満足のいく(53%)74でした。「マイノリティ・エイジング研究」と同様に、教育活動と共感的アプローチを提供し、優れた成果を上げています。特に、回答率は93%、登録率は28.7%、現時点での検死率は67%です。これらの料金は、人々に直接関与するプロジェクトが寄付のよりかなりの割合を持っていることを示しています。他の脳の寄付プログラム, 潜在的なドナーとの関係を構築するあまり注意を払って, 一般的に低い登録率を持っています 10-15% 以下73,,75.

神経病理学的分析で終わる以前のコホート研究はほとんどありません。さらに、脳バンクやリポジトリの大半は病気中心であり、「病気の」脳の数と比較して、健康なドナーからの「制御」脳の不足があります。,限られた数のBは、老化軌道,,,73、74、76、77、78、79、80を研究するために、病気と正常な被験者の両方を含む集団研究に基づいています。73,74,7677787980アメリカ74の「少数派老化研究研究」やフィンランド76の「ヴァンター85+研究」などのいくつかの研究は、私たちと似ていますが、コホートの終了で不足する傾向があります。代わりに、ABBの寄付プログラムは、潜在的なドナーを参加させ、InveCe.Ab縦断研究の終了後もフォローアップをスケジュールし、将来的に長く継続することが想定されています。このアプローチは、退職コミュニティ73を対象とした「太陽健康研究所(SHRI)脳寄贈プログラム」と同様の採用方法を作ります。脳の寄付のためのSHRIプロトコルは、世界で最も短い平均死後の間隔(3.92時間)で非常に効率的です。世界最大のBBと同様に、SHRIプロトコルは単に正中線(矢状面)で大脳、小脳、脳幹を切断し、その半分は生化学的研究のために新鮮で凍結し、もう半分は組織病理学的評価のためにホルマリンで固定されています。しかし、SHRI解剖プロトコルの強みの1つは、半球全体ではなく個々のスライスの固定です。実際、半球全体を固定することは、サーフェスとコアの間の異なる固定勾配のため、最適ではありません。さらに、皮質タンパク質は、ホルマリン溶液への長期暴露によって影響を受ける可能性がある。したがって、我々は個々のスライスを修正することを決めた理由。

どちらの側が固定または凍結されているかの決定は、特異銀行(常に同じ、解剖の日が奇数であるか偶数であるかによって、ランダムに割り当てられた)31、32、33、34、35に依存する。31,32,33,34,35そこで、生化学的および病理的解析は、各半球で別々に行われます。多くの神経疾患は非対称的であるように、私たちのBBは新鮮な標本をスライスするためのユニークなプロトコルを提供しています:脳幹からの代替セクションと小脳と大脳の各半球からの代替セクションは、固定または凍結材料として保持されます。一方の半球の固定スライスは、もう一方の半球の凍結スライスに対応します。我々の方法は、すべての凍結材料の完全な組織学的特徴を得て、両側のすべての領域からの結果を比較する機会を与える。導入で述べたように、記載された方法は、脳組織からできるだけ多くの情報を得ることを可能にする。さらに、ABBの方法は、ほぼすべての既知の脳タンパク質症および血管病理を含む、基本的だが完全な神経病理学的特徴を生み出す。認知障害を決定する際の血管損傷の論争の役割のために、我々は、血管の負担30、53,53のための二重スコアリングを使用することにしました。

プロトコルで説明したように、我々は学際的なアプローチを使用します。これは時間と労力のかかる方法ですが、研究にはいくつかの利点があると考えています。例えば、前の研究では、APOE-ε4アレレに関連する高tHcy自体、またはAPOE-ε4アレーレに関連するMTHFR C677T TTが、記憶喪失81ではなくエグゼクティブ機能不全に関連している可能性があることを実証した。したがって、この特定の遺伝的プロフィールを有する被験者を神経病理学的レベルで評価することは興味深いかもしれない。これは、このような詳細なフォローアップが、当社の銀行で収集された生物学的材料の調査を通じて検証可能な新しい研究仮説を作成するのにどのように役立つかの一例です。私たちのアプローチの利点のもう一つのデモンストレーションは、その独創性と比較的使いやすさのために、私たちが日常的に行っている評価の中にQEEGを含めることです。実際、脳体は、皮質錐体ニューロン82に属する樹状突起の電位を記録することによって大脳皮質のシナプス活性を検出する。QEEGは、認知83に関連する皮質シナプス活性の推定のためのバイオマーカーと考えることができる。特に、低い周波数(シタとデルタリズム)の一般的な増加を伴う脳の後部のアルファリズムの減少は、皮質接続の破壊に関連している。診断相関研究のほとんどは、可能性が高,く、明確な診断84、85、86、87ではない臨床診断に84,85,86基づいていると考えるべきです。87QEEGとLTS変異体88,89の相関関係を調べる神経病理学的画像とQEEGデータを比較した対象研究はごくわずかであり、FTLD89とAD83の間の区別を調べた。神経病理学的診断の定義で研究を終わらせることによって、脳の電気的活動に関する観察を正しく解釈することが可能である。さらに、各被験者にシリアルQEEGを行うことで、個々の脳波軌跡と神経病理学的画像との相関を追跡することができます。時間の経過とともに皮質電気活性の個々の変更に続いて、創発性認知症のバイオマーカーとしての意味をよりよく理解することができます。

今後の応用と方法の方向性
組織分布の実装は、私たちの主な将来の目標の1つです。そのために、GC財団(老人)の理事、パヴィア大学の神経学の学者、GC財団と老年病院ASPゴルジ・レダエリの神経学者、病理学者を含む科学委員会を設立しました。脳組織、組織学的スライド、その他の生物学的サンプルを配布する際には、ドナーが研究のために寄付に同意したことを覚えておくことが重要です。したがって、BNE行動規範40に記載されているように、材料の配布は慎重に行われるべきです。材料の要求を提出する当事者は、必要なサンプルの種類と量を示し、研究プロジェクトの説明とサンプルの使用方法を提供し、可能な場合は、以前の出版物の証拠を提供する必要があります(譲渡契約については、 図9を参照してください)。脳の銀行は、金銭的な利益のために働かない.したがって、研究者が支払う手数料は、組織調達、加工、保管、流通の費用のみをカバーする必要があります。

プロテオミクスやトランスクリプトミクスなどのエキソメシーケンシングとオミックス技術でケースの分析を開始する計画が動いています。我々の代替サンプリング方法論は、オミクス研究が両方の半球から組織学的に明確に定義された組織に対して行われることを可能にする。このアプローチにより、同じ半球の異なる脳領域と他の半球の対応する領域における遺伝子活性化のパターンを比較し、遺伝子活性化を組織病理学と相関させることができる。この分野では、深層学習アプリケーションは、組織学的スライドのコンピュータ解析や臨床、組織学、近江のデータの最先端の相関関係を含む大きな関心を持つであろう。多くの異なる変数間の他の相関関係は、他の可能な技術的応用と同様に識別することができる。両方の半球から凍結された物質の入手可能性は、遺伝子の活性化とタンパク質分布の正確な地形を可能にする。これは、脳機能といくつかの疾患の両方が非対称であることを考えると、健康な被験者でも特に興味深いでしょう。

また、我々は、十分に特徴付けられる脳ドナーから細胞培養を得ることができる。実際、採取した脳のレプトメニンジからの細胞培養は、レプトメニンゲ細胞線維芽細胞を再プログラミングし、高度なモデル90で神経細胞に分化することを含む誘導多能性幹細胞(iPSC)技術を用いて、疾患または老化機構のさらなる調査に使用できる生きた細胞を供給する。

脳が老化するにつれて、変化の異なるプロファイルは、分子、細胞および組織レベルで起こり得る。すべての脳はユニークです。それぞれに、内部および外部ストルッサーに対応する独自の方法があります。抵抗する人もいれば、異なる病理を示す人もいます。臨床提示と神経病理学的画像の間に不一致が存在するのは、病変の地形が臨床的な提示を決定するものではなく、病変の地形によって決まり、しばしば存在する。正しく明確な診断は、臨床症候群と、しばしば病気の病因を解明するために必要な重要な病因的手がかりを追加する神経病理学的知見を組み合わせることによってのみ達成することができた。ヨーロッパでは、神経病理学的診断に対する標準的なアプローチを作成する取り組みがあります。私たちの診断プロトコルは、脳バンキング91のための神経病理学的診断に関する最近公表されたガイドラインにほぼ完全に従います。これにより、最初のイタリア脳銀行を設立するという将来の目標を持って、十分に文書化された脳組織を収集し、共有することができます。確かに、イタリアには脳リポジトリがありますが、コホート研究に基づく脳バンクはありません。私たちの目的は、イタリア全土で広く実装できる脳組織収穫の方法を開発し、共通のプロトコルを使用し、同等の材料を共有するネットワークを確立することです。そのためには、他の研究センターの関与や特定のウェブサイトの作成が、将来の主な目的の一つです。

神経変性疾患の分子性の解析やバイオマーカー同定に、革新的な技術が常に使用されています。この文脈では、縦手方向の研究を通じて得られる認知および老化軌道に関する情報を伴う脳の必要性が高まり、神経病理学的に検証された疫学的アプローチ92の重要性を強調する。

Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この作品をミケラ・マンジェリ博士に捧げたいと思います。彼女は早死にする前に、彼女は考案し、アッビアテグラッソブレインバンクプロジェクトを開始しました。

私たちは、自分の体の最も高貴な器官を寄付する研究に寛大に貢献している私たちの脳のドナーに感謝しています。彼らがいなければ、この研究は不可能であろう。

ヴァレリア・マルザガリのABBプロジェクトでの貴重な仕事に感謝しています。

著者らは、ヨハネス・アッテムス教授、パオロ・フォシアニ博士、ジョルジオ・ジャッコーネ博士の貴重な指導と賢明な助言に感謝しています。

私たちは、プロジェクト全体を通して彼らの貴重な助けのために博士アリス・シリンシオーネとミスジュリア・ボルトンに感謝したいと思います。
テレ・カッサーニ夫人の支援と「フェデラツィオーン・アルツハイマー・イタリア」の協力に感謝します。
著者らは、パビア大学公衆衛生・実験・法医学科のマッテオ・モレッティ博士とアントニオ・マルコ・マリア・オスキュラティ教授に感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm BD 405253
Anti-GFAP Dako Z0334 policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60) Chemicon MAB377 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8) ThermoScientific MN1020 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) CosmoBio TIP-PTD-P02 policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51) Novocastra NCL-L-ASYN monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8) BioLegend 800703 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board BD 352070
DMEM High Glucose Carlo Erba FA30WL0101500 medium
Electrical saw with 5d blade CEA 06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm CEA 70064.250 HHH
Electrode pH needle Fisher Scientific 11796338
EnVision+System-HRP Dako K4001 secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP Dako K4003 secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether SMI 8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm Fisher Scientific 11749798
Fetal Bovine Serum Carlo Erba FA30WS1810500 medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical Uvex 500XG
Gloves CEA 01.28.14
Glue Arcobaleno 2624000800002
Head supporter Lacor 60456
L-Glutamine (100X) Carlo Erba FA30WX0550100 medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape CEABIS CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide UHU Bostik 8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140050 medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X) Carlo Erba FA30WL0022100 medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm CEA 03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin Olcelli Farmaceutica A930857255
Surgical mallet and surgical cisel CEA 79.68.88
Surgical scissor CEA 27.08.45/79.68.64
Feather M130RC

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References

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