Summary
هنا ، ونحن وصف بروتوكول بسيطه وقابله للتكرار من نموذج الماوس للعدوى لتقييم توهين السلالات المعدلة وراثيا من الزائفة الزنجاريه بالمقارنة مع الولايات المتحدة الغذاء والدواء أداره (FDA)-التي وافقت علي القولونية للتطبيقات التجارية.
Abstract
الكائنات المجهرية هي متعددة الأغراض وراثيا ومتنوعة وأصبحت مصدرا رئيسيا للعديد من المنتجات التجارية والbiopharmaceuticals. علي الرغم من ان بعض هذه المنتجات تنتج بشكل طبيعي من قبل الكائنات الحية ، والمنتجات الأخرى تتطلب الهندسة الوراثية للكائن الحي لزيادة غله الإنتاج. سلالات خبيثه من القولونية كانت تقليديا الأنواع البكتيرية المفضلة لإنتاج biopharmaceuticals; ومع ذلك ، بعض المنتجات من الصعب علي e. كولاي لإنتاج. وهكذا ، فان السلالات الخبيثة من الأنواع البكتيرية الأخرى يمكن ان توفر بدائل مفيده لإنتاج بعض المنتجات التجارية. الزائفة الزنجاريه هي بكتيريا سلبيه الجرام المشتركة ومدروسه جيدا التي يمكن ان توفر بديلا مناسبا ل e. كولاي. ومع ذلك ، الزنجاريه هو الممرض البشري الانتهازي. هنا ، ونحن التفاصيل الإجراءات التي يمكن استخدامها لتوليد سلالات غير المسببة للامراض من الزنجاريه من خلال الحذف الجيني متسلسلة باستخدام Plasmid pEX100T نؤتي. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي إنتاج سلاله خاليه من العلامات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد سلالات الزنجاريه موهنه للغاية لإنتاج المنتجات التجارية ، أو لتصميم سلالات لاستخدامات محدده أخرى. ونحن أيضا وصف نموذج الماوس بسيطه واستنساخه من العدوى الجهازية البكتيرية عن طريق حقن داخل الصفاق من سلالات اختبار المصادق عليها لاختبار التوهين من سلاله المهندسة وراثيا بالمقارنة مع سلاله BL21 المعتمدة من قبل FDA من e. كولاي.
Introduction
الزائفة الزنجاريه هو الممرض الجرثومي الانتهازية التي يمكن ان تسبب الامراض التي تهدد الحياة في البشر ، وخاصه في المناعة. ويرجع الامراضيه الزنجاريه إلى التعبير عن العديد من عوامل الضراوة ، بما في ذلك بروتياسيس و lipopolysaccharide ، فضلا عن قدرتها علي تشكيل بيوفيلم الواقية1. بسبب قدرتها علي إنتاج عوامل الضراوة وتسبب المرض في البشر ، وذلك باستخدام الزنجاريه لجعل المنتجات التجارية ويعرض المخاوف السلامة. السلالات غير المسببة للامراض من e. القولونية وقد استخدمت تقليديا للهندسة الحيوية المنتجات الطبية والتجارية للاستخدام البشري. ومع ذلك ، بعض المنتجات من الصعب علي e. كولاي لجعل ، والعديد من تعبئتها في هيئات الادراج ، مما يجعل استخراج شاقه. السلالات البكتيرية المهندسة مع القدرة علي صنع وإفراز منتجات محدده أمر مرغوب فيه للغاية ، كما إفراز من المرجح ان تزيد من الغلة وسهوله عمليات التنقية. وهكذا ، سلالات غير المسببة للامراض من الأنواع الأخرى من البكتيريا (علي سبيل المثال ، الأنواع التي تستخدم المزيد من مسارات إفراز) قد توفر بدائل مفيده ل e. كولاي. وقد أبلغنا مؤخرا عن تطور سلاله من الزنجاريه، PGN5 ، حيث الامراضيه وسميه الكائن الحي موهنه للغاية2. والاهم من ذلك ، لا تزال هذه السلالة تنتج كميات كبيره من الجينات السكاريد ، وهو مكون مثير للاهتمام من الناحية التجارية من p. الزنجاريه biofilm.
تم إنشاء سلاله PGN5 باستخدام اجراء تبادل اليليه من خطوتين مع pEX100T البلازميد لحذف بالتتابع خمسه الجينات (توكا، plch، phzm، wapr، aroa) المعروفة للمساهمة في الامراضيه الكائن الحي. تم توليد pEX100T-نؤتي عن طريق تغيير smai إلى موقع التعرف علي الانزيم نؤتي تقييد داخل موقع استنساخ متعددة من pEX100T البلازميد ، والتي وضعت في مختبر هربرت schweizer3،4. موقع الاعتراف لانزيم تقييد نؤتي هو تسلسل الحمض النووي النادرة مقارنه مع SmaI واقل احتمالا ان تكون موجودة في تسلسل يجري استنساخها ، التالي فانه هو أكثر ملاءمة لأغراض الاستنساخ. يحمل البلازميد الجينات التي تسمح للاختيار ، بما في ذلك الجينات bla ، والتي تقوم بترميز ß-lactamase ويمنح المقاومة لكاربينسيلين ، والجينات b. subtilissacb ، الذي يضفي حساسية لالسكروز (الشكل 1ا). كما يحمل البلازميد أصل النسخ المتماثل (ori) متوافق مع e. كولاي، واصل نقل (orit) الذي يسمح لنقل البلازميد من e. كولاي إلى الأنواع الزائفة عن طريق الاقتران. ومع ذلك ، فان البلازميد يفتقر إلى أصل النسخ المتماثل متوافقة مع الزائفة، التالي لا يمكن تكرار داخل الأنواع الزائفة (اي ، هو ناقلات الانتحار الزائفة ). هذه الخصائص تجعل pEX100T-نؤتي مثاليه لاستهداف المحذوفات الوراثية من كروموسوم الزائفة . يتم تنفيذ خطوات الاستنساخ البلازميد باستخدام e. كولاي ويتم نقل البلازميد الناتجة إلى الزائفة عن طريق التحويل أو الاقتران. ثم ، من خلال الاحداث أعاده تجميع المتماثلة والخطوات الانتقائية ، يتم إنشاء الحذف المستهدف في الإطار ، خاليه من العلامات. هذه الطريقة لحذف المناطق الجينية بالتتابع من كروموسوم الزنجاريه يمكن استخدامها لتوليد سلالات الزائفة الموهنة للغاية ، مثل PGN5 ، أو لتصميم سلالات لاستخدامات محدده أخرى (علي سبيل المثال ، سلالات نقص في الكريات الوحيدة النوى لانتشار البلازميد أو سلالات نقص في البرواسات لإنتاج البروتينات من الفائدة).
يتاثر الضراوة العامة لسلالات البكتيريا بظروف النمو والمراحل ، التي تحدث خلالها الطفرات بشكل متكرر. ولذلك ، فان قياس سلامه السلالات المهندسة وراثيا يمكن ان يكون صعبا. لتقييم العزلات البكتيرية لضراوة الجهازية ، ونحن تكييف بروتوكول نشرت سابقا من العدوى بواسطة حقن داخل الC57BL/6 الفئران5. قمنا بتعديل هذا الاجراء لاستخدام المخزونات البكتيرية المجمدة للحقن ، والتي سمحت بالجرعات الدقيقة وسهوله التحقق من السلالات المستخدمة. في هذا النموذج ، تم استخدام BL21 سلاله e. القولونية ، التي تمت الموافقة عليها من قبل أداره الاغذيه والعقاقير لإنتاج biopharmaceuticals ، كمعيار سلامه التحكم لتحديد المرض النسبي لسلاله6،7،8. الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الأسلوب هو انه هو استنساخ ويقلل من مصادر الاختلاف ، كما يتم التحقق من صحة سلالات عدوي لرقم الخلية البكتيرية ، والنمط الظاهري ، وعلامات وراثيه قبل وبعد العدوى. مع هذه الخطوات التي تسيطر عليها ، يتم تقليل عدد الحيوانية المطلوبة. في هذا النموذج, الزنجاريه سلالات التي تؤدي إلى معدلات الوفاات MURINE C57BL/6 مساويه أو اقل من e. كولاي BL21 عند حقن داخل الصفاق يمكن اعتبار الموهن. ويمكن أيضا استخدام هذا النموذج البسيط الماوس للعدوى لتقييم الامراضيه الموهن من سلالات المهندسة وراثيا من الأنواع الأخرى باستخدام سلاله e. القولونية التي وافقت عليها الهيئة كمرجع. الخطوات 1-7 التفاصيل الجيل من الحذف الجينوم متسلسلة في الزنجاريه (الشكل 1) والخطوات 8-12 التفاصيل استخدام نموذج الماوس لاختبار الامراضيه سلالات الزنجاريه .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
قبل البدء في التجارب الحيوانية ، يجب الموافقة علي البروتوكول الذي سيتم استخدامه من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي (IACUC). تم الحصول علي الموافقة علي البروتوكول الموصوف من خلال IACUC في جامعه مارشال (هنتنغتون ، WV ، الولايات الامريكيه).
1. تصميم plasmid
- لتوليد الحذف الجيني باستخدام plasmid pEX100T-نؤتي ، استنساخ المناطق من الحمض النووي الذي يحيط تسلسل الحذف المطلوب وادراجها في موقع تقييد نؤتي من plasmid. يجب ان تحتوي علي ادراج البلازميد حوالي 500 نوكليوديس المنبع من التسلسل المستهدف مباشره المتاخمة لحوالي 500 نوكليوديس المصب من تسلسل الحذف الهدف. بالاضافه إلى ذلك ، يجب ان يحتوي الادراج علي تسلسل التعرف علي نؤتي (GCGGCCGC) في 5 ' و 3 ' نهايات (الشكل 1B).
2. اعداد plasmid
- الخيار 1: استخدام إجراءات الاستنساخ التقليدية. استخدام pcr لتضخيم المناطق الجينية المنبع والمصب من الجينات الفائدة ، تليها كروس بكر9،10 للانضمام إلى شظايا ولدت ، وتقييد الهضم من المنتج pcr و plasmid ، وربط11 (الشكل 1ب ، ج).
- الخيار 2: بعد تصميم تسلسل الحذف في silico ، عقد الشركة التي دي نوفو توليفها لادراجها في البلازميد pEX100T-نؤتي. وقد قامت العديد من الشركات بتبسيط عمليه الاستنساخ بسرعة وكفاءه لتوليد البلازما للفائدة. بالاضافه إلى ذلك ، تسلسل التحقق من البلازميدات ان تكون خاليه من الطفرة قبل التسليم.
3. e. القولونية التحول
- تحويل الكهربائية e. القولونية مع البلازميد وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. باستخدام حلقه التلقيح معقمه ، خط 10 μL من رد فعل التحول لمستعمرات معزولة علي لوحه أجار المرق (LB) التي تم تسخينها مسبقا مع 100 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين واحتضانها بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
ملاحظه: يجب معالجه جميع المعدات ووسائل الاعلام المستخدمة في البكتيريا الثقافية وفقا لإرشادات السلامة الخاصة بالمؤسسة. - المرور مرتين.
- أزاله لوحه من الحاضنة وتحديد مستعمره معزولة. باستخدام حلقه التلقيح العقيمة ، والتقاط المستعمرة والمتتالية لوحه أجار رطل ما قبل الإحماء تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين لمستعمرات معزولة. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية. كرر هذه الخطوة مره أخرى لإنشاء ثقافة خالصه.
- باستخدام حلقه التلقيح معقمه ، تطعيم 5 مل من LB مع مستعمره واحده من لوحه أجار النهائي. وضع الثقافة في حاضنه الاهتزاز في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. في اليوم التالي, مزيج 1 مل من هذه الثقافة مع 1 مل من 5% في كريوفيال وتخزين في-80 درجه مئوية لتوليد مخزون المجمدة من سلاله.
4. اعداد السلالة البكتيرية والاقتران ثلاثي الوالدين
- استخدام مستعمره واحده معزولة من لوحات أجار من سلالات التالية لتطعيم الثقافات مرق ومكان في حاضنه الاهتزاز بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- أضافه كولاي PEX100T-نؤتي إلى 5 مل من LB تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين.
- أضافه الزنجاريه سلاله PAO1 إلى 5 مل من الزائفة العزلة الحساء (pib).
- أضافه كولاي prk2013 إلى 5 مل من LB تستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين.
ملاحظه: prk2013 البلازميد هو البلازميد المساعد الذي يتطابق في e. كولاي ولكن لا الزنجاريه; فانه يحمل الجينات نقل عبر التمثيل التي تحشد pEX100T-نؤتي البلازميد من المتبرع e. كولاي إلى الزنجاريه المتلقي ف 12. الزنجاريه هو الممرض علي مستوي السلامة البيولوجية 2 (BSL-2). يرجى اتباع المبادئ التوجيهية للمؤسسة للسلامة عند العمل مع الكائنات BSL-2.
- في اليوم التالي, أزاله الثقافات بين عشيه وضحيها من الحاضنة وأضافه 0.5 mL من كل ثقافة إلى 1.5 mL أنبوب ميكروطارد للطرد المركزي. جهاز الطرد المركزي في 6,000 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وتعليق بيليه الخلية في 50-100 μl من LB.
- ماصه تعليق الخلية بأكمله في قطره واحده علي لوحه أجار رطلا قبل التسخين. السماح للقطيره لتجف. ثم عكس لوحه واحتضان في 37 درجه مئوية ل 4-6 h.
- بعد الحضانة ، استخدم حلقه تلقيح معقمه لجمع الخلايا في 1 مل من LB في أنبوب الطرد المركزي. ماصه صعودا وهبوطا لخلط الخلايا.
- باستخدام موزع الخلية ، والخلايا المتتالية بالتساوي علي الجافة قبل الحرارة الزائفة العزل أجار (PIA) لوحه تستكمل مع 300 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين. لوحات متعددة متتالية مع زيادة حجم خليط الخلية (علي سبيل المثال ، 10 μL ، 100 μL ، 500 μL). احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
5. الكشف عن واحده-كروس ريكومبينانتس من الزنجاريه
- أزاله لوحات من الحاضنة وتفتيش لمستعمرات معزولة carbenicillin مقاومه. لأنه لا يمكن نسخ البلازميد pEX100T نؤتي في الزنجاريه، يجب ان تكون المستعمرات التي نمت علي لوحات المكملة carbenicillin نشات من الخلايا التي تم دمج البلازميد في الكروموسوم.
- اختيار ما لا يقل عن 4 من هذه المستعمرات وخط للعزل علي لوحات الحرارة المسبقة من PIA تستكمل مع 300 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين. احتضان لوحات بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- أزاله لوحات من الحاضنة وتفتيش للنمو. يجب ان تكون مستعمرات مقاومه الكاربينيسيلين أحاديه التقاطع ريكومبينانتس (اي انها قد أدمجت البلازما في الكروموسوم عبر حدث معاد تركيبه بين منطقه متجانسة من ادراج البلازميد والكروموسوم الزنجاريه) ().
- التصحيح 8 أو أكثر من المستعمرات مع المسواك العقيمة علي لوحات الحرارة المسبقة من: 1) PIA تستكمل مع 300 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين و 2) PIA تستكمل مع 300 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين و 10 ٪ السكروز (بدون الجلسرين).
- إذا لم يتم الحصول علي نمو مستعمره من الخطوة 5.1 ، كرر الاقتران وزيادة حجم خليط الخلايا التي يشوبها في الخطوة 4.5. إذا حدث الكثير من النمو ، وتكرار الاقتران وانخفاض مستوي الصوت.
- إذا فشلت الاقتران مرارا وتكرارا ، واعداد الخلايا الكهربائية من الزنجاريه سلاله وتحويل مباشره مع Plasmid pEX100T نؤتي. البروتوكولات التفصيلية لاعداد الزنجاريه الكهربائية والتحول متاحه في مكان آخر13,14.
- احتضان لوحات في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- أزاله لوحات من الحاضنة وتفتيش للنمو. صحيح واحد-كروس ريكومبينانتس سوف يكون كاربينيسيلين-المقاوم والحساسة السكروز (اي, المستعمرات التي نمت علي بيا تستكمل مع كاربينسيلين, ولكن لم تنمو علي بيا تستكمل مع كاربينسيلين والسكروز).
- اختيار 4 أو أكثر حقيقية واحده كروس ريكومبينانتس وتطعيم كل إلى 5 مل من LB دون تحديد. احتضان في حاضنه تهتز في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- إذا لم يتم الكشف عن ريكومبينانتس كروس واحد ، كرر الاقتران.
6. الكشف عن المزدوج-كروس ريكومبينانتس من الزنجاريه
- لكل ثقافة مرق ، تطعيم 10 μL من الثقافة علي لوحه الحرارة المسبقة من PIA تستكمل مع السكروز 10 ٪ (بدون الجلسرين) وخط لمستعمرات معزولة. احتضان لوحات بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- في اليوم التالي ، وأزاله لوحات من الحاضنة وتفتيشها للنمو. يجب ان تكون المستعمرات المقاومة للسكروز مزدوجة كروس ريكومبينانتس (اي أزاله البلازميد من الكروموسوم عبر حدث أعاده دمج بين المنطقة المتماثلة الأخرى من ادراج البلازميد والكروموسوم الزنجاريه ).
- التصحيح علي الأقل 20 مستعمرات مع المسواك المعقمة علي لوحات الحرارة المسبقة من: 1) PIA ، 2) PIA تستكمل مع السكروز 10 ٪ (بدون الجلسرين) ، و 3) بيا تستكمل مع 300 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين.
- احتضان لوحات بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- أزاله لوحات من الحاضنة وفحصها للنمو. صحيح مزدوجة كروس ريكومبينانتس ستكون حساسة كاربينسيلين ومقاومه السكروز (اي ، المستعمرات التي نمت علي PIA و PIA تستكمل مع السكروز ، ولكن لم تنمو علي بيا تستكمل مع كاربينسيلين).
7. تاكيد الحذف الجيني عن طريق مستعمره PCR
- اعداد 10-20 المستعمرات لشاشه الحذف مع PCR.
- التقاط النمو من يشتبه مزدوجة كروس المؤتلف مع مسواك معقمه وتعليق الخلايا في 50 μL من 1x الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني). يغلي تعليق في 100 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، الطرد المركزي لمده 3 دقائق في 13,000 x g، ومن ثم وضع علي الجليد.
- قم باجراء PCR لفحص المستعمرات للحذف المستهدف.
- استخدام 1 μl من ماده طافي كقالب في رد فعل PCR 25 μl لتاكيد حذف جين الفائدة.
- استخدم الإشعال الخاص بالجينات الذي يضخم المنطقة من الحذف الجيني. استخدام الإشعال التي تضخيم المنطقة من الحذف الجينوم بالاضافه إلى 100-200 bp من التطويق المنبع وتسلسل المصب.
- اعداد رد فعل PCR تحكم منفصلة مع سلاله الام (علي سبيل المثال ، PAO1).
ملاحظه: سوف تختلف الظروف ثيرموسيكلير اعتمادا علي درجه الحرارة الأمثل الصلب لأزواج التمهيدي ، وكوكتيل البلمره المستخدمة ، وطول المنطقة التي سيتم تضخيمها.
- أداء اجبرز هلام الكهربائي علي منتجات PCR. والمستعمرات التي تم فيها حذف منطقه الاهتمام تنتج منتجات تضخيم أصغر من المستعمرات التي تفتقر إلى الحذف (الشكل 2).
- اختر واحده أو أكثر من المستعمرات مع الحذف المؤكد PCR. خط لمستعمرات معزولة علي لوحه (ق) الحرارة المسبقة واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- المرور مره واحده علي الأقل. أزاله لوحه (ق) من الحاضنة وتحديد مستعمره معزولة. باستخدام حلقه التلقيح معقمه ، والتقاط المستعمرة وخط لوحه أجار الحرارة قبل الإحماء لمستعمرات معزولة. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- اختيار مستعمره من كل لوحه النهائي واستخدامها لتطعيم 5 مل من PIB. مكان في حاضنه تهتز في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- اخلط 1 مل من هذه الثقافة مع 1 مل من الحليب الخالي من الدسم 5 ٪ في كريوفيال وتخزين في-80 درجه مئوية لتوليد مخزون من السلالة.
- باستخدام هذه الثقافة ، واعداد الحمض النووي الجينوم من سلاله (علي سبيل المثال ، باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي). تضخيم منطقه الحذف الجيني باستخدام PCR والإشعال الخاصة بمنطقه الاهتمام.
- تنقيه هذه المنتجات PCR (علي سبيل المثال ، مع مجموعه تنقيه الحمض النووي ، أو استخراج كلوروفورم الفينول) واما تسلسل مباشره مع الإشعال الجينات الخاصة أو ligated إلى ناقل للتسلسل مع الإشعال الخاصة بالبلازما.
- بعد تاكيد الحذف الجيني من خلال التسلسل ، كرر هذا الاجراء مع سلاله الحذف الجديدة لتوليد بالتتابع العديد من الحذف الجيني خاليه من علامة. عند توليد السلالة المطلوبة ، استخدم تسلسل الجينوم الكامل للتحقق من الحذف المستهدف وللكشف عن التغييرات الأخرى في الجينوم (مقارنه بالسلالة المرجعية ، علي سبيل المثال ، PAO1) التي حدثت طوال العملية. بعد توضيحي الجينات ، إيداع التسلسل إلى GenBank وتسجيل أرقام الانضمام.
8. اعداد السلالة البكتيرية لاختبار الحيوانية
- لاختبار للامراضيه الموهن من الزنجاريه سلالات ، أولا اعداد الثقافات المصادق عليها والأسهم. اعداد سلالات الزنجاريه من الفائدة ، سلاله البرية من نوع الزنجاريه (خبيث) ، وسلاله التي وافقت عليها أداره الاغذيه والعقاقير من e. القولونية (علي سبيل المثال ، BL21) لتكون بمثابه مراقبه السلامة غير المسببة للامراض.
- خط سلالات البكتيريا التي يتم اختبارها علي أجار انتقائية من المخزونات المجمدة المتسلسلة والمصادق عليها. احتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- مع حلقه تلقيح معقمه ، والتقاط مستعمره واحده من كل سلاله وخط لمستعمرات معزولة علي وسائل الاعلام الانتقائية مره أخرى. احتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- أزاله لوحات من الحاضنة. لكل سلاله ، واختيار مستعمره واحده وخط للعزل علي لوحات LB.
- بعد 24 ساعة من النمو في 37 درجه مئوية ، تطعيم قارورة 500 mL التي تحتوي علي 250 مل من LB مع مستعمره واحده عزل من كل سلاله.
- خطوه التحقق من الصحة: استخدام بقايا المستعمرة نفسها ، والتحقق من صحة السلالة باستخدام PCR وسلاله محدده الإشعال ، و/أو الإشعال للتحقق من وجود التعديلات الجينية التي أجريت علي السلالة. استخدم الإشعال أدناه للتحقق من السلالات في المثال المقدم:
E. كولاي BL21:
T7 البوليميريز F:TGGCTATCTAATGTCTTACG
T7 البوليميريز R:TTACGCGAACGCGAAGTCC
VE2 و PGN5:
Aroa F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAاغاجاجي
Aroa R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC
- خطوه التحقق من الصحة: استخدام بقايا المستعمرة نفسها ، والتحقق من صحة السلالة باستخدام PCR وسلاله محدده الإشعال ، و/أو الإشعال للتحقق من وجود التعديلات الجينية التي أجريت علي السلالة. استخدم الإشعال أدناه للتحقق من السلالات في المثال المقدم:
- احتضان الثقافات في حاضنه تهتز في 160 دوره في الدقيقة و 37 درجه مئوية حتى تصل إلى نمو مرحله السجل (اي OD600 قياس 0.4-0.6 علي مقياس طيفي).
- باستخدام OD600 القيمة التي تم الحصول عليها عندما تم تحقيق مرحله التسجيل ، وحساب حجم المرق المطلوبة لإنتاج 2.5x 10 مستعمره تشكيل وحدات (كفو) لكل مل. بيليه حجم مرق محسوبة في أنابيب 50 mL في 4,500 x g لمده 10 دقيقه.
- تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في أنبوب واحد باستخدام 50 mL من 1x تلفزيوني لغسل الخلايا. الطرد المركزي مره أخرى في 4,500 x g لمده 10 دقيقه.
- تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 25 مل من الحليب الخالي من الدسم 5 ٪ في 1x تلفزيوني.
- خطوه التحقق من الصحة: استخدام عينه من أعاده التعليق 25 مل لتنفيذ التهم لوحه قابله للتطبيق لتحديد عدد كفو/mL.
- Aliquot و 25 مل الخالي من الدسم ثقافة الحليب أعاده التعليق إلى 2 الأسهم الثقافة مل في 2 مل تخزن. فلاش تجميد في النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية علي الأقل بين عشيه وضحيها قبل الاستخدام.
9. التحقق من النمو وسلاله من المخزونات المخزنة لاختبار الحيوانية.
- لكل سلاله ليتم اختبارها ، وأزاله ما لا يقل عن 3 تخزن من المخزونات المجمدة من-80 درجه مئوية التخزين وذوبان الجليد في 4 درجه مئوية ل 2-4 h. إذا بقي اي مخزون المجمدة ، دافئه لفتره وجيزة في 37 درجه مئوية.
- خذ عينات صغيره من كل كريوفيال للتحقق من صحة كل سلاله.
- تنفيذ التهم لوحه قابله للتطبيق لتحديد عدد كفو/mL. فمن الطبيعي ان يكون عدد اقل من CFU/مل بعد التجمد ، وذلك بسبب وفاه بعض الخلايا البكتيرية.
- استخدام PCR وسلاله محدده الإشعال للتحقق من صحة كل سلاله.
- خط كل سلاله علي وسائل الاعلام الانتقائية للتحقق من النمط الظاهري.
- بعد التاكد من ان سلالات هي من النمط الجيني الصحيح والنمط الظاهري ، والتحقق من CFU/مل ، والمضي قدما في اختبار الحيوانية.
10. تلقيح الماشية مع سلالات بكتيرية عن طريق الحقن
- في صباح الحقن ، وأزاله تخزن من سلالات بكتيرية يجري اختبارها وذوبان الجليد في 4 درجه مئوية ل 3-4 h. ذوبان 0.5 mL لكل الماوس التي سيتم حقنها. الحفاظ علي قوارير علي الجليد بعد ذوبان وحقن الفئران في غضون 2 ساعة.
- بعد الذوبان ، نقل كل كريوفيال إلى أنبوب 2 مل جديده والطرد المركزي في 4,500 x g لمده 10 دقيقه ، وتجاهل supernatant ، وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من 1X تلفزيوني.
- أجهزه الطرد المركزي مره أخرى في 4,500 x g ل 10 م. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق بيليه في 1x تلفزيوني إلى تركيز نهائي 2.5 x 109 CFU/مل. لتحديد كميه 1x تلفزيوني اللازمة لأعاده التعليق ، استخدم البيانات كفو/mL التي تم الحصول عليها من التهم لوحه قابله للحياة علي المخزونات المجمدة في الخطوة 2.2.1. فان المبلغ الدقيق لل 1x تلفزيوني المستخدمة تختلف قليلا بين سلالات.
- خذ 3 عينات من التعليق النهائي لكل سلاله للتحقق من صحة كفو/mL ، والنمط الجيني ، والنمط الظاهري كما هو موضح أعلاه.
- لكل سلاله ، قسامه 1.5 ml من تعليق تلفزيوني/خليه في أنبوب واحد 2 مل لكل 5 فئران للحد من عدد المرات التي يتم فيها إدخال الأنبوب. أيضا ، واعداد أنابيب 1x تلفزيوني لحقن السيطرة.
- جمع الفئران (10 الذكور و 10 الإناث C57BL/6 لكل مجموعه لهذه التجربة) والمواد اللازمة للحقن (المحاقن والابر والحاويات القرش ، وعلامات ، والقلم والورق ،وما إلى ذلك). الانتقال إلى غرفه الجراحة الحيوانية المعقمة. امسح جميع الأسطح بمناديل معقمه.
- للقضاء علي الكرب وخطر الاصابه بالمجرب ، فقط إحضار جنس واحد ومجموعه تجريبية من الفئران إلى غرفه العمليات الجراحية في وقت (علي سبيل المثال ، مجموعه من 10 ذكور الفئران للاصابه بسلاله معينه). ارتداء اثنين من أزواج من قفازات اللاتكس للقضاء علي ثقب من القفازات إذا عض. ارتداء معطف المختبر ، نظارات السلامة ، وقناع الوجه لتجنب التلوث.
- بدء الحقن من مجموعه التحكم مع 1x تلفزيوني. وهذا سيتاكد مما إذا كانت اي اثار ضاره تنتج عن الحقن وحدها.
- أزاله الماوس من القفص. قم بازاله ماوس واحد فقط في كل مره.
- تزن الماوس وعلامة ذيله مع علامة دائمة لتتبع لفقدان الوزن بعد الحقن.
- فتح حقنه جديده 1 مل و 27 G ابره (استخدام حقنه جديده وابره لكل الماوس للقضاء علي التلوث) وحقن 200 μL من العقيمة 1x تلفزيوني.
- الاستيلاء علي الماوس وراء أذانها باستخدام الإبهام والسبابة. قرصه لخلق اضعاف الجلد في مؤخر الرقبة لعقد علي-اضعاف أكثر صرامة يقلل من حركه الرقبة وخطر التعرض للعض اثناء الحقن. الذيل الأمن في النخيل باستخدام الخنصر لعقد الماوس شقه مع حركه قليله.
- تحويل الماوس فوق وادراج ابره في زاوية 30 درجه في التجويف البريتوني إلى الجانب الأيسر أو الأيمن من خط الوسط. رفع الابره قليلا مره واحده ادراجها لضمان ادراجها في منطقه داخل الصفاق وليس في الأعضاء. ببطء حقن التلفزيونية ومن ثم سحب الابره.
- ضع الابره المستخدمة في حاويه المخاطر البيولوجية المعينة. لا تعيد استخدام الحقنه أو الابره. A البلعه في موقع الحقن هو نموذجي.
- بعد الحقن ، وتحريك الماوس إلى قفص منفصل.
- كرر الاجراء مع الماوس التالي. بعد ان يتم حقن جميع الفئران من قفص واحد ، اعادتهم إلى قفصهم الأصلي علي الفور.
- بعد حقن مجموعه التحكم, بدء حقن التعليق من سلالات ليتم اختبارها بعد نفس الاجراء.
- حقن 200 μL من تعليق الخلية. عندما تبدا مع تعليق الخلية من 2.5 x 109 كفو/مل ، يتلقى كل ماوس 5 × 108 كفو.
ملاحظه: تم تحسين هذه التركيزات مع البحوث الاوليه للحيوانات لتحديد جرعات مميته من كل سلاله. قد تحتاج إلى تعديل الجرعات لسلالات أخرى/الأنواع.
- حقن 200 μL من تعليق الخلية. عندما تبدا مع تعليق الخلية من 2.5 x 109 كفو/مل ، يتلقى كل ماوس 5 × 108 كفو.
- مره واحده جميع الحقن كامله ، والعودة الفئران إلى غرفه السكن للتخفيف من حده الضائقة. منطقه عمل نظيفه مع مناديل معقمه.
- مراقبه الماشية للوفيات بعد الحقن عن طريق التحقق من أقفاص للفئران الموتى كل 3 ح ل 72 h وكل 12 ساعة لمده 10 أيام. تسجيل وزن الفئران كل 12 ح لتحديد فقدان الوزن بسبب المرض.
- سجل السلوك السلبي في الساعات التالية للحقن ، مثل الاختلاف في الموقف ، وعدم الاستمالة أو التجشؤ ، أو الجمود ، أو التغيرات في التنفس. سوف الفئران التي وفاه من الاصابه المرتبطة بالحقن تظهر السلوك السلبي ويموت بسرعة بعد الحقن. من ناحية أخرى ، فان الفئران التي وفاه من العدوى لن تبدا في إظهار السلوك السلبي أو الموت حتى بعد 18 ساعة. اي الفئران التي لا تظهر السلوك السلبي أو علامات واسعه من الاعتلال بما في ذلك التنفس السريع أو الكادح ، والجمود ، والموقف منحني ، والعينين الغارقة ، والجفاف الشديد ، أو غيرها ينبغي ان رحيم للحد من المعاناة لا لزوم لها (كما تمتثل لدينا بروتوكولات IACUC المعتمدة). ومع ذلك ، في تجاربنا ، لم يكن مطلوبا يوثانيزيشن لأي الفئران اثناء التجربة. وكانت الفئران الناجية رحيم 10 أيام بعد الانتهاء من الاختبار.
- بعد فتره الرصد لمده 10 أيام ، والسماح للحيوانات المتبقية للتعافي تماما وتصبح واضحة من اي عدوي تدار اثناء الاختبار. موت ببطء الحيوانية بعد اجراء IACUC.
11-التحليل الإحصائي للوفيات الحيوانية
- اجراء تحليل إحصائي باستخدام برامج الرسوم البيانية. اي برنامج قادر علي إنتاج الرسوم البيانية وأداء التحليل الإحصائي مناسب.
- لرسم بيانات الوفاات ، استخدم العمود X لتمثيل الوقت (h) والعمود Y لتمثيل المجموعات التي تم اختبارها.
- تمثيل كل الماوس أو الموضوع في الدراسة باستخدام التعليمات البرمجية = 0 (صفر) أو رمز = 1 ، مما يدل علي البقاء علي قيد الحياة أو الموت ، علي التوالي.
- لكل الحيوانية التي يموت ، ووضع 1 في العمود Y من تلك المجموعة في وقت الوفاة علي العمود X. إذا كان هناك عده وفيات في نقطه زمنيه واحده داخل مجموعه ، يمكن وضع نسخه من تلك النقطة الزمنيه في العمود X. علي سبيل المثال ، إذا كان ثلاثه مواضيع داخل مجموعه يموت في 3 ح ، سوف تظهر نقطه الوقت 3 h ثلاث مرات في العمود X.
- بالنسبة لجميع الكائنات الحية داخل مجموعه ، ضع صفرا في العمود Y عند قياس النقطة الزمنيه النهائية. علي سبيل المثال ، إذا كانت أربعه الفئران البقاء علي قيد الحياة ، وضع أربع نقاط وقت النهاية في العمود X التي تم وضع علامة مع أربعه أصفار في العمود ص.
- بعد إدخال البيانات الحيوانية لجميع المجموعات ، استخدم قالب رسم بياني للبقاء علي قيد الحياة لإنتاج رسم بياني للبقاء علي قيد الحياة.
- اترك الترميز الافتراضي ك 0 و 1.
- تعيين المعلمات للرسم البياني كنسبه مئوية.
- بمجرد تحديد المعلمات لمنحني البقاء علي قيد الحياة ، وتنفيذ التحليل الإحصائي باستخدام رف-كوكس (سجل رتبه) اختبار.
- تنسيق مؤامرات كابلان-ماير باستخدام البيانات الاحصائيه.
ملاحظه: السلالات التي تظهر معدلات الوفاات التي هي اقل من أو مساويه لسلاله الام وسلاله المعتمدة من قبل هيئه الاغذيه والعقاقير (علي سبيل المثال ، e. كولاي BL21) يمكن اعتبار الموهن.
12. تصور العدوى مع التلالؤ الإحيائي
- لتصور التقدم المحرز في العدوى ، ادراج operon الكروموسومات البيولوجية (Luxcdabe) في PGN5 و VE2 سلاله اختبارها. تم تطوير البلازميدات والبروتوكول المستخدم لتسميه هذه السلالات في مختبر Schweizer وقد لا تكون متوافقة مع جميع الأنواع/سلالات من البكتيريا13. الأهم من ذلك ، التصور للعدوى هو اختياري. التالي ، الادراج الجينوم من هذا operon ليست ضرورية لتنفيذ دراسة الوفاات الموصوفة أعلاه.
- اعداد السلالات والتحقق من صحتها باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه. بالاضافه إلى ذلك ، تحقق من التالق الإحيائي في سلالات المسمية في كل خطوه التحقق من الصحة.
- بعد اعداد سلالات ، حقن الماشية في مجموعات من 10 مع سلالات البيولوجية الهادئة بعد الخطوات المذكورة أعلاه.
- صوره للحيوانات كل 3 ساعات لمده 24 ساعة باستخدام نظام تصوير حيواني قادر علي التالق البيولوجي.
- أولا اعداد تصوير من خلال وضع المعلمات الكاميرا وتسخين المسرح للحيوانات. أيضا تعيين تدفق الأكسجين إلى 1.5 L لكل دقيقه (أو توصيات الشركة المصنعة التالية).
- بعد التصوير واستقرت المرحلة ، ووضع الماوس واحد في غرفه التخدير مباشره بعد الحقن وأداره 3.5 ٪ ايزوفلوراني في الغرفة مع O2 تدفق لمده 4 دقائق. قد تختلف أساليب التخدير تبعا للغرفة و/أو عامل التخدير المستخدم. اتبع توصيات الشركة المصنعة. تحديد التخدير السليم عن طريق اختبار منعكس الانسحاب.
- تحريك الماوس إلى درجه الحرارة استقرت المرحلة. وضع الماوس علي ظهره مع الذراعين ممدوده وتناسب الماوس مع مخروط الأنف لأداره 2.5 ٪ ايزوفلوان في جميع انحاء الاجراء التصوير.
- إغلاق الباب واتخاذ الصور البيولوجية الهادئة والاشعه السينية للماوس.
- عند اكتمال التصوير ، أعد الماوس إلى قفصه وراقبه. يجب ان يستعيد الماوس وعيه في غضون 3-5 دقيقه.
- الاستمرار في صوره الفئران كل 3 ح ل 24 ساعة ، في كل مره باستخدام ماوس مختلفه من كل مجموعه. لا أعاده صوره الماوس في غضون 24 ساعة بسبب امكانيه الآثار السلبية بسبب أعاده التعرض للتخدير. وينبغي ان الماوس واحد فقط تلقي جرعه واحده من التخدير كل 24-36 h. تنظيف منصة التصوير بعد كل الماوس هو imaged. قم بإيقاف تشغيل التصوير بين النقاط الزمنيه للتصوير.
ملاحظه: التلالؤ الإحيائي سوف تتلاشي ، بغض الانتباه عن السلالة التي تم حقنها. وسوف تختلف كثافة وطول العمر من التالق الإحيائي اعتمادا علي العديد من العوامل ، بما في ذلك عدد من البكتيريا حقن ، سلاله الماوس ، سلاله بكتيرية ، الخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكما هو مبين في الشكل 2، يمكن تاكيد الحذف الجيني المستهدف باستخدام المستعمرة PCR مع الإشعال المحددة التي تضخم منطقه الاهتمام. المستعمرات التي تحمل الحذف الجيني سوف تسفر عن حجم الفرقة PCR أقصر بالمقارنة مع المستعمرات من النوع البري. وعاده ما تكون الشاشة PCR من مستعمرات 10-12 كافيه للكشف عن مستعمره واحده علي الأقل تحمل الحذف المستهدف. في حاله عدم الكشف عن الحذف بعد عده جولات من الشاشات ، كرر الاجراء الذي يبدا بالاقتران. إذا كان الحذف لا يزال يفشل ، ادراج البلازميد قد تحتاج إلى تاكيد من خلال التسلسل ، أعاده تصميم ، أو الحذف قد تكون مميته. عند التحقق من حذف الجينات عبر PCR ، تاكيد الحذف من خلال التسلسل. وقد تخضع السلالة الناتجة لهذا الاجراء بشكل متكرر لتوليد تعديلات جينيه متسلسلة.
وكما هو مبين في الشكل 3، كانت الوفاات المرتبطة بالحقن داخل الصفاق من السلالة الموهنة من الزنجاريه PGN5 (+ muce) 0 ٪ ، وهو ما يعادل الوفاات التي لوحظت مع e. كولاي BL21. من ناحية أخرى ، كان الحقن داخل الصفاق من سلاله الام (VE2) قاتله إلى 80 ٪ من الفئران. تم الحصول علي هذه النتائج مع خطوات واسعه للتحقق من صحة السلالات التي تم حقنها. في حين ان السبب الدقيق للوفاة في هذه الفئران غير معروف ، يمكن ان يعزي علي الأقل في جزء منه إلى التعبير عن عوامل الضراوة في سلاله الام التي تم حذفها من سلاله PGN5 الموهن. وتم تتبع الاختلافات في تطور العدوى باستخدام الام التي تحمل علامة التلالؤ الإحيائي والسلالات الموهنة. وظلت السلالة الموهنة مترجمه في موقع الحقن حتى تلاشي التلالؤ الإحيائي (الشكل 4). وتزامنت أزاله العدوى علي الأرجح مع تلاشي التلالؤ الإحيائي. لم يتم الكشف عن التلالؤ 24 ح بعد الحقن والفئران عاش لأسابيع بعد الحقن حتى التضحية ، مع عدم وجود اثار سلبيه لاحظت.
الشكل 1: توليد الجينات المحذوفة في الزنجاريه مع PEX100T-نؤتي. (ا) خريطة PEX100T-نؤتي plasmid. (ب) توليد بناء يتالف من مناطق مباشره في المنبع (الأصفر) ومصب (ازرق) لمنطقه الاهتمام (ROI) ، محاطه بمواقع التعرف علي الانزيمات المقيدة لنؤتي. أولا ، PCR-تضخيم المنبع ومناطق المصب بشكل مستقل مع الإشعال المحددة التي تضيف 5 ' نؤتي الهضم المواقع (علي سبيل المثال ، نؤتي-aroa F الدفاع الذاتي والنؤتي-AROA R GCGGCCGGTTGTCTGTT الاتحاد الإنجليزي الكتروني والبحث والتطوير والتصوير المقطعي و 3 ' المناطق المتماثلة المتداخلة كما هو مبين (علي سبيل المثال ، Aroa-كروس ف CTCCAGGCTGCAGGTGCT.Gكاتجكتاكككتاجججكباال# لغة الانجليزيه و aroa-كروس ار TGTTCTCCACGGCTGTCAGTGACCAGCكاتجتكاككتاكجكبككتاكتكغككتاككوكتوكتاتجيتكاتجي. ثم ، استخدم PCR التي تحتوي علي ويثنوتي الإشعال للانضمام إلى المنبع والمصب المنتجات المتولدة في رد فعل PCR الاولي. (ج) PEX100T-نؤتي plasmid ، مسلحه وجاهزه. Ligate المنتج نؤتي الصليب أكثر من PCR في plasmid نؤتي هضمها. (د) مخطط انسيابي لعمليه حذف المناطق الجينية من كروموسوم الزنجاريه باستخدام plasmid pEX100T نؤتي. بعد تاكيد الحذف المطلوب وتنقيته ، يمكن ان تؤخذ السلالة الناتجة من خلال الاجراء مرارا وتكرارا لحذف المناطق الجينية الأخرى من الكروموسوم. عندما يتم الحصول علي السلالة المطلوبة ، تسلسل الجينوم كله لتاكيد الحذف وغيرها من التغييرات علي الكروموسوم. ويمكن بعد ذلك اختبار الامراضيه السلالة في الفئران باستخدام الاجراء المبين في الجزء الثاني من البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: هلام الكهربائي من المنتجات المستعمرة PCR من شاشه لحذف Aroa لتوليد الزنجاريه سلاله الموهن ، PGN5. مستعمره PCR المنتجات التي تعمل في الممرات 2-5 و 8-11 تشير المستعمرات مع Aroaالبرية من نوع. مستعمره [بكر] منتوجات يركض في ممرات 6 و 7 حملت ال [ ارو ] مورثه حذف, يشار بالصغير [بكر] منتوج ([استروركس] صفراء). الإشعال المستخدمة علي وجه التحديد تضخيم المنطقة الجينوم التي تحتوي علي جين aroa : aroa-F: GCGAACGAACAGCCGATAAGGCARFC ، واروا-R: اتكتغكتاكككتجكبجغكك. وكان حجم المنتج PCR المتوقع في المستعمرات من النوع البري 2,548 النيوبوتيديس (nt). وكان حجم المنتج PCR المتوقع في مستعمرات مع الحذف Aroa 307 nt. تم تشغيل سلم الحمض النووي في الممرات 1 و 12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الوفاات الاجماليه للفئران المحقونة بسلاله الزنجاريه المسببة للامراض (VE2) ، والموهنة الزنجاريه سلاله (PGN5 + muce) ، وسيطرة أداره الاغذيه والعقاقير e. القولونية سلاله (BL21). فقط الفئران حقن مع سلاله الام المسببة للامراض أظهرت الوفاات عند 80 ٪. الموهن الزنجاريه سلاله و أداره الاغذيه والعقاقير السيطرة e. القولونية سلاله أظهرت 0 ٪ من الوفاات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صوره الماوس 3 ح بعد الحقن من سلاله موهنه من الزنجاريه PGN5 + muce تحمل علامة البيولوجية الهادئة. وكانت البكتيريا البيولوجية قابله للكشف حتى 18-24 h بعد الحقن. خلال هذه الفترة ، ظلت التلالؤ الإحيائي في موقع الحقن مما يشير إلى ان البكتيريا بقيت مترجمه إلى موقع الحقن. هذا الماوس تعافي تماما مع اي اثار سلبيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PEX100T-Not1 البلازميد هو وسيط فعال لحذف الجينوم المتسلسلة التي هي خاليه من العلامات وفي الإطار. عند هندسه سلالات بكتيرية لضراوة موهنه ، فان حذف متواليات الجينات بأكملها بدلا من توليد طفرات النقطة يقلل من احتماليه الارتداد إلى النمط الظاهري الخبيث. بالاضافه إلى ذلك ، كل حذف الجينات الامراضيه يخفف الممرض أكثر من ذلك ، مما يعزز استقرار التوهين.
ويمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لتوليد التعديلات الجينية غير المحذوفات ، مثل الطفرات نقطه والادراج ، وذلك ببساطه عن طريق تعديل تصميم ادراج البلازميد. هذه الأنواع من التعديلات قد تكون أكثر فائده من حذف الجينات بأكملها للبكتيريا الهندسية مع معدل الأيض ، علي سبيل المثال. وللتعديلات الجينية المتسلسلة إمكانات كبيره لتوليد سلالات بكتيرية مصممه لتلائم أغراضا محدده في مجالي البحوث والصناعة. وقد وصفت طرق أخرى لتوليد المطلوب التعديلات الجينية خاليه من علامة في البكتيريا15,16,17,18. وكما هو الأمر بالنسبة لجميع أساليب تحرير الجينوم ، قد تكون محاولات التعديل علي المناطق الجينية الاساسيه مميته ، التالي غير ناجحه. في هذه الحالات ، يلزم تحديد التعديلات الجينية المختلفة أو الجينات المرشحة الأخرى لتوليد سلاله بكتيرية من الفائدة.
بالنظر إلى العديد من احداث النسخ المتماثل والمقاطع من كل مستعمره في جميع انحاء هذا البروتوكول ، ستحدث تغييرات غير مقصوده في الجينوم إلى السلالة المتولدة. ويمكن تحديد التغييرات الجينية الدقيقة من خلال تسلسل الجينوم الكامل. ومع ذلك ، من الصعب تحديد تاثير هذه التغييرات. عندما البكتيريا الهندسية لغرض معين ، التغييرات الجينية التي لا تؤثر سلبا علي نمو الكائن الحي أو المسار (ق) المستهدفة هي مقبوله. ورهنا بالسلالة المتولدة ، قد يكون من الممكن تحديد "قراءات" للتاكد من ان السلالة لا تزال مفيده للغرض المقصود منها. علي سبيل المثال ، مع PGN5 ، كان الهدف هو خلق سلاله موهنه التي احتفظت بالقدرة علي إنتاج كميات كبيره من الجينات. بعد حذف خمسه الامراضيه الجينات ، تم قياس كميه وتكوين الجينات التي تنتجها PGN5 ومصممه لتكون قابله للمقارنة مع غيرها من السلالات المنتجة للجينات. التالي ، لم يتاثر إنتاج الجينات بالخمسة المحذوفة من الجينات ، ولا بالتغيرات الجينية غير المقصودة التي حدثت اثناء تطور PGN5.
وقد استخدم نموذج من حقن الماوس داخل الصفاق لتحديد ما إذا كان الموهن سلاله المهندسة بالمقارنة مع سلاله الام و e. القولونية BL21, سلاله التي وافقت عليها FDA لإنتاج biopharmaceuticals. وكانت أهم الخطوات المتخذة خلال هذا الاجراء اختبار الحيوانية اعداد والتحقق من المخزونات البكتيرية المجمدة. اعداد واستخدام الثقافات البكتيرية المجمدة لحقن الفئران هو الأفضل لاستخدام الثقافة المستمرة ، كما انه يقلل من عدد الطفرات التي تحدث بطبيعة الحال في السكان البكتيرية19. الاضافه إلى ذلك ، ينبغي ان تظل الثقافات المجمدة صالحه لسنوات. وأظهرت التهم لوحه قابله للحياة لا فرق كبير بين كفو/mL مباشره بعد اعداد الأسهم وبعد ثلاثه أشهر من الاعداد. وقد كفل استخدام عده خطوات للتحقق من الصحة طوال هذا الاجراء ان الأسلوب كان قابلا للتكرار ، وان النتائج لم تكن منحرفة بتلويث البكتيريا. الاضافه إلى ذلك ، ومع عدد الخطوات الاحترازية المتخذة لضمان الاستنساخ ، كانت هناك حاجه إلى عدد اقل من الماشية. باستخدام سلاله بكتيرية التي وافقت عليها أداره الاغذيه والعقاقير لإنتاج ادويه كعنصر تحكم (مثل e. كولاي سلاله BL21) ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار التوهين من سلالات أخرى المهندسة وراثيا من الزنجاريه، أو أنواع أخرى من البكتيريا.
باستخدام التلالؤ الإحيائي كعلامة يوفر التحقق من صحة اضافيه من السلالات البكتيرية التي تم حقنها ، كما يمكن تصور علامة في موقع الحقن. ويلزم إدخال علامة التلالؤ الإحيائي في الكروموسوم البكتيري للتصوير بالاشعه البيولوجية ولكنه قد لا يكون ممكنا إذا كان يعمل مع سلالات/أنواع غير متوافقة. ومع ذلك ، لا يلزم وضع علامات علي السلالات ذات البريق الإحيائي لاختبار التوهين. تم وضع علامة علي السلالات التي تم اختبارها في هذه الدراسة مع التلالؤ الإحيائي ، والتي سمحت لتصور الاختلافات التعريب بين السلالات طوال مسار العدوى. لاحظنا ان السلالة المسببة للامراض نشرت من خلال الجسم من الماوس ، ولكن بقيت السلالة غير المسببة للامراض في موقع الحقن. وفي حين ان هذه التجربة لم تختبر سوي نوعين من السلالات المرتبطة ارتباطا وثيقا بالزنجاريه، فانها تشير إلى ان نشر البكتيريا مرتبط بالضراوة ، علي الأقل في الصفحة الزنجاريه. وهكذا ، يمكن استخدام هذا الاجراء من وضع العلامات مع التلالؤ لتصور تطور العدوى في المستقبل لتقييم بسرعة توهين سلالات البكتيريا المهندسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والمؤلف هونغوي د. يو هو كبير موظفي العلوم والمؤسس المشارك لشركه بروجينيسيس تكنولوجيز ، LLC.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة التي تمنح R44GM113545 و P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
