Neuroscience

Protocolo del Banco Cerebral Abbiategrasso para Recopilar, Procesar y Caracterizar Cerebros De Envejecimiento

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/60296

Tino Emanuele Poloni*^1,4, Valentina Medici*¹, Arenn Faye Carlos¹, Annalisa Davin², Arcangelo Ceretti¹, Michela Mangieri¹, Paola Cassini^1,4, Roberta Vaccaro³, Daniele Zaccaria³, Simona Abbondanza³, Matteo Bordoni⁵, Valentina Fantini^2,6, Elena Fogato⁷, Cristina Cereda⁵, Mauro Ceroni⁸, Antonio Guaita^1,2,3

¹Department of Neurology and Neuropathology, Golgi-Cenci Foundation, ²Laboratory of Neurobiology and Neurogenetic, Golgi-Cenci Foundation, ³Department of Neuropsychology and Social Sciences, Golgi-Cenci Foundation, ⁴Department of Rehabilitation, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, ⁵Genomic and Post-Genomic Center, IRCCS Mondino Foundation, ⁶Department of Brain and Behavioral Sciences, University of Pavia, ⁷Department of Pathology, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, ⁸Department of Neurological Science, IRCCS Mondino Foundation, University of Pavia

* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un método para rastrear trayectorias individuales de envejecimiento cerebral a través de un programa de donación cerebral y caracterización adecuada de cerebros. Los donantes cerebrales participan en un estudio longitudinal a largo plazo que incluye evaluaciones multidimensionales en serie. El protocolo contiene una descripción detallada del procesamiento cerebral y una metodología de diagnóstico precisa.

Abstract

En una población en constante envejecimiento, se espera que aumente la prevalencia de trastornos neurodegenerativos. Comprender los mecanismos de la enfermedad es la clave para encontrar medidas preventivas y curativas. La forma más eficaz de lograr esto es a través del examen directo del tejido cerebral enfermo y sano. Los autores presentan un protocolo para obtener, procesar, caracterizar y almacenar tejido cerebral de buena calidad donado por individuos registrados en un programa de donación cerebral antemortem. El programa de donación incluye un enfoque empático cara a cara para las personas, una colección de información clínica, biológica, social y de estilo de vida complementaria y evaluaciones multidimensionales en serie a lo largo del tiempo para realizar un seguimiento de las trayectorias individuales del envejecimiento normal y el deterioro cognitivo. Dado que muchas enfermedades neurológicas son asimétricas, nuestro banco cerebral ofrece un protocolo único para cortar especímenes frescos. Las secciones cerebrales de ambos hemisferios se congelan alternativamente (a -80 oC) o se fijan en formalina; una rebanada fija en un hemisferio corresponde a una congelada en el otro hemisferio. Con este enfoque, se puede obtener una caracterización histológica completa de todo el material congelado, y se pueden realizar estudios de omics sobre tejidos histológicamente bien definidos de ambos hemisferios, ofreciendo así una evaluación más completa de los mecanismos de la enfermedad neurodegenerativa. El diagnóstico correcto y definitivo de estas enfermedades sólo puede lograrse combinando el síndrome clínico con la evaluación neuropatológica, que a menudo añade importantes pistas etiológicas necesarias para interpretar la patogénesis. Este método puede llevar mucho tiempo, ser costoso y limitado, ya que sólo cubre un área geográfica limitada. Independientemente de sus limitaciones, el alto grado de caracterización que proporciona puede ser gratificante. Nuestro objetivo final es establecer el primer Banco Cerebral Italiano, al mismo tiempo que enfatizamos la importancia de los estudios epidemiológicos neuropatológicamente verificados.

Introduction

Según la OMS, aproximadamente 50 millones de personas padecen demencia, una cifra que se prevé triplicar para 2050. La enfermedad de Alzheimer es la principal causa de demencia, seguida de la enfermedad cerebrovascular y otros trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad. En 2017, la OMS elaboró el Observatorio Mundial de la Demencia para sensibilizar sobre la demencia y fomentar un plan de acción mundial contra ella¹. Cada individuo tiene su propia trayectoria de envejecimiento cerebral, por lo tanto, la búsqueda de la cura puede ser difícil debido a la complejidad de la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas. Tal vez, cada persona posee su propia patogénesis escrita en el tejido cerebral que requiere un enfoque personalizado. Por lo tanto, el estudio del tejido cerebral será la clave para entender los mecanismos de la neurodegeneración.

Mirando hacia atrás en la historia de la neurociencia, nos damos cuenta de que los descubrimientos más impresionantes y rompedores nunca podrían haber ocurrido sin el examen directo del cerebro humano. A lo largo del tiempo, la fuente de tejido cerebral a estudiar ha cambiado de disecciones brutas, "encuentros casuales" aleatorios y, en algunos casos, comercio ilegal, a colecciones de cerebros organizadas y bancos cerebrales modernos estratégicos. La consideración de muchos aspectos éticos es uno de los principales factores que diferencian a los bancos cerebrales modernos de las colecciones cerebrales del pasado. Los primeros brain Banks (BBs) modernos reales se instituyeron en la segunda mitad del^siglo XX. Nicholas Corsellis y Wallace Tourtelotte pueden ser considerados pioneros de la banca cerebral moderna. En el Reino Unido, Corsellis reunió una colección con más de 1000 cerebros bien documentados afectados con diversos trastornos mentales y neurológicos^2. Además, Corsellis ayudó a revelar la necesidad de preservar el tejido cerebral fresco en hielo en aras de las pruebas bioquímicas^3. Mientras tanto, en los EE.UU., Wallace Tourtelotte introdujo programas de donación de cerebros antemortem para facilitar la solicitud de posibles donantes cerebrales y asegurarse de que los cerebros recogidos están acompañados de una historia médica y neurológica completa⁴^,⁵. Para obtener una visión general histórica de las colecciones de cerebros y los BB modernos, véase Carlos et al. ⁶.

Entonces, ¿por qué todavía necesitamos cerebro humano? Las enfermedades cerebrales sólo pueden ser dadas un diagnóstico definitivo después de un examen neuropatológico. La neuropatología desafía el diagnóstico clínico, y es la clave para una correcta interpretación de los síntomas clínicos y para el descubrimiento de las bases histológicas de nuevas variantes sindrómicas. De hecho, el diagnóstico se puede redefinir en función del panorama patológico. No obstante, la tasa de autopsias ha disminuido en las últimas décadas debido al reciente desarrollo de técnicas innovadoras de neuroimagen. A través de imágenes cerebrales, las alteraciones morfológicas, funcionales y metabólicas en el cerebro, así como la extensión de la desdolicización de proteínas, se pueden valorar in vivo. Sin embargo, la neuroimagen in vivo y otros estudios de biomarcadores sólo pueden dar una "estimación" de la imagen patológica, ya que son incapaces de detectar cambios celulares y moleculares sutiles. Los avances en la imagen molecular y el descubrimiento de nuevos biomarcadores, moléculas diana y trazadores⁷ (por ejemplo, amiloide, TAU, trazadores microgliales) hacen que el cerebro humano sea aún más indispensable para la interpretación de los datos obtenidos a partir de evaluaciones clínicas y pruebas de biomarcadores. Además, las tecnologías omicas (genómica, epigenómica, transcriptómica, metabolómica, proteómica, Lipidomics, etc.), realizado en tejido cerebral fresco y congelado, abrió nuevas posibilidades para comprender los mecanismos de la enfermedad y descubrir genes de riesgo, nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico, y posibles objetivos farmacológicos⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹,²⁰^,^,²¹^,²²^,^{2 .}

Para estos fines, los BB modernos archivan tejidos cerebrales bien caracterizados y de alta calidad que los hacen disponibles para la comunidad científica^3,^,²⁴. Los cerebros suministrados por los BB deben ir acompañados de una historia clínica completa. La actividad de un BB incluye lo siguiente: (1) Reconocimiento y reclutamiento de individuos enfermos y sanos a programas de donación cerebral; la condición ideal sería lograr un seguimiento multidisciplinario de los donantes a lo largo de la vida para obtener una historia clínica, de estilo de vida y social completa, y perfiles de biomarcadores; de hecho, la reserva cognitiva y la estructura cerebral dependen del estilo de vida y de los factores socioeducativas^25,^,²⁶, por lo que esta información enriquece los datos totales en cuestión. (2) Adquisición del cerebro (compuesto por cerebrum, cerebelo y tallo cerebral) y tejidos relacionados (por ejemplo, médula espinal, nervios craneales y ganglios, etc.) siguiendo la desaparición del donante, respetando al mismo tiempo las regulaciones legales y éticas estandarizadas. (3) Procesamiento adecuado (disección, fijación, congelación) del cerebro, tal como se define en un protocolo operativo estandarizado, para obtener tejido de alta calidad y para permitir su uso futuro en la investigación multidisciplinaria. (4) Caracterización neuropatológica detallada que proporciona un diagnóstico definitivo final. (5) Almacenamiento y distribución de material tisular a la comunidad de investigación²⁷^,²⁸.

Todos los BBs almacenan tejidos incrustados congelados y de formalina fija-parafina. Cada BB tiene su propio protocolo. Excepto para estudios particulares, como el protocolo de corte bihemisférico del Instituto de Investigación Biomédica (Nueva Jersey)²⁹ y el estudio de Deramecourt de la patología cerebrovascular³⁰, los BBs más grandes del mundo simplemente cortan el cerebro, el cerebelo y el cerebro a lo largo de la línea media (plano sagital). Una mitad se disecciona fresca y luego se congela para estudios bioquímicos, mientras que la otra se fija en formalina para la evaluación histopatológica. Por lo tanto, los análisis bioquímicos e histopatológicos se realizan por separado en cada hemisferio. La decisión sobre qué lado está fijo o congelado (lateralidad), depende del banco singular³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵. Como muchas enfermedades neurológicas son asimétricas, nuestra BB ofrece un protocolo único para cortar cerebros frescos: secciones adyacentes del tronco encefálico y cada hemisferio están alternativamente fijos y congelados; una rebanada fija en un hemisferio corresponde a una congelada en el otro hemisferio. A través de este método, se optimiza el uso del tejido cerebral, y se puede lograr una caracterización histológica completa de todo el material congelado con la posibilidad de obtener y comparar información histológica y bioquímica de todas las áreas de ambos hemisferios.

El marco de nuestro proyecto de banco cerebral es la ciudad de Abbiategrasso. Abbiategrasso es una pequeña ciudad a unos 22 km al suroeste de la ciudad de Milán, en el norte de Italia. Tiene una población de unas 32.600 personas. Es el hogar de la Fundación Golgi-Cenci (GC). LA Fundación GC forma parte de un gran Hospital Geriátrico de Rehabilitación (ASP Golgi-Redaelli), y es un instituto que se centra en la investigación sobre el envejecimiento y el cuidado de los ancianos. En particular, se centra en el estudio del envejecimiento mental, los factores sociales y conductuales que influyen en él, y la biología y la patología subyacentes a los trastornos neurocognitivos dependientes de la edad (ENT). En 2009, la Fundación GC lanzó un nuevo estudio longitudinal con 1321 participantes (de 1644 sujetos elegibles: tasa de respuesta inicial del 80,3%) nacido entre 1935 y 1939 (de entre 70 y 75 años), de etnia caucásica, viviendo en la misma pequeña área geográfica. El estudio se llamó InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; en inglés: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) y actualmente está en curso. InveCe.Ab está previsto obtener una cohorte con la máxima homogeneidad y menor variabilidad con el fin de evaluar la incidencia, prevalencia e historia natural de la demencia, junto con sus posibles factores de riesgo o protección, incluyendo variables conductuales, psicosociales, clínicas y biológicas³⁶. Las características de la cohorte se muestran en la Figura 1 y la Tabla 1. Los datos epidemiológicos son coherentes con la tendencia de la demencia en la población europea^37,^,³⁸ y los participantes de InveCe.Ab tienen características genéticas y ambientales homogéneas, lo que representa un buen modelo para estudiar la trayectoria desde el envejecimiento normal hasta los trastornos neurocognitivos. De hecho, las poblaciones homogéneas requieren menos sujetos para alcanzar un poder estadístico adecuado. La metodología InveCe.Ab ya se ha notificado en otros^{lugares 36,} pero es importante subrayar su enfoque multidimensional a través de controles periódicos (cada 2-3 años) utilizando el mismo conjunto de evaluaciones, incluyendo: muestreo de sangre (panel metabólico, homocisteína y vitaminas, extracción de ADN para perfilar la Apolipoproteína E (APOE) y otros polimorfismos genéticos relacionados con la cognición y el envejecimiento), mediciones antropométricas (peso, altura y cintura), Talking While Walking Test (prueba de doble tarea), una entrevista para evaluar el estilo de vida (adherencia a la dieta mediterránea, niveles de actividad física y compromiso cognitivo) y factores sociales (implicación social, soledad), una evaluación neuropsicológica y un examen clínico general. Comparar estos datos longitudinales con datos neuropatológicos postmortem sería crucial para la investigación. Por lo tanto, nuestro equipo y particularmente la Dra. Michela Mangieri concibieron el enfoque neuropatológico mencionado anteriormente. Desde 2014 y durante el segundo seguimiento, se pidió a los participantes de InveCe.Ab que donaran sus cerebros, y dando así lugar al nacimiento del Abbiategrasso Brain Bank (ABB). Los principales donantes de ABB son los participantes de InveCe.Ab, pero ABB ahora está abierto a otros donantes voluntarios. Son pacientes de ASP Golgi-Redaelli, hogar de varios pacientes afectados por diferentes enfermedades neurológicas o voluntarios adultos que aprenden sobre el Proyecto ABB y pertenecen a la misma zona geográfica (Abbiategrasso y alrededores). Todos los donantes se someten al mismo protocolo de evaluación.

Los autores proponen un método para rastrear trayectorias individuales del envejecimiento normal y la posible progresión a las ENT, y para gestionar, procesar y caracterizar con precisión los cerebros adquiridos de dichos donantes seguidos longitudinalmente. Además, nuestro objetivo es conocer e involucrar a las personas en evaluaciones neurológicas periódicas, seminarios y actividades educativas con respecto al bienestar del cerebro y aumentar su conciencia de la donación de cerebros con fines de investigación.

Protocol

En línea con el Comité de ética de investigación humana de nuestra institución y el Código de Conducta de BNE, la ABB realiza sus actividades siguiendo las normas éticas^39,^,^40. El procedimiento de recolección cerebral fue presentado y aprobado por el Comité de ética de la Universidad de Pavía en el contexto del estudio InveCe.Ab³⁶. Los procedimientos de estudio se ajustaron a los principios esbozados en la Declaración de Helsinki de 1964 y a las siguientes enmiendas. El formulario de consentimiento es completo y fácilmente comprensible. Unirse al programa de donación es una decisión personal, y se necesita una conciencia completa. En caso de que una persona no se considere competente para firmar el formulario de consentimiento, se garantiza la autorización de un tutor legal o de familiares (NOK). La Tabla 2 informa de los criterios de inclusión y exclusión para la donación cerebral. La investigación se llevó a cabo bajo la supervisión de la Federazione Alzheimer Italia.

1. Reclutamiento al programa de donación cerebral

Convocar a los sujetos que habían expresado interés en la donación de cerebros y su NOK y / o tutor legal para presentar el proyecto (el alcance del programa de donación; el proceso de eliminación del cerebro, conservación, uso y distribución), el derecho a retirarse del programa en un momento dado, la protección del anonimato, y las estrategias de seguimiento. Discutir la posibilidad de investigaciones adicionales de biomarcadores y pruebas genéticas. Tenga en cuenta los deseos del posible donante o de su NOK de ser informado sobre los resultados.
Explicar todos los aspectos económicos, incluida la falta de beneficios financieros tanto para la Fundación como para el donante (los cerebros se donan y distribuyen altruistamente). Infórmeles que ABB cubre el costo del transporte corporal, mientras que la familia cubre los del funeral, entierro o cremación.
En caso de aceptación, obtener la firma del consentimiento para participar en el programa de donación. Proporcione al donante un código numérico individual para garantizar el anonimato. Anote el número de identificación de los participantes en el estudio longitudinal y proporcione otro código para que el banco cerebral separe fácilmente los dos subgrupos de donantes (participantes o no participantes en el estudio longitudinal; véase la Tabla 3).
Entregue al donante una tarjeta de identificación que declare su condición de donante y muestre el número de teléfono (disponible las 24 horas del día, los 7 días de la semana) para notificar al Banco Cerebral de su muerte.

2. Evaluación de donantes y seguimiento en serie

NOTA: Es posible dar su consentimiento sólo para algunos, y no todos, de los exámenes mencionados a continuación. Todas las evaluaciones clínicas son realizadas por el mismo equipo, incluyendo un neurólogo, un geriatra con experiencia en neurología y 3 psicólogos. Si se desarrollan nuevos síntomas o el deterioro cognitivo progresa, el intervalo de tiempo entre los seguimientos se puede acortar.

Como en el caso del estudio InveCe.Ab, obtener un cuestionario social-de estilo de vida, incluyendo grado de autonomía (ADL, IADL), hábitos personales, factores sociales y de estilo de vida que pueden afectar las funciones mentales. Recopilar antecedentes familiares, médicos y neurológicos con información sobre enfermedades genéticas, infecciosas, tóxicas, metabólicas, autoinmunes, cardiovasculares, traumáticas, degenerativas, neoplásicas y neurológicas. Recopile exámenes clínicos previos y enumere los tratamientos farmacológicos.
Llevar a cabo una extensa evaluación neuromotora que incluye pruebas para la función de los nervios craneales, fundus oculi, campo visual, fuerza muscular y tono, sensibilidades, reflejos tendinosos, reflejos exteroceptivos y primitivos, signos meningeales, postura, marcha, movimientos, coordinación, funciones esfíntericas, y cualquier presencia de signos focales o Babinski. Evaluar el lenguaje, el estado mental y cualquier cambio en el comportamiento.
Llevar a cabo una extensa evaluación neuro-cognitiva que incluye la cognición global y una evaluación neuropsicológica completa de dominios cognitivos específicos: memoria verbal y visual, atención, velocidad psicomotora, lenguaje, memoria semántica, funciones ejecutivas y capacidades visuospatiales(Tabla 4 para más detalles). Considere la presencia de depresión (escala CES-D).
Obtener muestras de sangre que se utiliza tanto para el análisis de química sanguínea (Tabla 5) como para el aislamiento y almacenamiento de ADN, plasma y células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Determinar el genotipado de APOE (rs429358 y rs7412) (se ha determinado un perfil genético más extenso en los participantes de InveCe.Ab; véase el Cuadro 6). Registrar un ECG (alteraciones cardíacas, fibrilación auricular) y un electroencefalograma del estado de reposo para el análisis cuantitativo (QEEG).
Considere las pruebas opcionales de biomarcadores, incluyendo el líquido cefalorraquídeo (LCR) TAU, el fosfo-TAU y el amiloide, y las imágenes cerebrales (RM para detectar la degeneración in vivo, la isquemia o la inflamación; FDG-PET para detectar fallas metabólicas; PIB-PET para detectar la amiloidosis cerebral relacionada con la fisiopatología del Alzheimer).
Planifique el programa de chequeo posterior del donante cerebral. Configure los intervalos de tiempo según diferentes grupos de edad (hasta 64 años de edad: cada 10 años, 65-74 años: cada 3 años, a partir de los 75 años: cada 2 años).
Asignar un diagnóstico clínico y/o un diagnóstico neurocognitivo según DSM-V. Clasificar la estadificación clínica de la demencia con la puntuación de clasificación de demencia clínica (CDR). Actualice el CDR en el último período antes de la muerte.
Prepare una base de datos gráficamente similar a la del papel. Inserte todos los datos recopilados en la base de datos del Banco Cerebral. Planifique una revisión por otro secretario para verificar si hay errores.

3. Hora de la muerte y extirpación del cerebro

NOTA: La ley italiana establece que la asittole debe durar más de 20 minutos para confirmar la muerte. El registro de un electrocardiograma plano (ECG) durante al menos 20 min (llamada thanatografía) permite realizar una autopsia dentro de las 24 horas de la muerte (DPR 285/90 art. 8 y Ley n. 578 29 de diciembre de 1993). Un tiempo postmortem de <24 h es un buen objetivo para preservar la calidad general del tejido. En caso de un tiempo postmortem >30 h se cancela la autopsia (ver Tabla 2). El equipo de autopsia está compuesto por un patólogo, un neurólogo y/o un neurobiólogo, una enfermera, un técnico de sala anatómica y cualquier estudiante en prácticas; los dos primeros miembros del equipo también realizan el diagnóstico neuropatológico. Durante el manejo y la disección de cadáveres, el uso de ropa apropiada (abrigo, guantes, anteojos y redes para el cabello) es obligatorio. En esta sección, describimos las principales herramientas y equipos utilizados normalmente en nuestro laboratorio. Los lectores pueden elegir los instrumentos que se utilizarán a su discreción. Para obtener una descripción detallada de los materiales aquí utilizados, consulte Tabla de materiales.

Asegúrese de que la agencia funeraria elegida por la familia lleva el cuerpo a las instalaciones de ABB. Realizar la thanatografía durante la cual la actividad cardíaca debe estar ausente. Si es así, firme un certificado de defunción e inicie los procedimientos de autopsia.
Transporte el cadáver a la sala de autopsias. Mida la circunferencia del cráneo a la altura de la parte más ancha de la cabeza. Mida desde el nasion hasta la inión para obtener el diámetro anteroposterior (APD), mientras que la distancia de una oreja a la otra produce el diámetro transversal (TD). Calcule el índice cefálico (CI) utilizando la fórmula: CI - TD/APD x 100.
Usando un bisturí afilado, haz una incisión del cuero cabelludo en el plano coronal, desde la punta del proceso mastoideo de un lado al otro, pasando sobre el vértice. Corta el cabello, la piel y el tejido subcutáneo y separa los dos pliegues del cuero cabelludo cuidadosamente de la parte inferior del cráneo. Realice la incisión hasta que la grasa supraorbital amarilla se haga visible y refleje el cuero cabelludo antes. Tire de la otra parte posteriormente.
Usando bisturí y fórceps, tome una pequeña muestra del músculo temporal a cada lado, ponga uno en 4% de formaldehído y congele el otro (ver sección 7).
Corte el cráneo usando una sierra eléctrica después de un corte en V en el lado frontal. Retire la tapa del cráneo y corte las meninges. Las piezas de la muestra de dura se fijan en un 4% de formaldehído y se congelan (ver sección 7).
Obtener aproximadamente 10 ml de LB insertando una aguja de 20 G 3.5 in. a través del cuerpo calloso para llegar al tercer ventrículo. Evaluar la apariencia, color y turbidez del CSF y medir el pH. A continuación, haga 10 alícuotas de aproximadamente 1 ml cada una y guárdelas a -80 oC.
Levante el cerebro tirando delicadamente de ambos lóbulos frontales y corte ambos nervios ópticos infundibulum, las arterias carótidas internas (ICA) y los nervios craneales tercero, cuarto, quinto y sexto. Cortar el tentorio para llegar a la fosa posterior y cortar las arterias vertebrales y los nervios craneales inferiores. Inserte el bisturí lo más profundo posible a través del foramen magnum, para cortar la porción más caudal de la médula. En este punto, retire todo el cerebro suavemente.
Con el bisturí, perfora el hueso sobre la cueva de Meckel y obtiene el ganglio Gasserian de ambos lados. Fijar un ganglio en 4% formaldehído y congelar el otro (ver sección 7). Fractura la sella turcica ósea usando un mazo quirúrgico y cincel para extraer la glándula pituitaria y luego fijarlo en 4% formaldehído.
Inspeccione el cráneo y todo el cerebro en busca de alteraciones macroscópicas y cambios vasculares. Con una cinta métrica, mida el cerebro obteniendo los diámetros transversales y anteroposteriores. Recuperar con cuidado el círculo de Willis y evaluarlo macroscópicamente (Figura 2E) para la presencia de variantes anatómicas, lesiones o estenosis de los vasos sanguíneos.
Tomar de 1 a 2 piezas de leptomeninges de 2-4 cm² de la convexidad y preservarlos en un medio de cultivo de medios águila modificado (DMEM) de Dulbecco de glucosa alta completa a 4 oC que contenga un 20% de suero bovino fetal (FBS), 1% pluma/estreptococo, 1% glutamina y 1% aminoácidos no esenciales (como se publicó anteriormente, con algunas modificaciones)⁴¹.
1. Para obtener cultivos de fibroblastos, coloque los leptomeninges en una placa Petri de 10 cm y lave dos veces con solución salina tampón de fosfato (PBS), cada vez desechar el líquido.
2. Usando un bisturí y una punta de pipeta, corte los leptomeninges en trozos pequeños de aproximadamente 2 o 3 mm, las piezas de semilla 3-4 en cada pozo de una placa de 6 pozos previamente recubierta con gelatina al 0,5% y llene cada pozo con 2 ml de medio completo complementado con 1% de anfotericina B (conduzca el procesamiento en un gabinete de biosegura para garantizar la estela del cultivo).
3. Colocar la placa en una_incubadora de 37oC, 5% co2 durante al menos una semana y cambiar el medio gastado cada 3-4 días. Trypsinize cells with estéril 1x trypsin when the well is at about 70% of confluence. Coloque los fibroblastos leptomeningeales en un matraz T75 y llénelo con 12 ml de medio completo. Después de 5 días de trippsinar y preservarlos en 900 l de FBS y 100 l de dimetil sulfóxido (DMSO).
Separe e inspeccione el cerebrum, el cerebelo y el tronco encefálica y peselo individualmente. Quítese la glándula pineal y fíjela en 4% de formaldehído. Retire las bombillas olfativas y los nervios ópticos, y arregle o congele uno de cada par, independientemente del lado. Mantener el cerebrum, el cerebelo y el tronco encefálica en hielo a 4 oC durante al menos 2-4 h hasta que estén listos para la disección para minimizar la interrupción del tejido y reducir la suavidad del tejido.
Después de la cosecha, prestar la atención y el cuidado adecuados al cadáver. Vuelva a colocar el hueso con un pegamento súper adhesivo y coser hacia atrás el cuero cabelludo usando una aguja quirúrgica y suturas no absorbibles.
Muestre respeto y gratitud a la persona fallecida tratando el cadáver suavemente. Limpiar y afeitar la cara, y lavar y secar el cabello, porque el cadáver se pondrá en un ataúd abierto visible para los seres queridos.
NOTA: La recomposición del cadáver es realizada por un técnico. El protocolo se puede pausar aquí.

4. Protocolo de disección ABB

NOTA: El mismo patólogo y/o neurólogo corta el tronco encefál, el cerebelo y el cerebrum bajo una campana de humos. Un neurobiólogo organiza las rebanadas después de secarse. Un aprendiz que no maneja las secciones cerebrales documenta todo el procedimiento con fotos que se cargarán en la base de datos para servir como guía durante las fases de procesamiento de tejido subsiguientes.

Usando un cuchillo disección, corte el tronco cerebral axialmente y haga el primer corte a nivel de cerebro medio rostral, a través del colliículo superior, para obtener dos rebanadas que expongan la sustancia nigra (SN).
Hacer el resto de los cortes para adquirir rodajas de tronco encefálica de 8 mm para obtener alrededor de 10 secciones. Tenga cuidado de incluir cortes que pasan a través de los pons rostrales cerca de los márgenes superiores del cuarto ventrículo para observar el locus coeruleus (LC) y a través de la médula oblongata inferior a las estrías acústicas justo por encima del ápice inferior del cuarto ventrículo para tener rodajas incluyendo el núcleo motor dorsal del vagus (DMNV).
Asigne un nombre a todas las rebanadas en un sentido rostrocaudal como BS (tronco cerebral) seguido de números árabes para identificar las secciones. Después de la última sección de tronco encefálico, utilice la designación SC (médula espinal) seguida de los números 1–n. Se obtienen aproximadamente 2–4 rodajas de SC dependiendo del número de metameros espinales eliminados (Figura 2H–I).
Etiquetar todas las secciones que se van a fijar o congelar alternativamente y tomar una foto para el archivo fotográfico (Figura 2). A continuación, corrija y congele todos los sectores como se describe a continuación (pasos 4.7 y 4.8).
Corte el cerebelo en el plano sagital para separar los dos hemisferios cerebelosos a nivel de la vermis. Realizar seccionamiento sagital para obtener 5 rodajas de cada hemisferio (Figura 2F–G).
Asigne un nombre a todos los sectores de vermis como CBR o CBL (para cerebelo derecho e izquierdo respectivamente) y utilice números árabes para identificar las secciones. Etiquete todas las secciones que se van a fijar o congelar alternativamente y tome una foto para el archivo (Figura 2). A continuación, corrija y congele todos los sectores como se describe a continuación.
Separe los dos hemisferios del cerebro a través del cuerpo calloso (Figura 2A–B) y corte singularmente en el plano coronal. Hacer el primer corte en un plano que pasa entre el quiasmo óptico y los cuerpos mamillarios, a través del lóbulo frontal, polo temporal, cingulado anterior, conmisura anterior, núcleo de Meynert y ganglios basales.
Realizar el segundo corte de aproximadamente 1 cm posteriormente pasando a través de los cuerpos mamilares y exponer los ganglios basales, tálamo anterior, subtálamo y amígdala. Continuar cortando para diseccionar las regiones anterior y posterior para adquirir rodajas de 1 cm con el fin de obtener de 15 a 20 secciones para cada hemisferio.
Establezca los cortes en una superficie plana. Colocarlos siguiendo su posición original en la dirección anteroposterior, desde el frontal hasta el polo occipital, con la porción continua con la rebanada anterior mirando hacia arriba.
Al comparar las secciones de ambos hemisferios, seleccione secciones alternativas de cada hemisferio para ser retenidas como material fijo o congelado. Reconocer las secciones principales a fijar y procesar para la histopatología incluyendo lóbulos frontales y temporales, cingulado, ganglios basales, núcleo basal de Meynert, amígdala, tálamo, hipocampo y corteza entorrinal, giro occipito-temporal, lóbulos parietales y occipitales.
Asigne un nombre a todos los sectores en sentido anteroposterior como L (izquierda) o R (derecha) seguidos de números árabes y coloque una etiqueta que indique si el sector debe ser fijo o congelado (Figura 2A–D). Para identificar las secciones, tome una foto para el archivo fotográfico. A continuación, fije y congele todos los sectores como se describe en las secciones 7 y 8.

5. Inspección del cerebro y de los vasos y evaluación patológica macroscópica (a simple vista)

Realizar un examen macroscópico general teniendo en cuenta las alteraciones meningeales, atrofia cortical difusa o localizada, atrofia hipocampal, agrandamiento ventricular, atrofia cerebelosa, atrofia del tronco cerebral, paliativa paliativa, alteraciones de la materia blanca (especificar el tipo y la ubicación).
Examine el círculo de Willis considerando la aterosclerosis y la oclusión. Asignar puntuación 1 en presencia de ateroma sin estenosis de más del 50%, puntuación 2 si al menos una arteria es 50% o más ocluida, puntuación 3 si dos o más arterias son 50% o más ocluidas⁴². Evaluar la presencia o ausencia de patología en otros vasos intracraneales.
Para detectar lesiones vasculares parénquimales, examine los hemisferios cerebrales, el cerebelo y el tronco encefálica. Considere lesiones lacunares (diámetro < 10 mm), infartos isquémicos o hemorrágicos y hemorragias (diámetro > 10 mm). Si está presente, especifique el tamaño en milímetro, número y ubicación. Además, considere la presencia o ausencia de hemorragia subaracnoidea.

6. Control de la calidad de los tejidos

NOTA: La puntuación de factores agonales (AFS) oscila entre 0 y 2 y es importante en la evaluación de la calidad del tejido. Para determinar la AFS, considere las condiciones clínicas que ocurren alrededor del momento de la muerte (particularmente las condiciones que determinan la acidosis cerebral) y la duración del estado agonal (muerte súbita o agonía prolongada). Si AFS > 1, el tejido cerebral podría no ser de calidad óptima⁴³. Considere también el pH del cerebro y del CSF; si pH < 6, el tejido cerebral podría no ser de calidad óptima⁴³^,⁴⁴.

Verificar si la muerte ha sido causada por condiciones que pueden dañar el tejido cerebral incluyendo hipoxia, acidosis prolongada, ventilación mecánica, fallo multiorgánico, fiebre alta, trauma craneal grave, ingestión de sustancias neurotóxicas, deshidratación grave, hipoglucemia grave, estado epiléptico y coma prolongado. Si una de estas condiciones está presente, asigne 1 punto.
Verifique la duración del estado agonal(rápido si la muerte ocurre dentro de 1 h, intermedio si la muerte ocurre entre 1 y 24 h, lento si el estado agonista dura más de 1 día). Si ocurre una muerte intermedia o lenta, asigne 1 punto.
Calcular la puntuación de AFS, y medir el pH del FSC por una aguja de pH del electrodo y un medidor de pH de la superficie en una rebanada cerebral de cada lóbulo y en una sección cerebelosa.

7. Congelación de tejidos

Mantenga todos los tejidos congelados en hielo a 4 oC. Entonces, congeladlos rápidamente. Colóquelos en una bandeja de aluminio precongelación. Cubra con una placa de aluminio entrelazada para mantenerlas planas. Ponerlos en nitrógeno líquido a -120 oC durante 3 min.
Coloque las rodajas dentro de una bolsa de plástico etiquetada con su correspondiente código de identificación y número de rebanada. Divida las bolsas de plástico en tres cajas criogénicas (para el hemisferio derecho, el hemisferio izquierdo y el tronco encefálico) y guárdelos a -80 oC.

8. Fijación de tejidos

Envuelva las rodajas en gasa una por una, y coloque las rodajas en una solución de formalina con búfer de 10%. Después de 1 día, sustituya la solución de formol por una solución fresca. Dejarlos durante unos 5 días en una habitación fría a 4oC.
Mantenga todas las rebanadas como un todo y divida sólo las rodajas que contienen hipocampo y amígdala en dos partes (Figura 3). La parte superior de ambas rebanadas contendrá el lóbulo frontal (R10a–L9a en la Figura 3); las partes inferiores contendrán respectivamente: (1) amígdala, lóbulo temporal y ganglios basales (L9b en la Figura 3B),y (2) hipocampo y parte del lóbulo temporal (R10b en la Figura 3A). Esto se hace con el fin de mantener la relación entre las diversas estructuras.
Coloque todas las secciones en el tampón de fosfato durante al menos 2 días para lavar y eliminar los productos de enlace cruzado.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

9. Deshidratación, limpieza, incrustación de parafina y preparación de diapositivas

Preparar concentraciones crecientes de alcohol etílico de 70% a 100%, xileno y dos conjuntos de cera de parafina fundida. Colocar las secciones cerebrales en el procesador automático para la deshidratación, el procedimiento de limpieza y la infiltración de parafina (utilizar dos protocolos de procesamiento de tejido diferentes para macro (rebanadas de cerebrum y cerebelo) y micro muestras (rebanadas de tronco encefálica y las otras muestras pequeñas); Tabla 7). Incruste el tejido en cera de parafina en un molde metálico o plástico.
Seleccione las secciones a cortar para evaluar todas las regiones de interés aplicando el índice de Montine para la caracterización neuropatológica⁴⁵ (Tabla 8). A continuación, corte las secciones seleccionadas.
Utilice un microtoma de trineo para macrosecciones y un microtomo giratorio para secciones pequeñas. Cortar rodajas de 5 m para la tinción de Hematoxilina y Eosina (H&E) y rodajas de 8 m para las otras tinciones e inmunohistoquímica. Pon las rodajas en tres tipos diferentes de toboganes histológicos: 8,5 cm x 11 cm para las rodajas más grandes, 5 cm x 7,5 cm para rodajas medianas y el clásico de 2,5 cm x 7,5 cm para las más pequeñas.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

10. Desparafinación, tinción histológica e inmunohistoquímica (IHC)

Realice la desparafinación para permitir la reacción con soluciones de tinte acuoso. Realizarlo con xileno y disminución de la concentración de alcohol (5 min por cada paso). Rehidrata durante 5 min con agua destilada.
Utilice las siguientes tinciones histológicas para evaluar anomalías del tejido arquitectónico y estructural, y morfología celular: H&E (para lesiones microscópicas vasculares e inflamación), Cresyl Violet (NISSL; para la pérdida neuronal), Luxol Fast Blue (LFB; para la desmielinización), Gallyas (para placas neuríticas e hilos neuropil).
Utilizar inmunohistoquímica (IHC) para resaltar la presencia de estructuras objetivo específicas. Anti-NeuN y anti-GFAP se utilizan para identificar compartimentos neuronales y gliales; 4G8, AT8, -SYN y TDP-43 se utilizan para identificar proteínas que se agregan en enfermedades neurodegenerativas (Tabla de Materiales).
1. Pretrata las secciones desperfudidas con 3% H₂O₂ durante 10 min y luego enjuagar en PBS. Realizar el tratamiento de recuperación con tampón de citrato 0,01 M pH 6 (en caliente en serie durante 2, 1 y 2 min) para antígenos 4G8, SYN, TDP-43 y NeuN; utilizar 70% de ácido fórmico para 4G8 y -SYN. Preincubate durante 30 min en 5% de suero de cabra normal.
2. Incubar durante la noche a 4oC con el anticuerpo primario. El día después, enjuague las secciones en PBS antes de la incubación con el anticuerpo secundario (Polímero etiquetado con Envision+System-HRP) a una dilución de 1:2 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Lavar varias veces en PBS e incubar en el sistema de cromógenos con diaminobenzidina (Liquid DAB+Substrate Chromogen System) examinando el desarrollo de la reacción bajo el microscopio (magnificación 4-10x). Finalmente lave las secciones en PBS. Contrate las secciones de hematoxilina, deshidratación y cubreplo con montaje DPX.
  NOTA: La Tabla 8 resume el protocolo estándar. Realice tinciones de H&E en todas las secciones, mientras que las manchas y reacciones especiales/específicas se utilizan en las secciones seleccionadas. Los casos seleccionados requieren áreas o reacciones adicionales. Tabla de materiales muestra los detalles de los anticuerpos utilizados para IHC.

11. Caracterización neuropatológica básica

NOTA: Se estudian alteraciones inespecíficas del tejido cerebral, patología vascular, patología de la enfermedad de Alzheimer (AD), TAUopatías no AD, sinucleinopatías, patología de proteínas que une al ADN TAR (TDP-43) y lesiones hipocampales. Un microscopio óptico conectado a una cámara se utiliza para detectar lesiones microscópicas parénquimales. La evaluación histológica es realizada por el mismo equipo de personal capacitado en neuropatología, incluyendo un profesor de neurología, un neurólogo y un patólogo. Se basa en un enfoque modificado de Montine⁴⁵ (Tabla 8) que incluye también: (1) TAUopatías heterogéneas no-AD que constituyen el sello patólogo de la degeneración del lóbulo fronto-temporal (FTLD) relacionada con los depósitos TAU: Enfermedad de Pick, Afasia Progresiva Primaria (TAU-nfPPA), Parálisis Supranuclear Progresiva (PSP)⁴⁶^,⁴⁷ y Degeneración Cortico-Basal (CBD)⁴⁸. Además, las TAUopatías no AD incluyen condiciones relacionadas con el envejecimiento y sin importancia clínica definitiva como LA TAUopatía relacionada con la edad primaria (PART)⁴⁹, Tau Astro-Gliopathy (ARTAG)⁵⁰relacionada con la edad primaria, enfermedad de grano argyrofílico⁴⁸. (2) Sinucleinopatía de tipo Lewy (LTS) que está relacionada con la enfermedad de Parkinson (PD) y la demencia de Lewy Bodies (LBD). Para buscar LTS, aplique los siguientes pasos jerárquicos: al principio, bulbo olfativo, tronco encefálica, amígdala/corteza temporal; si las áreas anteriores son positivas, añadir estructuras límbicas (formación de hipocampal, corteza entorhinal, cingulado anterior), giro frontal medio, lobulo parietal inferior y corteza occipital⁴⁵. Si las características clínicas de la LBD cortical están presentes (es decir, fluctuaciones y/o alucinaciones), considere las estructuras límbicas y el isocórtex para el primer paso. (3) Depósitos TDP-43,el sello patólogo de FTLD relacionado con los depósitos TDP-43: variante conductual de la demencia fronto-temporal (bvFTD), demencia semántica (SD o svFTD), TDP-nfPPA y enfermedad de la neurona FTD-Motor (FTD-MND). El IHC para TDP-43 se realiza en las siguientes secciones: amígdala, hipocampo, corteza entorhinal y giro frontal medio; en casos con sospecha de FTLD clínico, considere examinar otras secciones⁵¹.

Evaluar alteraciones inespecíficas del tejido cerebral en secciones seleccionadas utilizando H&E, NISSL, LFB e IHC para GFAP y NeuN. Considere la rarefacción neuronal, las neuronas globo, la espongosia, la gliosis, la pérdida de mielina, la presencia o ausencia de infiltrados inflamatorios o tumorales. Especifique la ubicación predominante de estas alteraciones.
Para detectar lesiones vasculares microscópicas,examine las diapositivas H&E y LFB, incluyendo al menos dos macrosecciones hemisféricas (la primera que pasa a través de los cuerpos mammillares (corte de carro) con lóbulos frontales y temporales, ganglios basales, tálamo anterior, amígdala, y el segundo pasando a través del lóbulo occipital), la sección "geniculada" de la formación del hipocampo, una sección cerebelosa, y las tres secciones principales del tronco encefásico (a través de la sustancia nigra, locus coeruleus y DMNV).
1. Detectar la enfermedad de los vasos pequeños incluyendo arteriolosclerosis, lipohyalinosis, dilatación del espacio perivascular, pérdida de materia blanca, leptomeningeal y/o angiopatía amiloide cerebral parénquima y/o capilar. Especifique la calificación (0–3) y la ubicación frecuente⁴²^,⁵². Considere la presencia o ausencia de fugas de hemosiderina, microbledos y microinfartos.
2. Evaluar la contribución del daño vascular al deterioro cognitivo utilizando el esquema jerárquico de Deramecourt (alteraciones de la pared del vaso– enfermedad de los vasos pequeños –infartos macroscópicos). Para esta evaluación considere una sección del lóbulo frontal y temporal, ganglios basales e hipocampo (puntuación 0–20)³⁰. Además, estimar la probabilidad de que la enfermedad vascular cerebral contribuyó al deterioro cognitivo utilizando la puntuación VCING (baja-intermedia-alta), obtenida considerando infartos macroscópicos hemisféricos y enfermedad de los vasos pequeños del lóbulo occipital incluyendo arteriolosclerosis moderada a grave y angiopatía amiloidea⁵³.
Evaluar la patología AD utilizando IHC (4G8) para la propagación de amiloide. Definir las etapas de Thal (1-5)⁵⁴, la puntuación de amiloide agregado (0-3)⁴⁵, y la morfología por sitio (difuso, focal, cored).
1. Evaluar la patología de AD Tau utilizando IHC (AT8) y describir la morfología prevalente por sitio (enredos neurofibrilares, hilos neuropil, placas neuréticas). Definir la etapa de Braak (I–VI +; signo positivo indica la presencia de áreas adicionales de patología Tau hiperfosforilada que no siguen la jerarquía de los Braak)⁵⁵ y la puntuación agregada (0-3)⁴⁵.
2. Evaluar placas neuróticas utilizando tinción de Gallyas y puntuación CERAD (0–3)⁵⁶. A continuación, defina la probabilidad de las características neuropatológicas correspondientes a un síndrome clínico ad utilizando la puntuación Amyloid-Braak-CERAD (puntuación ABC 0–3): ninguno bajo-intermedio-alto⁴⁵.
Utilice AT8 IHC para notar la presencia o ausencia de patología TAU no AD especificando la ubicación prevalente y la peculiar imagen morfológica. Considere inclusiones neuronales tales como enredos en forma de llama o globosa, inclusiones esféricas-globulares (es decir, cuerpos de Pick)⁵⁷, hilos de neuropil, neuritas distróficas, granos argyrofilos; y inclusiones gliales como astrocitos mechonados, astrocitos espinosos, placas astrocíticas, cuerpos enrollados, inclusiones globulares^58,^,⁵⁹.
Utilice IHC para detectar LTS (cuerpos de Lewy, cuerpos pálidos y neuritas de Lewy) en las áreas de la nota anterior. En caso de positividad, aplique la calificación de McKeith (0–4) para evaluar la gravedad de las lesiones^60; entonces, utilizar las etapas de Beach (I–IV) para la distribución topográfica (bulbo olfativo, tronco encefálica predominante, predominante límbico, neocortical)⁶¹. Compare las etapas de Beach y Braak para definir la relación entre LBD y patología AD⁶⁰^,⁶¹^,⁶².
Considere la presencia o ausencia de Inclusiones citoplasmáticas Glial (GCI; sinucleinopatía glial no de tipo Lewy) que son el sello patológico de la Atrofia del Sistema Múltiple (MSA) y especifique su ubicación predominante⁶³.
Utilice TDP-43 IHC para detectar depósitos TDP-43 en las áreas de la nota anterior. Identificar la morfología prevalente por sitio: Inclusiones citoplasmáticos Neuronales (NCIs), Inclusiones de Neuritas Distróficas (DN), Inclusiones Nucleares (NII). Definir el patrón: A (NCIs predominantes y DN: bvFTD y nfPPA); B (LAS NCIs predominantes: FTD-MND); C (DN largos predominantes: svPPA y bvFTD)⁵¹^,⁶⁴. Utilice el esquema de Nelson para definir la presencia de TDP-43 en los casos de AD^65,^,⁶⁶.
Evaluar el hipocampo a partir del sector subiculum y Sommer (CA1). Utilice la puntuación de Rauramaa (0–4): 1–2 para microinfartos y macroinfartos, respectivamente; 3–4 correspondiente a la pérdida neuronal moderada y grave, respectivamente, y atrofia del hipocampo (esclerosis hipocampal: HS). Señale la presencia o ausencia de depósitos de proteínas patológicas (en orden decreciente de frecuencia: pTAU, TDP-43, é-syn)⁶⁷.
Definir el diagnóstico neuropatológico e introducir todos los datos patológicos en la base de datos.
NOTA: Las salas en las que se almacenan el material biológico y los datos sensatos de los donantes están siempre cerradas y sólo el personal autorizado puede entrar, con el fin de garantizar tanto la seguridad como la privacidad. El material biológico congelado se almacena en congeladores cerrados a -80 oC, mientras que los tejidos de parafina fijadas en formalina se almacenan en armarios cerrados a temperatura ambiente. Se utilizan congeladores de motor doble y también hay un congelador de respaldo. Además, para garantizar que los congeladores estén siempre funcionando, se les proporciona un sistema de monitoreo 24/7 que activa una alarma. También hay un generador de emergencia, en caso de corte de energía. Los participantes son anónimos con un código numérico para garantizar su privacidad; no es posible que el personal no autorizado vuelva a la identidad de los donantes y a sus datos razonables. Toda la información se recopila en una base de datos protegida por contraseña; Del mismo modo, una copia impresa de estos datos se mantiene en archivos bloqueados.

Representative Results

Donantes cerebrales y datos de recolección cerebral
En 2014, el reclutamiento de donantes comenzó durante el segundo seguimiento de InveCe.Ab, que involucró a 1010 de 1061 sujetos elegibles (tasa de respuesta: 93%; Figura 1). En relación con el estudio longitudinal InveCe.Ab, 290 de cada 1010 participantes (28,7%) acordaron registrarse como donantes (160 ya registrados y 130 que expresaron su intención de registrarse). El nivel educativo es mayor en los donantes que en los no donantes (66% de nuestros donantes tienen un nivel medio-alto de educación: 8 o más años de escuela), lo que indica la importancia de la cultura y la educación. Muchas personas "saludables" también mostraron interés en el programa de donación cerebral. La mayoría de nuestros "controles" confiesan que pueden simpatizar con los enfermos y sus familiares, y quieren contribuir de alguna manera a la investigación que conduce a una mejor comprensión de las enfermedades neurológicas. Las personas desinteresadas que regularmente participan en programas de donación de sangre o médula durante la vida están más abiertas a la idea de la donación de cerebros, al igual que las personas que ya han aceptado donar órganos después de la muerte. Son conscientes del hecho de que aunque no habría un beneficiario vivo, su donación sería de gran importancia para la investigación. Otro factor que contribuye a la donación cerebral es la preferencia por ser cremado. Actualmente, la población de donantes de ABB incluye un total de 427 individuos (290 participantes de InveCe.Ab + 137 voluntarios o pacientes del Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli), de los cuales el 75% tienen 70 años o más. Hay un claro predominio de las hembras (64%) y ancianos mentalmente intactos (alrededor del 85%). Hasta ahora, 27 cerebros han sido cosechados de 40 donantes fallecidos (67% tasa de autopsias); 13 sujetos no han sido autopsiados por varias razones, incluyendo la falta de informe de la muerte a ABB, lesiones graves que conducen a la destrucción cerebral, enfermedades infecciosas peligrosas y 1 caso de ECJ; 4 sujetos han revocado su consentimiento. Hasta ahora, 24 de los 27 cerebros cosechados recibieron una caracterización neuropatológica completa con un diagnóstico clínico-patológico definido, mientras que los 3 cerebros restantes todavía están en examen (Tabla 3). Los datos adicionales de recolección cerebral de ABB incluyen: edad media al morir (81 años); intervalo medio postmortem (10,37 h); pH medio del CSF (6,64); pH medio del tejido (6,07); peso cerebral promedio (1012.86 gr); AFS fue 1 en el 90% de los sujetos fallecidos.

Biomarcadores neurofisiológicos (QEEG)
QEEG es parte del enfoque multidimensional. Es un método sencillo, no invasivo y barato, con un potencial probable para detectar la conversión de trastorno neuro-cognitivo leve (NCD leve o MCI) a trastorno neuroco cognitiva mayor (mayor ENT o demencia). A través de nuestro enfoque multidimensional, se realiza un examen de QEEG simple y se prueba su posible papel como biomarcador para la demencia. Nuestros datos sobre una serie preliminar de 36 donantes cerebrales (18 ancianos normales (NOLD), 11 DE LAS ENT leves y 7 de las PRINCIPALES ENT; 9 de los cuales con un diagnóstico neuropatológico definido) indican que el porcentaje medio de ritmo alfa fue significativamente menor en la CONT mayor en comparación con la ENFERMEDADNC leve (p: 0,002) y NOLD (p: 0,033). Por el contrario, las frecuencias EEG más lentas (theta/delta) fueron significativamente más altas en las PNC principales que en noLD/NCD leve (véase los casos de ejemplo en la Figura 4). En nuestra serie, la distribución rítmica del EEG puede diferenciar a los sujetos de NOLD/NCD leve de los pacientes con NDC principales, independientemente del diagnóstico etiológico, lo que sugiere que los ritmos cerebrales están influenciados por la carga de lesiones degenerativas independientemente del tipo de lesión. De hecho, 7 de cada 9 cerebros examinados muestran demencia debido a patologías mixtas. La especificidad relativa a la naturaleza de la patología parecería ser baja y los ritmos eléctricos cerebrales parecen estar más influenciados por la carga y la topografía de las lesiones que por su naturaleza molecular (Poloni, et al. proceedings of AD/PD 2019, Lisbon, data inpublished).

Casos emblemáticos
El protocolo ABB puede ser útil y necesario en algunos casos y condiciones. Un ejemplo es la presencia de una patología asimétrica (Figura 5). Nuestro protocolo es muy adecuado para la identificación y caracterización adecuada de este tipo de patología. Hasta ahora, hemos examinado 4 cerebros con afectación asimétrica, algunos de los cuales se muestran en la Figura 5. Macroscópicamente, la atrofia del lado derecho (Figura 5A) está presente en un caso con dilatación ventricular grave en la sección coronal derecha ( Figura5C) en comparación con el lado izquierdo ( Figura5B). Otro caso muestra infarto del hemisferio derecho (Figura 5D) y otro muestra una clara atrofia del cuerpo mamilar derecho (Figura 5E). A nivel microscópico, un caso de FTLD muestra una positividad asimétrica TDP-43 que es más intensa en el lado frontal derecho en comparación con la izquierda (Figura 5F,G).

Las macrosecciones (Figura 6A,C) se utilizan para obtener una vista general. La tinción LFB ayuda a identificar la pérdida de mielina (Figura 6D) e IHC para 4G8 y AT8 (Figura 6B) permite evaluar la distribución de la inmunoreactividad en los hemisferios a simple vista. En la serie ABB, cerebros de individuos relacionados están disponibles para ser comparados.

En la Figura 7, las imágenes microscópicas de secciones de los cerebros de gemelos homocigotos se colocan una al lado de la otra para una comparación más fácil (gemelo 1 (BB137): Figura 7A,C,E,G,I,K versus twin 2 (BB138: Figura 7B,D,F,H,J,L). Al igual que en un estudio anterior similar^68,ambos gemelos fueron comparados por evaluaciones clínicas y neuropatológicas. Los gemelos informaron del mismo diagnóstico de ENT mayor debido a múltiples etiologías, pero murieron con dos años de diferencia, a los 83 años (inicio de la demencia a los 72 años) y 85 (inicio de la demencia a los 76 años), respectivamente. Sus cerebros tienen un cuadro neuropatológico muy similar, con alta patología AD asociada con la angiopatía amiloide. La inmunorreactividad 4G8 se difunde a lo largo de la corteza(Figura 7A, B)y los ganglios basales (Figura 7C,D) con placas difusas, densas y núcleos. También se detecta claramente en los vasos parénquimales y leptomeningeales de la corteza y el cerebelo (Figura 7A, B, G-J). Con mayor aumento, capCAA es claramente evidente(Figura 7G,H). Las placas inmunopositivas AT8, los enredos y los hilos son difusos en los cortices parietales de ambos cerebros (Figura 7E,F,L). En cuanto a la carga de patología amiloide y NFT, gemelo 1 se considera una etapa Thal 3 (montine A2) y un Braak etapa 5 (montine B3), mientras que el gemelo 2 se considera una etapa 5 Thal (montine A3) y una etapa Deak 6 (montine B3). Tuvieron los mismos años de educación y un estilo de vida similar; sin embargo, uno (BB137) se casó y enviudó poco después, mientras que el otro era soltero (BB138). Mostraron diferentes grados de variabilidad clínica-patológica con el mismo comienzo y el mismo curso de la enfermedad pero en diferentes plazos. Esto confirma el hecho de que, aunque el componente genético desempeña un papel clave en el desarrollo de la enfermedad, el componente epigenético y ambiental son fundamentales para determinar manifestaciones ligeramente diferentes.

En algunos casos, el cuadro clínico no se corresponde con las características neuropatológicas. En la Figura 8,dos casos diferentes se definieron clínicamente como casos de AD; los análisis neuropatológicos muestran, además de una patología intermedia de addumping, una positividad difusa para el sí-syn. En el primer caso, una imagen grave de LTS (Playa IV) muestra los cuerpos de Lewy encontrados homogéneamente a lo largo del gyrus cingoli (Figura 8A) y en SN como inclusiones citoplasmasmicas rodeadas de neuromelanina ( Figura8B,C). En el segundo caso, los cuerpos de Lewy asociados con las neuritas de Lewy se distribuyen difusamente en la amígdala (Figura 8D,E) y en el núcleo de Meynert (Figura 8F,G) que sugiere un diagnóstico límbico de LTS. De hecho, la topografía de las lesiones en lugar de su naturaleza molecular produce las manifestaciones clínicas.

Figura 1: Diagrama de flujo del estudio Inve.Ce.Ab. Al inicio, la prevalencia general de demencia fue del 3%. Durante el transcurso de los seguimientos, las tasas de prevalencia fueron: 4,4%^(1o)⁶⁹, 7,1% (2^nd),10,9% (3^rd). La tasa de incidencia de ocho años fue de 15 p/1000/año (IC del 95%: 13–18 p/1000/año). El reclutamiento de donantes comenzó en 2014 (durante el segundo seguimiento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Protocolo de disección de cerebrum (A), cerebelo (F) y tronco encefálica (H). Círculo de Willis y hemisferios individuales se muestran en (E) y (B). Los cortes coronales del lado derecho (C) y del lado izquierdo (D) están numerados y, alternativamente, fijos ("F") y congelados ("C"). Se muestran secciones de cerebelo sagital (G) y secciones axiales del tronco encefálica (I). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Se muestran las rebanadas coronales del lóbulo fronto-temporal derecho (A) e izquierdo (B).
El hipocampo y el lóbulo temporal (A, R10b) se dividen del lóbulo frontal (A, R10a) en la rebanada derecha. En la rebanada opuesta, la amígdala y los ganglios basales (B, L9b) se dividen del lóbulo frontal (B, L9a). Barra de escala: 1,7 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Distribución relativa de la potencia espectral en sujetos NOLD y de LA CONT mayor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes representativas de patologías asimétricas. (A) Primer caso: cerebro con atrofia derecha. Las rodajas coronales (B) y( C) muestran dilatación ventricular del lado derecho particularmente evidente en las secciones 10–12 (C, flechas). En las secciones (B) y (C), "F" significa fijo y "C" para congelado (en italiano: congelato). (D) Segundo caso: infarto grave del hemisferio derecho. (E) Tercer caso: atrofia del cuerpo mamilario derecho (flecha). (F, G) Cuarto caso: las imágenes microscópicas muestran una inmunoreactividad TDP-43 más intensa en la corteza derecha frontal (G) en comparación con la izquierda (F) en un caso de demencia frontotemporal. Barras de escala: 183 m (F, G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Macrosections. (A, C) Rebanadas coronales de lóbulo fronto-temporal fijo (A) y lóbulo parietal fresco (C). (B) Sección histológica fronto-temporal inmunoetiqueda con anticuerpo AT8. La inmunoreactividad se distribuye claramente por toda la corteza, pero es más intensa en el lóbulo temporal. (D) Sección parietal histológica manchada con LFB. La flecha indica un área de desmielinización de la materia blanca. Barra de escala: 1,55 cm (B, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Gemelos. Comparación entre cerebros de dos gemelos homocigotos: BB137 (A, C, E, G, I, K) y BB138 (B, D, F, H, J, L). Las imágenes neuropatológicas son muy similares. (A) y( B) muestran positividad 4G8 difusa en el lóbulo occipital con placa amiloide, vasos leptomeningeales (flechas) y parénquimales (puntas de flecha). La angiopatía amiloide capilar (asteriscos) es bien reconocida en aumentos más altos (G) y( H). 4G8 se distribuye difusamente a través de los ganglios basales (C, D) y alrededor de los vasos leptomeningeales de cerebelo (I, J: flechas). La inmunorreactividad AT8 identifica enredos, hilos y placas (flechas) en la corteza parietal (E, F). La tinción de Gallyas (K) revela placas neuréticas como lo hace el anticuerpo AT8 (L). Barras de escala: 470 m (A–F; I–J); 90 m (G–H; K–L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Diagnóstico clínico versus neuropatológico. En esta figura, se notifican dos casos diferentes en los que el diagnóstico neuropatológico difiere del diagnóstico clínico. La inmunoreactividad para el syn es un resultado inesperado. (A–C) Primer caso: Gyrus cingoli (A) muestra una distribución homogénea de los cuerpos de Lewy en SN (flechas B). En una neurona de SN, se muestra un cuerpo doble de Lewy rodeado de neuromelanina (C). (D–G) Segundo caso: Una positividad difusa para el syn es detectable en el núcleo de amígdala (D, E) y Meynert (F, G). Los cuerpos celulares y las neuritas de Lewy (asterisco) están bien marcados. Barras de escala: 154 m (A, D, F); 37 m (B, E, G); 20 m (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Plantilla de acuerdo de transferencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

		N	%
Género	Machos	607	45.9
Género	Hembras	714	54.1
Cohorte de nacimiento	1935	236	17.8
	1936	219	16.6
	1937	264	20.0
	1938	305	23.1
	1939	297	22.5
Estado civil	Casado	872	66.1
	Cohabiting	13	1.0
	Separado/Divorciado	29	2.2
	Viuda	325	24.6
	soltero	80	6.1
Ocupación primaria de la vida	Trabajadores de cuello azul	666	50.6
	Trabajadores de cuello blanco	459	34.9
	Ama	191	14.5
Años de educación	5 años	754	57.2
Años de educación	>5 años	565	42.8

Tabla 1: Características sociodemográficas de los participantes del estudio InveCe.Ab.

CRITERIOS DE INCLUSIÓN	CRITERIOS DE EXCLUSIONES
Todos los individuos de 18 años o más	Personas que rechazan descaradamente la donación
Personas que viven dentro del territorio de Abbiategrasso	Personas que viven fuera de la región de Lombardía
Voluntarios que dan su consentimiento por su cuenta	Discrepancias entre el posible donante y los noks con respecto a la donación cerebral
Sujetos incapaces de decidir con el permiso de NOK	Situaciones que destruyen en gran medida la consistencia del cerebro
Muerte por una causa natural	Curso clínico de <2 años a menos que se haya excluido la posibilidad de una enfermedad priónica
	Muerte causada por homicidio o suicidio, con la necesidad de un informe forense
	Intervalo post mortem >30 horas

Tabla 2: Criterios para la donación de cerebros.

No, no	Sexo	CÓDIGO BB	CODE InveCe	Edad	edu (años)	Diagnóstico clínico	Cdr	Afs	PM (horas)	tejido de pH	licor de pH	diagnóstico neuropatológico
1	F	BB 37		87	5	Mayor-NCD debido a AD (BPSD)	5	2	29	Nd	Nd	Patología ad alta, SVD moderada, TDP43+, CTx LTS, HS
2	F	BB 105		94	5	Contra las ENFERMEDADes mayores debido a la AD	5	1	5	5.72	6.78	Alta patología de AD, SVD leve, HS
3	F	BB 137		83	3	Mayor-NCD debido a múltiples etiologías (AD-VaD)	5	1	16	Nd	Nd	Alta patología de la AD, SVD moderada, infarto occipital, CAA-capCAA
4	M	BB 181		71	13	Mayor-NCD debido a AD (BPSD)	5	2	3	Nd	Nd	LTS grave (Playa IV), patología intermedia de addumping, leveSVD, mCAA
5	M	BB 115	I 636	78	18	Contra las ENFERMEDADes mayores debido a la AD	5	1	6	Nd	Nd	AD intermedio, SVD moderado, Inflamación, ILBD (Beach IIa), HS
6	F	BB 23	I 65	79	3	Contra las ENFERMEDADes Mayores debidas a una enfermedad vascular	5	1	14	Nd	Nd	CAA grave y generalizada, patología ad intermedia
7	M	BB 102	I 412	79	8	Contra las ENFERMEDADes Mayores debidas a una enfermedad vascular	3	1	8	Nd	Nd	Demencia vascular, ILBD
8	M	BB 224	I 16	80	3	Mayor-NCD debido a múltiples etiologías	5	1	11	Nd	5.99	SVD moderada, Patología baja en AD, ILBD (Beach IIa), HS
9	F	BB 47		78	5	Principales NCD a múltiples etiologías (LBD-VaD BPSD)	5	0	8	Nd	Nd	Patología ad alta, patología BG TAU, ARTAG, SVD leve, HS
10	F	BB 153	I 965	79	5	ENFERMEDAD leve (muerte por cáncer de colon con metástasis generalizada)	0.5	1	8	Nd	6.73	Patología baja de AD, BG-SVD moderado
11	M	BB 118	I 1211	79	13	NOLD (muerte por cáncer de hígado)	0	2	3	Nd	6.51	SVD moderado
12	M	BB 236	I 521	80	3	Mayor-NCD debido a AD (BPSD)	4	1	15	Nd	6.15	Alta patología de adción, BG-SVD grave (varios micro sangrados), HS
13	F	BB 138		85	3	Mayor-NCD debido a múltiples etiologías (AD-VaD BPSD)	4	0	15	Nd	6.75	Patología ad alta, SVD moderada, CAA, TDP límbico43
14	M	BB 109	I 876	79	8	NOLD (muerte por tumor cerebral - GBL)	0	1	16	Nd	6.4	Patología baja en AD, ILBD (Beach IIa), SVD leve
15	F	BB 271		84	8	Mayor-NCD debido a AD (BPSD)	4	1	2	Nd	6.7	AD intermedio, LTS límbico, BG-SVD moderado, mCAA, TDP
16	F	BB 71	I 1080	79	8	NOLD (muerte por insuficiencia cardíaca)	0	0	6	Nd	6.26	BG-SVD moderado, ILBD, amy TDP, AD bajo
17	F	BB 189	I 858	80	5	Mayor-NCD debido a AD (BPSD)	3	0	20	Nd	6.42	AD intermedio, CAA-capCAA, TDP43, BG-SVD moderado, HS
18	F	BB 278	I 924	80	5	Mayor-NCD debido a LBD (BPSD)	3	1	5	6.02	7.05	AD intermedio, LTS límbico (Playa IV), TDP límbico, HS
19	F	BB 247		104	8	Ansncocitos mayores debido a múltiples etiologías (probablemente patología mixta)	3	0	6	6.48	7.22	TAU pathology (PART-ARTAG), HS
20	M	BB 85	I 19	83	10	Mayor-NCD debido a LBD (BPSD)	3	1	9	6.26	7.3	LTS límbico grave, AD intermedio, SVD moderada, CAA-capCAA grave, HS
21	F	BB 14	I 222	82	8	Mayor-NCD debido a múltiples etiologías (AD-VaD)	2	1	11	5.59	6.4	Patología de AD intermedia, SVD moderada
22	F	BB 282		76	8	PRINCIPALES ANT frontotemporales (nfPPA BPSD)	3	1	10	6.07	6.39	TDP (tipo A), ILBD, SVD moderado, AD bajo, HS
23	F	BB 154	I 1079	80	5	NOLD (muerte por cáncer con metástasis generalizada)	0	1	5	6.49	6.9	SVD moderado, CAA, AD baja, encefalitis límbica
24	F	BB 290		65	13	PRINCIPALES ANT frontotemporales (bvFTD BPSD)	5	1	12	5.73	6.42	TDP (tipo A)
25	F	BB 210		89	8	Mayor-NCD debido a AD (BPSD)	5	1	15	5.94	6.4	en curso
26	M	BB 293		75	18	Principales ENT frontotemporal (bvFTD BPSD)	5	1	8	6.14	6.83	en curso
27	F	BB 99	I 1370	79	9	NOLD (muerte por shock séptico)	0	2	14	6.3	7.12	en curso
	M/F			Decir	Decir		Decir	Decir	Decir	Decir	Decir
	0.5			81	7.7		3.2	1.0	10.4	6.1	6.6

Tabla 3: Diagnóstico clínico/neuropatológico de la serie ABB. BB: Brain Bank; edu (años): años educativos; CDR: Clasificación de la demencia clínica (0 no hay demencia; 0,5 - deterioro cognitivo leve; 1 - demencia leve; 2 - demencia moderada; 3 - demencia grave; 4 - demencia muy grave; 5 - demencia terminal); AFS: Puntuación de Factor Agonal; PM (horas): Horas post Mortem; nd: no hecho; M/F: Machos/Hembras; BPSD: Síntomas conductuales y psicológicos de la demencia; VaD: Demencia vascular; NOLD: Ancianos normales; GBL: Glioblastoma; nfPPA: Afasia Progresiva Primaria no fluida; bvFTD: variante conductual de la demencia frontotemporal; SVD: Enfermedad de los vasos pequeños; LTS: Sinucleinopatía Tipo Lewy; HS: Esclerosis hipocampal; CAA: Angiopatía amiloide cerebral; capCAA: CAA capilar; mCAA: CAA meningeal; ILBD: Enfermedad del cuerpo de Lewy incidental; BG: Ganglia basal; ARTAG: Astro-Gliopatía TAU relacionada con la edad; PARTE: TAUopatía relacionada con la edad primaria; amy: amigdala.

Dominio	Nombre de la prueba
Depresión	Escala de depresión del Centro de Estudios Epidemiológicos (CES-D) [2]
Cognición global	Mini-Examen de Estado Mental (MMSE) [1]
Memoria verbal y visual	Prueba de Recordatorio Selectivo Libre y Cued [3]
	Prueba de Corsi [4]
	Figura del complejo Rey-Osterrieth (ROCF) Recuperación [5]
Atención/velocidad psicomotora	Trail making A [6]
Atención/velocidad psicomotora	Matrices atencionales [4]
Memoria semántica del lenguaje	Fluidez verbal semántica (colores, animales, frutas, ciudades) [4]
Funciones ejecutivas	Trail making B [6]
Funciones ejecutivas	Matrices de color del cuervo [7]
Habilidades visuospatiales	Prueba de dibujo del reloj (CDT) [8]
	Copia de la figura del complejo Rey-Osterrieth (ROCF) [5]

Tabla 4: Evaluación neuropsicológica para donantes cerebrales.

Metabolitos

Conteo sanguíneo completo

Colesterol HDL y LDL

Triglicéridos

Glucosa

Hemoglobina glicada (HbA1c)

Homocisteína

Cobalamina (Vitamina B12)

Folato

Albúmina

Urea

Creatinina

Transaminasas (ALT y AST)

Gamma Glutamyl transferasa

Hormona estimulante de la tiroides (TSH)

Vitamina D (25-hidroxi-vitamina D)

Proteína C reactiva (CRP)

Electrolitos

Tabla 5: Panel metabólico para donantes cerebrales.

NOMBRE GENE	dbSNP
Apolipoproteína E (APOE)	rs429358
Apolipoproteína E (APOE)	rs7412
Catalasa (CAT)	rs1001179
Superóxido dismutasa 2 (SOD2)	rs4880
Angiotensinogen (AGT)	rs699
Sirtuina 2 (SIRT2)	rs10410544
Translocase de membrana mitocondrial externa 40 (TOMM40)	rs2075650
Integrador de puentes 1 (BIN1)	rs7561528
Catecol-O-metiltransferasa (COMT)	rs4680
Metilenetetrahidrofolato reductasa (MTHFR)	rs1801133
Metilenetetrahidrofolato reductasa (MTHFR)	rs1801131
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	rs6265
soluto familia portadora 6, miembro 4 (SLC6A4 o 5HTT)	Transportador de hidroxitriptamina región polimórfica ligada al gen (5-HTTLPR)
soluto familia portadora 6, miembro 4 (SLC6A4 o 5HTT)	rs25531

Tabla 6: SNP analizados para donantes cerebrales InveCe.Ab.

Proceso	Solución	Duración
		MACRO SAMPLES	MICRO MUESTRAS
Fijación	10% FORMALINA TAMPONADA	8 días a 4oC	8 días a 4oC
Lavado	BÚFER DE FOSFATO	2-15 días a temperatura ambiente	2-15 días a temperatura ambiente
Lavado	H₂O LAVADO	2-3 h, agua del grifo	2-3 h, agua del grifo
Deshidratación	ALCOHOL ETÍLICO 70%	24 h	8 h
Deshidratación	ALCOHOL ETÍLICO 80%	24 h	4 h
Deshidratación	ALCOHOL ETÍLICO 90%	60 h (generalmente durante el fin de semana)	4 h
Deshidratación	ALCOHOL ETÍLICO 95%	12 h	4 h
Deshidratación	ALCOHOL ETÍLICO 95%	12 h	4 h
Deshidratación	ALCOHOL ETÍLICO 100%	6 h	4 h
Deshidratación	ALCOHOL ETÍLICO 100%	6 h	4 h
Claro	XYLENE I	12 h	10 h
Claro	XYLENE II	12 h	10 h
Infiltración	PARAFFIN I	12 h	11 h
Infiltración	PARAFFIN II	12 h	11 h
Incrustación	CERA DE PARAFINA

Tabla 7: Protocolo de procesamiento de tejidos ABB.

Región	H&E	CRESIL VIOLETA	Lfb	Gallyas	4G8	AT8	-SYN	TDP-43	Neun	Gfap
BRAINSTEM
Medulla- Núcleo Motor Dorsal de Vagus	X					X	X
Pons - Locus Coeruleus	X					X	X
Midbrain - Sustancia Nigra	X				X	X	X
Cerebelo
Núcleo de corteza cerebelosa y dentuto	X	X	X		X
Cerebro
Giro frontal medio	X	X	X		X	X	X	X
Bastelia + núcleo de Meynert	X	X	X		X				X	X
Cingulate, anterior	X	X	X		X		X		X	X
Amígdala	X					X	X	X	X	X
Tálamo y núcleo subtalámico	X					X
Giro temporal superior y medio	X	X	X	X	X	X	X		X	X
Hipocampo y corteza entorrinaal	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Lobulo parietal inferior	X	X	X	X	X	X	X
Corteza occipital	X		X		X	X	X
Bombilla olfativa	X						X

Tabla 8: Evaluación de regiones, tinción e inmunohistoquímica.

Discussion

Pasos críticos en el protocolo
Nuestro objetivo es obtener, caracterizar y almacenar tejidos de buena calidad procedentes de sujetos con una historia detallada derivada de la observación longitudinal. Para alcanzar este objetivo, es necesario abordar los siguientes aspectos clave. Como se describió anteriormente, el protocolo comienza con el reclutamiento de donantes, que es el primer paso crucial. Entonces, es necesario que los donantes continúen el programa de seguimiento y mantengan la adhesión al proyecto a lo largo del tiempo hasta la donación real del cerebro. En el momento de la muerte, es necesario que el personal de la ABB sea notificado rápidamente para convocar al equipo de autopsia dentro de las 24 horas, siendo importante para la calidad adecuada del tejido. El corte fresco de los hemisferios cerebrales requiere una mano firme y un entrenamiento específico. Para evitar el daño celular causado por la congelación lenta y obtener rebanadas de buena calidad para el criostato y la omica, es importante que se congelen rápidamente. Teniendo en cuenta la velocidad de penetración de la solución de formalina (1 mm/hora), para preservar la antigenicidad tisular, el tiempo de remojo de la rebanada única se mantiene en su mínimo.

Solución de problemas del método
Con el fin de abordar los pasos críticos mencionados anteriormente, ofrecemos el siguiente enfoque. Reclutamiento de donantes y adherencia a los seguimientos: Hay varios factores que dificultan la donación de cerebros, incluyendo el temor de dañar la figura del cuerpo, pureza e integridad, o de la posibilidad de sentir dolor después de la muerte. Algunos incluso se preocupan de que la autopsia se puede llevar a cabo mientras que todavía están vivos^70,^,⁷¹. Las preocupaciones sobre la interrupción de los arreglos funerarios y la carga financiera también están presentes⁷². Además, la falta de conocimiento del personal médico sobre los procedimientos postmortem y la incapacidad para abordar las preocupaciones de los posibles donantes o de su NOK pueden desalentar el registro. Todos estos factores pueden producir un bajo nivel de conciencia con un bajo número de participantes inscritos y una alta posibilidad de pérdida del donante con el tiempo. De hecho, el programa de reclutamiento de donantes debería ser eficiente para difundir la concienciación, inculcar confianza y convencer a las personas para que registren y mantengan altas tasas de participación en el seguimiento. En nuestra experiencia, esto se hace a través de una cuidadosa selección de posibles donantes y una explicación exhaustiva de los propósitos del BB. Ofrecemos actividades educativas y un enfoque empático que aborda los miedos y necesidades tanto de las personas sanas como de las personas afectadas por enfermedades neurodegenerativas y sus familias. Encontramos que los donantes potenciales son más propensos a dar su consentimiento cuando se les acerca en persona. Un enfoque cara a cara crea una relación basada en la confianza mutua y el respeto que es fundamental para lograr un alto porcentaje de registro en la donación de cerebros y evaluaciones de seguimiento. Un personal altamente capacitado con un fuerte sentido de la ética primero se acerca al donante potencial, discute la posibilidad de donar el cerebro después de la muerte, explica el valor del tejido cerebral humano para la investigación neurocientífica, y aclara cualquier duda con respecto a los procedimientos postmortem. El boca a boca favorable es igualmente importante. Después de la cosecha del cerebro, se da la atención y el cuidado adecuados para recomponer el cadáver. Es importante mostrar respeto y gratitud a la persona fallecida tratando el cadáver suavemente. Unos meses después, está programada una reunión para comunicar los resultados del análisis neuropatológico cuando lo soliciten los familiares.

La hora de la muerte y la recolección del cerebro: Cuando la persona acepta, se convierte en donante y se le da una tarjeta de identificación con un número para contactar 24 horas/día, 7 días/semana (el número de recepción del Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli que está conectado con nosotros). Además, se da una etiqueta adhesiva a los familiares que se utilizarán en caso de hospitalización. Las agencias funerarias de la zona fueron previamente informadas para llevar el cuerpo a las instalaciones de la ABB, donde se convoca al equipo de autopsias. El equipo de autopsia está compuesto por un patólogo, un neurólogo y/o un neurobiólogo, y un técnico de sala anatómica, que están de guardia de 6 a. m. a 11 p. m. todos los días; algunos estudiantes en prácticas también están presentes con frecuencia para ayudar y tomar fotos.

La precisión y consistencia de los nuevos procedimientos de corte están garantizadas por la participación de los mismos dos operadores (un neurólogo y un patólogo) que han desarrollado el método y tienen varios años de experiencia en neuropatología. Al congelar las rodajas, se colocan en una bandeja de aluminio precongelado y se cubren con una placa de aluminio entrelazado para mantenerlas bien planas. Inmediatamente después, se ponen en nitrógeno líquido durante 3 minutos, antes de almacenarlos a -80 oC. Las rodajas a fijar se envuelven individualmente en gasa y se empapan en una solución de formalina tamponada de 10%, que se sustituye después de un día. Posteriormente, se mantienen en formalina no más de 5 días adicionales; sin embargo, teniendo en cuenta que la solución de formalina penetra a 1 mm/día, nos gustaría acortar aún más el tiempo de remojo.

Limitaciones del método
El método de investigación descrito aquí sólo cubre un área geográfica limitada, y las personas involucradas en el programa de donación poseen características que no representan completamente a la población general. Aunque es más que aceptable, un intervalo postmortem de hasta 24 horas puede producir alteraciones en algunas estructuras proteicas, enzimas y ARN del tejido cerebral. La determinación de AFS y pH puede no ser totalmente adecuada para determinar la calidad del tejido⁷³ y estamos desarrollando otras formas de autenticar la calidad del tejido en función de la integridad del ARN.

En cuanto al procedimiento de corte de microtomos, aunque muy útil para la reconstrucción de relaciones anatómicas, cabe señalar que el uso de macrosecciones no es sencillo y presenta algunas dificultades técnicas. Nuestro método es desafiante y requiere mucho tiempo. Los costos son bastante altos y la financiación no siempre es fácil. La financiación proviene principalmente de recursos públicos (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) y privados (Fundación Golgi-Cenci), donaciones privadas, organizaciones sin fines de lucro (por ejemplo, "Federazione Alzheimer Italia") y otorga la participación.

La importancia del método ABB con respecto a los métodos existentes/alternativos
Al principio, nuestro programa de donación de cerebros se dirigió a individuos que participaban en el estudio longitudinal InveCe.Ab. Como consecuencia, los cerebros donados van acompañados de información clínica, biológica y social detallada recopilada a lo largo de los años. La fuerza de ABB deriva precisamente de este origen distintivo. De hecho, estudiar un grupo de personas relacionadas social y genéticamente que comparten características biológicas y exposiciones ambientales mejora el análisis estadístico. Además, el estudio incluye los siguientes beneficios: 1) Cuidar y proveer para las necesidades de la comunidad (el acto de "dar antes de preguntar"): las personas reciben un chequeo periódico gratuito del cual se informa al médico general, se proporciona un número de teléfono de nuestro secretario para consultas y se visita a las personas severamente discapacitadas en casa; 2) Involucrar a los participantes, las personas con funciones públicas y los médicos generales en las actividades educativas a través de la organización de seminarios periódicos (relacionados con la salud cerebral, la donación de cerebros y la salud general), y la planificación de cursos temáticos (por ejemplo, el uso de dispositivos de tecnología de la información para personas mayores); 3) Conocer a las personas y adoptar un enfoque cara a cara. Todos estos elementos constituyen la fuerza del proyecto ABB. Además, el proyecto mejora las capacidades clínicas del personal médico involucrado, ya que adquieren experiencia tanto en evaluaciones antemortem como en evaluaciones neuropatológicas postmortem. En este sentido, nos gustaría mencionar la experiencia muy peculiar de "El estudio de investigación de envejecimiento minoritario". Este estudio involucró un número limitado y seleccionado de afroamericanos que residen en el área de Chicago (784 de 1.357 sujetos elegibles: tasa de respuesta del 57%). Los participantes fueron visitados anualmente en casa y se les pidió que se unieran al programa de donación cerebral. Este estudio se basa en un enfoque inusual con algunas similitudes con la nuestra obteniendo altos porcentajes de respuesta positiva al programa de donación cerebral (352 donantes de 784 participantes fueron inscritos: 44%), aunque la tasa de autopsia no fue del todo satisfactoria (53%)⁷⁴. Al igual que en "El estudio de investigación de envejecimiento minoritario", ofrecemos actividades educativas y un enfoque empático, logrando excelentes resultados. En particular, nuestra tasa de respuesta es del 93%, el porcentaje de inscripción es del 28,7%, y la tasa de autopsia en este momento es del 67%. Estas tasas muestran que los proyectos que involucran directamente a las personas tienen un porcentaje más sustancial de donaciones. Otros programas de donación de cerebros, con menos atención en la construcción de una relación con donantes potenciales, generalmente tienen un bajo porcentaje de inscripción, siendo alrededor de 10-15% o menos^73,^,⁷⁵.

Hay pocos estudios previos de cohortes que terminan con un análisis neuropatológico. Además, la mayoría de los bancos y repositorios cerebrales están centrados en enfermedades y hay una escasez de cerebros de "control" de donantes sanos en comparación con el número de cerebros "enfermos". Sólo un número limitado de BBs se basan en estudios poblacionales que involucran tanto sujetos enfermos como normales para estudiar trayectorias de envejecimiento^73,^,^74,^,^76,^,^77,^,^78,^,^79,^,^80. Algunos estudios como "El estudio de investigación de envejecimiento minoritario" en los EE.UU.⁷⁴ y "El estudio Vantaa 85+" en Finlandia⁷⁶ son similares a los nuestros, pero tienden a agotarse con la terminación de la cohorte. En su lugar, el programa de donación de ABB está previsto que continúe durante mucho tiempo en el futuro, alistando a posibles donantes y programando seguimientos incluso después del final del estudio longitudinal InveCe.Ab. Este enfoque hace que nuestro método de reclutamiento sea similar al del programa de donación cerebral del "Sun Health Research Institute (SHRI)" que está dirigido a una comunidad de jubilados⁷³. El protocolo SHRI para la donación de cerebros es muy eficiente con el intervalo postmortem medio más corto del mundo (3,92 horas). Al igual que los BB más grandes del mundo, el protocolo SHRI simplemente corta el cerebrum, el cerebelo y el tronco encefálico en la línea media (plano sagital), entonces una mitad se disecciona fresca y congelada para estudios bioquímicos, mientras que la otra se fija en formalina para la evaluación histopatológica. Sin embargo, uno de los puntos fuertes del protocolo de disección SHRI es la fijación de rebanadas individuales en lugar de todo el hemisferio. De hecho, fijar un hemisferio como un todo no es óptimo, debido a los diferentes gradientes de fijación entre la superficie y el núcleo. Además, las proteínas corticales pueden verse afectadas por una exposición prolongada a la solución de formalina. Por lo tanto, la razón por la que decidimos arreglar rebanadas individuales.

La decisión sobre qué lado es fijo o congelado, depende del banco singular (siempre el mismo, asignado aleatoriamente o asignado dependiendo de si el día de la disección es impar o par)³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵. Por lo tanto, el análisis bioquímico e histopatológico se lleva a cabo por separado en cada hemisferio. Como muchas enfermedades neurológicas son asimétricas, nuestra BB ofrece un protocolo único para cortar muestras frescas: secciones alternativas del tronco encefálico y de cada hemisferio de cerebelo y cerebrum se conservan como material fijo o congelado; una rebanada fija en un hemisferio corresponde a una congelada en el otro hemisferio. Nuestro método da la oportunidad de obtener una caracterización histológica completa de todo el material congelado y comparar los resultados de todas las áreas de ambos lados. Como se dijo en la introducción, el método descrito nos permite obtener tanta información como sea posible del tejido cerebral. Además, el método de ABB produce una caracterización neuropatológica básica pero completa, incluyendo casi todas las proteinopatías cerebrales conocidas y patología vascular. Debido al controvertido papel de las lesiones vasculares en la determinación del deterioro cognitivo, decidimos utilizar una doble puntuación para la carga vascular^30,^,⁵³.

Como se explica en el protocolo, utilizamos un enfoque multidisciplinario. Aunque este es un método lento y laborioso, creemos que proporciona varias ventajas para la investigación. Por ejemplo, en un trabajo anterior, demostramos que el alto tHcy per se, o MTHFR C677T TT asociado con el alelo APOE-4, puede estar relacionado con disfunciones ejecutivas en lugar de pérdida de memoria⁸¹. Por lo tanto, puede ser interesante evaluar sujetos con este perfil genético particular a nivel neuropatológico. Este es un ejemplo de cómo un seguimiento tan profundo es útil para crear nuevas hipótesis de investigación verificables a través de la investigación del material biológico recogido en nuestro banco. Otra demostración de la ventaja de nuestro enfoque es la inclusión de QEEG entre las evaluaciones que realizamos habitualmente, por su originalidad y la relativa facilidad de uso. De hecho, el EEG detecta la actividad sináptica de la corteza cerebral registrando los potenciales eléctricos de las dendritas pertenecientes a las neuronas piramidales corticales^82. QEEG puede considerarse un biomarcador para la estimación de la actividad sináptica cortical relacionada con la cognición⁸³. Particularmente, una disminución en los ritmos alfa en la parte posterior del cerebro con un aumento general de frecuencias más bajas (ritmos theta y delta) se ha relacionado con la ruptura de la conexión cortical. Se debe considerar que la mayoría de los estudios de correlación diagnóstica se han basado en un diagnóstico clínico que es sólo un diagnóstico probable y no definitivo⁸⁴^,⁸⁵^,⁸⁶^,⁸⁷. Sólo muy pocos estudios dirigidos han comparado los datos de QEEG con el cuadro neuropatológico para investigar la correlación entre las variantes^{88, 89}^,⁸⁹y LA distinción entre FTLD y AD^83. Al finalizar nuestro estudio con una definición del diagnóstico neuropatológico, es posible interpretar correctamente las observaciones realizadas sobre la actividad eléctrica cerebral. Además, realizando QEEG serie en cada sujeto podemos rastrear la trayectoria de las ondas EEG intra-individuales y sus correlaciones con el cuadro neuropatológico. Después de las modificaciones individuales de la actividad eléctrica cortical a lo largo del tiempo puede conducir a una mejor comprensión de su significado como un biomarcador para la demencia incipiente.

Aplicaciones futuras y dirección del método
La implementación de la distribución de tejidos es uno de nuestros principales objetivos prospectivos. Para ello, acabamos de crear una comisión científica que incluye al director de la Fundación GC (geriatra), académico de Neurología de la Universidad de Pavía, neurólogo y patólogo tanto de la Fundación GC como del Hospital Geriátrico ASP Golgi-Redaelli. Al distribuir tejido cerebral, diapositivas histológicas y otras muestras biológicas, es importante recordar que los donantes estuvieron de acuerdo con la donación en aras de la investigación. Por lo tanto, la distribución del material debe llevarse a cabo con prudencia, tal como se describe en el Código de Conducta⁴⁰de la BNE. Cualquier parte que presente una solicitud de material debe indicar el tipo y la cantidad de la muestra necesaria, proporcionar una descripción del proyecto de investigación y cómo se utilizarán las muestras y, siempre que sea posible, proporcionar pruebas de publicaciones anteriores (para el acuerdo de transferencia, véase la figura 9). El banco cerebral no funciona para obtener ganancias financieras. Por lo tanto, las tasas pagadas por los investigadores sólo deben cubrir los gastos de la adquisición, procesamiento, almacenamiento y distribución de tejidos.

Los planes para comenzar a analizar casos con técnicas de secuenciación de exomas y omics, como la proteómica y la transcriptómica, están en movimiento. Nuestra metodología de muestreo alternativo permitirá realizar estudios omics en tejidos histológicamente bien definidos de ambos hemisferios. A través de este enfoque, será posible comparar el patrón de activación genética en diferentes áreas cerebrales del mismo hemisferio y en las áreas correspondientes del otro hemisferio, y ser capaz de correlacionar la activación genética con la histopatología. En este campo, las aplicaciones de aprendizaje profundo serían de gran interés, incluyendo el análisis informatizado de diapositivas histológicas y la correlación de vanguardia de datos clínicos, histológicos y omicos. Se pueden identificar otras correlaciones entre muchas variables diferentes, así como otras posibles aplicaciones tecnológicas. La disponibilidad de material congelado de ambos hemisferios permitirá una topografía precisa de la activación genética y la distribución de proteínas. Esto será de particular interés incluso en sujetos sanos, teniendo en cuenta que tanto las funciones cerebrales como algunas enfermedades son asimétricas.

Además, podemos obtener cultivos celulares de donantes cerebrales bien caracterizados. De hecho, los cultivos celulares a partir de los leptomeninges de los cerebros cosechados suministran células vivas que pueden utilizarse para una mayor investigación de enfermedades o mecanismos de envejecimiento, mediante la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que consiste en reprogramar fibroblastos leptomeningales y diferenciarlos en células neuronales en los modelos avanzados⁹⁰.

A medida que el cerebro envejece, diferentes perfiles de cambio pueden ocurrir a nivel molecular, celular y tisular. Cada cerebro es único. Cada uno tiene su propia manera de responder a los factores de estrés internos y externos; algunos se resisten mientras que otros sucumben y muestran patologías distintas. Las discrepancias entre la presentación clínica y el cuadro neuropatológico a menudo existen porque la topografía de las lesiones, en lugar de su naturaleza molecular, determina la presentación clínica. El diagnóstico correcto y definitivo sólo podría lograrse combinando el síndrome clínico con los hallazgos neuropatológicos que a menudo añaden importantes pistas etiológicas necesarias para desentrañar la patogénesis de las enfermedades. En Europa, hay un esfuerzo por crear un enfoque estándar para el diagnóstico neuropatológico. Nuestro protocolo de diagnóstico sigue casi por completo las directrices recientemente publicadas sobre el diagnóstico neuropatológico para la banca cerebral⁹¹. Esto nos permitirá recoger y compartir tejido cerebral bien documentado, con el objetivo prospectivo de establecer el primer Banco Cerebral Italiano. De hecho, en Italia hay repositorios cerebrales pero no bancos cerebrales basados en estudios de cohortes. Nuestro objetivo es desarrollar un método para la recolección de tejido cerebral que se puede implementar ampliamente en toda Italia, para establecer una red que utilice un protocolo común y comparta material comparable. Para ello, la implicación de otros centros de investigación y la creación de un sitio web específico son algunos de los principales objetivos para el futuro.

Las tecnologías innovadoras se utilizan constantemente para el análisis de la naturaleza molecular de las enfermedades neurodegenerativas y para la identificación de biomarcadores. En este contexto, habrá una creciente necesidad de cerebros acompañada de información sobre trayectorias cognitivas y de envejecimiento obtenida a través de estudios longitudinales, haciendo hincapié en la importancia de un enfoque epidemiológico neuropatológicamente verificado⁹².

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Queremos dedicar este trabajo a la Dra. ssa Michela Mangieri. Antes de morir prematuramente, concibió e inició el Proyecto Abbiategrasso Brain Bank.

Estamos agradecidos a nuestros donantes cerebrales, que están contribuyendo generosamente a la investigación donando el órgano más noble de su cuerpo; sin ellos esta investigación no sería posible.

Agradecemos a Valeria Marzagalli su preciado trabajo en el proyecto ABB.

Los autores agradecen al Prof. Johannes Attems, al Dr. Paolo Fociani y al Dr. Giorgio Giaccone su valiosa orientación y sabio consejo.

Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Alice Cirrincione y a la señorita Giulia Bortone por su valiosa ayuda a lo largo del proyecto.
Muchas gracias a la Sra. Tere Cassani por su apoyo y a la "Federazione Alzheimer Italia" por su colaboración.
Los autores agradecen al Dr. Matteo Moretti y al Prof. Antonio Marco Maria Osculati, Departamento de Salud Pública, Medicina Experimental y Forense de la Universidad de Pavía.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC