Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Abbiategrasso Brain Bank protokoll för att samla in, bearbetning och karaktärisera åldrande hjärnor

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/60296
Automatic Translation
*1,4, *1, 1, 2, 1, 1, 1,4, 3, 3, 3, 5, 2,6, 7, 5, 8, 1,2,3
1Department of Neurology and Neuropathology, Golgi-Cenci Foundation, 2Laboratory of Neurobiology and Neurogenetic, Golgi-Cenci Foundation, 3Department of Neuropsychology and Social Sciences, Golgi-Cenci Foundation, 4Department of Rehabilitation, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 5Genomic and Post-Genomic Center, IRCCS Mondino Foundation, 6Department of Brain and Behavioral Sciences, University of Pavia, 7Department of Pathology, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 8Department of Neurological Science, IRCCS Mondino Foundation, University of Pavia
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att spåra enskilda hjärnan-åldrande banor genom en hjärna donation program och korrekt karakterisering av hjärnor. Brain givare är involverade i en långsiktig longitudinell studie inklusive seriella flerdimensionella bedömningar. Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av hjärnans bearbetning och en korrekt diagnostisk metodik.

Abstract

I en ständigt åldrande befolkning förväntas prevalensen av neurodegenerativa störningar stiga. Att förstå sjukdomsmekanismer är nyckeln för att hitta förebyggande och botande åtgärder. Det mest effektiva sättet att uppnå detta är genom direkt undersökning av sjuka och frisk hjärnvävnad. Författarna presenterar ett protokoll för att erhålla, bearbeta, karakterisera och lagra god kvalitet hjärnvävnad som donerats av individer som registrerats i en antemortem hjärnan donation program. Donationen programmet innehåller en ansikte mot ansikte empatisk inställning till människor, en samling av kompletterande kliniska, biologiska, sociala och livsstil information och seriella flerdimensionella bedömningar över tiden för att spåra enskilda banor av normalt åldrande och kognitiv försämring. Eftersom många neurologiska sjukdomar är asymmetriska, erbjuder vår hjärnbank ett unikt protokoll för skivning av färska exemplar. Hjärnsektioner av båda halvkloten är omväxlande frysta (vid -80 °C) eller fixerade i formalin; ett fast segment på en halvsfär motsvarar en fryst på den andra hjärnhalvan. Med detta tillvägagångssätt kan en komplett histologisk karakterisering av allt fryst material erhållas, och omics studier kan utföras på histologiskt väldefinierade vävnader från båda halvkloten därmed erbjuda en mer komplett bedömning av neurodegenerativa sjukdomsmekanismer. Korrekt och bestämd diagnos av dessa sjukdomar kan endast uppnås genom att kombinera det kliniska syndromet med den neuropatologiska utvärderingen, som ofta lägger till viktiga etiologiska ledtrådar som krävs för att tolka patogenesen. Denna metod kan vara tidskrävande, dyr och begränsad eftersom den endast omfattar ett begränsat geografiskt område. Oavsett dess begränsningar, kan den höga graden av karakterisering det ger vara givande. Vårt slutmål är att etablera den första italienska hjärnbanken, samtidigt som vi betonar vikten av neuropatologiskt verifierade epidemiologiska studier.

Introduction

Enligt WHO lider för närvarande cirka 50 miljoner människor av demens, en siffra som beräknas tredubblas fram till 2050. Alzheimers sjukdom är den främsta orsaken till demens, följt av cerebrovaskulär sjukdom och andra åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar. År 2017 utvecklade WHO Det globala demensobservatoriet för att öka medvetenheten om demens och uppmuntra en global handlingsplan mot den1. Varje individ har sin egen hjärna åldrande bana, därför sökandet efter botemedlet kan vara utmanande på grund av komplexiteten i patogenesen vid neurodegenerativa sjukdomar. Kanske har varje person henne eller sin egen patogenes skriven i hjärnvävnaden kräver en personlig strategi. Således kommer studiet av hjärnvävnad vara nyckeln till att förstå mekanismerna för neurodegeneration.

Om vi ser tillbaka på neurovetenskapens historia inser vi att de mest imponerande och banbrytande upptäckterna aldrig skulle ha kunnat inträffa utan direkt undersökning av den mänskliga hjärnan. Under tiden har källan till hjärnvävnad som ska studeras förändrats från råa dissektioner, slumpmässiga "chansmöten" och, i vissa fall, olaglig handel, till organiserade hjärnsamlingar och strategiska moderna hjärnbanker. Övervägandet av många etiska aspekter är en av de viktigaste faktorerna som skiljer moderna hjärnbanker från hjärnans samlingar från det förflutna. Den första riktiga moderna Brain Banks (BBs) instiftade under andra hälften av20-talet. Nicholas Corsellis och Wallace Tourtelotte kan anses vara pionjärer inom modern hjärnbank. I Storbritannien, Corsellis samlat en samling som håller över 1000 väldokumenterade hjärnor påverkas med olika psykiska och neurologiska sjukdomar2. Dessutom hjälpte Corsellis avslöja behovet av att bevara färsk hjärnvävnad i is för den skull biokemiska tester3. Under tiden i USA, Wallace Tourtelotte infört antemortem hjärnan donation program för att underlätta värvning av potentiella hjärnan givare och se till att de insamlade hjärnorna åtföljs av en komplett medicinsk och neurologisk historia4,5. För en historisk översikt över hjärnsamlingar och moderna BBs, se Carlos et al. 6.

Så, varför behöver vi fortfarande mänskliga hjärnor? Hjärnsjukdomar kan endast ges en bestämd diagnos efter neuropatologisk undersökning. Neuropatologin utmanar den kliniska diagnosen, och är nyckeln till en korrekt tolkning av de kliniska symptomen och till upptäckten av de histologiska grunderna för nya syndromatiska varianter. I själva verket kan diagnosen omdefinieras baserat på den patologiska bilden. Icke desto mindre har obduktionsfrekvensen minskat under de senaste decennierna på grund av den senaste utvecklingen av innovativa neuroimaging tekniker. Genom hjärnavbildning kan de morfologiska, funktionella och metaboliska förändringarna i hjärnan, liksom omfattningen av protein felveckning, bedömas in vivo. Emellertid, in vivo neuroimaging och andra biomarkör studier kan bara ge en "uppskattning" av den patologiska bilden eftersom de inte kan upptäcka subtila cellulära och molekylära förändringar. Framsteg inom molekylär avbildning och upptäckten av nya biomarkörer, målmolekyler och spårämnen7 (t.ex. amyloid, TAU, mikroglial spårämnen) gör den mänskliga hjärnan ännu mer oumbärlig för tolkningen av data som erhållits från kliniska utvärderingar och biomarkörtestning. Vidare, omikteknikerna (genomik, epigenomik, transkriptomik, metabolomik, proteomik, lipidomik, etc.), utförs på färsk och frusen hjärnvävnad, öppnade nya möjligheter för att förstå sjukdomar mekanismer och upptäcka riskgener, nya diagnostiska och prognostiska markörer, och potentiella läkemedel mål8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

För dessa ändamål, moderna BBs arkiv väl karakteriserade, högkvalitativa hjärnvävnader gör dem tillgängliga för det vetenskapliga samfundet3,24. Hjärnorna som levereras av BBs bör åtföljas av en fullständig klinisk historia. Verksamheten i en BB omfattar följande: (1) Erkännande och rekrytering av sjuka och friska individer till hjärnan donation program; det ideala villkoret skulle vara att uppnå en tvärvetenskaplig uppföljning av donatorer under hela livet för att få en komplett klinisk, livsstil och social historia, och biomarkörprofiler; verkligen, kognitiv reserv och hjärnans struktur beror på livsstil och socio-pedagogiskafaktorer 25,26, så dessa uppgifter berikar den totala data till hands. (2) Förvärv av hjärnan (bestående av storhjärna, lillhjärnan och hjärnstammen) och relaterade vävnader (t.ex., ryggmärg, kranialnerv och ganglier, etc.) efter givarens frånfälle, hela tiden observera standardiserade rättsliga och etiska föreskrifter. (3) Lämplig bearbetning (dissektion, fixering, frysning) av hjärnan, enligt definitionen i ett standardiserat operativt protokoll, för att erhålla vävnad av hög kvalitet och för att möjliggöra framtida användning i tvärvetenskaplig forskning. (4) Detaljerad neuropatologisk karakterisering som ger en slutlig bestämd diagnos. (5) Lagring och distribution av vävnadsmaterial till forskarsamhället27,28.

Alla BBs lagra både frysta och formalin-fast-paraffin inbäddade vävnader. Varje BB har sitt eget protokoll. Med undantag för särskilda studier, såsom bihemispheric skär protokoll av Biomedical Research Institute (New Jersey)29 och Deramecourt studie av cerebrovaskulär patologi30, den största BBs i världen helt enkelt skära storhjärnan, cerebellum och hjärnstammen längs mittlinjen (sagittal plan). Ena halvan dissekeras färska och sedan frysta för biokemiska studier, medan den andra är fast i formalin för histopatologisk bedömning. Så, biokemiska och histopatologiska analyser utförs separat på varje halvklot. Beslutet om vilken sida som är fast eller fryst (lateralitet), beror påsingularbanken 31,32,33,34,35. Eftersom många neurologiska sjukdomar är asymmetriska erbjuder vår BB ett unikt protokoll för skivning av färska hjärnor: intilliggande sektioner av hjärnstammen och varje halvklot är växelvis fasta och frysta; ett fast segment på en halvsfär motsvarar en fryst på den andra hjärnhalvan. Genom denna metod optimeras användningen av hjärnvävnad, och en fullständig histologisk karakterisering av allt fruset material kan uppnås med möjlighet att erhålla och jämföra histologisk och biokemisk information från alla områden av båda halvkloten.

Ramen för vårt hjärnbanksprojekt är staden Abbiategrasso. Abbiategrasso är en liten stad cirka 22 km sydväst om staden Milano, i norra Italien. Den har en befolkning på cirka 32.600 personer. Det är hem till Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation är en del av ett stort Rehabilitation Geriatric Hospital (ASP Golgi-Redaelli), och är ett institut med fokus på forskning om åldrande och äldreomsorg. Särskilt fokuserar den på att studera mentalt åldrande, de sociala och beteendemässiga faktorer som påverkar det, och biologi och patologi underliggande åldersberoende neurokognitiva störningar (NCDs). 2009 lanserade GC Foundation en ny longitudinell studie med 1321 deltagare (av 1644 berättigade försökspersoner: den initiala svarsfrekvensen på 80,3 %) född mellan 1935 och 1939 (i åldrarna mellan 70–75 år), av kaukasisk etnicitet, bosatt i samma lilla geografiska område. Studien kallades InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; på engelska: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) och pågår för närvarande. InveCe.Ab planeras att erhålla en kohort med maximal homogenitet och minst variabilitet för att bedöma demensens incidens, prevalens och naturhistoria, tillsammans med dess möjliga risk- eller skyddsfaktorer, inklusive beteendemässiga, psykosociala, kliniska och biologiska variabler36. Kohortens egenskaper visas i figur 1 och tabell 1. De epidemiologiska uppgifterna överensstämmer med demenstrenden i deneuropeiska populationen 37,38 och InveCe.Ab-deltagarna har homogena genetiska och miljömässiga egenskaper, vilket representerar en bra modell för att studera banan från normalt åldrande till neurokognitiva sjukdomar. Faktum är att homogena populationer kräver färre försökspersoner för att nå tillräcklig statistisk makt. InveCe.Ab-metodiken har redan rapporteratspå andra ställen 36 men det är viktigt att understryka dess flerdimensionella tillvägagångssätt genom periodiska kontroller (var 2–3 år) med hjälp av samma uppsättning utvärderingar inklusive: blodprovstagning (metabolisk panel, homocystein och vitaminer, DNA-extraktion för att profilera Apolipoprotein E (APOE) och andra genetiska polymorfiser relaterade till kognition och åldrande), antropometriska mätningar (vikt, längd och midja), Talking While Walking Test (dual task test), en intervju för att bedöma livsstil (Medelhavskostens följsamhet, nivåer av fysisk aktivitet och kognitivt engagemang) och sociala faktorer (socialt engagemang, ensamhet), en neuropsykologisk utvärdering och en klinisk allmän undersökning. Att jämföra sådana longitudinella data med postmortem neuropatologiska data skulle vara avgörande för forskning. Därför vårt team och särskilt Dr Michela Mangieri tänkt neuropatologiska metoden som nämns ovan. Sedan 2014 och under den andra uppföljningen ombads InveCe.Ab-deltagarna att donera sina hjärnor, och därmed åstadkomma abbiategrasso-hjärnbankens (ABB) födelse . De centrala givarna av ABB är InveCe.Ab deltagarna men ABB är nu öppen för andra frivilliga givare. De är patienter från ASP Golgi-Redaelli, hem till flera patienter som drabbats av olika neurologiska sjukdomar eller vuxna frivilliga som lär sig om ABB-projektet och tillhör samma geografiska område (Abbiategrasso och omgivning). Alla givare genomgår samma utvärderingsprotokoll.

Författarna föreslår en metod för att spåra enskilda banor för normalt åldrande och den möjliga utvecklingen till NCDs, och att exakt hantera, bearbeta och karakterisera hjärnor som förvärvats från sådana givare följt longitudinellt. Vårt mål är dessutom att möta och engagera individer i periodiska neurologiska bedömningar, seminarier och pedagogiska aktiviteter gällande hjärnans välbefinnande och att öka deras medvetenhet om hjärndonation för forskningsändamål.

Protocol

I linje med vår institutions humanforskningsetiska kommitté och BNE:s uppförandekod utför ABB sin verksamhet efter etiska standarder39,40. Förfarandet för hjärnskörd lämnades in till och godkändes av etikkommittén vid universitetet i Pavia i samband med InveCe.Ab-studien36. Studieförfarandena var i enlighet med de principer som beskrivs i Helsingforsdeklarationen från 1964 och följande ändringar. Samtyckesformuläret är fullständigt och lättbegripligt. Att gå med i donationsprogrammet är ett personligt beslut, och det behövs fullständig medvetenhet. Om en person inte anses behörig att underteckna samtyckesformuläret är tillstånd från vårdnadshavare eller anhöriga (NOK) motiverat. I tabell 2 redovisas inkluderings- och uteslutningskriterier för donation av hjärnan. Forskningen utfördes under överinseende av Federazione Alzheimer Italia.

1. Rekrytering till hjärnan donation programmet

  1. Sammankalla de ämnen som hade uttryckt intresse för hjärnan donation och deras NOK och / eller förmyndare att presentera projektet (omfattningen av donation programmet, processen för avlägsnande av hjärnan, bevarande, användning och distribution), rätten att dra sig ur programmet vid varje given tidpunkt, skydd av anonymitet, och uppföljningsstrategier. Diskutera möjligheten till ytterligare biomarkör undersökningar och genetiska tester. Notera den potentiella givarens eller hans NOK:s önskemål om att få information om resultaten.
  2. Förklara alla ekonomiska aspekter inklusive bristen på ekonomisk vinning för både Stiftelsen och givaren (hjärnor doneras och distribueras altruistiskt). Informera dem om att ABB täcker kostnaden för kroppstransport, medan familjen täcker de av begravningen, begravning eller kremering.
  3. Vid godkännande, erhålla underskrift av samtycket att delta i donation programmet. Ge donatorn en individuell numerisk kod för att garantera anonymitet. Skriv ner identifikationsnumret för dem som deltar i den longitudinella studien och ge en annan kod för att hjärnbanken lätt ska kunna separera de två undergrupperna av donatorer (deltagare eller icke-deltagare i den longitudinella studien; se tabell 3).
  4. Ge givaren ett id-kort som förklarar sin status som donator och visar telefonnumret (tillgängligt 24/7) för att meddela Brain Bank om hans död.

2. Utvärdering av givare och följena uppföljningar

OBS: Det är möjligt att ge samtycke endast för vissa, och inte alla, av nedanstående undersökningar. Alla kliniska bedömningar utförs av samma team inklusive en neurolog, en geriatrier med expertis inom neurologi och 3 psykologer. Om nya symptom utvecklas eller den kognitiva försämringen fortskrider kan tidsintervallet mellan uppföljningarna förkortas.

  1. Som i fallet med InveCe.Ab-studien, få en livsstil-social frågeformulär, inklusive grad av autonomi (ADL, IADL), personliga vanor, sociala och livsstilsfaktorer som kan påverka mentala funktioner. Samla familj, medicinsk och neurologisk historia med information angående genetiska, infektiös, toxisk, metabola, autoimmuna, kardiovaskulära, traumatiska, degenerativa, neoplastiska, och neurologiska sjukdomar. Samla tidigare kliniska tentor och lista farmakologiska behandlingar.
  2. Genomföra en omfattande neuro-motor utvärdering inklusive testning för kraniala nerver funktion, fundus oculi, synfält, muskelstyrka och ton, sensibilities, senoflexer, exteroceptive och primitiva reflexer, meningeal tecken, hållning, gång, rörelser, samordning, sphincteric funktioner, och någon närvaro av fokal eller Babinski tecken. Utvärdera språk, mental status och eventuell förändring i beteende.
  3. Genomföra en omfattande neuro-kognitiv utvärdering inklusive global kognition och en komplett neuropsykologisk bedömning av specifika kognitiva domäner: verbalt och visuellt minne, uppmärksamhet, psykomotorisk hastighet, språk, semantiskt minne, verkställande funktioner, och visuospatial förmågor (Tabell 4 för detaljer). Tänk på förekomsten av depression (CES-D skala).
  4. Få blodprov som används för både blodkemianalys (tabell 5) och isolering och förvaring av DNA, plasma och perifera blod mononukleära celler (PBMC). Bestäm APOE genotypning (rs429358 och rs7412) (en mer omfattande genetisk profilering har bestämts i InveCe.Ab deltagare; se tabell 6). Registrera ett EKG (hjärt förändringar, förmaksflimmer) och ett vilotillstånd Elektroencefalogram för kvantitativ analys (QEEG).
  5. Överväg valfri biomarkör testning inklusive ryggmärgsvätskan (CSF) TAU, fosfo-TAU och β-amyloid, och hjärnavbildning (MRT att upptäcka in vivo degeneration, ischemi eller inflammation; FDG-PET för att upptäcka metaboliska fel; PIB-PET för att upptäcka hjärnan amyloidos relaterade till Alzheimers patofysiologi).
  6. Planera hjärngivarens efterföljande check-up program. Ställ in tidsintervallen enligt olika åldersgrupper (upp till 64 år: var 10:e år, 65–74 år: vart tredje år, från 75 år och framåt: vart 2:e år).
  7. Tilldela en klinisk diagnos och/eller en neurokognitiv diagnos enligt DSM-V. Klassificera klinisk demens iscensättning med klinisk demens Rating (CDR) poäng. Uppdatera CDR i den sista perioden före dödsfallet.
  8. Förbered en databas grafiskt liknar papperet en. Infoga alla insamlade data i Brain Bank-databasen. Planera en revidering av en annan kontorist för att kontrollera om eventuella misstag.

3. Tidpunkt för död och hjärnborttagning

OBS: Den italienska lagen fastställer att asystoli måste pågå längre än 20 min för att bekräfta döden. Registreringen av ett platt elektrokardiogram (EKG) i minst 20 min (benämnd thanatografi) möjliggör en obduktion som skall utföras inom 24 h av död (DPR 285/90 art. 8 och lag n. 578 dec 29, 1993). En postmortem tid av <24 h är ett bra mål för att bevara den totala vävnaden kvalitet. Vid en postmortemtid >30 h avbryts obduktionen (se tabell 2). Obduktionsteamet består av en patolog, en neurolog och/eller en neurobiolog, en sjuksköterska, en anatomisk rumstekniker och eventuella praktikantstudenter; de två första gruppmedlemmarna utför också den neuropatologiska diagnosen. Under kadaverhantering och dissektion är användning av lämpliga kläder (kappa, handskar, glasögon och hårnät) obligatorisk. I det här avsnittet beskriver vi de huvudverktyg och utrustningar som normalt används i vårt laboratorium. Läsarna kan välja de instrument som ska användas efter eget gottfinnande. För en detaljerad beskrivning av materialen häri utnyttjad, se Table of Materials.

  1. Se till att begravningsbyrån som valts av familjen för kroppen till ABB anläggningarna. Utför den änatografi under vilken hjärtaktiviteten måste vara frånvarande. Om så är, underteckna en dödsattest och påbörja obduktionsförfarandena.
  2. Transportera kadavern till obduktionsrummet. Mät skallens omkrets på nivån för den bredaste delen av huvudet. Mät från nasion till inion för att erhålla den anteroposterior diametern (APD), medan avståndet från ena örat till det andra ger tvärgående diameter (TD). Beräkna cephalic index (CI) med formeln: CI = TD/APD x 100.
  3. Med hjälp av en skarp skalpell, gör en hårbotten snitt på koronaplanet, från spetsen av mastoid processen på ena sidan till den andra, passerar över vertex. Klipp genom hår, hud och subkutan vävnad och separera de två veck i hårbotten försiktigt från undersidan skallen. Utför snittet tills det gula supraorbitalfettet blir synligt och reflekterar hårbotten anteriorly. Dra den andra delen posteriort.
  4. Använda skalpell och tuppar, ta ett litet prov av temporalmuskeln vid varje sida, sätta en i 4% formaldehyd och frysa den andra (se avsnitt 7).
  5. Skär skallen med hjälp av en elektrisk såg efter en V-cut på frontalsidan. Ta bort kalotten och skär hjärnhinnorna. Provstycken av dura är båda fixerade i 4 % formaldehyd och frysta (se avsnitt 7).
  6. Få ca 10 mL CSF genom att sätta in en 20 G 3.5 in. nål genom corpus callosum för att nå den tredje ventrikeln. Bedöma utseende, färg och grumlighet csf och mäta pH. Gör sedan 10 alikvoter på ca 1 mL vardera och förvara dem vid -80 °C.
  7. Lyft upp hjärnan försiktigt dra på både frontallober och skär både synnerver infundibulum, den inre halspulsådern (ICA) och den tredje, fjärde, femte och sjätte kranialnerver. Skär tentorium för att nå den bakre fossa och skär vertebrala artärer och lägre kranialnerverna. Sätt in skalpell så djupt som möjligt genom foramen magnum, att skära den mest caudal delen av medulla. Vid denna punkt, ta bort hela hjärnan försiktigt.
  8. Med skalpellen, genomborra benet över Meckels grotta och få den gasseriska ganglion från båda sidor. Fixa en ganglion i 4% formaldehyd och frysa den andra (se avsnitt 7). Fracture den beniga sella turcica med hjälp av en kirurgisk klubba och mejsel för att ta bort hypofysen och sedan fixa det i 4% formaldehyd.
  9. Inspektera skallen och hela hjärnan för makroskopiska förändringar och vaskulära förändringar. Med en måttband, mäta hjärnan erhålla tvär- och anteroposterior diametrar. Hämta med omsorg cirkeln av Willis och bedöma det makroskopiskt (Figur 2E) för förekomst av anatomiska varianter, skador eller fartyg stenos.
  10. Ta 1–2 bitar leptomeninges av 2–4 cm2 från konvexiteten och bevara dem i komplett hög glukos Dulbecco modifierade Eagle media (DMEM) odlingsmedium vid 4 °C som innehåller 20% fetalt bovin serum (FBS), 1% penna/strep, 1% glutamin och 1% icke-essentiella aminosyror (som tidigare publicerats, med vissa ändringar)41.
    1. För att erhålla fibroblasterkulturer, placera leptomeninges på en 10 cm Petriskål och tvätta två gånger med fosfat buffer koksaltlösning (PBS), varje gång kassera vätskan.
    2. Skär med hjälp av en skalpell och en pipettspets leptomeninges i små bitar på ca 2 eller 3 mm, frö 3–4 stycken i varje brunn av en 6-brunnsplatta som tidigare var belagd med gelatin vid 0,5 % och fyll varje brunn med 2 mL komplett medium kompletterat med 1 % amphotericin B (genomför bearbetningen i ett biosäkerhetsskåp för att garantera kulturens sterilitet).
    3. Placera plattan i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i minst en vecka och ändra tillbringade medium varje 3–4 dagar. Trypsinize celler med steril 1x trypsin när brunnen är på ca 70% av sammanflödet. Placera leptomeningeal fibroblaster i en T75 kolv och fyll den med 12 mL av komplett medium. Efter 5 dagar trypsinize och bevara dem i 900 μL av FBS och 100 μL av dimetylsulfoxid (DMSO).
  11. Separera och inspektera storhjärna, lillhjärnan och hjärnstammen och vikt dem individuellt. Ta av tallkottkörteln och fixa det i 4% formaldehyd. Ta bort luktglödlampor och synnerverna, och fixera eller frysa en av varje par, oberoende av sidan. Håll storhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen i is vid 4 °C i minst 2–4 h tills de är redo för dissekering för att minimera vävnadsavbrott och minska mjukheten i vävnad.
  12. Efter skörden, var uppmärksam och omsorg till kadaver. Sätt tillbaka benet med hjälp av ett superlimlim och sy tillbaka hårbotten med hjälp av en kirurgisk nål och icke-resorberbara suturer.
  13. Visa respekt och tacksamhet till den avlidne genom att behandla kadaver försiktigt. Rengör och raka ansiktet, och tvätta och torka håret, eftersom kadaver kommer att läggas i en öppen kista synlig för nära och kära.
    OBS: Omkomläggning av kadaver görs av en tekniker. Protokollet kan pausas här.

4. ABB-protokoll för dissekering

OBS: Samma patolog och / eller neurolog skiva hjärnstammen, lillhjärnan och cerebrum under en rök huva. En neurobiolog arrangerar skivorna efter snittning. En praktikant som inte hanterar hjärnsektioner dokumenterar hela proceduren med bilder som ska laddas upp till databasen för att fungera som vägledning under de efterföljande vävnadsbearbetningsfaserna.

  1. Med hjälp av en dissekerande kniv, skär hjärnstammen axiellt och gör det första snittet i nivå med rostralt mellanhjärna, genom den överlägsna colliculus, för att få två skivor utsätta substantia nigra (SN).
  2. Gör resten av nedskärningarna att förvärva 8 mm hjärnstammen skivor för att få ca 10 sektioner. Var noga med att inkludera skärsår som passerar genom rostral pons nära de överlägsna marginalerna i den fjärde ventrikeln att observera locus coeruleus (LC) och genom medulla avlånga sämre än den akustiska striae strax ovanför sämre spetsen av den fjärde ventrikeln att ha skivor inklusive dorsala motorkärnan av vagus (DMNV).
  3. Namnge alla skivor i en rostrocaudal mening som BS (hjärnstammen) följt av arabiska siffror för att identifiera avsnitten. Efter den sista hjärnstammen avsnitt, använd beteckningen SC (ryggmärg) följt av nummer 1–n. Ca 2–4 SC-skivor erhålls beroende på antalet spinalmetamerer som tagits bort (Figur 2H–I).
  4. Märk alla avsnitt som ska fixeras eller att frysas växelvis och ta en bild för fotoarkivet (Bild 2). Sedan, fixa och frysa alla skivor enligt beskrivningen nedan (steg 4.7 och 4.8).
  5. Skär lillhjärnan på sagittal planet för att separera de två cerebellära halvkloten i nivå med vermis. Utför sagittal snittning för att få 5 skivor från varje halvklot (Bild 2F–G).
  6. Namnge alla skivor från vermis som CBR eller CBL (för höger respektive vänster lillhjärna) och använd arabiska nummer för att identifiera avsnitten. Märk alla sektioner som ska fixeras eller frysas växelvis och ta ett foto till arkivet (Bild 2). Sedan, fixa och frysa alla skivor som beskrivs nedan.
  7. Separera de två halvorna av storhjärnan genom corpus callosum (Figur 2A–B) och skiva dem singularly på koronaplanet. Gör det första snittet i ett plan som passerar mellan den optiska chiasm och mammillary organ, genom frontalloben, temporalpolen, främre cingulate, främre commissure, kärnan av Meynert och basala ganglier.
  8. Utför den andra snittet ca 1 cm posteriort passerar genom mammillary organ och utsätta basala ganglierna, främre thalamus, subthalamus och amygdala. Fortsätt skivning att dissekera de främre och bakre regionerna att förvärva 1 cm skivor för att få 15 till 20 sektioner för varje halvklot.
  9. Ställ in skivorna på en plan yta. Lägg dem efter sin ursprungliga position i anteroposterior riktning, från frontal till occipital polen, med den del kontinuerliga med föregående skiva uppåt.
  10. Genom att jämföra avsnitten från båda halvkloten väljer du alternativa sektioner från varje halvklot som ska behållas som fast eller fryst material. Erkänna de viktigaste sektionerna som skall fastställas och bearbetas för histopatologi inklusive frontal och temporala lober, cingulate, basala ganglier, nucleus basalis av Meynert, amygdala, thalamus, hippocampus och entorhinal cortex, occipito-temporala, parietal och occipital lobes.
  11. Namnge alla skivor i anteroposterior mening som L (vänster) eller R (höger) följt av arabiska tal och sätta en etikett som anger om segmentet ska fixeras eller frysas (Bild 2A–D). Om du vill identifiera avsnitten tar du en bild för fotoarkivet. Sedan, fixa och frysa alla skivor enligt beskrivningen i avsnitt 7 och 8.

5. Besiktning av hjärna och kärl och makroskopisk patologisk bedömning (med blotta ögat)

  1. Genomföra en allmän makroskopisk undersökning med tanke på meningeal förändringar, diffusa eller lokaliserade när atrofi, hippocampus atrofi, ventrikulär utvidgning, cerebellar atrofi, hjärnstammen atrofi, substantia nigra pallor, vit fråga ändringar (ange typ och plats).
  2. Undersök cirkeln av Willis överväger åderförkalkning och ocklusion. Tilldela poäng = 1 i närvaro av aterom utan stenos på mer än 50%, poäng = 2 om minst en artär är 50% eller mer ockluderas, poäng = 3 om två eller flera artärer är 50% eller mer ockluderas42. Utvärdera närvaron eller frånvaron av patologi i andra intrakraniella kärl.
  3. För att upptäcka parenkymala kärlskador, undersöka hjärnhalvor, lillhjärnan och hjärnstammen. Tänk på lacunar lesioner (diameter < 10 mm), ischemisk eller hemorragisk infarcts och blödning (diameter > 10 mm). Om den finns, ange storlek i millimeter, antal och plats. Också överväga närvaro eller frånvaro av subarachnoid blödning.

6. Kvalitetskontroll av vävnad

OBS: Agonal factor score (AFS) varierar mellan 0 och 2 och är viktigt vid utvärderingen av vävnadskvaliteten. För att bestämma AFS, överväga kliniska tillstånd som inträffar runt tidpunkten för dödsfallet (särskilt villkor som bestämmer hjärnans acidos) och varaktigheten av agonaltillstånd (plötslig död eller långvarig vånda). Om AFS > 1, kanske hjärnvävnaden inte är av optimal kvalitet43. Också överväga hjärnan och CSF pH; om pH < 6, kanske hjärnvävnaden inte är av optimal kvalitet43,44.

  1. Verifiera om dödsfall har orsakats av tillstånd som kan skada hjärnvävnaden inklusive hypoxi, utdragen acidos, mekanisk ventilation, multi-organsvikt, hög feber, svår kranialtrauma, intag av neurotoxiska ämnen, allvarlig uttorkning, svår hypoglykemi, epileptisk tillstånd och långvarig koma. Om ett av dessa villkor är närvarande, tilldela 1 punkt.
  2. Verifiera varaktigheten av agonaltillstånd (snabb om döden inträffar inom 1 h, mellanliggande om döden inträffar mellan 1 och 24 h, långsam om den agonal tillstånd varar mer än 1 dag). Om en mellanliggande eller en långsam död händer, tilldela 1 punkt.
  3. Beräkna AFS poäng, och mäta CSF pH genom en elektrod pH nål och vävnad pH genom en yta pH-mätare på en hjärna skiva från varje lob och på en cerebellär avsnitt.

7. Frysning av vävnad

  1. Håll alla vävnader som ska frysas i is vid 4 °C. Sedan frysa dem snabbt. Placera dem på en prefrozen aluminium bricka. Täck med en förregling aluminiumplatta för att hålla dem platta. Lägg dem i flytande kväve vid -120 °C i 3 min.
  2. Placera skivorna inuti en plastpåse märkt med deras motsvarande identifieringskod och segmentnummer. Dela plastpåsarna i tre kryogena lådor (för höger hjärnhalva, vänster hjärnhalva och hjärnstammen) och förvara vid -80 °C.

8. Fixering av vävnad

  1. Linda skivorna i gasväv en efter en, och lägg skivorna i 10% fosfatbuffertad formalinlösning. Efter 1 dag, ersätta formalinlösningen med en fräsch lösning. Lämna dem i ca 5 dagar i ett kylrum vid 4 °C.
  2. Håll alla skivor som helhet och dela endast skivorna innehållande hippocampus och amygdala i två delar (Figur 3). Den övre delen av båda skivorna kommer att innehålla frontalloben (R10a–L9a i figur 3); de nedre delarna kommer att innehålla respektive: (1) amygdala, temporallob och basala ganglier (L9b i figur 3B), och (2) hippocampus och en del av temporalloben (R10b i figur 3A). Detta görs för att upprätthålla förhållandet mellan de olika strukturerna.
  3. Sätt alla sektioner i fosfatbuffert i minst 2 dagar för att tvätta ur och ta bort korslänkande produkter.
    OBS: Protokollet kan pausas här.

9. Uttorkning, röjning, paraffininbäddning och glidberedning

  1. Förbered ökande koncentrationer av etylalkohol från 70% till 100%, xylen och två uppsättningar av smält paraffinvax. Placera hjärnan sektioner i den automatiska processorn för uttorkning, clearing förfarande och paraffin infiltration (använd två olika vävnad bearbetning protokoll för makro (cerebrum och lillhjärnan skivor) och mikroprover (hjärnstammen skivor och de andra små prover); Tabell 7). Bädda in vävnaden i paraffinvax på en metall eller plastmögel.
  2. Markera de avsnitt som ska skäras upp för utvärdering av alla de regioner av intresse som tillämpar Montines index för neuropatologiskkarakterisering 45 (tabell 8). Sedan segmentera de markerade avsnitten.
  3. Använd en släde mikrotom för makrosektioner och en roterande mikrotom för små sektioner. Skär 5 μm skivor för Haematoxylin och Eosin (H&E) färgning och 8 μm skivor för de andra färgningar och immunohistokemi. Lägg skivorna på tre olika slags histologiska diabilder: 8,5 cm x 11 cm för största skivor, 5 cm x 7,5 cm för mellansegment och den klassiska 2,5 cm x 7,5 cm för minsta.
    OBS: Protokollet kan pausas här.

10. Avparaffinisering, histologisk färgning och immunohistokemi (IHC)

  1. Utför avparaminisering för att möjliggöra reaktion med vattenhaltiga färgningslösningar. Utför det med hjälp av xylen och minskande alkoholkoncentration (5 min för varje steg). Rehydrera i 5 min med destillerat vatten.
  2. Använd följande histologiska färgningar för att utvärdera arkitektoniska och strukturella vävnadsavvikelser, och cellulär morfologi: H&E (för vaskulära mikroskopiska lesioner och inflammation), Cresyl Violet (NISSL; för neuronal förlust), Luxol Fast Blue (LFB; för demyelination), Gallyas (för neuritiska plack och neuropiltrådar).
  3. Använd immunohistokemi (IHC) i syfte att belysa förekomsten av specifika målstrukturer. Anti-NeuN och anti-GFAP används för att identifiera neuronala och stödjeceller fack; 4G8, AT8, α-SYN och TDP-43 används för att identifiera proteiner som aggregerar vid neurodegenerativa sjukdomar (Table of Materials).
    1. Förtredade dewaxed sektioner med 3% H2O2 i 10 min skölj sedan i PBS. Utför hämtningsbehandling med citratbuffert 0,01 M pH 6 (mikrad seriellt i 2, 1 och 2 min) för 4G8, α-SYN, TDP-43 och NeuN-antigener; använda 70% myrsyra för 4G8 och α-SYN. Preincubate i 30 min i 5% normal get serum.
    2. Inkubera över natten vid 4 °C med den primära antikroppen. På dagen efter, skölj sektionerna i PBS före inkubation med den sekundära antikroppen (Envision+ System-HRP märkt Polymer) vid en spädning av 1:2 i PBS i 1 h vid rumstemperatur.
    3. Tvätta flera gånger i PBS och inkubera i kromogensystem med diaminobenzidin (Liquid DAB+Substrat Chromogen System) som tittar på reaktionsutveckling under mikroskopet (förstoring 4–10x). Slutligen tvätta sektionerna i PBS. Counterstain sektionerna i haematoxylin, dehydrate och coverslip med DPX montering.
      OBS: Tabell 8 sammanfattar standardprotokollet. Utför H&E-färgning på alla sektioner, medan speciella/specifika fläckar och reaktioner används på utvalda sektioner. Utvalda fall kräver ytterligare områden eller reaktioner. Tabell över material visar detaljerna för antikroppar som används för IHC.

11. Grundläggande neuropatologisk karakterisering

OBS: Ospecifika hjärnvävnadsförändningar, vaskulär patologi, Alzheimers sjukdom (AD) patologi, icke-AD TAUopatier, synukleinopatier, TAR DNA-bindande Protein (TDP-43) patologi och hippocampus skador studeras. Ett optiskt mikroskop ansluten till en kamera används för att upptäcka parenkymala mikroskopiska skador. Den histologiska bedömningen utförs av samma team av utbildad personal i neuropatologi, inklusive en professor i neurologi, en neurolog och en patolog. Den bygger på en modifierad Montines tillvägagångssätt45 (tabell 8) även inklusive: (1) Heterogena icke-AD TAUopatier som utgör det patologiska kännetecknet för fronto-temporala louda degeneration (FTLD) i samband med TAU insättningar: Picks sjukdom, icke-flytande Primär Progressiv Afasi (TAU-nfPPA), Progressiv Supranukleär Pares (PSP)46,47 och Cortico-Basal Degeneration (CBD)48. Dessutom omfattar icke-AD TAUopatier villkor relaterade till åldrande och utan bestämd klinisk betydelse såsom Primär Åldersrelaterad TAUopati (PART)49, Åldersrelaterad TAU Astro-Gliopathy (ARTAG)50, argyrofil sädessjukdom48. (2) Lewy Typ Synucleinopati (LTS) som är relaterade till Parkinsons sjukdom (PD) och Lewy organ Demens (LBD). För att söka efter LTS, tillämpa följande hierarkiska steg: först, luktbulb, hjärnstammen, amygdala/temporal cortex; om de tidigare områdena är positiva, lägg till limbiska strukturer (hippocampusbildning, entorhinal cortex, främre cingulate), mellersta frontal gyrus, sämre parietal lobule och occipital cortex45. Om kliniska funktioner av när LBD är närvarande (dvs., fluktuationer och/eller hallucinationer), överväga limbiska strukturer och isocortex för det första steget. (3) TDP-43 insättningar, den patologiska kännetecken för FTLD relaterade till TDP-43 insättningar: beteendemässiga variant av Fronto-Temporal Demens (bvFTD), semantisk demens (SD eller svFTD), TDP-nfPPA och FTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). IHC för TDP-43 utförs på följande sektioner: amygdala, hippocampus, entorhinal cortex och mellersta frontal gyrus; i fall med misstänkt klinisk FTLD, överväga att undersöka andra avsnitt51.

  1. Utvärdera ospecifika hjärnvävnadsförändningar i utvalda avsnitt med hjälp av H&E, NISSL, LFB, och IHC för GFAP och NeuN. Överväga neuronal rarefaction, ballooned nervceller, spongiosis, gliosis, myelin förlust, närvaro eller frånvaro av inflammatoriska eller tumoral infiltrates. Ange den förhärskande platsen för dessa ändringar.
  2. För att upptäcka mikroskopiska kärlskador, undersök H&E- och LFB-diabilder inklusive minst två halvklotformade makrosektioner (de första som passerar genom mammillarykropparna (Charcot cut) med frontal- och temporallob, basala ganglierna, främre talamus, amygdala och den andra som passerar genom den occipitala loben), avsnittet "geniculate" i hippocampusbildningen, en cerebellärsektion och alla tre huvudavsnitten i hjärnstammen (genom substantia nigra, locus coeruleus och DMNV).
    1. Upptäcka små fartyg sjukdom inklusive arterioloskleros, lipohyalinosis, perivaskulära utrymmet dilatation, vit fråga förlust, leptomeningeal och/eller parenchymal och/eller kapillär cerebral amyloid angiopati. Ange betygsgrad (0–3) och förhärskandeplats 42,52. Överväga närvaro eller frånvaro av hemosiderin läckage, mikroblekter och mikroinfarcts.
    2. Utvärdera bidraget från vaskulär skada på kognitiv svikt med hjälp av hierarkiska Deramecourts schema (kärlväggsförändningar–liten kärlsjukdom–makroskopisk infarcts). För denna utvärdering överväga en frontal och temporala LOB avsnitt, basala ganglierna och hippocampus (poäng 0–20)30. Också, uppskatta sannolikheten för att cerebral kärlsjukdom bidragit till den kognitiva svikten med hjälp av VCING poäng (låg-mellanliggande-hög), som erhållits genom att överväga halvklotformade makroskopiska infarcts och små fartyg sjukdom i den occipital LOB inklusive måttlig till svår arterioloskleros och amyloida angiopati53.
  3. Utvärdera AD patologi med hjälp av IHC (4G8) för amyloid spridning. Definiera Thals stadier (1–5)54, aggregera Amyloid scoring (0–3)45, och morfologi per plats (diffus, fokal, kärnhus).
    1. Utvärdera AD Tau patologi med hjälp av IHC (AT8) och beskriva den förhärskande morfologi per plats (neurofibrillary trassel, neuropil trådar, neuritic plack). Definiera Braaks stadium (I–VI +; positivt tecken indikerar förekomst av ytterligare områden med hyperfosforylerad Tau-patologi som inte följer Braakshierarki) 55 och sammanlagda poängsättning (0–3)45.
    2. Utvärdera neuritiska plack med gallyasfärgning och CERAD-poäng (0–3)56. Definiera sedan sannolikheten för de neuropatologiska funktionerna som motsvarar ett AD-kliniskt syndrom med hjälp av Amyloid-Braak-C ERAD-poäng (ABC-poäng 0–3): ingen-låg-mellanliggande-hög45.
  4. Använd AT8 IHC att märka förekomsten eller frånvaron av icke-AD TAU patologi ange förhärskande plats och egendomliga morphologic bild. Överväg neuronala inneslutningar såsom flamformade eller globose trassel, sfärisk-klotformiga inneslutningar (dvs., Picks kroppar)57, neuropil trådar, dystrofa neuriter, argyrofila korn; och gliainräknanden som tuftade astrocyter, taggiga astrocyter, astrocytiska plack, lindade kroppar, klotformiga inneslutningar58,59.
  5. Använd α-syn IHC för att upptäcka LTS (Lewykroppar, bleka kroppar och Lewy-neuriter) på områdena i noten ovan. Vid positivitet, tillämpa McKeiths gradering (0–4) för att utvärdera hur allvarliga skadornaär 60; sedan, använd Beach's etapper (I–IV) för topografiska fördelning (luktbulb, hjärnstammen dominerande, limbiska dominerande, neokortikala)61. Jämför Beachs och Braaks stadier för att definiera förhållandet mellan LBD och AD patologi60,61,62.
  6. Tänk på förekomsten eller frånvaron av Glial Cytoplasmatiska inneslutningar (GCI; icke Lewy-typ gliaceller synukleinopati) som är patologiska kännetecknet för Multiple System Atrofi (MSA) och ange deras förhärskande plats63.
  7. Använd TDP-43 IHC för att upptäcka TDP-43-fyndigheter på områdena i noten ovan. Identifiera den förhärskande morfologin per plats: Neuronal Cytoplasmiska inneslutningar (NCIs), Distrofa Neurites-inneslutningar (DNs), Kärnintrodelse (NIIs). Definiera mönstret: A (dominerande NCIs och DN: bvFTD och nfPPA); B (dominerande nationella behöriga nd: FTD-MND); C (dominerande långa DNs: svPPA och bvFTD)51,64. Använd Nelsons schema för att definiera förekomsten av TDP-43 i AD-fall65,66.
  8. Utvärdera hippocampus-starten från subiculum och Sommer sektor (CA1). Använd Rauramaas poäng (0–4): 1–2 för mikroinfarcts respektive makroinfarct; 3–4 som motsvarar måttlig respektive svår neuronal förlust, respektive, och hippocampusatrofi (hippocampus skleros: HS). Peka ut förekomsten eller frånvaron av patologiska proteinavlagringar (i minskande storleksordning för frekvens: pTAU, TDP-43, α-syn)67.
  9. Definiera den neuropatologiska diagnosen och ange alla patologiska data i databasen.
    OBS: De rum där givarnas biologiska material och förnuftiga data lagras är alltid låsta och endast den auktoriserade personalen får komma in, för att garantera både säkerhet och integritet. Det frysta biologiska materialet förvaras i låsta frysar vid -80 °C, medan formalin-fasta paraffinininbäddade vävnader förvaras i låsta garderober vid rumstemperatur. Dubbla motorfrysar används och en back-up frys finns också. För att säkerställa att frysarna alltid fungerar är de dessutom försedda med ett övervakningssystem som 24/7 övervakar som sätter igång ett larm. En nödgenerator är också närvarande, i händelse av strömavbrott. Deltagarna anonymiseras med en numerisk kod för att säkerställa deras privatliv; det är inte möjligt för icke-auktoriserad personal att gå tillbaka till givarnas identitet och deras förnuftiga uppgifter. All information samlas in i en lösenordsskyddad databas; jämväl sparas en papperskopia av dessa data i låst arkiv.

Representative Results

Hjärndonatorer och hjärnskörddata
Under 2014 inleddes rekryteringen av givare under den andra uppföljningen av InveCe.Ab, som omfattade 1010 av 1061 berättigade ämnen (svarsfrekvens: 93 %; Bild 1). Med relation till InveCe.Ab longitudinella studien, 290 av 1010 deltagare (28,7%) gick med på att registrera sig som givare (160 redan registrerade och 130 som uttryckte sin avsikt att registrera sig). Utbildningsnivån är högre hos donatorer än hos icke-donatorer (66 % av våra givare har en medelhög utbildningsnivå: 8 eller fler år i skolan), vilket anger kulturens och utbildningens betydelse. Många "friska" individer visade också intresse för hjärnan donation programmet. De flesta av våra "kontroller" bekänna att de kan sympatisera med den sjuka och deras släktingar, och vill bidra på något sätt till forskning som leder till en bättre förståelse av neurologiska sjukdomar. Osjälviska människor som regelbundet ägnar sig åt blod eller märg donation program under livet är mer öppna för idén om hjärnan donation, liksom människor som redan har gått med på att donera organ efter döden. De är medvetna om det faktum att även om det inte skulle finnas en levande mottagare, skulle deras donation vara av stor betydelse för forskningen. En annan faktor som bidrar till hjärnan donation är föredrar att kremeras. För närvarande omfattar ABB-donatorpopulationen totalt 427 individer (290 InveCe.Ab-deltagare + 137 frivilliga eller patienter från ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital), varav 75% är 70 år eller äldre. Det finns en tydlig dominans av honor (64%) och mentalt intakta äldre (ca 85%). Hittills har 27 hjärnor skördats av 40 avlidna givare (67% obduktionsfrekvens); 13 försökspersoner har av olika skäl inte blivit autopsedliga inklusive underlåtenhet att rapportera dödsfall till ABB, svåra skador som leder till hjärnförstörelse, farliga infektionssjukdomar och 1 CJS-fall; 4 ämnen har återkallat sitt samtycke. Fram till nu fick 24 av de 27 skördade hjärnorna en komplett neuropatologisk karakterisering med en bestämd clinico-patologisk diagnos, medan de återstående 3 hjärnorna fortfarande är under undersökning (Tabell 3). Ytterligare hjärnskörddata från ABB inkluderar: medelålder vid dödsfall (81 år); genomsnittligt postmortemintervall (10,37 h), medel CSF pH (6,64); genomsnittligt vävnads pH (6,07), genomsnittliga hjärnans vikt (1012.86 gr); AFS var 1 av 90% av avlidna försökspersoner.

Neurofysiologiska biomarkörer (QEEG)
QEEG är en del av det flerdimensionella tillvägagångssättet. Det är en enkel, icke-invasiv och billig metod, med en trolig potential att upptäcka konvertering från mild Neuro-Cognitive Disorder (mild-NCD eller MCI) till större Neuro-Cognitive Disorder (major-NCD eller demens). Allt genom vår flerdimensionella tillvägagångssätt utförs en vanlig QEEG-undersökning och dess möjliga roll som biomarkör för demens testas. Våra uppgifter om en preliminär serie av 36 hjärnan givare (18 normala äldre (NOLD), 11 mild-NCD och 7 major-NCD; 9 av vilka med en bestämd neuropatologisk diagnos) visar att medelvärdet alfa rytm procent var betydligt lägre i större-NCD jämfört med mild-NCD (p: 0,002) och NOLD (p: 0,033). Omvänt var långsammare EEG-frekvenser (theta/delta) betydligt högre i major-NCD än i NOLD/mild-NCD (se exempelfallen i figur 4). I vår serie, EEG rytm distribution kan differentiera NOLD/mild-NCD ämnen från större-NDC patienter oavsett etiologiska diagnosen, vilket tyder på att hjärnan rytmer påverkas av bördan av degenerativa skador oavsett lesion typ. Faktum är att 7 av 9 undersökta hjärnor visar demens på grund av blandade patologier. Specificiteten som angår naturen av patologin verkar för att vara låg, och elektriska rytmer för hjärnan verkar för att påverkas mer av bördan och topografin av skadorna än vid deras molekylära natur (Poloni, et al. förfaranden av AD/PD 2019, Lisbon, data unpublished).

Emblematiska fall
ABB-protokollet kan vara användbart och nödvändigt i vissa fall och villkor. Ett exempel är förekomsten av en asymmetrisk patologi (Figur 5). Vårt protokoll är mycket lämplig för identifiering och korrekt karakterisering av denna typ av patologi. Hittills har vi undersökt 4 hjärnor med asymmetrisk inblandning, varav några visas i figur 5. Makroskopiskt, höger sida atrofi (Figur 5A) förekommer i ett fall med svår ventrikulär dilatation i den högra koronasektionen ( Figur5C) jämfört med vänster sida ( Bild5B). Ett annat fall visar infarct av den högra hjärnhalvan (Bild 5D) och en annan visar en tydlig atrofi av rätt mammillary kroppen (Figur 5E). På mikroskopisk nivå, ett fall av FTLD visar en asymmetrisk TDP-43 positivitet som är mer intensiv i höger frontalsida jämfört med vänster (Figur 5F,G).

Makrosektioner ( bild6A,C) används för att få en helhetsvy. LFB färgning hjälper till att identifiera myelin förlust (Figur 6D) och IHC för både 4G8 och AT8 (Figur 6B) gör det möjligt att utvärdera fördelningen av immunoreactivity i halvkloten med blotta ögat. I ABB-serien, hjärnor av närstående individer finns att jämföras.

I figur 7placeras mikroskopiska bilder av sektioner från hjärnorna hos homozygösa tvillingar sida vid sida för enklare jämförelse (twin 1 (BB137): Figur 7A,C,E,G,I,K mot tvilling 2 (BB138: Bild 7B,D,F,H,J,L). Som i en liknande tidigare studie68jämfördes båda tvillingarna av kliniska och neuropatologiska bedömningar. Tvillingarna rapporterade samma diagnos av major-NCD på grund av att flera etiologies, men de dog två år ifrån varandra, vid ålder 83 (demens-debuten vid 72 år) och 85 (demens-debuten vid 76 år), respektive. Deras hjärnor har en mycket liknande neuropatologiska bild, med hög AD patologi i samband med amyloid angiopati. 4G8 immunoreactivity är diffust i hela cortex (Figur 7A,B) och basala ganglierna (Figur 7C,D) med diffusa, täta, och kärnade plack. Det är också tydligt detekteras i både parenkymala och leptomeningeal kärl i cortex och lillhjärnan (Figur 7A,B,G–J). Vid högre förstoring är capCAA tydligt uppenbart (Figur 7G,H). AT8 immunpositiva plack, trassel och trådar är diffusa i de parietala cortices av båda hjärnorna (Figur 7E,F,L). Angående amyloid och NFT patologi börda, twin 1 anses vara en Thal etapp 3 (montine A2) och en Braak steg 5 (montine B3), medan twin 2 anses vara en Thal etapp 5 (montine A3) och en Braak steg 6 (montine B3). De hade samma år av utbildning och liknande livsstil; dock en (BB137) var gift och blev änka strax efter medan den andra var singel (BB138). De visade olika grader av clinico-patologiskt variabilitet med samma början och samma sjukdomsföring men i olika tidsramar. Detta bekräftar det faktum att, även om den genetiska komponenten spelar en nyckelroll i utvecklingen av sjukdomen, den epigenetiska och miljömässiga komponenten är grundläggande för att fastställa något olika manifestationer.

I vissa fall motsvarar den kliniska bilden inte de neuropatologiska funktionerna. I figur 8definierades två olika fall kliniskt som AD-fall; neuropatologiska analyser visar, förutom en mellanliggande AD-patologi, en diffus positivitet för α-syn. I det första fallet visar en svår LTS (Beach IV) bild Lewy kroppar homogent finns i hela gyrus cingoli (Figur 8A) och i SN som cytoplasmatiska inneslutningar omgiven av neuromelanin ( Figur8B,C). I det andra fallet är Lewy organ som är associerade med Lewy neurites diffust fördelas i amygdala (Figur 8D,E) och i Meynerts kärna (Figur 8F,G) vilket tyder på en limbic LTS diagnos. Faktum är att topografin av skador snarare än deras molekylära karaktär producerar de kliniska manifestationerna.

Figure 1
Figur 1: Flödesdiagram för Inve.Ce.Ab-studien. Vid baslinjen var den totala prevalensen av demens 3%. Under uppföljningarnas gång var prevalenstalen: 4,4 % (1st)69, 7,1 % (2nd), 10,9 % (3rd). Den åttaåriga incidensen var 15 p/1000/år (95% KI: 13–18 p/1000/år). Rekrytering av donatorer inleddes 2014 (under den andra uppföljningen). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Dissektionsprotokoll av cerebrum (A), lillhjärnan (F) och hjärnstammen (H). Cirkel av Willis och enstaka halvklot visas i (E) och (B). Koronasnitt av höger (C) och vänster sida (D) är numrerade och alternativt fixerade ("F") och frysta ("C"). Sagittal cerebellum sektioner (G) och hjärnstammen axial sektioner (I) visas. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Koronalskivor av fast höger (A) och vänster (B) fronto-temporallob visas.
Hippocampus och temporalloben (A, R10b) delas från frontalloben (A, R10a) på den högra skivan. På den motsatta skivan delas amygdala och basala ganglier (B, L9b) från frontalloben (B, L9a). Skala bar: 1,7 cm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Relativ spektral kraftfördelning i NOLD och större-NCD-ämnen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: Representativa bilder av asymmetriska patologier. (A) Första fallet: hjärnan med rätt atrofi. Koronalskivor (B) och (C) visar högersidig ventrikeldilation särskilt tydligt i avsnitten 10–12 (C, pilar). I avsnitten (B) och (C) står "F" för fast och "C" för fryst (på italienska: congelato). (D) Andra fallet: svår infarct av den högra hjärnhalvan. (E) Tredje fallet: atrofi av rätt mammillary kropp (pil). (F, G) Fjärde fallet: mikroskopiska bilder visar en mer intensiv TDP-43 immunoreactivity i frontakrona högra hjärnbarken (G) jämfört med den vänstra (F) i ett fall av frontotemporal demens. Skala barer: 183 μm (F, G). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: Makroavsnitt. (A, C) Koronaskivor av fast fronto-temporallob (A) och färsk parietallob (C). (B) Histologiska fronto-temporal avsnitt immunolabeled med AT8 antikropp. Immunoreaktivitet är klart fördelat över hela cortex, men mer intensiv i tinningloben. (D) Histologisk parietalsektion färgas med LFB. Pilen anger ett område med demyelination av den vita materian. Skala bar: 1,55 cm (B, D). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: Tvillingar. Jämförelse mellan hjärnor av två homozygous tvillingar: BB137 (A, C, E, G, I, K) och BB138 (B, D, F, H, J, L). De neuropatologiska bilderna är mycket lika. (A) och (B) visa diffus 4G8 positivitet i occipital LOB med amyloid plack, leptomeningeal (pilar) och parenchymala (pilspetsar) fartyg. Kapillär amyloid angiopati (asterisker) är väl igenkänd vid högre förstoringar (G) och (H). 4G8 är diffust fördelat i hela de basala ganglierna (C, D) och runt leptomeningeal fartyg av lillhjärnan (I, J: pilar). AT8 immunoreaktivitet identifiera trassel, trådar och plack (pilar) i parietal cortex (E, F). Gallyas färgning (K) avslöjar neuritiska plack som AT8 antikropp (L) gör. Skala barer: 470 μm (A–F; I–J); 90 μm (G–H; K–L). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Klinisk kontra neuropatologisk diagnos. I denna figur rapporteras två olika fall där den neuropatologiska diagnosen skiljer sig från den kliniska diagnosen. Immunoreaktivitet för α-syn är ett oväntat resultat. (A–C) Första fallet: Gyrus cingoli (A) visar homogen fördelning av Lewy organ i SN (B-pilar). I en neuron av SN, en dubbel Lewy kropp omgiven av neuromelanin visas (C). (D–G) Andra fallet: En diffus positivitet för α-syn är detekterbar i amygdala (D, E) och Meynert kärnan (F, G). Cellulära kroppar och Lewy neuriter (asterisk) är väl markerade. Skala barer: 154 μm (A, D, F); 37 μm (B, E, G); 20 μm (C). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 9
Bild 9: Mall för överföringsavtal. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

N %
Kön Män 607 45.9
Kvinnor 714 54.1
Födelsekohort 1935 236 17.8
1936 219 16.6
1937 264 20.0
1938 305 23.1
1939 297 22.5
Civilstånd Gift 872 66.1
Samboende 13 1.0
Separerade/Frånskilda 29 2.2
Änka 325 24.6
Enda 80 6.1
Yrket i primärt liv Arbetare för blå krage 666 50.6
Vit krage arbetare 459 34.9
Hemmafru 191 14.5
År av utbildning ≤5 år 754 57.2
>5 år 565 42.8

Tabell 1: Sociodemografiska inslag i InveCe.Ab-studiedeltagarna.

INKLUSIONSKRITERIER UTESLUTNINGSKRITERIER
Alla individer som är 18 år och äldre Människor som uppenbart vägrar donation
Människor som bor inom territorium Abbiategrasso Människor som bor utanför regionen Lombardiet
Volontärer som ger sitt samtycke på egen hand Diskrepanser mellan den potentiella givaren och NOKs önskemål om hjärnan donation
Försökspersoner som inte kan bestämma med NOK:s tillstånd Situationer som i hög utsträckning förstör hjärnans konsistens
Död genom en naturlig orsak Kliniskt förloppet av <2 år om inte möjligheten till en prionsjukdom har uteslutits
Dödsfall orsakade av mord eller självmord, med behov av en rättsläkare rapport
Post mortem-intervall >30 timmar

Tabell 2: Kriterier för donation av hjärnan.

N° Sex KOD BB KOD InveCe Ålder edu (år) klinisk diagnos Cdr Afs PM (tim) pH-vävnad pH-sprit neuropatologisk diagnos
1 F BB 37 87 5 Major-NCD på grund av AD (BPSD) 5 2 29 Nd Nd Hög AD patologi, måttlig SVD, TDP43+, ctx LTS, HS
2 F BB 105 94 5 Major-NCD på grund av AD 5 1 5 5.72 6.78 Hög AD patologi, mild SVD, HS
3 F BB 137 83 3 Major-NCD på grund av flera etiologier (AD-VaD) 5 1 16 Nd Nd Hög AD patologi, måttlig SVD, occipital infarct, CAA-capCAA
4 M BB 181 71 13 Major-NCD på grund av AD (BPSD) 5 2 3 Nd Nd Svår LTS (Beach IV), mellanliggande AD patologi, mildSVD, mCAA
5 M BB 115 Jag 636 78 18 Major-NCD på grund av AD 5 1 6 Nd Nd Mellanliggande annons, måttlig SVD, Inflammation, ILBD (Beach IIa), HS
6 F BB 23 Jag 65 79 3 Major-NCD på grund av kärlsjukdom 5 1 14 Nd Nd Svår och utbredd CAA, mellanliggande AD-patologi
7 M BB 102 Jag 412 79 8 Major-NCD på grund av kärlsjukdom 3 1 8 Nd Nd Vaskulär demens, ILBD
8 M BB 224 Jag 16 80 3 Major-NCD på grund av flera etiologier 5 1 11 Nd 5.99 Måttlig SVD, Låg AD-patologi, ILBD (Beach IIa), HS
9 F BB 47 78 5 Major-NCD till flera etiologier (LBD-VaD BPSD) 5 0 8 Nd Nd Hög AD patologi, BG TAU patologi, ARTAG, mild SVD, HS
10 F BB 153 Jag 965 79 5 Mild-NCD (död på grund av tjocktarmscancer med utbredd metastasering) 0.5 1 8 Nd 6.73 Låg AD patologi, måttlig BG-SVD
11 M BB 118 Jag 1211 79 13 NOLD (död på grund av levercancer) 0 2 3 Nd 6.51 Måttlig SVD
12 M BB 236 Jag 521 80 3 Major-NCD på grund av AD (BPSD) 4 1 15 Nd 6.15 Hög AD patologi, Svår BG-SVD (flera mikrobleeds), HS
13 F BB 138 85 3 Major-NCD på grund av flera etiologier (AD-VaD BPSD) 4 0 15 Nd 6.75 Hög AD patologi, måttlig SVD, CAA, limbiska TDP43
14 M BB 109 Jag 876 79 8 NOLD (död på grund av hjärntumör - GBL) 0 1 16 Nd 6.4 Låg AD-patologi, ILBD (Beach IIa), mild SVD
15 F BB 271 84 8 Major-NCD på grund av AD (BPSD) 4 1 2 Nd 6.7 Mellanliggande AD, limbisk LTS, måttlig BG-SVD, mCAA, TDP
16 F BB 71 Jag 1080 79 8 NOLD (död på grund av hjärtsvikt) 0 0 6 Nd 6.26 Måttlig BG-SVD, ILBD, amy TDP, låg AD
17 F BB 189 Jag 858 80 5 Major-NCD på grund av AD (BPSD) 3 0 20 Nd 6.42 Mellanliggande AD, CAA-capcaA, TDP43, måttlig BG-SVD, HS
18 F BB 278 Jag 924 80 5 Major-NCD på grund av LBD (BPSD) 3 1 5 6.02 7.05 Mellanliggande AD, limbisk LTS (strand IV), limbisk TDP, HS
19 F BB 247 104 8 Major-NCD på grund av flera etiologier (troligen blandad patologi) 3 0 6 6.48 7.22 TAU patologi (PART-ARTAG), HS
20 M BB 85 Jag 19 83 10 Major-NCD på grund av LBD (BPSD) 3 1 9 6.26 7.3 Svår limbisk LTS, mellanliggande AD, Måttlig SVD, svår CAA-capCAA, HS
21 F BB 14 Jag 222 82 8 Major-NCD på grund av flera etiologier (AD-VaD) 2 1 11 5.59 6.4 Mellanliggande AD patologi, Måttlig SVD
22 F BB 282 76 8 Större Frontotemporal NCD (nfPPA BPSD) 3 1 10 6.07 6.39 TDP (typ A), ILBD, måttlig SVD, låg AD, HS
23 F BB 154 Jag 1079 80 5 NOLD (död på grund av cancer med utbredd metastasering) 0 1 5 6.49 6.9 måttlig SVD, CAA, låg AD, limbisk encefalit
24 F BB 290 65 13 ha som huvudämne Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD) 5 1 12 5.73 6.42 TDP (typ A)
25 F BB 210 89 8 Major-NCD på grund av AD (BPSD) 5 1 15 5.94 6.4 pågår
26 M BB 293 75 18 Större Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD) 5 1 8 6.14 6.83 pågår
27 F BB 99 Jag 1370 79 9 NOLD (död på grund av septisk chock) 0 2 14 6.3 7.12 pågår
M/F Menar Menar Menar Menar Menar Menar Menar
0.5 81 7.7 3.2 1.0 10.4 6.1 6.6

Tabell 3: Klinisk/neuropatologisk diagnos av ABB-serien. BB: Brain Bank; edu (yrs): utbildningsår; CDR: Clinical Dementia Rating (0 = ingen demens; 0,5 = mild kognitiv svikt; 1 = mild demens; 2 = måttlig demens; 3 = svår demens; 4 = mycket svår demens; 5 = terminal demens); AFS: Agonal Factor Score; PM (tims): Post Mortem timmar; nd: inte gjort; M/F: Hanar/Hondjur; BPSD: Beteendemässiga och psykologiska symtom på demens; VaD: Vad: Vaskulär demens; NOLD: Normal äldre; GBL: Glioblastoma; nfPPA: icke flytande Primär Progressiv Afasi; bvFTD: beteendevariant av Frontotemporal Demens; SVD: Liten kärlets sjukdom; LTS: Lewy Typ Synucleinopati; HS: Hippocampus skleros; CAA: Cerebral Amyloid angiopati; capCAA: kapillär CAA; mCAA: meningeal CAA; ILBD: Tillfällig Lewy Kroppssjukdom; BG: Basala Ganglier; ARTAG: Åldersrelaterad TAU Astro-Gliopati; PART: Primär åldersrelaterad TAUopati; amy: amigdala.

Domän Testnamn
Depression Centrum för epidemiologiska studier Depression Scale (CES-D) [2]
Global kognition Mini-Mental State Undersökning (MMSE) [1]
Verbalt och visuellt minne Gratis och Cued Selektiv påminna Test [3]
Corsi-test [4]
Rey-Osterrieth Complex Figur (ROCF) Recall [5]
Uppmärksamhet/ psykomotorisk hastighet Trail gör A [6]
Uppmärksamhetsmatriser [4]
Språk-semantiskt minne Semantisk verbal flyt (färger, djur, frukter, städer) [4]
Verkställande funktioner Trail gör B [6]
Ravens färgade matriser [7]
Visuospatiala förmågor Test för klockritning (CDT) [8]
Rey-Osterrieth Complex Figur (ROCF) Kopia [5]

Tabell 4: Neuropsykologisk bedömning för hjärndonatorer.

Metaboliter
Fullständigt blodförstredning
Kolesterol HDL och LDL
Triglycerider
Glukos
Glycated hemoglobin (HbA1c)
Homocystein
Kobalamin (Vitamin B12)
Folat
Albumin
Urea
Kreatinin
Transaminaser (ALT och AST)
Gamma Glutamyl-överföringsas
Sköldkörtelstimulerande hormon (TSH)
Vitamin D (25-hydroxi-vitamin D)
C-reaktivt protein (CRP)
Elektrolyter

Tabell 5: Metabolisk panel för hjärndonatorer.

GENENS NAMN dbSNP
Apolipoprotein E (APOE) rs429358
rs7412
Katalas (CAT) rs1001179
Superoxiddismutas 2 (SOD2) rs4880
Angiotensinogen (AGT) rs699
Sirtuin 2 (SIRT2) rs10410544
Translocase av yttre mitokondriellt membran 40 (TOMM40) rs2075650
Överbryggande integratör 1 (BIN1) rs7561528
Katekol-O-metyltransferas (COMT) rs4680
Metylentetrahydrofolate reduktas (MTHFR) rs1801133
rs1801131
Hjärnan härledd neurotrofa faktor (BDNF) rs6265
solute carrier familj 6, medlem 4 (SLC6A4 eller 5HTT) Hydroxytryptamin transportör gen-linked polymorf region (5-HTTLPR)
rs25531

Tabell 6: SNPs analyseras för InveCe.Ab hjärndonatorer.

Process Lösning Varaktighet
MAKROPROVER MIKROPROVER
Fixering 10% BUFFRAT FORMALIN 8 dagar vid 4 °C 8 dagar vid 4 °C
Tvätt FOSFATBUFFERT 2-15 dagar i rumstemperatur 2-15 dagar i rumstemperatur
Tvätt H2O TVÄTT 2-3 h, kranvatten 2-3 h, kranvatten
Uttorkning ETYLALKOHOL 70% 24 h 8 h
Uttorkning ETYLALKOHOL 80% 24 h 4 h
Uttorkning ETYLALKOHOL 90% 60 h (vanligtvis under helgen) 4 h
Uttorkning ETYLALKOHOL 95% 12 h 4 h
Uttorkning ETYLALKOHOL 95% 12 h 4 h
Uttorkning ETYLALKOHOL 100% 6 h 4 h
Uttorkning ETYLALKOHOL 100% 6 h 4 h
Röjning XYLEN I 12 h 10 h
Röjning XYLEN II 12 h 10 h
Infiltration PARAFFIN I 12 h 11 h
Infiltration PARAFFIN II 12 h 11 h
Bädda in PARAFFIN VAX

Tabell 7: ABB vävnad bearbetning protokoll.

Regionen H&E CRESIL VIOLETT LFB GALLYAS 4G8 AT8 α-SYN TDP-43 Neun GFAP
Hjärnstammen
Medulla- Dorsal Motor Nucleus av Vagus X X X
Pons - Locus Coeruleus X X X
Mitthjärnan - Substantia Nigra X X X X
Lillhjärnan
Cerebellar cortex och Dentate kärna X X X X
Storhjärnan
Mellersta frontal gyrus X X X X X X X
Basala Ganglier + kärna av Meynert X X X X X X
Cingulera, främre X X X X X X X
Amygdala X X X X X X
Thalamus och subthalamic kärna X X
Överlägsen och mellersta temporal gyri X X X X X X X X X
Hippocampus och Entorhinal cortex X X X X X X X X X X
Sämre parietal lobule X X X X X X X
Occipital cortex X X X X X
Luktlampa X X

Tabell 8: Bedömda regioner, färgning och immunhistokemi.

Discussion

Kritiska steg i protokollet
Vårt mål är att erhålla, karakterisera och lagra vävnader av god kvalitet som kommer från ämnen med detaljerad historia som härrör från longitudinell observation. För att nå detta mål krävs det att man tar itu med följande centrala aspekter. Som beskrivits ovan börjar protokollet med rekrytering av donatorer, vilket är det första avgörande steget. Sedan är det nödvändigt att givarna fortsätter uppföljningsprogrammet och upprätthåller vidhäftningen till projektet över tiden tills den faktiska donationen av hjärnan. Vid tidpunkten för dödsfallet är det nödvändigt att ABB-personalen omgående meddelas för att sammankalla obduktionsteamet inom 24 timmar, och vara viktigt för tillräcklig vävnadskvalitet. Färsk styckning av hjärnhalvorna kräver en stadig hand och en specifik träning. För att undvika cellskador orsakade av långsam frysning och erhålla skivor av god kvalitet för kryostaten och Omiken är det viktigt att de fryses ner snabbt. Med tanke på hastigheten för penetration av formalinlösning (1 mm/timme), för att bevara vävnadsdogenitet hålls blötläggningstiden för den enda skiva på sin lägsta nivå.

Felsökning av metoden
För att ta itu med de kritiska steg som nämns ovan erbjuder vi följande tillvägagångssätt. Givare rekrytering och anslutning till uppföljningar: Det finns flera faktorer som hindrar hjärnan donation inklusive rädsla för att skada kroppens figur, renhet och integritet, eller möjligheten att känna smärta efter döden. Vissa oroar sig till och med för att obduktionen kan genomföras medan de fortfarande lever70,71. Oron för störningar i begravningsarrangemangen och den ekonomiska bördan finns också72. Vidare kan en medicinsk personals brist på kunskap om förfaranden efter blödning och oförmågan att ta itu med de potentiella donatorernas eller deras NOK:s oro avskräcka från registrering. Alla dessa faktorer kan ge en låg grad av medvetenhet med ett lågt antal inskrivna deltagare och en stor möjlighet att givaren förlust över tiden. I själva verket bör givaren rekryteringsprogram vara effektiva för att sprida medvetenhet, ingjuta förtroende och övertyga människor att registrera och upprätthålla höga nivåer av uppföljning deltagande. Enligt vår erfarenhet sker detta genom noggrant urval av potentiella givare och grundlig förklaring av BB:s syften. Vi erbjuder pedagogiska aktiviteter och ett empatiskt tillvägagångssätt som tar itu med rädsla och behov hos både friska människor och de som drabbats av neurodegenerativa sjukdomar och deras familjer. Vi finner att potentiella givare är mer benägna att ge sitt samtycke när de kontaktas personligen. En face-to-face-strategi skapar en relation som bygger på ömsesidigt förtroende och respekt som är grundläggande för att uppnå en hög andel av registreringen till hjärnan donation och uppföljning bedömningar. En välutbildad personal med en stark känsla för etik först närmar sig den potentiella givaren, diskuterar möjligheten att donera hjärnan efter döden, förklarar värdet av mänsklig hjärnvävnad till neurovetenskaplig forskning, och klargör eventuella tvivel om postmortem förfaranden. Gynnsamma word of mouth är lika viktigt. Efter hjärnskörden ges lämplig uppmärksamhet och omsorg för att komponera om kadaver. Det är viktigt att visa respekt och tacksamhet till den avlidne genom att behandla kadaver försiktigt. Några månader efter, ett möte är planerad att kommunicera resultaten av den neuropatologiska analysen närhelst begärs av familjemedlemmar.

Tidpunkten för död och hjärnskörd: När personen accepterar, blir de en donator och får ett id-kort med ett nummer att kontakta 24 timmar/dag, 7 dagar/vecka (mottagningsnumret på ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital som är ansluten till oss). Dessutom ges en självhäftande tagg till de anhöriga som ska användas vid sjukhusvistelse. Begravningsbyråerna i området har tidigare informerats om att föra kroppen till ABB anläggningar, där obduktionen laget kallas. Obduktionsteamet består av en patolog, en neurolog och/eller en neurobiolog, och en anatomisk rumstekniker, som är jour från 6 till 23 varje dag; några trainee studenter är också ofta närvarande för att hjälpa och ta bilder.

Precisionen och konsekvensen hos de färska skärprocedurerna säkerställs genom medverkan av samma två operatörer (en neurolog och en patolog) som har utvecklat metoden och har flera års erfarenhet av neuropatologi. När fryser skivorna, de sätts på en prefrozen aluminium bricka och täckt med en samverkande aluminiumplatta för att hålla dem väl platt. Omedelbart efter sätts de i flytande kväve i 3 minuter, innan de förvaras vid -80 °C. De skivor som skall fastställas är individuellt insvept i gasväv, och indränkt i en 10% fosfat buffrad formalinlösning, som ersätts efter en dag. Därefter hålls de i formalin högst 5 ytterligare dagar; dock, med tanke på att formalinlösningen tränger in på 1 mm/dag, skulle vi vilja förkorta ytterligare blötläggningstiden.

Metodens begränsningar
Den forskningsmetod som beskrivs här omfattar endast ett begränsat geografiskt område, och de individer som deltar i donationsprogrammet besitter egenskaper som inte helt representerar den allmänna befolkningen. Även om det är mer än acceptabelt, kan ett postmortemintervall upp till 24 timmar producera förändringar i vissa proteinstrukturer, enzymer och RNA av hjärnvävnad. Fastställandet av AFS och pH kanske inte är helt tillräcklig för att bestämmavävnadskvalitet 73 och vi utvecklar andra sätt att autentisera vävnadskvaliteten baserat på RNA-integritet.

Angående förfarandet för mikrotomskärning, även om det är mycket användbart för att rekonstruera anatomiska samband, bör det noteras att användningen av makrosektioner inte är enkel och innebär vissa tekniska svårigheter. Vår metod är utmanande och tidskrävande. Kostnaderna är ganska höga och finansieringen är inte alltid lätt. Finansieringen kommer främst från offentliga (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) och privata resurser (Golgi-Cenci Foundation), privata donationer, ideella organisationer (t.ex. "Federazione Alzheimer Italia") och beviljar deltagande.

ABB-metodens betydelse med avseende på befintliga/alternativa metoder
I början riktade vår hjärna donation program individer som deltar i InveCe.Ab longitudinella studien. Som en följd av detta åtföljs de hjärnor som doneras av detaljerad klinisk, biologisk och social information som samlats in genom åren. ABB:s styrka härrör just från detta särskiljande ursprung. Att studera en grupp socialt och genetiskt närstående personer som delar biologiska egenskaper och miljöexponeringar förbättrar statistisk analys. Dessutom innehåller studien följande fördelar: 1) Att ta hand om och sörja för samhällets behov (handlingen att "ge innan de frågar"): människor får en gratis periodisk kontroll som allmänläkaren är informerad om, ett telefonnummer till vår sekreterare tillhandahålls för samråd, och svårt funktionshindrade personer besöks hemma; 2) Engagerande deltagare, personer med offentliga roller och allmänläkare i pedagogisk verksamhet genom anordnande av periodiska seminarier (relaterade till hjärnans sundhet, hjärndonation och allmän hälsa), och planering av tematiska kurser (t.ex. användning av informationsteknik enheter för äldre); 3) Att träffa människor och anta en face-to-face-strategi. Alla dessa delar utgör styrkan i ABB-projektet. Vidare förbättrar projektet den kliniska förmågan hos involverad medicinsk personal, eftersom de får erfarenhet av både antemortembedömningar och eftermortem neuropatologiska utvärderingar. I detta avseende vill vi nämna den mycket egendomliga erfarenheten av "Minoritetens åldrande forskningsstudie". Denna studie omfattade ett begränsat och utvalt antal afroamerikaner bosatta i Chicago-området (784 av 1.357 berättigade ämnen: svarsfrekvens på 57%). Deltagarna besöktes årligen hemma och ombads att gå med i programmet för hjärndonation. Denna studie är baserad på en ovanlig strategi med vissa likheter med vår få höga procentsatser av positivt svar på hjärnan donation programmet (352 givare av 784 deltagare var inskrivna: 44%), om än obduktionen var inte helt tillfredsställande (53%)74. Precis som i "Minoriteten åldrande forskningsstudie", erbjuder vi pedagogiska aktiviteter och en empatisk strategi, att uppnå utmärkta resultat. I synnerhet är vår svarsfrekvens 93%, inskrivningsprocenten är 28,7%, och obduktionsfrekvensen för tillfället är 67%. Dessa priser visar att projekt som direkt engagerar människor har en mer betydande andel av donationer. Andra hjärnan donation program, med mindre uppmärksamhet i att bygga en relation med potentiella givare, i allmänhet har en låg inskrivning procent, är cirka 10-15%eller mindre 73,75.

Det finns få tidigare kohortstudier som slutar med en neuropatologisk analys. Dessutom är majoriteten av hjärnan banker och förråd sjukdomscentrerade och det finns en brist på "kontroll" hjärnor från friska givare jämfört med antalet "sjuka" hjärnor. Endast ett begränsat antal BBs baseras på befolkningsstudier som involverar både sjuka och normala försökspersoner för att kunna studera åldrandebanor 73,74,76,77,78,79,80. Vissa studier som Minoritetens åldrande forskningsstudie i USA74 och The Vanda 85+ studien i Finland76 liknar vår men de tenderar att ta i och med att kohorten upphör. Istället är ABB: s donation program tänkt att fortsätta under en lång tid i framtiden, värva potentiella givare och schemaläggning uppföljningar även efter utgången av InveCe.Ab longitudinella studien. Detta tillvägagångssätt gör vår rekryteringsmetod liknar den i "Sun Health Research Institute (SHRI) hjärnan donation program" som syftar till en pensionering gemenskap73. Shri-protokollet för hjärndonation är mycket effektivt med det kortaste medelvärdet postmortemintervall i världen (3,92 timmar). I likhet med de största BBs i världen, SHRI protokollet helt enkelt klippa storhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen i mittlinjen (sagittal plan), då ena halvan är dissekeras färska och frysta för biokemiska studier, medan den andra är fast i formalin för histopatologisk bedömning. En av styrkorna med SHRI-dissektionsprotokollet är dock fixeringen av enskilda skivor i stället för hela halvklotet. Faktum är att fixera en halvklot som helhet är inte optimalt, på grund av de olika fixeringsgradienterna mellan ytan och kärnan. Dessutom kan de kortikala proteinerna påverkas av långvarig exponering för formalinlösningen. Således, anledningen till att vi beslutat att fixa enskilda skivor.

Beslutet om vilken sida som är fast eller fryst, beror på singularbanken (alltid samma, slumpmässigt tilldelade eller tilldelade beroende på om dissekeringsdagen är udda eller jämn)31,32,33,34,35. Så, biokemiska och histopatologisk analys utförs separat på varje halvklot. Eftersom många neurologiska sjukdomar är asymmetriska, erbjuder vår BB ett unikt protokoll för skivning av färska exemplar: alternativa sektioner från hjärnstammen och från varje halvklot av lillhjärnan och cerebrum behålls som fast eller fryst material; ett fast segment på en halvsfär motsvarar en fryst på den andra hjärnhalvan. Vår metod ger möjlighet att få en komplett histologisk karakterisering av allt fruset material och att jämföra resultaten från alla områden på båda sidor. Som sagt i inledningen, den metod som beskrivs tillåter oss att få så mycket information som möjligt från hjärnvävnaden. Vidare ger ABB: s metod en grundläggande men komplett neuropatologiska karakterisering, inklusive nästan alla kända hjärnan proteinopathies och vaskulär patologi. På grund av den kontroversiella roll vaskulära skador vid fastställandet av kognitiv svikt, vi beslutat att använda en dubbel scoring förden vaskulära bördan 30,53.

Som förklaras i protokollet använder vi oss av ett tvärvetenskapligt tillvägagångssätt. Även om detta är en tidskrävande och ansträngd metod, tror vi att det ger flera fördelar för forskning. Till exempel, i ett tidigare arbete, visade vi att hög tHcy i sig, eller MTHFR C677T TT i samband med APOE-ε4 allel, kan vara relaterade till verkställande dysfunktioner snarare än minnesförlust81. Därför kan det vara intressant att utvärdera ämnen med just denna genetiska profil på en neuropatologisk nivå. Detta är ett exempel på hur en sådan fördjupad uppföljning är användbar för att skapa nya forskningshypoteser som kan verifieras genom utredning av biologiskt material som samlats in i vår bank. En annan demonstration av fördelen med vårt tillvägagångssätt är införandet av QEEG bland de bedömningar vi rutinmässigt utför, för sin originalitet och den relativa användarvänligheten. I själva verket upptäcker EEG den synaptiska aktiviteten i hjärnbarken genom att registrera de elektriska potentialerna för dendrites som tillhör när pyramidala nervceller82. QEEG kan anses vara en biomarkör för uppskattning av när synaptisk aktivitet som är relaterad till kognition83. Särskilt har en minskning av alfa rytmer i den bakre delen av hjärnan med en allmän ökning av lägre frekvenser (theta och delta rytmer) varit relaterade till när anslutning uppdelning. Det bör anses att de flesta av de diagnostiska korrelationsstudierna har baserats på en klinisk diagnos som bara är en trolig och inte en bestämd diagnos84,85,86,87. Endast mycket få riktade studier har jämfört QEEG-data med den neuropatologiska bilden för att undersöka sambandet mellan QEEG och LTS-varianterna88,89, och skillnaden mellan FTLD och AD83. Genom att avsluta vår studie med en definition av den neuropatologiska diagnosen är det då möjligt att korrekt tolka de observationer som gjorts på cerebral elektrisk aktivitet. Dessutom utför seriella QEEG i varje ämne kan vi spåra intra-individuella EEG vågor bana och deras korrelationer med neuropatologiska bilden. Efter enskilda modifieringar av när elektrisk aktivitet över tiden kan leda till en bättre förståelse av dess innebörd som en biomarkör för begynnande demens.

Framtida tillämpningar och riktning av metoden
Att implementera vävnadsfördelningen är ett av våra viktigaste prospektiva mål. För att göra detta, vi just inrättat en vetenskaplig kommission inklusive direktören för GC Foundation (geriatriker), en akademiker i Neurology från universitetet i Pavia, en neurolog och en patolog både från GC Foundation & den geriatriska sjukhuset ASP Golgi-Redaelli. Vid distribution av hjärnvävnad, histologiska diabilder och andra biologiska prover är det viktigt att komma ihåg att givarna gick med på donationen för forskningens skull. Materialdistributionen bör därför ske försiktigt, precis som beskrivs i BNE:s uppförandekod40. Varje part som lämnar in en begäran om material bör ange typ och mängd av det prov som behövs, ge en beskrivning av forskningsprojektet och hur proverna kommer att användas, och när så är möjligt, lämna bevis på tidigare publikationer (för överlåtelseavtalet, se figur 9). Hjärnbanken fungerar inte för ekonomisk vinning. Så bör de avgifter som betalas av forskare endast täcka kostnaderna för vävnadsanskaffning, bearbetning, lagring och distribution.

Planer på att börja analysera fall med exome sekvensering och Omics tekniker, såsom proteomik och transkriptomik, är i rörelse. Vår alternativa provtagningsmetodik gör det möjligt att utföra omikstudier på histologiskt väldefinierade vävnader från båda halvkloten. Genom detta tillvägagångssätt kommer det att vara möjligt att jämföra mönstret för genaktivering i olika hjärnområden på samma halvklot och i motsvarande områden i den andra hjärnhalvan, och kunna korrelera genaktivering med histopatologi. Inom detta område, skulle djupinlärning applikationer vara av stort intresse inklusive datoriserad analys av histologiska diabilder och banbrytande korrelation av kliniska, histologiska och omics data. Andra samband mellan många olika variabler kan identifieras liksom andra möjliga tekniska tillämpningar. Tillgången på fryst material från båda halvkloten kommer att möjliggöra en korrekt topografi av genaktivering och proteinfördelning. Detta kommer att vara av särskilt intresse även i friska försökspersoner, med tanke på att både hjärnans funktioner och vissa sjukdomar är asymmetriska.

Dessutom kan vi få cellkulturer från väl karakteriserade hjärndonatorer. Faktum är att cellkulturer från leptomeninges av skördade hjärnor leverera levande celler som kan användas för ytterligare undersökning av sjukdomar eller åldrande mekanismer, med hjälp av de inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) teknik som innebär omprogrammering leptomeningeal fibroblaster och differentiera dem till neurala celler i avancerade modeller90.

Som hjärnor ålder, olika profiler av förändring kan uppstå på molekylär, cellulär och vävnad nivå. Varje hjärna är unik. Var och en har sitt eget sätt att reagera på interna och externa stressfaktorer; vissa motstår medan andra dukar under och visar distinkta patologier. Diskrepanser mellan den kliniska presentationen och den neuropatologiska bilden finns ofta eftersom topografin av skador, snarare än deras molekylära karaktär, bestämmer den kliniska presentationen. korrekt och bestämd diagnos kunde endast uppnås genom att kombinera det kliniska syndromet med de neuropatologiska resultaten som ofta lägger till viktiga etiologiska ledtrådar som krävs för att reda ut patogenesen vid sjukdomarna. I Europa finns en strävan att skapa en standardmetod för neuropatologisk diagnos. Vårt diagnostiska protokoll följer nästan helt de nyligen publicerade riktlinjerna om neuropatologisk diagnos för brain banking91. Detta kommer att tillåta oss att samla in och dela väldokumenterad hjärnvävnad, med det prospektiva målet att etablera den första italienska Brain Bank. I Italien finns det faktiskt hjärnregister men inte hjärnbanker baserade på kohortstudier. Vårt mål är att utveckla en metod för hjärnvävnadsskörd som kan implementeras brett i hela Italien, att etablera ett nätverk som använder ett gemensamt protokoll och delar jämförbart material. För att kunna göra det är medverkan av andra forskningscentra och skapandet av en specifik webbplats bland de viktigaste målen för framtiden.

Innovativ teknik används ständigt för analys av neurodegenerativa sjukdomars molekylära natur och för identifiering av biomarkör. I detta sammanhang kommer det att finnas ett ökande behov av hjärnor åtföljs av information om kognitiva och åldrande banor som erhållits genom longitudinella studier, betonar vikten av en neuropatologiskt verifierad epidemiologisk strategi92.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi önskar att tillägna detta arbete till Dr.ssa Michela Mangieri. Innan hon dog i förtid, hon tänkt och startade Abbiategrasso Brain Bank Project.

Vi är tacksamma mot våra hjärndonatorer, som generöst bidrar till forskning donerar den ädlaste organ i sin kropp; utan dem skulle denna forskning inte vara möjlig.

Vi är tacksamma mot Valeria Marzagalli för hennes dyrbara arbete i ABB-projektet.

Författarna tackar prof. Johannes Attems, Dr Paolo Fociani och Dr Giorgio Giaccone för deras dyrbara vägledning och kloka råd.

Vi vill tacka Dr.ssa Alice Cirrincione och Miss Giulia Bortone för deras dyrbara hjälp under hela projektet.
Ett stort tack till Fru Tere Cassani för hennes stöd och till "Federazione Alzheimer Italia" för sitt samarbete.
Författarna är tacksamma mot Dr Matteo Moretti och prof. Antonio Marco Maria Osculati, Institutionen för folkhälsa, experimentell och rättsmedicin, University of Pavia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm BD 405253
Anti-GFAP Dako Z0334 policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60) Chemicon MAB377 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8) ThermoScientific MN1020 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) CosmoBio TIP-PTD-P02 policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51) Novocastra NCL-L-ASYN monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8) BioLegend 800703 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board BD 352070
DMEM High Glucose Carlo Erba FA30WL0101500 medium
Electrical saw with 5d blade CEA 06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm CEA 70064.250 HHH
Electrode pH needle Fisher Scientific 11796338
EnVision+System-HRP Dako K4001 secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP Dako K4003 secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether SMI 8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm Fisher Scientific 11749798
Fetal Bovine Serum Carlo Erba FA30WS1810500 medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical Uvex 500XG
Gloves CEA 01.28.14
Glue Arcobaleno 2624000800002
Head supporter Lacor 60456
L-Glutamine (100X) Carlo Erba FA30WX0550100 medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape CEABIS CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide UHU Bostik 8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140050 medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X) Carlo Erba FA30WL0022100 medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm CEA 03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin Olcelli Farmaceutica A930857255
Surgical mallet and surgical cisel CEA 79.68.88
Surgical scissor CEA 27.08.45/79.68.64
Feather M130RC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Global Dementia Observatory Reference Guide World Health Organization. , at http://apps.who.int/bookorders (2018).
  2. Kasper, B. S., et al. Neuropathology of epilepsy and psychosis: the contributions of J.A.N. Corsellis. Brain: a journal of neurology. 133, Pt 12 3795-3805 (2010).
  3. Overy, C., Tansey, E. M. The development of brain banks in the UK. c.1970-c.2010. , Available from: www.histmodbiomed.org (2013).
  4. Tourtellotte, W. W., Itabashi, H. H., Rosario, I., Berman, K. The National Neurological Research Bank. A collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists. Annals of the New York Academy of Sciences. 436, 513-516 (1984).
  5. Tourtellotte, W. W., Rosario, I. P., Conrad, A., Syndulko, K. Human neuro-specimen banking 1961-1992. The National Neurological Research Specimen Bank (a donor program of pre- and post-mortem tissues and cerebrospinal fluid/blood; and a collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists). Journal of neural transmission. 39, Supplementum 5-15 (1993).
  6. Carlos, A. F., Poloni, T. E., Medici, V., Chikhladze, M., Guaita, A., Ceroni, M. From brain collections to modern brain banks: A historical perspective. Alzheimer's & dementia. 5, New York, N.Y. 52-60 (2019).
  7. Szymański, P., Markowicz, M., Janik, A., Ciesielski, M., Mikiciuk-Olasik, E. Neuroimaging diagnosis in neurodegenerative diseases. Nuclear medicine review. Central & Eastern Europe. 13 (1), 23-31 (2010).
  8. Nowak, D., Hofmann, W. K., Koeffler, H. P. Genome-Wide Mapping Of Copy Number Variations using SNP Arrays. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 36 (4), 246-251 (2009).
  9. Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS computational biology. 8 (12), 1002822 (2012).
  10. Dirks, R. A. M., Stunnenberg, H. G., Marks, H. Genome-wide epigenomic profiling for biomarker discovery. Clinical epigenetics. 8 (1), 122 (2016).
  11. Felsenfeld, G. A Brief History of Epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 018200 (2014).
  12. Cogswell, J. P., et al. Identification of miRNA Changes in Alzheimer's Disease Brain and CSF Yields Putative Biomarkers and Insights into Disease Pathways. Journal of Alzheimer's Disease. 14 (1), 27-41 (2008).
  13. Lau, P., et al. Alteration of the microRNA network during the progression of Alzheimer's disease. EMBO molecular medicine. 5 (10), 1613-1634 (2013).
  14. Lowe, R., Shirley, N., Bleackley, M., Dolan, S., Shafee, T. Transcriptomics technologies. PLoS computational biology. 13 (5), 1005457 (2017).
  15. Simpson, J. E., et al. Microarray analysis of the astrocyte transcriptome in the aging brain: relationship to Alzheimer’s pathology and APOE genotype. Neurobiology of aging. 32 (10), 1795-1807 (2011).
  16. Shevchenko, G., Konzer, A., Musunuri, S., Bergquist, J. Neuroproteomics tools in clinical practice. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 705-717 (2015).
  17. Patterson, S. D. Proteomics: evolution of the technology. BioTechniques. 35 (3), 440-444 (2003).
  18. Paraizo Leite, R. E., Tenenholz Grinberg, L. Closing the gap between brain banks and proteomics to advance the study of neurodegenerative diseases. Proteomics. Clinical applications. 9 (9-10), 832-837 (2015).
  19. Giacomelli, C., Daniele, S., Martini, C. Potential biomarkers and novel pharmacological targets in protein aggregation-related neurodegenerative diseases. Biochemical Pharmacology. 131, 1-15 (2017).
  20. Faghihi, M. A., Mottagui-Tabar, S., Wahlestedt, C. Genetics of neurological disorders. Expert review of molecular diagnostics. 4 (3), 317-332 (2004).
  21. Toft, M. Advances in genetic diagnosis of neurological disorders. Acta Neurologica Scandinavica. 129, 20-25 (2014).
  22. Kumar, D., Weatherall, D. J. Genomics and clinical medicine. , 651 (2008).
  23. Han, G., Sun, J., Wang, J., Bai, Z., Song, F., Lei, H. Genomics in Neurological Disorders. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 12 (4), 156-163 (2014).
  24. Gere, C. A Brief History of Brain Archiving. Journal of the History of the Neurosciences. 12 (4), 396-410 (2003).
  25. Fratiglioni, L., Paillard-Borg, S., Winblad, B. An active and socially integrated lifestyle in late life might protect against dementia. Lancet neurology. 3 (6), 343-353 (2004).
  26. Spartano, N. L., et al. Association of Accelerometer-Measured Light-Intensity Physical Activity With Brain Volume. JAMA Network Open. 2 (4), 192745 (2019).
  27. Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta neuropathologica. 115 (5), 497-507 (2008).
  28. Ravid, R., Park, Y. mok Brain banking in the twenty-first century: creative solutions and ongoing challenges. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine. 2, 17 (2014).
  29. Iacono, D., Geraci-Erck, M., Peng, H., Bouffard, J. P. Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), (2016).
  30. Deramecourt, V., et al. Staging and natural history of cerebrovascular pathology in dementia. Neurology. 78 (14), 1043-1050 (2012).
  31. Netherlands Brain Bank Information for tissue applicants. , Available from: https://www.brainbank.nl/media/uploads/file/Information for tissue applicants_2019.pdf (2019).
  32. UK Brain Bank Network Process used by the banks for tissue processing and storage. The UK Brain Bank Network protocol. , Available from: https://mrc.ukri.org/documents/pdf/process-used-by-the-banks-for-tissue-processing-and-storage/ (2019).
  33. Vonsattel, J. P. G., Del Amaya, M. P., Keller, C. E. Twenty-first century brain banking. Processing brains for research: the Columbia University methods. Acta neuropathologica. 115 (5), 509-532 (2008).
  34. A Tour Of The Brain Bank. Brain Bank. , Available from: https://hbtrc.mclean.harvard.edu/pdf/about/HBTRC-Tour-2013.2.pdf (2019).
  35. Sheedy, D., et al. An Australian Brain Bank: a critical investment with a high return! Cell and tissue banking. 9 (3), 205-216 (2008).
  36. Guaita, A., et al. Brain aging and dementia during the transition from late adulthood to old age: design and methodology of the "Invece.Ab" population-based study. BMC Geriatr. 13, 98 (2013).
  37. Lobo, A., et al. Prevalence of dementia and major subtypes in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 4-9 (2000).
  38. Hofman, A., et al. The prevalence of dementia in Europe: a collaborative study of 1980-1990 findings. Eurodem Prevalence Research Group. Int J Epidemiol. 20 (3), 736-748 (1991).
  39. BrainNet Europe - Code of Conduct. , Available from: https://www.brainnet-europe.org/indexe151.html?_option=com_content_view=article_id=89_Itemid=89 (2008).
  40. Klioueva, N. M., Rademaker, M. C., Huitinga, I. Design of a European code of conduct for brain banking. Handbook of Clinical Neurology. 150, Elsevier B.V. (2018).
  41. Lee, K., Saetern, O. C., Nguyen, A., Rodriguez, L., Schüle, B. Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors. Journal of visualized experiments: JoVE. (119), (2017).
  42. Esiri, M. M., Wilcock, G. K., Morris, J. H. Neuropathological assessment of the lesions of significance in vascular dementia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 63 (6), 749-753 (1997).
  43. Tomita, H., et al. Effect of agonal and postmortem factors on gene expression profile: quality control in microarray analyses of postmortem human brain. Biological psychiatry. 55 (4), 346-352 (2004).
  44. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: what quality markers matter. Brain research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  45. Montine, T. J., et al. National Institute on Aging-Alzheimer's Association guidelines for the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease: a practical approach. Acta Neuropathologica. 123 (1), 1-11 (2012).
  46. Boxer, A. L., Yu, J. T., Golbe, L. I., Litvan, I., Lang, A. E., Höglinger, G. U. Advances in progressive supranuclear palsy: new diagnostic criteria, biomarkers, and therapeutic approaches. The Lancet Neurology. 16 (7), 552-563 (2017).
  47. Dickson, D. W., Ahmed, Z., Algom, A. A., Tsuboi, Y., Josephs, K. A. Neuropathology of variants of progressive supranuclear palsy. Current opinion in neurology. 23 (4), 394-400 (2010).
  48. Dickson, D. Neurodegeneration: the molecular pathology of dementia and movement disorders. , Wiley-Blackwell. (2011).
  49. Crary, J. F., et al. Primary age-related tauopathy (PART): a common pathology associated with human aging. Acta neuropathologica. 128 (6), 755-766 (2014).
  50. Kovacs, G. G., et al. Aging-related tau astrogliopathy (ARTAG): harmonized evaluation strategy. Acta neuropathologica. 131 (1), 87-102 (2016).
  51. Alafuzoff, I., et al. Neuropathological assessments of the pathology in frontotemporal lobar degeneration with TDP43-positive inclusions: an inter-laboratory study by the BrainNet Europe consortium. Journal of neural transmission. 122 (7), Vienna, Austria. 957-972 (2015).
  52. Love, S., et al. Development, appraisal, validation and implementation of a consensus protocol for the assessment of cerebral amyloid angiopathy in post-mortem brain tissue. American journal of neurodegenerative disease. 3 (1), 19-32 (2014).
  53. Skrobot, O. A., et al. Vascular cognitive impairment neuropathology guidelines (VCING): the contribution of cerebrovascular pathology to cognitive impairment. Brain. 139 (11), 2957-2969 (2016).
  54. Thal, D. R., Rüb, U., Orantes, M., Braak, H. Phases of A beta-deposition in the human brain and its relevance for the development of AD. Neurology. 58 (12), 1791-1800 (2002).
  55. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112 (4), 389-404 (2006).
  56. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD): Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-479 (1991).
  57. Finger, E. C. Frontotemporal Dementias. CONTINUUM: Lifelong Learning in Neurology. 22, 2, Dementia 464-489 (2016).
  58. Kovacs, G. G. Neuropathology of Neurodegenerative Diseases. , Cambridge University Press. Cambridge. (2014).
  59. Kovacs, G. G., et al. Neuropathology of the hippocampus in FTLD-Tau with Pick bodies: a study of the BrainNet Europe Consortium. Neuropathology and applied neurobiology. 39 (2), 166-178 (2013).
  60. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  61. Beach, T. G., et al. Unified staging system for Lewy body disorders: correlation with nigrostriatal degeneration, cognitive impairment and motor dysfunction. Acta neuropathologica. 117 (6), 613-634 (2009).
  62. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies. Neurology. 89 (1), 88-100 (2017).
  63. Trojanowski, J. Q., Revesz, T. Neuropathology Working Group on MSA Proposed neuropathological criteria for the post mortem diagnosis of multiple system atrophy. Neuropathology and applied neurobiology. 33 (6), 615-620 (2007).
  64. Mackenzie, I. R. A., et al. A harmonized classification system for FTLD-TDP pathology. Acta neuropathologica. 122 (1), 111-113 (2011).
  65. Nelson, P. T., et al. Limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy (LATE): consensus working group report. Brain. 142 (6), 1503-1527 (2019).
  66. Josephs, K. A., et al. Staging TDP-43 pathology in Alzheimer's disease. Acta neuropathologica. 127 (3), 441-450 (2014).
  67. Rauramaa, T., et al. Consensus recommendations on pathologic changes in the hippocampus: a postmortem multicenter inter-rater study. Journal of neuropathology and experimental neurology. 72 (6), 452-461 (2013).
  68. Iacono, D., et al. Same Ages, Same Genes: Same Brains, Same Pathologies?: Dementia Timings, Co-Occurring Brain Pathologies, ApoE Genotypes in Identical and Fraternal Age-matched Twins at Autopsy. Alzheimer Disease & Associated Disorders. 30 (2), 178-182 (2016).
  69. Guaita, A., et al. Influence of socio-demographic features and apolipoprotein E epsilon 4 expression on the prevalence of dementia and cognitive impairment in a population of 70-74-year olds: The InveCe.Ab study. Archives of Gerontology and Geriatrics. 60 (2), 334-343 (2015).
  70. Stevens, M. Factors influencing decisions about donation of the brain for research purposes. Age and ageing. 27 (5), 623-629 (1998).
  71. Le Bouc, R., et al. Limiting Factors of Brain Donation in Neurodegenerative Diseases: The Example of French Memory Clinics. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 49 (4), 1075-1083 (2016).
  72. Samarasekera, N., et al. Brain banking for neurological disorders. The Lancet. Neurology. 12 (11), 1096-1105 (2013).
  73. Beach, T. G., et al. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: description and experience, 1987-2007. Cell and tissue banking. 9 (3), 229-245 (2008).
  74. Barnes, L. L., Shah, R. C., Aggarwal, N. T., Bennett, D. A., Schneider, J. A. The Minority Aging Research Study: ongoing efforts to obtain brain donation in African Americans without dementia. Current Alzheimer research. 9 (6), 734-745 (2012).
  75. de Lange, G. M., Rademaker, M., Boks, M. P., Palmen, S. J. M. C. Brain donation in psychiatry: results of a Dutch prospective donor program among psychiatric cohort participants. BMC psychiatry. 17 (1), 347 (2017).
  76. Peuralinna, T., et al. APOE and AβPP Gene Variation in Cortical and Cerebrovascular Amyloid-β Pathology and Alzheimer's Disease: A Population-Based Analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (2), 377-385 (2011).
  77. Kawas, C. H. The oldest old and the 90+ Study. Alzheimer's & dementia: the journal of the Alzheimer's Association. 4, Suppl 1 56-59 (2008).
  78. Bennett, D. A., Schneider, J. A., Arvanitakis, Z., Wilson, R. S. Overview and findings from the religious orders study. Current Alzheimer research. 9 (6), 628-645 (2012).
  79. O'Brien, R. J., et al. Neuropathologic studies of the Baltimore Longitudinal Study of Aging (BLSA). Journal of Alzheimer's disease: JAD. 18 (3), 665-675 (2009).
  80. Jonkman, L. E., et al. Normal Aging Brain Collection Amsterdam (NABCA): A comprehensive collection of postmortem high-field imaging, neuropathological and morphometric datasets of non-neurological controls. NeuroImage: Clinical. 22, 101698 (2019).
  81. Polito, L., et al. High homocysteine and epistasis between MTHFR and APOE: association with cognitive performance in the elderly. Experimental gerontology. 76, 9-16 (2016).
  82. Amzica, F., Lopes Silva, F. Cellular substrates of brain rhythms. Niedermeyer's Electroencephalography is now in its thoroughly updated sixth edition. , 33-63 (2009).
  83. Vecchio, F., et al. Resting state cortical EEG rhythms in Alzheimer's disease: toward EEG markers for clinical applications: a review. Supplements to Clinical neurophysiology. 62, 223-236 (2013).
  84. Gouw, A. A., et al. EEG spectral analysis as a putative early prognostic biomarker in nondemented, amyloid positive subjects. Neurobiology of Aging. 57, 133-142 (2017).
  85. Babiloni, C., et al. Abnormalities of cortical neural synchronization mechanisms in patients with dementia due to Alzheimer's and Lewy body diseases: an EEG study. Neurobiology of Aging. 55, 143-158 (2017).
  86. Bonanni, L., et al. Quantitative electroencephalogram utility in predicting conversion of mild cognitive impairment to dementia with Lewy bodies. Neurobiology of Aging. 36 (1), 434-445 (2015).
  87. Engedal, K., et al. Quantitative EEG Applying the Statistical Recognition Pattern Method: A Useful Tool in Dementia Diagnostic Workup. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 40 (1-2), 1-12 (2015).
  88. Caviness, J. N., Beach, T. G., Hentz, J. G., Shill, H. A., Driver-Dunckley, E. D., Adler, C. H. Association Between Pathology and Electroencephalographic Activity in Parkinson's Disease. Clinical EEG and Neuroscience. 49 (5), 321-327 (2018).
  89. Goossens, J., et al. EEG Dominant Frequency Peak Differentiates Between Alzheimer's Disease and Frontotemporal Lobar Degeneration. Journal of Alzheimer's Disease. 55 (1), 53-58 (2016).
  90. Bordoni, M., et al. From Neuronal Differentiation of iPSCs to 3D Neuro-Organoids: Modelling and Therapy of Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3972 (2018).
  91. Alafuzoff, I. Minimal neuropathologic diagnosis for brain banking in the normal middle-aged and aged brain and in neurodegenerative disorders. Handbook of clinical neurology. 150, 131-141 (2018).
  92. Wharton, S. B., et al. Epidemiological Neuropathology: The MRC Cognitive Function and Aging Study Experience. Journal of Alzheimer's Disease. 25 (2), 359-372 (2011).

Tags

Neurovetenskap Brain Bank neuropatologi åldrande äldreomsorg longitudinell kohortstudie hjärndonation hjärnsorsektionsprotokoll QEEG clinico-patologisk korrelation omics
Abbiategrasso Brain Bank protokoll för att samla in, bearbetning och karaktärisera åldrande hjärnor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poloni, T. E., Medici, V., Carlos,… More

Poloni, T. E., Medici, V., Carlos, A. F., Davin, A., Ceretti, A., Mangieri, M., Cassini, P., Vaccaro, R., Zaccaria, D., Abbondanza, S., Bordoni, M., Fantini, V., Fogato, E., Cereda, C., Ceroni, M., Guaita, A. Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains. J. Vis. Exp. (160), e60296, doi:10.3791/60296 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter