Abbiategrasso Мозг Банк Протокол для сбора, обработки и характеристики старения мозга

Summary

Этот протокол описывает метод для отслеживания отдельных траекторий старения мозга с помощью программы донорства мозга и надлежащей характеристики мозга. Доноры мозга участвуют в долгосрочном продольном исследовании, включая серийные многомерные оценки. Протокол содержит подробное описание обработки мозга и точную диагностическую методологию.

Abstract

В постоянно стареющей популяции, распространенность нейродегенеративных расстройств, как ожидается, возрастет. Понимание механизмов заболевания является ключом к поиску профилактических и лечебных мер. Наиболее эффективным способом достижения этой цели является прямое изучение больных и здоровых тканей мозга. Авторы представляют протокол для получения, обработки, характеристики и хранения тканей мозга хорошего качества, пожертвованных лицами, зарегистрированными в программе пожертвования мозга antemortem. Программа донорства включает в себя индивидуальный эмпатичный подход к людям, набор дополнительной клинической, биологической, социальной и образ жизни информации и серийные многомерные оценки с течением времени для отслеживания индивидуальных траекторий нормального старения и когнитивного спада. Поскольку многие неврологические заболевания являются асимметричными, наш банк мозга предлагает уникальный протокол для нарезки свежих образцов. Участки мозга обоих полушарий поочередно замораживаются (при -80 градусов по Цельсию) или фиксируются в формалине; фиксированный кусочек на одном полушарии соответствует замороженному на другом полушарии. При этом подходе можно получить полную гистологическую характеристику всего замороженного материала, и исследования омиков могут быть проведены на гистологически четко определенных тканях обоих полушарий, предлагая тем самым более полную оценку механизмов нейродегенеративных заболеваний. Правильная и определенная диагностика этих заболеваний может быть достигнута только путем объединения клинического синдрома с невропатологической оценкой, которая часто добавляет важные этиологические подсказки, необходимые для интерпретации патогенеза. Этот метод может быть трудоемким, дорогостоящим и ограниченным, поскольку он охватывает лишь ограниченную географическую область. Независимо от его ограничений, высокая степень его характеристики может быть полезной. Нашей конечной целью является создание первого итальянского банка мозга, все время подчеркивая важность нейропатологически проверенных эпидемиологических исследований.

Introduction

По данным ВОЗ, в настоящее время около 50 миллионов человек страдают деменцией, и, по предварительным данным, к 2050 году эта цифра утроится. Болезнь Альцгеймера является основной причиной деменции, а затем цереброваскулярных заболеваний и других возрастных нейродегенеративных расстройств. В 2017 году ВОЗ разработала Глобальную обсерваторию деменции для повышения осведомленности о деменции и поощрения глобального плана действий против нее¹. Каждый человек имеет свою собственную траекторию старения мозга, поэтому поиск лечения может быть сложным из-за сложности патогенеза нейродегенеративных заболеваний. Возможно, каждый человек обладает своим патогенезом, написанным в тканях мозга, требующим индивидуального подхода. Таким образом, изучение тканей мозга будет ключом к пониманию механизмов нейродегенерации.

Оглядываясь назад на историю неврологии, мы понимаем, что самые впечатляющие и новаторские открытия никогда бы не произошло без прямого изучения человеческого мозга. На протяжении всего времени источник изученной ткани мозга менялся от грубых вскрытий, случайных «случайных встреч» и, в некоторых случаях, незаконной торговли, к организованным сборам мозгов и стратегическим современным банкам мозга. Рассмотрение многих этических аспектов является одним из основных факторов, отличающих современные банки мозга от коллекций мозга прошлого. Первые настоящие современные мозговые банки (ББ) были введены во второй половине^20-го века. Николас Корселлис и Уоллес Туртелотта можно считать пионерами современного банковского дела мозга. В Великобритании, Corsellis собрал коллекцию проведения более 1000 хорошо документированных мозгов, пострадавших с различными психическими и неврологическими расстройствами². Кроме того, Corsellis помогли выявить необходимость сохранения свежей ткани мозга во льду ради биохимических испытаний³. Между тем в США году, Уоллес Tourtelotte представил antemortem программы донорства мозга для облегчения вымогательства потенциальных доноров мозга и обеспечить, чтобы мозг собраны сопровождаются полной медицинской и неврологической^{истории 4,5}. Для исторического обзора коллекций мозгов и современных BBs, см Карлос и др. ⁶.

Итак, зачем нам все еще нужен человеческий мозг? Заболевания головного мозга могут быть поставлены только определенный диагноз после невропатологического обследования. Нейропатология бросает вызов клинической диагностике и является ключом к правильной интерпретации клинических симптомов и открытию гистологических основ новых синдромных вариантов. Действительно, диагноз можно переопределить на основе патологической картины. Тем не менее, уровень вскрытия снизился в последние десятилетия из-за недавних разработок инновационных методов нейровизуаляции. С помощью визуализации мозга, морфологические, функциональные и метаболические изменения в головном мозге, а также степень неправильного сфоливания белка, могут быть оценены in vivo. Однако нейровизуагия in vivo и другие исследования биомаркеров могут дать только «оценку» патологической картины, так как они не в состоянии обнаружить тонкие клеточные и молекулярные изменения. Достижения в области молекулярной визуализации и открытие новых биомаркеров,^{молекул-мишеней и трассировщиков 7 (например,} амилоид, ТАУ, микроглиальные трассировщики) делают человеческий мозг еще более незаменимым для интерпретации данных, полученных в результате клинических оценок и тестирования биомаркеров. Кроме того, омические технологии (геномика, эпигеномика, транскриптомика, метаболомика, протеомика, липидомика и т.д.), выполненные на свежих и замороженных тканях мозга, открыли новые возможности для понимания механизмов заболевания и обнаружения генов риска, новых диагностических и прогностические^{маркеры, а также потенциальных целей препарата 8,,9,,,10,,11, 12,,13,,14,,15,,16,,17,,1018,,19,,20,,21,,22,,23.}

Для этих целей, современные BBs архив хорошо охарактеризованы, высококачественные ткани мозга, что делает их доступными^{для научного сообщества 3,24}. Мозги, поставляемые BBs должны сопровождаться полной клинической истории. Деятельность BB включает в себя следующее: (1) Признание и набор больных и здоровых людей в программы донорства мозга; идеальным условием было бы достижение междисциплинарного последующего деятельности доноров на протяжении всей жизни для получения полного клинического, образа жизни и социальной истории, а также профилей биомаркеров; действительно, когнитивный резерв и структура мозга зависят от образа жизни и^{социально-образовательных факторов 25,26}, так что эта информация обогащает общие данные под рукой. (2) Приобретение головного мозга (состоящего из головного мозга, мозжечка и ствола мозга) и связанных с ним тканей (например, спинного мозга, черепных нервов и ганглиев и т.д.) после кончины донора, при этом соблюдая стандартизированные правовые и этические нормы. (3) Соответствующая обработка (рассечение, фиксация, замораживание) мозга, как это определено в стандартизированном оперативном протоколе, для получения высококачественных тканей и для дальнейшего использования в междисциплинарных исследованиях. (4) Подробная невропатологическая характеристика, обеспечивающая окончательный определенный диагноз. (5) Хранение и распределение тканевого материала для научно-исследовательского^{сообщества 27,28}.

Все BBs хранить как замороженные и формалин-фиксированный парафин встроенных тканей. Каждый BB имеет свой собственный протокол. За исключением конкретных исследований, таких как бигемисферный протокол резки Биомедицинского научно-исследовательского института^{(Нью-Джерси) 29} и исследование Deramecourt цереброваскулярной^{патологии 30}, крупнейших BBs в мире просто сократить мозжечка, мозжечок и ствол мозга вдоль средней линии (sagittal плоскости). Одна половина вскрывается свежей, а затем замораживается для биохимических исследований, в то время как другая фиксируется в формалине для гистопатологической оценки. Таким образом, биохимические и гистопатологические анализы проводятся отдельно на каждом полушарии. Решение о том, какая сторона является фиксированной или замороженной (боковой), зависит от единственного банка^{31,,32,,33,,34,,35.} Поскольку многие неврологические заболевания асимметричны, наш BB предлагает уникальный протокол для нарезки свежего мозга: соседние участки ствола мозга и каждое полушарие поочередно фиксируются и замораживаются; фиксированный кусочек на одном полушарии соответствует замороженному на другом полушарии. С помощью этого метода оптимизировано использование тканей мозга, и может быть достигнута полная гистологическая характеристика всего замороженного материала с возможностью получения и сравнения гистологической и биохимической информации из всех областей обоих полушарий.

Рамой нашего проекта банка мозга является город Аббиатеграссо. Аббиатеграссо () — небольшой городок в Италии, в 22 км к юго-западу от города Милан. Население составляет около 32 600 жителей. Он является домом для Golgi-Cenci (GC) Фонд. Фонд GC является частью большой реабилитационной гериатрической больницы (ASP Golgi-Redaelli) и является институтом, ориентированным на исследования о старении и уходе за пожилыми людьми. В частности, основное внимание уделяется изучению психического старения, социальных и поведенческих факторов, влияющих на него, а также биологии и патологии, лежащих в основе возрастных нейрокогнитивных расстройств (НИЗ). В 2009 году Фонд ГК начал новое продольное исследование с участием 1321 участника (из 1644 подходящих предметов: первоначальный процент ответов 80,3%) родился в период с 1935 по 1939 год (в возрасте от 70 до 75 лет) кавказской национальности, проживающий в том же небольшом географическом районе. Исследование называлось InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; на английском языке: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) и в настоящее время продолжается. InveCe.Ab планируется получить когорту с максимальной однородностью и наименьшей изменчивостью для того, чтобы оценить заболеваемость, распространенность и естественную историю деменции, наряду с ее возможным риском или защитными факторами, включая поведенческие, психосоциальные, клинические и биологические^{переменные 36}. Характеристики когорты показаны на рисунке 1 и таблице 1. Эпидемиологические данные согласуются с тенденцией деменции^{в европейском населении 37,38} и InveCe.Ab участники имеют однородные генетические и экологические характеристики, представляющие собой хорошую модель для изучения траектории от нормального старения до нейрокогнитивных расстройств. Действительно, однородные группы населения требуют меньшего числа субъектов для достижения адекватной статистической власти. Методология InveCe.Ab уже была зарегистрирована в^{других местах 36,} но важно подчеркнуть ее многомерный подход через периодические проверки (каждые 2-3 года) с использованием одного и того же набора оценок, включая: анализ крови (метаболическая панель, гомоцистеин и витамины, экстракция ДНК в профиль Apolipoprotein E (APOE) и другие генетические полиморфизмы, связанные с познанием и старением), антропометрические измерения (вес, рост и талия), Talking While Walking Test (двойной тест задачи), интервью для оценки образа жизни (средиземноморская диета соблюдение, уровни физической активности и когнитивного взаимодействия) и социальные факторы (социальное участие, нейропсихологическое обследование). Сравнение таких продольных данных с посмертным невропатологическими данными будет иметь решающее значение для исследований. Поэтому наша команда и особенно доктор Микела Мангиери задумали упомянутый выше невропатологический подход. С 2014 года и во время второго последующего, InveCe.Ab участников попросили пожертвовать свои мозги, и, таким образом, в результате чего рождение Abbiategrasso мозга банка (ABB). Основными донорами ABB являются участники InveCe.Ab, но ABB теперь открыта для других доноров-добровольцев. Это пациенты из ASP Golgi-Redaelli, где находятся несколько пациентов с различными неврологическими заболеваниями, или взрослые добровольцы, которые узнают о проекте ABB и принадлежат к тому же географическому району (Abbiategrasso и окрестности). Все доноры проходят одинаковую оценку.

Авторы предлагают метод отслеживания индивидуальных траекторий нормального старения и возможного прогрессирования НИЗ, а также точного управления, обработки и характеристики мозга, приобретенного у таких доноров, следуют продольно. Кроме того, наша цель состоит в том, чтобы встретиться и вовлечь людей в периодические неврологические оценки, семинары и образовательные мероприятия, касающиеся благополучия мозга и повысить их осведомленность о донорстве мозга в исследовательских целях.

Protocol

В соответствии с Комитетом по этике исследований человека нашего учреждения и Кодексом поведения BNE, ABB выполняет свою деятельность в соответствии с^{этическими стандартами 39,,40}. Процедура сбора мозгов была представлена и одобрена Комитетом по этике Университета Павии в контексте исследования InveCe.Ab³⁶. Процедуры исследования соответствовали принципам, изложенным в Хельсинкской декларации 1964 года, и следующим поправкам. Форма согласия является полной и легко понятной. Присоединение к программе пожертвований является личным решением, и необходима полная осведомленность. В случае, если лицо не считается компетентным подписать форму согласия, разрешение от законного опекуна или ближайших родственников (NOK) является оправданным. Таблица 2 сообщает о включении и критериях исключения для донорства мозга. Исследование проводилось под руководством Federazione Alzheimer Italia.

1. Набор в программу донорства мозга

1. Созвать субъектов, которые выразили заинтересованность в донорстве мозга и их NOK и / или правовой опекун представить проект (сфера программы пожертвования; процесс удаления мозга, сохранения, использования и распределения), право выйти из программы в любой момент времени, защита анонимности, а также последующие стратегии. Обсудите возможность дополнительных исследований биомаркеров и генетических тестов. Обратите внимание на пожелания потенциального донора или его НОК быть информированными о результатах.
2. Объясните все экономические аспекты, включая отсутствие финансовой выгоды как для Фонда, так и для донора (мозги пожертвованы и распределены альтруистически). Сообщите им, что ABB покрывает расходы на транспортировку тела, в то время как семья покрывает похороны, похороны или кремацию.
3. В случае принятия, получить подпись согласия на участие в программе пожертвования. Дайте донору индивидуальный численный код, чтобы гарантировать анонимность. Запишите идентификационное число участников продольного исследования и предоставьте еще один код для банка мозга, чтобы легко отделить две подгруппы доноров (участников или неуязей в продольном исследовании; см. таблицу 3).
4. Дайте донору удостоверение личности, которое объявляет его статус донора и отображает номер телефона (доступно 24/7), чтобы уведомить Банк мозга о его смерти.

2. Оценка доноров и последовательное последующее

ПРИМЕЧАНИЕ: Согласие можно дать только на некоторые, а не на все из упомянутых ниже экзаменов. Все клинические оценки проводятся одной и той же командой, включая невролога, гериатр с опытом работы в неврологии и 3 психолога. Если новые симптомы развиваются или когнитивное снижение прогрессирует, интервал времени между последующих мер может быть сокращен.

1. Как и в случае исследования InveCe.Ab, получить образ жизни социальной вопросник, в том числе степень автономии (ADL, IADL), личные привычки, социальные и образ жизни факторов, которые могут повлиять на психические функции. Соберите семейную, медицинскую и неврологическую историю с информацией о генетических, инфекционных, токсичных, метаболических, аутоиммунных, сердечно-сосудистых, травматических, дегенеративных, неопластических и неврологических заболеваниях. Соберите предыдущие клинические экзамены и перечислите фармакологические методы лечения.
2. Провести обширную нейро-моторную оценку, включая тестирование на функцию черепных нервов, fundus oculi, поле зрения, мышечную силу и тонус, чувства, сухожилия рефлексы, экстероцептивные и примитивные рефлексы, менингеальные признаки, осанка, походка, движения, координация, сфинктерные функции, и любое наличие координационных или Бабински знаков. Оцените язык, психическое состояние и любые изменения в поведении.
3. Провести обширную нейрокогнитивную оценку, включая глобальное познание и полную нейропсихологическую оценку конкретных когнитивных областей: вербальная и зрительная память, внимание, скорость психомотора, язык, семантическая память, исполнительные функции и висуопространственные способности(таблица 4 для деталей). Рассмотрим наличие депрессии (шкала CES-D).
4. Получить образец крови, который используется как для анализа химии крови ( Таблица 5 ) и изоляции ихранения ДНК,плазмы и периферических моноядерных клеток крови (PBMC). Определите генотипирование APOE (rs429358 и rs7412) (более обширное генетическое профилирование было определено в участниках InveCe.Ab; см. таблицу 6). Зарегистрируйте ЭКГ (сердечные изменения, мерцательная аритмия) и состояние покоя Электроэнцефалограммы для количественного анализа (ЗЕЭГ).
5. Рассмотрим факультативное тестирование биомаркеров, включая спинномозговую жидкость (CSF) TAU, фосфо-ТАУ и З-амилоид, а также визуализацию мозга (МРТ для выявления виво-дегенерации, ишемии или воспаления; FDG-PET для выявления нарушения обмена веществ; PIB-PET для обнаружения амилоидоза мозга, связанного с патофизиологией Альцгеймера).
6. Запланируйте последующую программу проверки мозга донора. Настройка интервалов времени в зависимости от возрастных групп (до 64 лет: каждые 10 лет, 65-74 лет: каждые 3 года, от 75 лет: каждые 2 года).
7. Назначить клинический диагноз и/или нейрокогнитивный диагноз в соответствии с DSM-V. Классифицировать клинической деменции постановка с клинической деменции Рейтинг (CDR) оценка. Обновление CDR в последний период перед смертью.
8. Подготовь базу данных, графически похожую на бумажную. Вставьте все собранные данные в базу данных Brain Bank. Запланируйте пересмотр другим клерком, чтобы проверить на наличие ошибок.

3. Время смерти и удаления мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Итальянское законодательство устанавливает, что асизол должен длиться более 20 минут, чтобы подтвердить смерть. Регистрация плоской электрокардиограммы (ЭКГ) в течение не менее 20 минут (названная чематография) позволяет продать вскрытие в пределах 24 ч от смерти (ст. 285/90 и закон No 578 от 29 декабря 1993 года). Посмертное время lt;24 h является хорошей мишенью для сохранения общего качества тканей. В случае посмертного времени при вскрытии отменяется (см. таблицу 2). Команда вскрытия состоит из патологоанатома, невролога и/или нейробиолога, медсестры, специалиста по анатомическим комнатам и всех студентов-стажеров; первые два члена команды также выполняют невропатологический диагноз. Во время обработки трупов и вскрытия, использование соответствующей одежды (пальто, перчатки, очки и волосы сети) является обязательным. В этом разделе мы описываем основные инструменты и оборудование, обычно используемые в нашей лаборатории. Читатели могут выбрать инструменты, которые будут использоваться по своему усмотрению. Для подробного описания материалов, используемых здесь, пожалуйста, смотрите Таблица материалов.

1. Убедитесь, что похоронное агентство, выбранное семьей, приносит тело в учреждения ABB. Выполните токатографию, во время которой сердечная деятельность должна отсутствовать. Если да, то подпишите свидетельство о смерти и начните процедуры вскрытия.
2. Транспорт трупа в комнату для вскрытия. Измерьте окружность черепа на уровне наиболее широкой части головы. Измерение от насиона до иниона для получения диаметра антеропостериора (APD), в то время как расстояние от одного уха к другому дает поперечный диаметр (TD). Рассчитайте цефалический индекс (КИ) по формуле: CI и TD/APD x 100.
3. Используя острый скальпель, сделайте разрез кожи головы на корональной плоскости, от кончика мастоидного процесса с одной стороны на другую, проходя через вершину. Вырезать волосы, кожу и подкожные ткани и отделить две складки кожи головы тщательно из-под черепа. Выполните разрез до тех пор, пока желтый надорбитальный жир не станет видимым и не отразит кожу головы. Потяните другую часть задним числом.
4. Используя скальпель и типсы, возьмите небольшой образец височной мышцы с каждой стороны, положите один в 4% формальдегида и заморозьте другой (см. раздел 7).
5. Отрежьте череп с помощью электрической пилы после V-разреза на лобной стороне. Снимите тюбетейку и вырежьте околи. Образец кусочков дуры фиксируется в 4% формальдегида и замораживается (см. раздел 7).
6. Получить около 10 мл CSF путем вставки 20 G 3.5 дюйма иглы через корпус мозоли для достижения третьего желудочка. Оцените внешний вид, цвет и мутность CSF и измерьте рН. Затем сделайте 10 алицитов по 1 мл каждый и храните их при -80 градусов по Цельсию.
7. Поднимите мозг деликатно потянув на обе лобные доли и сократить как зрительные нервы infundibulum, внутренние сонные артерии (ICA) и третий, четвертый, пятый и шестой черепных нервов. Вырезать тенторий для достижения задней ямки и сократить позвоночных артерий и нижних черепных нервов. Вставьте скальпель как можно глубже через foramen magnum, чтобы сократить наиболее caudal часть медуллы. В этот момент, удалить весь мозг осторожно.
8. Скальпелем проткните кость над пещерой Мекеля и получите гассерианский ганглион с обеих сторон. Исправить один ганглия в 4% формальдегида и заморозить другой (см. раздел 7). Перелом костлявый sella turcica с помощью хирургического молотка и стамески, чтобы удалить гипофиз, а затем исправить его в 4% формальдегида.
9. Осмотрите череп и весь мозг на макроскопические изменения и сосудистые изменения. С помощью измерительной ленты, измерить мозг получения поперечных и антеропостерных диаметров. Извлекать с осторожностью круг Уиллиса и оценивать его макроскопически (рисунок 2E) на наличие анатомиических вариантов, поражений или стеноза сосудов.
10. Возьмите 1-2 куска лептоменинга 2-4^{см 2 от} выкаленности и сохранить их в полной высокой глюкозы Dulbecco модифицированных Eagle MEDIA (DMEM) культуры среды при 4 КК, содержащих 20% плода бычьего сыворотки (FBS), 1% пера / стрептококка, 1% глутамина и 1% несущественных аминокислот (как ранее опубликовано, с^{некоторыми изменениями) 41}.
    1. Для того, чтобы получить фибробласты культур, поместите лептоменинги на 10 см Петри блюдо и мыть дважды с фосфатным буфером солевого раствора (PBS), каждый раз отбрасывая жидкость.
    2. Используя скальпель и наконечник пипетки, разрежьте лептоменинги на мелкие кусочки около 2 или 3 мм, семя 3-4 штуки в каждом колодец 6-хорошо пластины ранее покрыты желатином на 0,5% и заполнить каждый колодец с 2 мл полной среды дополняется 1% амфотерицина B (провести обработку в биобезопасности шкаф, чтобы гарантировать стерильность культуры).
    3. Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ в течение по крайней мере одной недели и изменение провел средний каждые 3-4 дней. Трипсинизировать клетки с стерильным 1x трипсина, когда хорошо составляет около 70% от слияния. Поместите лептоменингеальные фибробласты в колбу T75 и заполните ее 12 мл полной среды. Через 5 дней трипсинизировать и сохранить их в 900 йл FBS и 100 йл диметила сульфоксида (DMSO).
11. Отделить и проверить мозжечок, мозжечок и ствол мозга и вес их индивидуально. Смей шишковидной железы и исправить его в 4% формальдегида. Удалите обонятельные лампы и зрительные нервы, и исправить или заморозить одну из каждой пары, независимо от стороны. Держите мозжечок, мозжечок и ствол мозга во льду при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере 2-4 ч, пока не будет готов к вскрытию, чтобы свести к минимуму разрушение тканей и уменьшить мягкость тканей.
12. После сбора урожая обратите должное внимание и заботу о трупе. Прикрепить кость с помощью супер клей клей, и сшить обратно кожу головы с помощью хирургической иглы и неаспасаемых швов.
13. Проявите уважение и благодарность умершему человеку, мягко отдав его трупу. Очистите и побрите лицо, и мыть и сушить волосы, потому что труп будет положить в открытый гроб видимых для близких.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Recomposition трупа делается техником. Протокол можно приостановить здесь.

4. Протокол вскрытия ABB

ПРИМЕЧАНИЕ: Тот же патологоанатом и/или невролог нарезают ствол мозга, мозжечок и мозжечок под дымовой капот. Нейробиолог организует ломтики после секции. Стажер, не обрабатывающий секции мозга, документирует всю процедуру с фотографиями, которые должны быть загружены в базу данных, чтобы служить в качестве руководства на последующих этапах обработки тканей.

1. Используя рассечение ножа, вырезать ствол мозга аксиально и сделать первый разрез на уровне рострального среднего мозга, через превосходный колликул, чтобы получить два ломтика подвергая substantia nigra (SN).
2. Сделайте остальные разрезы, чтобы приобрести 8 мм срезы ствола мозга, чтобы получить около 10 разделов. Будьте осторожны, чтобы включить разрезы, проходящие через ростральные поны вблизи верхних окраин четвертого желудочка, чтобы наблюдать локус coeruleus (LC) и через медулла продолговатый уступает акустической стрии чуть выше нижней вершины четвертого желудочка иметь ломтики, включая спинное моторное ядро блуждающего (DMNV).
3. Назовите все ломтики в розовом смысле как BS (мозги), а затем арабские номера, чтобы определить разделы. После последнего раздела ствола мозга, используйте обозначение SC (спинной мозг), а затем номера 1-n. Около 2-4 ломтиков SC получаются в зависимости от количества удаленных метамер позвоночника(рисунок 2H-I).
4. Наклейте этикетку на все разделы, которые должны быть исправлены или заморожены поочередно, и смойте для фотоархива(рисунок 2). Затем зафиксьте и заморозьте все срезы, описанные ниже (шаги 4.7 и 4.8).
5. Вырежьте мозжечок на сагиттаальной плоскости, чтобы отделить два мозжечковых полушария на уровне вермы. Выполните sagittal секционирование, чтобы получить 5 ломтиков из каждого полушария(рисунок 2F-G).
6. Назовите все ломтики из вермы как CBR или CBL (для правого и левого мозжечка соответственно) и используйте арабские номера для идентификации разделов. Наклейте этикетку на все разделы, которые должны быть исправлены или заморожены поочередно и сфотографироваться для архива(рисунок 2). Затем исправить и заморозить все ломтики, как описано ниже.
7. Разделите два полушария головного мозга через мозоли корпуса(рисунок 2A-B)и нарежьте их сингулярно на корональной плоскости. Сделайте первый разрез в плоскости, проходящей между оптическим чиазмом и маммилляционными телами, через лобную долей, височный полюс, передний cingulate, переднее комиссариат, ядро Meynert и базальные ганглии.
8. Выполните второй разрез около 1 см задним проходом через млекопитающие тела и подвергая базальных ганглиев, передней таламус, субталамус и миндалины. Продолжайте нарезку, чтобы вскрыть передние и задние области, чтобы приобрести 1 см ломтиками, чтобы получить от 15 до 20 секций для каждого полушария.
9. Установите ломтики на плоскую поверхность. Положите их после их первоначального положения в направлении anteroposterior, от фронтального к затылочной полюса, с частью непрерывной с предыдущим ломтиком, обращенным вверх.
10. Сравнивая разделы из обоих полушарий, выберите альтернативные разделы из каждого полушария, которые будут сохранены в качестве фиксированного или замороженного материала. Распознать основные разделы, которые должны быть исправлены и обработаны для гистопатологии, включая лобные и височные доли, cingulate, базальные ганглии, ядро базалиса Meynert, миндалины, таламуса, гиппокампа и энторинальной коры, затылочных-височной извилины, теменной и затылочной долей.
11. Назовите все ломтики в антеропостере как L (слева) или R (справа), а затем арабские номера и поместите этикетку, указывая, должен ли срез быть фиксированным или замороженным(рисунок 2A-D). Чтобы определить разделы, смойте для фотоархива. Затем исправить и заморозить все ломтики, как описано в разделах 7 и 8.

5. Осмотр мозга и сосудов и макроскопическая патологическая оценка (невооруженным глазом)

1. Провести общее макроскопическое обследование с учетом менингеальных изменений, диффузной или локализованной корковой атрофии, гиппокампа атрофии, расширения желудочков, мозжечковой атрофии, атрофии ствола мозга, substantia nigra pallor, изменения белого вещества (указать тип и местоположение).
2. Изучите круг Уиллиса, рассматривая атеросклероз и окклюзию. Назначить оценку No 1 при наличии атеромы без стеноза более чем на 50%, оценка No 2, если по крайней мере одна артерия 50% или более окклюдных, оценка No 3, если две или более артерий 50% или более закрыты⁴². Оцените наличие или отсутствие патологии в других внутричерепных сосудах.
3. Для выявления паренхимальных сосудистых поражений, изучить полушария мозга, мозжечка и ствол мозга. Рассмотрим лакунарные поражения (диаметр 10 мм), ишемические или геморрагические инфаркты и кровоизлияния (диаметр 10 мм). При необходимости укажите размер в миллиметре, количестве и местоположении. Также учитывайте наличие или отсутствие субарахноидального кровоизлияния.

6. Контроль качества тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Agonal фактор оценка (AFS) колеблется от 0 до 2 и имеет важное значение в оценке качества тканей. Чтобы определить АФС, рассмотрим клинические условия, происходящие во время смерти (в частности, условия, определяющие ацидоз мозга) и продолжительность агонального состояния (внезапная смерть или длительная агония). Если АФС No 1, ткани мозга не может быть оптимального качества⁴³. Также рассмотрим мозг и CSF рН; если рН йлт; 6, ткани мозга не может быть оптимального^{качества 43,44}.

1. Проконтрикните, была ли смерть вызвана состояниями, которые могут повредить ткани мозга, включая гипоксию, затяжной ацидоз, механическую вентиляцию легких, многоохо органа, высокую температуру, тяжелую черепно-мозговую травму, прием нейротоксических веществ, сильное обезвоживание, тяжелую гипогликемию, эпилептическое состояние и длительную кому. Если одно из этих условий присутствует, назначьте 1 очко.
2. Проверить продолжительность агоальногоrapid состояния (быстро, если смерть происходит в пределах 1 slow ч, промежуточный, если смерть происходит между 1 и 24 ч, медленно, если агонное состояние длится более 1 дня). Если происходит промежуточная или медленная смерть, назначьте 1 очко.
3. Рассчитайте оценку AFS и измерьте CSF pH с помощью электродной иглы рН и рН ткани по поверхности рН-метра на ломтике мозга из каждой доли и на мозжечковой секции.

7. Замораживание тканей

1. Храните все ткани, чтобы быть заморожены во льду при 4 градусов по Цельсию. Затем, заморозить их быстро. Поместите их на предварительно размороженный алюминиевый лоток. Обложка с взаимосвязанной алюминиевой пластины, чтобы держать их плоскими. Положите их в жидкий азот при -120 градусов по Цельсию в течение 3 мин.
2. Поместите ломтики в полиэтиленовый пакет с соответствующим идентификационный код и номер ломтика. Разделите полиэтиленовые пакеты на три криогенные коробки (для правого полушария, левого полушария и ствола мозга) и храните при -80 градусов по Цельсию.

8. Фиксация тканей

1. Оберните ломтики в марлю один за другим, и положить ломтики в 10% фосфат буферного раствора формалина. Через 1 день замените раствор формалина свежим раствором. Оставьте их на 5 дней в холодной комнате при 4 градусов по Цельсию.
2. Храните все ломтики в целом и разделить только ломтики, содержащие гиппокамп и миндалины в двух частях(рисунок 3). Верхняя часть обоих ломтиков будет содержать лобную долей (R10a-L9a на рисунке 3); нижние части будут содержать соответственно: (1) миндалины, височной доли и базальных ганглиев (L9b на рисунке 3B), и (2) гиппокампа и часть височной доли (R10b на рисунке 3A). Это делается для поддержания отношений между различными структурами.
3. Поместите все секции в фосфатный буфер, по крайней мере 2 дня, чтобы вымыть и удалить перекрестные связывающие продукты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.

9. Обезвоживание, очистка, парафин встраивания и подготовки слайдов

1. Приготовьте повышение концентрации этилового спирта с 70% до 100%, ксилена и двух наборов расплавленного парафинового воска. Поместите секции мозга в автоматический процессор для обезвоживания, процедуры очистки и фильтрации парафина (используйте два различных протокола обработки тканей для макросов (срезы головного мозга и мозжечка) и микро-образцы (ломтики ствола мозга и другие небольшие образцы); Таблица 7). Встраивание ткани в парафиновый воск на металлическую или пластиковую форму.
2. Выберите разделы, чтобы нарезать для оценки всех областей интересов применения индекса Монтина для невропатологических^{характеристик 45} (Таблица 8). Затем нарежьте выбранные разделы.
3. Используйте микротом для саней для макрозекции и роторный микротом для небольших секций. Вырезать 5 мкм ломтиками для гематоксилина и эозин (H и E) окрашивания и 8 мкм ломтиками для других окрашивания и иммуногистохимии. Положите ломтики на три различных вида гистологических слайдов: 8,5 см х 11 см для самых больших ломтиков, 5 см х 7,5 см для средних ломтиков и классические 2,5 см х 7,5 см для самых маленьких.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.

10. Депараффинизация, гистологическое окрашивание и иммуногистохимия (IHC)

1. Выполните депарафинизацию, чтобы включить реакцию с aqueous растворами красителя. Выполните его с помощью ксилена и снижения концентрации алкоголя (5 мин на каждый шаг). Регидратировать в течение 5 минут с дистиллированной водой.
2. Используйте следующие гистологические окрашивания для оценки архитектурных и структурных аномалий тканей, а также клеточной морфологии: H и E (для сосудистых микроскопических поражений и воспаления), Cresyl Violet (NISSL; для потери нейронов), Luxol Fast Blue (LFB; для демиелинизации), Gallyas (для neuritic бляшек и нейропильных нитей).
3. Используйте иммуногистохимию (IHC) для того, чтобы подчеркнуть наличие конкретных целевых структур. Анти-NeuN и анти-GFAP используются для идентификации нейрональных и глиальных отсеков; 4G8, AT8, No-SYN и TDP-43 используются для выявления белков, которые агрегируются при нейродегенеративныхзаболеваниях (таблица материалов).
   1. Предварительная обработка dewaxed разделов с 3% H₂O_{2 в} течение 10 минут, то промыть в PBS. Выполните обработку поиска с помощью буфера цитратов 0,01 М рН 6 (в микроволновой печи последовательно в течение 2, 1 и 2 мин) для антигенов 4G8, SYN, TDP-43 и NeuN; использовать 70% мимической кислоты для 4G8 и Q-SYN. Прединцировать в течение 30 мин в 5% нормальной сыворотки козы.
   2. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию с первичным антителом. На следующий день после этого, промыть разделы в PBS перед инкубацией со вторичным антителом (Envision' System-HRP помечены полимера) при разбавлении 1:2 в PBS для 1 ч при комнатной температуре.
   3. Вымойте несколько раз в PBS и инкубировать в хромогенной системе с diaminobenzidine (жидкий DAB-Субстрат Хромоген системы) глядя на развитие реакции под микроскопом (увеличение 4-10x). Наконец мыть разделы в PBS. Счетчики секций в гематоксилин, обезвоживание и coverslip с DPX монтажа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 8 обобщает стандартный протокол. Выполните Окрашивание на всех секциях, в то время как специальные/специфические пятна и реакции используются на отдельных участках. Выбранные случаи требуют дополнительных областей или реакций. Таблица материалов показывает детали антител, используемых для IHC.

11. Основная невропатологическая характеристика

ПРИМЕЧАНИЕ: Изучаются неспецифические изменения тканей головного мозга, сосудистая патология, патология болезни Альцгеймера (АД), не-АД ТАУОПАТИЯ, синуклеинопатии, патология ТДО ДНК-связывающего белка (TDP-43) и поражения гиппокампа. Оптический микроскоп, подключенный к камере, используется для обнаружения паренхимальных микроскопических повреждений. Гистологическая оценка проводится той же командой квалифицированного персонала по невропатологии, включая профессора неврологии, невролога и патологоанатома. Он основан на модифицированном подходе Монтина⁴⁵ (Таблица 8) также в том числе: (1) Неоднородные не-AD TAUopathies, которые представляют собой патологическую отличительную черту Фронто-временной дегенерации доли (FTLD), связанные с TAU месторождений: Болезнь Пика, несвободная первичная прогрессивная афазия (TAU-nfPPA), Прогрессивный надядерный паралич (PSP)^46,,47 и Кортико-Базальная дегенерация (CBD)⁴⁸. Кроме того, не-AD TAUopathies включают условия, связанные со старением и без определенного клинического значения, такие как первичная возрастная ТАУопатия (PART)⁴⁹, Возраст связанных TAU Астро-Глиопатия (ARTAG)⁵⁰, аргирофильные зерновые^{заболевания 48}. (2) Леви типа синуклеинопатии (LTS), которая связана с болезнью Паркинсона (PD) и Деменция органов Леви (LBD). Для поиска LTS примените следующие иерархические шаги: сначала обонятельная лампа, ствол мозга, миндалина/височная кора; если предыдущие области являются положительными, добавить лимбических структур (образование гиппокампа, энторинал коры, передней cingulate), средняя лобная извилина, нижняя теменной лобуле и затылочной^{коры 45}. Если клинические особенности корковых LBD присутствуют (т.е. колебания и / или галлюцинации), рассмотреть лимбических структур и изокортекса для первого шага. (3) TDP-43 депозиты, патологическая отличительная черта FTLD, связанные с TDP-43 месторождений: поведенческий вариант Фронто-временной деменции (bvFTD), семантической деменции (SD или svFTD), TDP-nfPPA и FTD-Мотор Нейрон болезни (FTD-MND). IHC для TDP-43 выполняется на следующих участках: миндалина, гиппокамп, энторхинальная кора и средняя лобная извилина; в случаях с подозрением на клиническую FTLD, рассмотреть вопрос о рассмотрении других^{разделов 51}.

1. Оцените неспецифические изменения тканей мозга в отдельных разделах с использованием H и E, NISSL, LFB и IHC для GFAP и NeuN. Рассмотрим нейронной редкофракции, воздухоплавания нейронов, губчатый эффект, глиоз, потеря миелина, наличие или отсутствие воспалительных или опухолевых инфильтраций. Укажите распространенное местоположение этих изменений.
2. Для обнаружения микроскопических сосудистых поражений,изучить H и E и LFB слайды, включая по крайней мере два полушария макро-секций (первый проход через маммиллярные тела (Charcot вырезать) с лобной и височной долей, базальные ганглии, передний таламус, миндалина, и второй, проходящий через затылочную долей), "гениальный" раздел гиппокампа формирования, один мозжечковый раздел, и все три основных разделов ствола мозга (через substantia nigra, локус coeruleus и DMNV).
   1. Обнаружить болезни мелких сосудов, включая артериолосклероз, липохиалиноз, периваскулярное пространство дилатации, потеря белого вещества, лептоменингеальной и / или паренхимальной и / или капиллярной амилоидной ангиопатии. Укажите классификацию (0-3) и распространенное^{местоположение 42,52}. Рассмотрим наличие или отсутствие утечки гемозидрина, микротренов и микроинфарктов.
   2. Оцените вклад повреждения сосудов в когнитивные нарушения с помощью иерархической схемы Deramecourt (изменения стенок сосудов – болезнь малых сосудов – макроскопические инфаркты). Для этой оценки рассмотрим лобной и височной доли разделе, базальные ганглии и гиппокампа (оценка 0-20)³⁰. Кроме того, оценить вероятность того, что церебральные сосудистые заболевания способствовали когнитивных нарушений с помощью VCING оценка (низкий-промежуточный-высокий), полученные с учетом полушария макроскопических инфарктов и заболеваний малого сосуда затылочной доли, включая умеренной до тяжелой артериолоклероз и амилоидной^{ангиопатии 53}.
3. Оцените патологию АД с помощью IHC (4G8) для распространения амилоидов. Определите этапы Тала (1-5)⁵⁴, совокупный амилоидный скоринг (0-3)⁴⁵, и морфология на место (диффузный, координационный, cored).
   1. Оцените патологию AD Tau с помощью IHC (AT8) и опишите распространенную морфологию на объект (нейрофибриллярные клубки, нейропильные нити, неуритические бляшки). Определите стадию Браака (I-VI; положительный знак указывает на наличие дополнительных областей гиперфосфорилированной патологии Тау, не следуя иерархии Браака)⁵⁵ и совокупный балл (0-3)⁴⁵.
   2. Оцените неуритические бляшки с помощью окрашивания Галляс и оценка CERAD (0-3)⁵⁶. Затем определите вероятность невропатологических особенностей, соответствующих клиническому синдрому АД, используя Amyloid-Braak-C ERAD (оценка ABC 0-3): none-low-intermediate-high⁴⁵.
4. Используйте AT8 IHC, чтобы заметить наличие или отсутствие патологии NON-AD TAU, указывающей распространенное местоположение и своеобразную морфологическую картину. Рассмотрим нейрональные включения, такие как клубки формы пламени или глобозы, сферически-шарбулярные включения (т.е. тела Пика)⁵⁷, нейропиловые нити, дистрофические невриты, аргирофильные зерна; и глиальные включения, такие как tufted астроциты, колючие астроциты, астроцитные бляшки, спиральные тела, шаровые^{включения 58,59}.
5. Используйте IHC для обнаружения LTS (тела Леви, бледные тела и невриты Леви) на участках в примечании выше. В случае положительности, применить mcKeith в классификации (0-4) для оценки тяжести поражений⁶⁰; затем используйте этапы Beach (I-IV) для топографического распределения (обонятельные лампы, мозг преобладающий, лимбический преобладающий, неокортикальный)⁶¹. Сравните этапы Бич и Браак, чтобы определить связь между LBD и АД патологии^60,61,62.
6. Рассмотрим наличие или отсутствие glial цитоплазмических включений (GCI; не Lewy типа глиальной синуклеинопатии), которые являются патологическими отличительной чертой множественной атрофии системы (MSA) и указать их^{распространенное местоположение 63}.
7. Используйте TDP-43 IHC для обнаружения отложений TDP-43 на участках, о которых говорится в записке выше. Определите распространенную морфологию на объект: нейронные цитоплазмические включения (NCIs), включения дистрофических норитов (DNs), ядерные включения (NIIs). Определить закономерность: A (преобладающие NCIs и DNs: bvFTD и nfPPA); B (преобладающие NCIs: FTD-MND); C (преобладающие длинные DNs: svPPA и bvFTD)^51,64. Используйте схему Нельсона, чтобы определить наличие TDP-43 в случаях AD^65,66.
8. Оцените гиппокамп, начиная с субикулума и сектора Зоммер (CA1). Используйте счет Раурамаа (0-4): 1-2 для микроинфарктов и макроинфарктов, соответственно; 3-4, соответствующие умеренной и тяжелой потере нейронов, соответственно, и гиппокампа атрофии (гиппокампа склероз: HS). Укажите на наличие или отсутствие патологических белковых отложений (в порядке уменьшения частоты: PTAU, TDP-43, q-syn)⁶⁷.
9. Определите невропатологический диагноз и введите все патологические данные в базу данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комнаты, в которых хранятся биологический материал и разумные данные доноров, всегда заперты, и только уполномоченный персонал может войти, чтобы гарантировать как безопасность, так и конфиденциальность. Замороженный биологический материал хранится в запертых морозильных камерах при температуре -80 градусов по Цельсию, в то время как ткани, закрепленные на формалине, хранятся в запертых шкафах при комнатной температуре. Используются двойные моторные морозильные камеры, а также камера резервного двигателя. Кроме того, для обеспечения того, чтобы морозильные камеры всегда работали, им предоставляется система мониторинга 24/7, которая приводит в воздух сигнализацию. Аварийный генератор также присутствует, в случае сбоя питания. Участники анонимизированы с числовым кодом для обеспечения их конфиденциальности; не уполномоченный персонал не может вернуться к личности доноров и их разумным данным. Вся информация собирается в защищенной паролем базе данных; кроме того, неимовеерная копия этих данных хранится в заблокированных архивах.

Representative Results

Доноры мозга и данные по сбору мозгов
В 2014 году набор доноров начался во время второго последующего исследования InveCe.Ab, в котором приняли участие 1010 из 1061 субъекта, имеющего право голоса (процент ответов: 93%; Рисунок 1). Что касается продольного исследования InveCe.Ab, то 290 из 1010 участников (28,7%) согласились зарегистрироваться в качестве доноров (160 уже зарегистрированных и 130, которые выразили свое намерение зарегистрироваться). Уровень образования среди доноров выше, чем у не-доноров (66% наших доноров имеют средне-высокий уровень образования: 8 или более лет в школе), что свидетельствует о важности культуры и образования. Многие "здоровые" люди также проявили интерес к программе донорства мозга. Большинство наших «контрольников» признаются, что могут сочувствовать больному и их родственникам, и хотят каким-то образом внести свой вклад в исследования, ведущие к лучшему пониманию неврологических заболеваний. Самоотверженные люди, которые регулярно участвуют в программах донорства крови или костного мозга в течение жизни, более открыты к идее донорства мозга, как и люди, которые уже согласились пожертвовать органы после смерти. Они знают о том, что, хотя не будет живого получателя, их пожертвование будет иметь большое значение для научных исследований. Другим фактором, способствующим донорству мозга является предпочтение быть кремированы. В настоящее время донорская популяция ABB включает в себя в общей сложности 427 человек (290 участников InveCe.Ab , 137 добровольцев или пациентов из Гериатрической больницы ASP Golgi-Redaelli), 75% из которых 70 лет и старше. Существует явное преобладание женщин (64%) и психически нетронутых пожилых людей (около 85%). К настоящему времени из 40 умерших доноров (67% вскрытия) было собрано 27 мозгов; 13 субъектов не были взготовлены по различным причинам, включая непредоятие смерти АББ, тяжелые травмы, ведущие к разрушению мозга, опасные инфекционные заболевания и 1 случай ХДД; 4 субъекта аннулировали свое согласие. До сих пор 24 из 27 собранных мозгов получили полную невропатологическую характеристику с определенным клинико-патологическим диагнозом, в то время как остальные 3 мозга все еще находятся на обследовании(таблица 3). Дополнительные данные по сбору мозгов от ABB включают: средний возраст смерти (81 год); средний посмертный интервал (10,37 ч); средний рН CSF (6,64); средний рН ткани (6,07); средний вес мозга (1012,86 г); AFS был 1 в 90% умерших субъектов.

Нейрофизиологические биомаркеры (ЗЕЭГ)
ЗЭЭГ является частью многомерного подхода. Это простой, неинвазивный и недорогой метод, с вероятным потенциалом для обнаружения перехода от легкого нейро-когнитивного расстройства (мягкий НИЗ или MCI) к основным нейро-когнитивных расстройств (основной НИЗ или слабоумие). На протяжении всего нашего многомерного подхода проводится простое обследование КЭЭГ и проверяется его возможная роль в качестве биомаркера для слабоумия. Наши данные по предварительной серии из 36 доноров мозга (18 нормальных пожилых людей (NOLD), 11 легкой НИЗ и 7 основных НИЗ; 9 из которых с определенным невропатологическим диагнозом) показывают, что средний процент альфа-ритма был значительно ниже в основных НИЗ по сравнению с легкой НИЗ (р: 0,002) и NOLD (р: 0,033). И наоборот, более медленные частоты ЭЭГ (theta/delta) были значительно выше в основных НИЗ, чем в NOLD/mild-NCD (см. пример случаев на рисунке 4). В нашей серии, распределение ритма ЭЭГ может дифференцировать NOLD/mild-NCD субъектов от основных пациентов NDC, независимо от этиологического диагноза, предполагая, что ритмы мозга находятся под влиянием бремени дегенеративных поражений, независимо от типа поражения. Действительно, 7 из 9 исследованных мозгов показывают слабоумие из-за смешанных патологий. Специфика, касающаяся характера патологии, по-видимому, низка, и электрические ритмы мозга, как представляется, в большей степени зависит от бремени и топографии поражений, чем от их молекулярного характера (Poloni, et al. proceedings of AD/PD 2019, Lisbon, данные неопубликованные).

Эмблематические случаи
Протокол ABB может быть полезным и необходимым в некоторых случаях и условиях. Примером может быть наличие асимметричной патологии(рисунок 5). Наш протокол очень подходит для выявления и правильной характеристики этого вида патологии. До сих пор мы исследовали 4 мозга с асимметричным участием, некоторые из которых показаны на рисунке 5. Макроскопически, атрофия правойстороны (рисунок 5A) присутствует в одном случае с тяжелой желудочковой дилатации в правой корональной секции (рисунок 5C) по сравнению с левой стороной (Рисунок 5B). Другой случай отображает инфаркт правого полушария(рисунок 5D), а другой показывает явную атрофию правого маммильного тела(рисунок 5E). На микроскопическом уровне, случай FTLD показывает асимметричный TDP-43 положительность, которая является более интенсивным в правой лобной стороне по сравнению слевой (рисунок 5F,G).

Macrosections (Рисунок 6A,C) используются, чтобы получить общее представление. Окрашивание LFB помогает определить потерюмиелина (рисунок 6D)и IHC как для 4G8, так и для AT8(рисунок6B) позволяет оценить распределение иммунореактивности в полушариях невооруженным глазом. В серии ABB, мозги родственных индивидуалов имеющиеся, что можно сравнить.

На рисунке 7, микроскопические изображения разделов из мозга однородных близнецов помещаются бок о бок для более легкого сравнения (twin 1 (BB137): Рисунок 7A,C,E,G,I,K против близнецов 2 (BB138: Рисунок 7B,D,F, H,J,L). Как и в аналогичном предыдущем исследовании⁶⁸, оба близнеца были сравнены по клиническим и невропатологическим оценкам. Близнецы сообщили тот же диагноз основных НИЗ из-за нескольких этиологий, но они умерли два года друг от друга, в возрасте 83 (деменция начала в 72 лет) и 85 (деменция начала в 76 лет), соответственно. Их мозг имеет очень похожую невропатологическую картину, с высокой патологией АД, связанной с амилоидной ангиопатией. Иммунореактивность 4G8 рассеивается по всей коре головного мозга(рисунок 7A,B)и базальных ганглиев(рисунок 7C,D) с диффузными, плотными и ядром бляшек. Он также четко обнаружен как в паренхимальных, так и в лептоменинговых сосудах коры головного мозга имозжечка (рисунок 7A,B,G-J). При более высоком увеличении, capCAA ясно видно(рисунок 7G,H). Иммунопозитивные бляшки, клубки и нити AT8 рассеиваются в темных кортитах обоих мозгов(рисунок 7E,F,L). Что касается ламиноидной и NFT патологии бремя, близнец 1 считается Тал этап 3 (монтин A2) и Braak этап 5 (монтин B3), в то время как близнец 2 считается Тал этап 5 (монтин A3) и Braak этап 6 (монтин B3). Они имели те же годы образования и подобный образ жизни; однако, один (BB137) был женат и стал овдоветь вскоре после этого, в то время как другой был один (BB138). Они показали разную степень клинико-патологическую изменчивость с одним и тем же началом и одним и тем же течением заболевания, но в разные сроки. Это подтверждает тот факт, что, хотя генетический компонент играет ключевую роль в развитии болезни, эпигенетическая и экологическая составляющая имеют основополагающее значение для определения несколько иных проявлений.

В некоторых случаях клиническая картина не соответствует невропатологическим особенностям. На рисунке 8два различных случая были клинически определены как случаи АД; нейропатологические анализы показывают, в дополнение к промежуточной патологии АД, диффузной позитивности для К-син. В первом случае, тяжелые LTS (Пляж IV) картина показывает Леви органов однородно найти по всей извилины cingoli (Рисунок 8А) и в SN как цитоплазмические включения в окружении нейромеланина (Рисунок 8B,C). Во втором случае тела Леви, связанные с невритами Леви, диффузно распределены в миндалине(рисунок 8D,E)и в ядре Мейнерта(рисунок 8F,G), предполагая лимбический диагноз LTS. Действительно, топография поражений, а не их молекулярная природа производит клинические проявления.

Рисунок 1: Диаграмма потока исследования Inve.Ce.Ab. На базовом уровне общая распространенность деменции составила 3%. В ходе последующих мер показатели распространенности составили: 4,4%⁽¹шт.)^69,7,1% (2^ndтыс.), 10,9% (3-е место).^rd Восьмилетняя заболеваемость составила 15 р/1000/год (95% КИ: 13-18 р/1000/год). Набор доноров начался в 2014 году (во время второго последующего процесса). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Протокол вскрытия головного мозга (A), мозжечка (F) и ствола мозга (H). Круг Уиллиса и одного полушария показаны в (E) и (B). Коронные разрезы правой(C)и левой стороны(D) пронамеровы и альтернативно зафиксированы ("F") и заморожены ("C"). Показаны секции стрелочковогомозжечка (G)и аксиальные секцииствола мозга (I). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Показаны корональных ломтиков фиксированной правой (А) и левой (B) фронто-височной доли.
Гиппокамп и височная доля (A, R10b) делятся с лобной доли (A, R10a) на правом ломтике. На противоположном ломтике миндалина и базальные ганглии (B, L9b) делятся от лобной доли (B, L9a). Шкала бар: 1,7 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Относительное спектральное распределение энергии в субъектах НОЛД и основных НИЗ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Репрезентативные изображения асимметричных патологий. (A)Первый случай: мозг с правой атрофией. Коронные ломтики(B) и (C) показывают правостороннее расширение желудочков, особенно очевидное в разделах 10-12 (C, стрелки). В разделах (B) и (C), "F" означает фиксированный и "C" для замороженных (на итальянском языке: congelato). (D)Второй случай: тяжелый инфаркт правого полушария. (E)Третий случай: атрофия правого маммильного тела (стрелка). (F, G) Четвертый случай: микроскопические изображения показывают более интенсивную иммунореактивность TDP-43 в лобной правой коре (G) по сравнению с левой (F) в случае фронтотемпоральной деменции. Шкала баров: 183 мкм (F, G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Макрозекции. (A, C) Корональные ломтики фиксированной фронто-височной доли (A) и свежей теменной доли (C). (B)Гистологическая фронто-временная секция с иммунолабелом антитела AT8. Иммунореактивность четко распределена по всей коре головного мозга, но более интенсивна в височной доле. (D)Гистологический теменной разделе окрашенных с LFB. Стрелка указывает на область демиелинизации белого вещества. Шкала бар: 1,55 см (B, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Близнецы. Сравнение мозга двух однородных близнецов: BB137 (A, C, E, G, I, K) и BB138 (B, D, F, H, L). Невропатологические фотографии очень похожи. (A) и (B) показывают диффузную положительность 4G8 в затылочной доле с амилоидным налетом, лептоменингелом (стрелки) и паренхимальными (наконечниками стрел) сосудами. Капиллярная амилоидная ангиопатия (звездочки) хорошо распознается при более высоких увеличениях(G)и (H). 4G8 диффузно распространяется по всей базальной ганглии (C, D) и вокруг лептоменинговых сосудов мозжечка (I, J: стрелки). Иммунореактивность AT8 определяет клубки, нити и бляшки (стрелки) в теменной коре(E, F). Галляс окрашивания (K) показывает neuritic бляшки, как AT8 антитела (L) делает. Шкала баров: 470 мкм (A-F; I-J); 90 мкм (G-H; К-Л). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 8: Клинический против невропатологического диагноза. В этой цифре, два различных случаях, в которых невропатологический диагноз отличается от клинического диагноза. Иммунореактивность для К-син является неожиданным результатом. (A-C) Первый случай: Gyrus cingoli (A) показывает однородное распределение тел Леви в SN (B-стрелки). В нейроне SN, двойное тело Леви окружен нейромеланин показано (C). (D-G) Второй случай: диффузный позитив для К-син обнаруживается в миндалине (D, E) и ядре Meynert (F, G). Сотовые тела и невриты Леви (звездочка) хорошо отмечены. Шкала баров: 154 мкм (A, D, F); 37 мкм (B, E, G); 20 мкм (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 9: Шаблон соглашения о передаче. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

		N	%
Гендерного	Мужчин	607	45.9
	Женщин	714	54.1
Когорта рождения	1935	236	17.8
	1936	219	16.6
	1937	264	20.0
	1938	305	23.1
	1939	297	22.5
Семейное положение	Женат	872	66.1
	Сожительство	13	1.0
	Разлучены/разведены	29	2.2
	Овдовевших	325	24.6
	Одного	80	6.1
Первичное жизненное занятие	Работники синих воротничков	666	50.6
	Белые воротнички работников	459	34.9
	Домохозяйка	191	14.5
Годы образования	5 лет	754	57.2
	5 лет	565	42.8

Таблица 1: Социально-демографические особенности участников исследования InveCe.Ab.

КРИТЕРИИ ВКЛЮЧЕНИЯ	КРИТЕРИИ ИСКЛЮЧЕНИЯ
Все лица в возрасте 18 лет и старше	Люди, которые открыто отказываются от донорства
Люди, живущие на территории Аббиатеграссо	Люди, которые живут за пределами региона Ломбардии
Добровольцы, да которые дают согласие самостоятельно	Расхождения между потенциальным донором и NOKs пожелания в отношении донорства мозга
Субъекты, не могут принять решение с разрешения НОК	Ситуации, которые значительно разрушают консистенцию мозга
Смерть по естественной причине	Клинический курс хт;2 лет, если не исключена возможность прионные заболевания
	Смерть, вызванная убийством или самоубийством, с необходимостью отчета коронера
	Посмертный интервал 30 часов

Таблица 2: Критерии донорства мозга.

НЗ	Секс	КОД BB	CODE InveCe	Возраст	Эду (годы)	клиническая диагностика			Cdr	Afs	PM (часы)	рН ткани	рН ликер	невропатологический диагноз
1	F	BB 37		87	5	Основные НИЗ из-за АД (BPSD)			5	2	29	Nd	Nd	Высокая патология АД, умеренный SVD, TDP43, ctx LTS, HS
2	F	BB 105		94	5	Майор-НИЗ из-за АД			5	1	5	5.72	6.78	Высокая патология АД, мягкий SVD, HS
3	F	BB 137		83	3	Основные НИЗ из-за нескольких этиологий (AD-VaD)			5	1	16	Nd	Nd	Высокая патология АД, умеренное СВД, затылочной инфаркт, CAA-capCAA
4	М	BB 181		71	13	Основные НИЗ из-за АД (BPSD)			5	2	3	Nd	Nd	Тяжелые LTS (пляж IV), промежуточная патология АД, mildSVD, mCAA
5	М	BB 115	I 636	78	18	Майор-НИЗ из-за АД			5	1	6	Nd	Nd	Промежуточный АД, умеренный SVD, Воспаление, ILBD (Пляж IIa), HS
6	F	BB 23	I 65	79	3	Основные НИЗ из-за сосудистых заболеваний			5	1	14	Nd	Nd	Тяжелая и широко распространенная CAA, промежуточная патология АД
7	М	BB 102	I 412	79	8	Основные НИЗ из-за сосудистых заболеваний			3	1	8	Nd	Nd	Сосудистая деменция, ILBD
8	М	BB 224	I 16	80	3	Основные НИЗ из-за многочисленных этиологий			5	1	11	Nd	5.99	Умеренный SVD, Низкая патология AD, ILBD (Пляж IIa), HS
9	F	BB 47		78	5	Основные НИЗ для нескольких этиологий (LBD-VaD BPSD)			5	0	8	Nd	Nd	Высокая патология АД, патология BG TAU, ARTAG, мягкий SVD, HS
10	F	BB 153	I 965	79	5	Милая НИЗ (смерть от рака толстой кишки с широко распространенными метастазами)			0.5	1	8	Nd	6.73	Низкая патология АД, умеренный BG-SVD
11	М	BB 118	I 1211	79	13	NOLD (смерть от рака печени)			0	2	3	Nd	6.51	Умеренное СВД
12	М	BB 236	I 521	80	3	Основные НИЗ из-за АД (BPSD)			4	1	15	Nd	6.15	Высокая патология АД, тяжелые BG-SVD (несколько микротрубок), HS
13	F	BB 138		85	3	Основные НИЗ из-за нескольких этиологий (AD-VaD BPSD)			4	0	15	Nd	6.75	Высокая патология АД, умеренное SVD, CAA, лимбический TDP43
14	М	BB 109	I 876	79	8	NOLD (смерть от опухоли головного мозга - GBL)			0	1	16	Nd	6.4	Низкая патология АД, ILBD (Пляж IIa), мягкий SVD
15	F	BB 271		84	8	Основные НИЗ из-за АД (BPSD)			4	1	2	Nd	6.7	Промежуточный АД, лимбический LTS, умеренный BG-SVD, mCAA, TDP
16	F	BB 71	I 1080	79	8	NOLD (смерть от сердечной недостаточности)			0	0	6	Nd	6.26	Умеренный BG-SVD, ILBD, Эми TDP, низкий AD
17	F	BB 189	I 858	80	5	Основные НИЗ из-за АД (BPSD)			3	0	20	Nd	6.42	Промежуточный AD, CAA-capCAA, TDP43, умеренный BG-SVD, HS
18	F	BB 278	I 924	80	5	Основные НИЗ из-за LBD (BPSD)			3	1	5	6.02	7.05	Промежуточный AD, лимбический LTS (пляж IV), лимбический TDP, HS
19	F	BB 247		104	8	Основные НИЗ из-за нескольких этиологий (вероятно, смешанная патология)			3	0	6	6.48	7.22	ПАТОЛОГИЯ ТАУ (PART-ARTAG), HS
20	М	BB 85	I 19	83	10	Основные НИЗ из-за LBD (BPSD)			3	1	9	6.26	7.3	Тяжелые лимбические LTS, промежуточные АД, Умеренный SVD, тяжелые CAA-capCAA, HS
21	F	BB 14	I 222	82	8	Основные НИЗ из-за нескольких этиологий (AD-VaD)			2	1	11	5.59	6.4	Промежуточная патология АД, Умеренное СВД
22	F	BB 282		76	8	Основные Фронтотемпоральные НИЗ (nfPPA BPSD)			3	1	10	6.07	6.39	TDP (тип A), ILBD, умеренный SVD, низкий AD, HS
23	F	BB 154	I 1079	80	5	NOLD (смерть от рака с широко распространенными метастазами)			0	1	5	6.49	6.9	умеренное СВД, CAA, низкий АД, лимбический энцефалит
24	F	BB 290		65	13	основные Фронтотемпоральные НИЗ (bvFTD BPSD)			5	1	12	5.73	6.42	TDP (тип A)
25	F	BB 210		89	8	Основные НИЗ из-за АД (BPSD)			5	1	15	5.94	6.4	в процессе
26	М	BB 293		75	18	Основные Фронтотемпоральные НИЗ (bvFTD BPSD)			5	1	8	6.14	6.83	в процессе
27	F	BB 99	I 1370	79	9	NOLD (смерть от септического шока)			0	2	14	6.3	7.12	в процессе
	M/F			Означает	Означает				Означает	Означает	Означает	Означает	Означает
	0.5			81	7.7				3.2	1.0	10.4	6.1	6.6

Таблица 3: Клиническая/нейропатологическая диагностика серии ABB. BB: Мозг банка; edu (годы): учебные годы; CDR: Клиническая деменция Рейтинг (0 - нет деменции; 0,5 - легкие когнитивные нарушения; 1 - легкая деменция; 2 - умеренное слабоумие; 3 - тяжелое слабоумие; 4 - очень тяжелое слабоумие; 5 - терминальная деменция); AFS: Оценка agonal фактора; PM (часы): Посмертные часы; nd: не сделано; M/F: Мужчины/женщины; BPSD: Поведенческие и психологические симптомы деменции; VaD: Сосудистая деменция; NOLD: Нормальные пожилые люди; GBL: Глиобластома; nfPPA: не свободно Первичная прогрессивная афазия; bvFTD: поведенческий вариант фронтотемпоральной деменции; СВД: Болезнь малых сосудов; LTS: Леви Тип Синуклеинопатия; HS: Гиппокампальный склероз; CAA: церебральная амилоидная ангиопатия; capCAA: капиллярная CAA; mCAA: менингеальный CAA; ILBD: Случайная болезнь тела Леви; БГ: Базаль Ганглия; ARTAG: Возрастная АСТРО-глиопатия ТАУ; PART: Первичная возрастная ТАУопатия; Эми: амигдала.

Домена	Название теста
Депрессии	Центр эпидемиологических исследований Шкала депрессии (CES-D)
Глобальное познание	Мини-ментальный государственный экзамен (MMSE)
Вербальная и зрительная память	Бесплатный и Cued Селективный Напоминающий Тест
	Тест Корси
	Рей-Остерриет Комплекс Рисунок (ROCF) Напомним,
Внимание/ психомоторная скорость	Тропа, делая A
	Внимание Матрицы (4)
Языко-семантическая память	Семантическая вербальная беглость (цвета, животные, фрукты, города)
Исполнительные функции	Тропа, делая B
	Цветные матрицы Ворона
Висуопространственные способности	Тест по рисованию часов (CDT)
	Рей-Остерриет Комплекс Рисунок (ROCF) Копия

Таблица 4: Нейропсихологическая оценка доноров мозга.

Метаболитов

Полный анализ крови

Холестерин ЛПВП и ЛПНП

Триглицеридов

Глюкозы

Гликированный гемоглобин (HbA1c)

Гомоцистеина

Кобаламин (Витамин В12)

Фолат

Альбумина

Мочевины

Креатинина

Трансаминазы (ALT и АСТ)

Гамма Глутамыл трансфераза

Гормон стимуляции щитовидной железы (ТТГ)

Витамин D (25-гидрокси-витамин D)

C-реактивный белок (CRP)

Электролитов

Таблица 5: Метаболическая панель для доноров мозга.

ИМЯ ГЕНА	dbSNP
Аполипопротеин E (APOE)	rs429358
	rs7412
Каталаза (CAT)	rs1001179
Супероксид дисмутаза 2 (SOD2)	rs4880
Ангиотенсиноген (AGT)	rs699
Сиртуин 2 (SIRT2)	rs10410544
Транслокация внешней митохондриальной мембраны 40 (TOMM40)	rs2075650
Преодоление интегратора 1 (BIN1)	rs7561528
Катехол-О-метилтрансфераза (КОМТ)	rs4680
Метилентетрагидрофолатная редуказа (MTHFR)	rs1801133
	rs1801131
Мозг, полученный нейротрофический фактор (BDNF)	rs6265
семейство носителей 6, член 4 (SLC6A4 или 5HTT)	Гидрокситриптамин транспортер ген связанных полиморфных области (5-HTTLPR)
	rs25531

Таблица 6: SNPs проанализированы для доноров мозга InveCe.Ab.

Процесс	Решение	Длительность
		ОБРАЗЦЫ МАКРО	МИКРО-ОБРАЗЦЫ
Фиксации	10% БУФЕРНЫЙ ФОРМАЛИН	8 дней при 4 кк	8 дней при 4 кк
Стиральная	ФОСФАТНЫЙ БУФЕР	2-15 дней при комнатной температуре	2-15 дней при комнатной температуре
Стиральная	H2O ВАШ	2-3 ч, водопроводная вода	2-3 ч, водопроводная вода
Обезвоживания	ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ 70%	24 ч	8 ч
Обезвоживания	ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ 80%	24 ч	4 ч
Обезвоживания	ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ 90%	60 ч (обычно в выходные дни)	4 ч
Обезвоживания	ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ 95%	12 ч	4 ч
Обезвоживания	ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ 95%	12 ч	4 ч
Обезвоживания	ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ 100%	6 ч	4 ч
Обезвоживания	ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ 100%	6 ч	4 ч
Очистка	КСИЛЕН I	12 ч	10 ч
Очистка	XYLENE II	12 ч	10 ч
Проникновения	ПАРАФФИН I	12 ч	11 ч
Проникновения	ПАРАФФИН II	12 ч	11 ч
Внедрение	Парафин

Таблица 7: Протокол обработки тканей ABB.

Регионе	Н И Е	КРЕСИЛ ВАЙОЛЕТ	LFB	ГАЛЛЯС	4G8	AT8	К-СИН	ТДП-43	Нойн	GFAP
МОЗГОВТЕМ
Медулла-Дорсаль Моторное Ядро Вагуса	X					X	X
Понс - Локус Курулей	X					X	X
Мидбрин - Субстантия Нигра	X				X	X	X
Мозжечка
Мозжечковая кора и ядро дентата	X	X	X		X
Головного мозга
Средняя лобная извилина	X	X	X		X	X	X	X
Базал Ганглия и ядро Мейнерта	X	X	X		X				X	X
Cingulate, передняя	X	X	X		X		X		X	X
Миндалина	X					X	X	X	X	X
Таламус и Субталаминое ядро	X					X
Высший и средний височный гири	X	X	X	X	X	X	X		X	X
Гиппокамп и энториналь коры	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Нижняя теменной лобуле	X	X	X	X	X	X	X
Затылчной коры	X		X		X	X	X
Обонятельная лампочка	X						X

Таблица 8: Оценка регионов, окрашивания и иммуногистохимии.

Discussion

Критические шаги в протоколе
Наша цель состоит в том, чтобы получить, охарактеризовать и хранить ткани хорошего качества, поступающие от субъектов с подробной историей, полученной от продольного наблюдения. Для достижения этой цели необходимо заниматься следующими ключевыми аспектами. Как описано выше, протокол начинается с набора доноров, что является первым важным шагом. Затем необходимо, чтобы доноры продолжали последующую программу и поддерживать притон к проекту с течением времени до фактического донорства мозга. В момент смерти необходимо, чтобы сотрудники АББ были незамедлительно уведомлены о том, что в течение 24 часов она должна созвать группу по вскрытию, что имеет важное значение для надлежащего качества тканей. Свежая резка полушарий головного мозга требует постоянной руки и специфической подготовки. Чтобы избежать повреждения клеток, вызванного медленным замораживанием и получить хорошее качество ломтиков для криостата и омичи, важно, чтобы они были заморожены быстро. Учитывая скорость проникновения раствора формалина (1 мм/час), для сохранения антигенности тканей время замачивания одного ломтика сведено к минимуму.

Устранение неполадок метода
Для решения упомянутых выше критических шагов мы предлагаем следующий подход. Донор вербовки и присоединения к последующей деятельности: Есть несколько факторов, которые препятствуют донорству мозга, включая опасения повреждения фигуры тела, чистоты и целостности, или возможность чувствовать боль после смерти. Некоторые даже опасаются, что вскрытие может быть проведено в то время как они все^{еще живы 70,71}. Озабоченность по поводу срыва похорон и финансового бремени также^{присутствуют 72}. Кроме того, отсутствие у медицинского персонала знаний о посмертных процедурах и неспособность решить проблемы потенциальных доноров или их НОК могут препятствовать регистрации. Все эти факторы могут привести к низкому уровню информированности с низким числом зачисленных участников и высокой вероятностью потери доноров с течением времени. Действительно, программа набора доноров должна быть эффективной в распространении информации, вселяя доверие и убеждая людей регистрироваться и поддерживать высокие показатели последующего участия. По нашему опыту, это делается путем тщательного отбора потенциальных доноров и тщательного объяснения целей BB. Мы предлагаем образовательную деятельность и чуткий подход, обращаясь к страхам и потребностям как здоровых людей, так и людей, затронутых нейродегенеративными заболеваниями, и их семей. Мы считаем, что потенциальные доноры с большей вероятностью дадут свое согласие, когда к нам обращаются лично. Личные подходы создают отношения, основанные на взаимном доверии и уважении, которые имеют основополагающее значение для достижения высокого процента регистрации для донорства мозга и последующих оценок. Высококвалифицированный персонал с сильным чувством этики сначала подходит к потенциальному донору, обсуждает возможность донорства мозга после смерти, объясняет ценность тканей человеческого мозга для нейронаучных исследований и разъясняет любые сомнения относительно посмертных процедур. Не менее важно и благоприятное из уст в уста. После сбора мозгов, надлежащее внимание и уход уделяется повторной компенсации трупа. Важно проявлять уважение и благодарность к умершему человеку, мягко рассматривая труп. Через несколько месяцев после этого, встреча запланирована сообщить результаты невропатологического анализа, когда просили члены семьи.

Время смерти и сбора мозгов: Когда человек принимает, они становятся донорами и получают удостоверение личности с номером, чтобы связаться 24 часа в сутки, 7 дней в неделю (номер приема ASP Golgi-Redaelli Гериатрическая больница, которая связана с нами). Кроме того, родственникам дается клейая бирка, которая будет использоваться в случае госпитализации. Похоронные агентства этого района были ранее проинформированы о том, чтобы доставить тело в учреждения АББ, где вызвана группа по вскрытию. Команда вскрытия состоит из патологоанатома, невролога и/или нейробиолога, а также специалиста по анатомическим комнатам, которые ежедневно по вызову с 6 утра до 11 вечера; некоторые студенты-стажеры также часто присутствуют, чтобы помочь и сфотографировать.

Точность и консистенцию свежих процедур резки обеспечивает участие тех же двух операторов (невролог и патологоанатом), которые разработали метод и имеют опыт работы в невропатологии. При замораживании ломтики, они ставятся на предварительно размороженный алюминиевый лоток и покрыты взаимосвязанной алюминиевой пластины, чтобы держать их хорошо плоским. Сразу после этого их поставить в жидкий азот на 3 минуты, а затем хранить при -80 градусов по Цельсию. Ломтики, которые необходимо зафиксировать, индивидуально завернуты в марлю и пропитаны 10% фосфатным буферным раствором формалина, который заменяется через один день. Впоследствии они хранятся в формалине не более 5 дополнительных дней; однако, учитывая, что раствор формалина проникает в 1 мм/день, мы хотели бы еще больше сократить время замачивания.

Ограничения метода
Описанный здесь метод исследования охватывает лишь ограниченную географическую область, и лица, участвующие в программе донорства, обладают характеристиками, которые не полностью отражают население в целом. Хотя более чем приемлемо, посмертный интервал до 24 часов может производить изменения в некоторых белковых структур, ферментов и РНК ткани мозга. Определение AFS и рН не может быть полностью адекватным для определения^{качества тканей 73, и} мы разрабатываем другие способы проверки качества тканей на основе целостности РНК.

Что касается процедуры резки микротом, хотя и очень полезной для восстановления анатомических отношений, следует отметить, что использование макрозекции не является простым и представляет некоторые технические трудности. Наш метод является сложным и трудоемким. Затраты довольно высоки, и финансирование не всегда легко. Финансирование осуществляется главным образом за счет государственных (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) и частных ресурсов (Golgi-Cenci Foundation), частных пожертвований, некоммерческих организаций (например, "Federazione Alzheimer Italia") и грантового участия.

Значение метода ABB по отношению к существующим/альтернативным методам
В начале, наша программа донорства мозга ориентирована лиц, участвующих в InveCe.Ab продольное исследование. Как следствие, пожертвованные мозги сопровождаются подробной клинической, биологической и социальной информацией, собранной на протяжении многих лет. Сила ABB проистекает именно из этого отличительного происхождения. Действительно, изучение группы социально и генетически связанных людей, которые разделяют биологические характеристики и воздействие на окружающую среду, способствует статистическому анализу. Кроме того, исследование включает в себя следующие преимущества: 1) Обеспечение и обеспечение потребностей общества (акт "предоставления, прежде чем спрашивать"): люди получают бесплатный периодический осмотр, о котором врач общей практики проинформирован, номер телефона нашего секретаря предоставляется для консультаций, и инвалиды посещаются на дому; 2) привлечение участников, лиц, занимающих государственные должности, и врачей общей практики к образовательной деятельности путем организации периодических семинаров (связанных со здоровьем мозга, донорством головного мозга и общим здоровьем) и планированием тематических курсов (например, использование информационных технологий для пожилых людей); 3) Встреча с людьми и принятие лик-подхода. Все эти элементы составляют силу проекта ABB. Кроме того, проект улучшает клинические способности вовлеченного медицинского персонала, так как они приобретают опыт как в предземных оценках, так и в посмертных невропатологических оценках. В этой связи мы хотели бы упомянуть весьма своеобразный опыт "Исследования старения меньшинств". Это исследование включало ограниченное и выбранное число афроамериканцев, проживающих в районе Чикаго (784 из 1357 подходящих предметов: процент ответов 57%). Участников ежегодно посещали дома и просили присоединиться к программе донорства мозга. Это исследование основано на необычном подходе с некоторым сходством с нашим получением высоких процентов положительного ответа на программу донорства мозга (352 доноров из 784 участников были зачислены: 44%), хотя уровень вскрытия был не совсем удовлетворительным (53%)⁷⁴. Так же, как в "Меньшинство старения исследования", мы предлагаем образовательную деятельность и чуткий подход, достижение отличных результатов. В частности, наш процент ответов составляет 93%, процент зачисления составляет 28,7%, а уровень вскрытия на данный момент составляет 67%. Эти показатели показывают, что проекты, непосредственно привлекаемые людей, имеют более значительный процент пожертвований. Другие программы донорства мозга, с меньшим вниманием в построении отношений с потенциальными донорами, как правило, имеют низкий процент зачисления, будучи около 10-15% или менее^73,75.

Есть несколько предыдущих когортных исследований, заканчивающийся невропатологическим анализом. Кроме того, большинство банков мозга и хранилищ ориентированы на болезни и существует нехватка "контроля" мозгов от здоровых доноров по сравнению с числом "больных" мозгов. Лишь ограниченное число BBs основаны на демографических исследованиях с участием как больных, так и нормальных^{субъектов для изучения траекторий старения 73,,74,,76,,77,,78,,79,,80.} Некоторые исследования, такие как "Исследование старения меньшинств" в США⁷⁴ и "Исследование Вантаа 85" в^{Финляндии 76} похожи на наши, но они, как правило, закончились с прекращением когорты. Вместо этого, программа пожертвования ABB, как предполагается, будет продолжаться в течение длительного времени в будущем, привлечение потенциальных доноров и планирование последующих мероприятий даже после окончания продольного исследования InveCe.Ab. Такой подход делает наш метод набора похож на "Sun Health Research Institute (SHRI) программа донорства мозга", которая направлена на пенсионное сообщество⁷³. Протокол SHRI для донорства мозга очень эффективен с самым коротким средним посмертным интервалом в мире (3,92 часа). Подобно самым большим BBs в мире, протокол SHRI просто отрезал мозжечок, мозжечок и ствол мозга в средней линии (сагиттальную плоскость), затем одна половина расчленена свежей и заморожена для биохимических исследований, в то время как другая фиксируется в формалине для гистопатологической оценки. Однако одной из сильных сторон протокола вскрытия SHRI является фиксация отдельных ломтиков вместо всего полушария. Действительно, фиксация полушария в целом не является оптимальной из-за различных градиентов фиксации между поверхностью и ядром. Кроме того, на корковые белки может повлиять длительное воздействие раствора формалина. Таким образом, причина, почему мы решили исправить отдельные ломтики.

Решение о том, какая сторона является фиксированной или замороженной, зависит от единственного банка (всегда тот же, случайно назначенный или назначенный в зависимости от того, является ли день вскрытия нечетным или^{четным)31,32,,33,,34,,35}. Таким образом, биохимический и гистопатологический анализ проводится отдельно по каждому полушарию. Поскольку многие неврологические заболевания являются асимметричными, наш BB предлагает уникальный протокол для нарезки свежих образцов: альтернативные секции из ствола мозга и из каждого полушария мозжечка и мозжечка сохраняются в виде фиксированного или замороженного материала; фиксированный кусочек на одном полушарии соответствует замороженному на другом полушарии. Наш метод дает возможность получить полную гистологическую характеристику всего замороженного материала и сравнить результаты со всех областей обеих сторон. Как говорится во введении, описанный метод позволяет получить как можно больше информации из ткани мозга. Кроме того, метод ABB дает базовую, но полную невропатологическую характеристику, включая почти все известные протеинопатии мозга и сосудистой патологии. В связи со спорной ролью сосудистых травм в определении когнитивных нарушений, мы решили использовать двойной балл для^{сосудистой нагрузки 30,53}.

Как поясняется в протоколе, мы используем междисциплинарный подход. Хотя это трудоемкий и трудоемкий метод, мы считаем, что он дает ряд преимуществ для исследований. Например, в предыдущей работе, мы показали, что высокий tHcy как таковой, или MTHFR C677T TT, связанный с аллелем APOE-No4, может быть связан с исполнительной дисфункции, а не потеря^{памяти 81}. Поэтому может быть интересно оценить субъекты с этим конкретным генетическим профилем на невропатологическом уровне. Это пример того, как такое углубленное последующее участие полезно для создания новых исследовательских гипотез, поддающихся проверке путем изучения биологического материала, собранного в нашем банке. Еще одной демонстрацией преимущества нашего подхода является включение ЗЭЭГ в число оценок, которые мы обычно выполняем, за его оригинальность и относительную простоту использования. Действительно, ЭЭГ обнаруживает синаптической активности коры головного мозга, записывая электрические потенциалы дендритов, принадлежащих к корковых пирамидальных^{нейронов 82}. ЗЕЭГ можно считать биомаркером для оценки корковой синаптической активности, которая связана с познанием^83. В частности, снижение альфа-ритмов в задней части мозга с общим увеличением нижних частот (тета и дельта ритмы) было связано с нарушением корковых связей. Следует учитывать, что большинство диагностических корреляционные исследования были основаны на клиническом диагнозе, который является лишь вероятным, а не определенным^{диагнозом 84,,85,,86,,87}. Лишь очень немногие целевые исследования сравнили данные ЕГЭ с невропатологической картиной, чтобы исследовать корреляцию между вариантами^{ЗЭЭГ и}LTS 88^,89, и различие между FTLD и AD⁸³. Закончив наше исследование определением невропатологического диагноза, можно правильно интерпретировать наблюдения, сделанные по мозговой электрической активности. Кроме того, выполняя серийный КЭЭГ в каждом предмете, мы можем отслеживать внутриим индивидуалическую траекторию ЭЭГ-волн и их корреляцию с невропатологической картиной. После индивидуальных изменений корковой электрической активности с течением времени может привести к лучшему пониманию его значения в качестве биомаркера для зарождающейся деменции.

Будущие приложения и направление метода
Реализация распределения тканей является одной из наших главных перспективных целей. Для этого мы только что создали научную комиссию, в которую входят директор Фонда ГК (гериатр), академик неврологии из Университета Павии, невролог и патологоанатом из Фонда ГК и Гериатрической больницы ASP Golgi-Redaelli. При распределении тканей мозга, гистологических слайдов и других биологических образцов важно помнить, что доноры согласились на пожертвование ради исследований. Поэтому распространение материалов должно происходить разумно, как описано в Кодексе поведения БНЕ^40. Любая сторона, подающая запрос на материал, должна указать тип и количество необходимой выборки, представить описание исследовательского проекта и способ использования образцов, а по возможности предоставить доказательства предыдущих публикаций (для соглашения о передаче см. рисунок 9). Мозг банк не работает для получения финансовой выгоды. Таким образом, сборы, уплачиваемые исследователями, должны покрывать только расходы на закупку, обработку, хранение и распределение тканей.

Планы начать анализировать случаи с exome sequencing и методами Omics, such as proteomics и transcriptomics, в движении. Наша альтернативная методология отбора проб позволит проводить исследования омичей на гисто логически четко определенных тканях обоих полушарий. С помощью этого подхода можно будет сравнить структуру активации генов в различных областях мозга одного полушария и в соответствующих областях другого полушария, и быть в состоянии соотнести активацию генов с гистопатологией. В этой области, глубокое обучение приложений будет иметь большой интерес, включая компьютеризированный анализ гистологических слайдов и передовые корреляции клинических, гистологических и омических данных. Можно определить другие корреляции между различными переменными, а также другими возможными технологическими приложениями. Наличие замороженных материалов из обоих полушарий позволит точно оценить активацию генов и распределение белка. Это будет иметь особый интерес даже у здоровых испытуемых, учитывая, что и функции мозга, и некоторые заболевания асимметричны.

Кроме того, мы можем получить клеточные культуры от хорошо охарактеризованных доноров мозга. Действительно, клеточные культуры из лептоменинга собранных мозгов поставляют живые клетки, которые могут быть использованы для дальнейшего исследования болезни или механизмов старения, с помощью индуцированной плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) технологии, которая включает в себя перепрограммирование лептоменинговых фибробластов и дифференциации их в нервные клетки в^{передовых моделях 90}.

По мере старения мозга различные профили изменений могут происходить на молекулярном, клеточном и тканевом уровне. Каждый мозг уникален. Каждый из них имеет свой собственный способ реагирования на внутренние и внешние стрессоры; некоторые сопротивляются, в то время как другие поддаются и проявляют различные патологии. Расхождения между клинической презентацией и невропатологической картиной часто существуют, потому что топография поражений, а не их молекулярная природа, определяет клиническую презентацию. Правильный и определенный диагноз может быть достигнут только путем объединения клинического синдрома с невропатологическими выводами, которые часто добавляют важные этиологические подсказки, необходимые для распутывания патогенеза заболеваний. В Европе есть усилия по созданию стандартного подхода к невропатологической диагностике. Наш диагностический протокол почти полностью следует недавно опубликованным руководящим принципам по невропатологической диагностике для банковского дела^{мозга 91}. Это позволит нам собирать и делиться хорошо документированными тканями мозга, с перспективной целью создания первого итальянского банка мозга. Действительно, в Италии есть хранилища мозга, но не банки мозга на основе когортных исследований. Наша цель заключается в разработке метода сбора тканей мозга, который может быть реализован широко по всей Италии, чтобы создать сеть, которая использует общий протокол и разделяет сопоставимый материал. Для этого одной из основных целей на будущее является привлечение других исследовательских центров и создание конкретного веб-сайта.

Инновационные технологии постоянно используются для анализа молекулярной природы нейродегенеративных заболеваний и для идентификации биомаркеров. В этом контексте, будет возрастать потребность в мозге сопровождается информацией о когнитивных и старения траектории, полученные в результате продольных исследований, подчеркивая важность невропатологически проверенный эпидемиологический^{подход 92}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC