Summary
Ici, nous décrivons un protocole simple et reproductible du modèle d'infection de souris pour évaluer l'atténuation des souches génétiquement modifiées de Pseudomonas aeruginosa par rapport à la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis approuvée par Escherichia coli pour des applications commerciales.
Abstract
Les micro-organismes sont génétiquement polyvalents et diversifiés et sont devenus une source majeure de nombreux produits commerciaux et biopharmaceutiques. Bien que certains de ces produits soient produits naturellement par les organismes, d'autres produits nécessitent le génie génétique de l'organisme pour augmenter les rendements de production. Les souches avirulentes d'Escherichia coli ont traditionnellement été l'espèce bactérienne préférée pour la production de produits biopharmaceutiques; cependant, certains produits sont difficiles à produire pour E. coli. Ainsi, les souches avirulentes d'autres espèces bactériennes pourraient fournir des alternatives utiles pour la production de certains produits commerciaux. Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative commune et bien étudiée qui pourrait fournir une alternative appropriée à E. coli. Cependant, P. aeruginosa est un agent pathogène humain opportuniste. Ici, nous détaillons une procédure qui peut être utilisée pour générer des souches non pathogènes de P. aeruginosa par des suppressions génomiques séquentielles à l'aide du plasmide pEX100T-NotI. Le principal avantage de cette méthode est de produire une souche sans marqueur. Cette méthode peut être utilisée pour générer des souches P. aeruginosa fortement atténuées pour la production de produits commerciaux, ou pour concevoir des souches pour d'autres utilisations spécifiques. Nous décrivons également un modèle simple et reproductible de souris de l'infection systémique bactérienne par l'injection intraperitoneal des souches d'essai validées pour tester l'atténuation de la souche génétiquement modifiée par rapport à la souche BL21 approuvée par la FDA de E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène bactérien opportuniste qui peut causer des maladies potentiellement mortelles chez l'homme, en particulier chez les immunocompromis. La pathogénie de P. aeruginosa est due à l'expression de nombreux facteurs de virulence, y compris les protéases et le lipopolysaccharide, ainsi que sa capacité à former un biofilm protecteur1. En raison de sa capacité à produire des facteurs de virulence et à causer des maladies chez l'homme, l'utilisation de P. aeruginosa pour fabriquer des produits commerciaux pose des préoccupations en matière de sécurité. Les souches non pathogènes d'E. coli ont traditionnellement été utilisées pour bioingénieurr des produits médicaux et commerciaux à usage humain. Cependant, certains produits sont difficiles à fabriquer pour E. coli, et beaucoup sont emballés dans des organismes d'inclusion, ce qui rend l'extraction laborieuse. Les souches bactériennes modifiées avec la capacité de fabriquer et de sécrétiser des produits spécifiques est hautement souhaitable, car la sécrétion augmenterait probablement le rendement et faciliterait les processus de purification. Ainsi, les souches non pathogènes d'autres espèces de bactéries (p. ex., les espèces qui utilisent plus de voies de sécrétion) peuvent fournir des solutions de rechange utiles à E. coli. Nous avons récemment signalé le développement d'une souche de P. aeruginosa, PGN5, dans lequel la pathogénicité et la toxicité de l'organisme est fortement atténuée2. Fait important, cette variété produit encore de grandes quantités de polysaccharide alginate, un composant commercialement intéressant du biofilm P. aeruginosa.
La souche PGN5 a été générée à l'aide d'une procédure d'échange allélique en deux étapes avec le plasmide pEX100T-NotI pour supprimer séquentiellement cinq gènes (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) connus pour contribuer à la pathogénie de l'organisme. pEX100T-NotI a été généré en changeant le SmaI à un site de reconnaissance d'enzymede de restriction notI dans le site multiple de clonage du plasmide pEX100T, qui a été développé dans le laboratoire d'Herbert Schweizer3,4. Le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction NotI est une séquence d'ADN plus rare par rapport à SmaI et moins susceptible d'être présent dans les séquences étant clonées, il est donc plus pratique pour les fins de clonage. Le plasmide porte des gènes qui permettent la sélection, y compris le gène bla, qui code la lactamase et confère une résistance à la carbenicilline, et le gène B. subtilissacB, qui confère une sensibilité au saccharose (Figure 1A). Le plasmide porte également une origine de réplication (ori) compatible avec E. coli, et une origine de transfert (oriT) qui permet le transfert de plasmide de E. coli à l'espèce Pseudomonas par conjugaison. Cependant, le plasmide n'a pas d'origine de réplication compatible avec Pseudomonas, et ne peut donc pas se répliquer chez les espèces Pseudomonas (c'est-à-dire qu'il s'agit d'un vecteur de suicide Pseudomonas). Ces caractéristiques font pEX100T-NotI idéal pour cibler les suppressions génétiques du chromosome Pseudomonas. Des étapes de clonage de plasmide sont effectuées à l'aide d'E. coli et le plasmide qui en résulte est transféré à Pseudomonas par transformation ou conjugaison. Puis, grâce à des événements de recombinaison homologues et des étapes sélectives, la suppression ciblée dans le cadre est générée, sans marqueur. Cette méthode de suppression séquentielle des régions génomiques du chromosome de P. aeruginosa pourrait être utilisée pour générer des souches pseudomonas fortement atténuées, comme PGN5, ou pour concevoir des souches pour d'autres utilisations spécifiques (par exemple, des souches déficientes en endodocules pour la propagation plasmide ou des souches déficientes en protéases pour la production de protéines d'intérêt).
La virulence globale des souches de bactéries est affectée par les conditions de croissance et les phases, au cours desquelles les mutations se produisent fréquemment. Par conséquent, il peut être difficile de mesurer l'innocuité des souches génétiquement modifiées. Pour évaluer les isolats bactériens pour la virulence systémique, nous avons adapté un protocole précédemment édité de l'infection par injection intrapéritonéale des souris de C57BL/65. Nous avons modifié cette procédure pour utiliser des stocks bactériens congelés pour l'injection, ce qui a permis un dosage précis et une validation facile des souches utilisées. Dans ce modèle, la souche E. coli BL21, qui a été approuvée par la FDA pour la production de produits biopharmaceutiques, a été utilisée comme norme de sécurité de contrôle pour déterminer la pathogénie relative de la souche6,7,8. Le principal avantage de l'utilisation de cette méthode est qu'elle est reproductible et minimise les sources de variation, car les souches infectieuses sont validées pour le nombre de cellules bactériennes, le phénotype et les marqueurs génétiques avant et après l'infection. Avec ces étapes contrôlées, le nombre d'animaux requis est réduit. Dans ce modèle, les souches de P. aeruginosa qui entraînent des taux de mortalité par c57BL/6 murine s'un ou moins de E. coli BL21 lorsqu'elles sont injectées par voie intrapéritoyonnelle peuvent être considérées comme atténuées. Ce modèle simple d'infection de souris peut également être employé pour évaluer la pathogénicité atténuée des souches génétiquement modifiées d'autres espèces utilisant la souche E. coli approuvée par fda comme référence. Les étapes 1 à 7 détaillent la génération de suppressions génomiques séquentielles dans P. aeruginosa (figure 1) et les étapes 8-12 détaillent l'utilisation d'un modèle de souris pour tester la pathogénicité des souches de P. aeruginosa.
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Protocol
Avant de commencer les expériences sur les animaux, le protocole à utiliser doit être approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC). L'approbation du protocole décrit a été obtenue par l'IACUC de l'Université Marshall (Huntington, WV, États-Unis).
1. Conception Plasmid
- Pour générer une suppression génétique à l'aide du plasmide pEX100T-NotI, clonez les régions de l'ADN flanquant la séquence de suppression désirée et insérez dans le site de restriction NotI du plasmide. L'insert plasmide doit contenir environ 500 nucléotides en amont de la séquence cible directement adjacente à environ 500 nucléotides en aval de la séquence de suppression cible. De plus, l'insert doit contenir la séquence de reconnaissance NotI (GCGGCCGC) à ses extrémités de 5' et 3' (figure 1B).
2. Préparation Plasmid
- Option 1 : Utiliser les procédures traditionnelles de clonage. Utilisez PCR pour amplifier les régions génomiques en amont et en aval du gène d'intérêt, suivie par le crossover PCR9,10 pour rejoindre les fragments générés, restriction de la digestion endonucab du produit PCR et plasmide, et la ligature11 ( Figure1B,C).
- Option 2 : Après avoir conçu la séquence de suppression en silico, contractez une société qui de novo la synthétise pour l'insérer dans le plasmien pEX100T-NotI. De nombreuses entreprises ont rationalisé le processus de clonage afin de générer rapidement et efficacement le plasmide d'intérêt. En outre, la séquence vérifie les plasmides pour être sans mutation avant l'accouchement.
3. Transformation de la bactérie E. coli
- Transformez E. coli électrocompétent avec le plasmide selon les recommandations du fabricant. À l'aide d'une boucle inoculante stérile, stries de 10 l de la réaction de transformation pour les colonies isolées sur une plaque d'agar Pré-chauffée Luria Broth (LB) complétée par 100 g/mL de carbenicilline et incuber pendant la nuit à 37 oC.
REMARQUE : Tous les équipements et les supports utilisés pour la culture des bactéries doivent être traités conformément aux directives de sécurité de l'institution. - Passage deux fois.
- Retirez la plaque de l'incubateur et identifiez une colonie isolée. À l'aide d'une boucle d'isolation stérile, ramasser la colonie et silloner une plaque d'agar LB préréchauffée, complétée de 100 g/mL de carbenicilline pour les colonies isolées. Incuber toute la nuit à 37 oC. Répétez cette étape une fois de plus pour générer une culture pure.
- À l'aide d'une boucle inoculante stérile, inoculer 5 ml de LB avec une seule colonie de la plaque d'agar finale. Placez la culture dans un incubateur secouant à 37 oC pendant la nuit. Le lendemain, mélanger 1 ml de cette culture avec 1 ml de 5 % dans un cryovial et stocker à -80 oC pour générer un stock congelé de la souche.
4. Préparation bactérienne des souches et conjugaison triparentale
- Utilisez une seule colonie isolée à partir de plaques d'agar des souches suivantes pour inoculer les cultures de bouillon et placez-les dans un incubateur secouant pendant la nuit à 37 oC.
- Ajouter E. coli pEX100T-NotI dans 5 ml de LB complété par 100 g/mL de carbenicilline.
- Ajouter la souche P. aeruginosa PAO1 en 5 ml de Pseudomonas Isolation Broth (PIB).
- Ajouter E. coli prk2013 dans 5 ml de LB complété par 50 g/mL de kanamycine.
REMARQUE: Le plasmide prk2013 est un plasmide d'aide qui se reproduit dans E. coli mais pas P. aeruginosa; il porte les gènes de transfert trans-agissant qui mobilisent le plasmide pEX100T-NotI du donneur d'E. coli au receveur de P. aeruginosa 12. P. aeruginosa est un agent pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Veuillez suivre les lignes directrices de l'institution en matière de sécurité lorsque vous travaillez avec des organismes BSL-2.
- Le lendemain, retirez les cultures de nuit de l'incubateur et ajoutez 0,5 ml de chaque culture à un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant et suspendez le granule cellulaire dans 50-100 l de LB.
- Pipette toute la suspension de la cellule dans une gouttelette sur une plaque d'agar LB préréchauffée. Laisser sécher la gouttelette. Puis inverser la plaque et incuber à 37 oC pendant 4-6 h.
- Après l'incubation, utiliser une boucle d'inoculation stérile pour recueillir les cellules en 1 ml de LB dans un tube microcentrifuge. Pipette de haut en bas pour mélanger les cellules.
- À l'aide d'un épandeur cellulaire, les cellules stries se répertquaient uniformément sur une plaque sèche d'agar d'isolement de Pseudomonas (PIA) complétée par 300 g/mL de carbenicilline. Streak plaques multiples avec des volumes croissants du mélange cellulaire (par exemple, 10 L, 100 l, 500 l). Incuber toute la nuit à 37 oC.
5. Détection des recombinants à croisement unique de P. aeruginosa
- Retirez les plaques de l'incubateur et inspectez les colonies isolées résistantes à la carbenicilline. Puisque le plasmide de pEX100T-NotI ne peut pas se reproduire dans P. aeruginosa,les colonies qui ont grandi sur des plaques carbenicillin-supplémentées devraient avoir surgi des cellules dans lesquelles le plasmide a été intégré dans le chromosome.
- Choisissez au moins 4 de ces colonies et strie pour l'isolement sur des plaques pré-chaudes de PIA complétées par 300 g/mL de carbenicilline. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 oC.
- Retirer les plaques de l'incubateur et inspecter la croissance. Les colonies résistantes à la carbenicilline devraient être des recombinants à croisement unique (c.-à-d. qu'elles ont incorporé le plasmide dans le chromosome par l'intermédiaire d'un événement de recombinaison entre une région homologue de l'insert plasmide et le chromosome de P. aeruginosa).
- Patch 8 colonies ou plus avec des cure-dents stériles sur des plaques pré-chaudes de: 1) PIA complété par 300 g/mL de carbenicilline et 2) PIA complété par 300 g/mL de carbenicilline et 10% de saccharose (sans glycérol).
- Si aucune croissance de colonie n'a été obtenue à partir de l'étape 5.1, répétez la conjugaison et augmentez le volume du mélange cellulaire strié à l'étape 4.5. Si trop de croissance s'est produite, répétez la conjugaison et diminuez le volume strié.
- Si la conjugaison échoue à plusieurs reprises, préparez des cellules électrocompétentes de la souche P. aeruginosa et transformez-la directement avec le plasmide pEX100T-NotI. Des protocoles détaillés pour la préparation de l'électrocompétent P. aeruginosa et la transformation sont disponibles ailleurs13,14.
- Incuber les assiettes à 37 oC pendant la nuit.
- Retirer les plaques de l'incubateur et inspecter la croissance. Les véritables recombinants à croisement unique seront résistants à la carbenicilline et sensibles au saccharose (c.-à-d. colonies qui ont grandi sur PIA complétées par la carbenicilline, mais n'ont pas grandi sur PIA complétée par la carbenicilline et le saccharose).
- Choisissez 4 ou plus de vrais recombinants à croisement unique et inoculez chacun en 5 ml de LB sans sélection. Incuber dans un incubateur secouant à 37 oC pendant la nuit.
- Si aucun recombinant à croisement unique n'a été détecté, répétez la conjugaison.
6. Détection des recombinants à double croisement de P. aeruginosa
- Pour chaque culture de bouillon, inoculer 10 l de culture sur une assiette pré-chauffée de PIA complétée de 10% de saccharose (sans glycérol) et de strie pour les colonies isolées. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 oC.
- Le lendemain, retirez les plaques de l'incubateur et inspectez-les pour la croissance. Les colonies résistantes au saccharose devraient être des recombinants à double croisement (c.-à-d., ont enlevé le plasmide du chromosome par l'intermédiaire d'un événement de recombinaison entre l'autre région homologue de l'insert plasmide et le chromosome P. aeruginosa).
- Patch au moins 20 colonies avec des cure-dents stériles sur des plaques pré-chaudes de: 1) PIA, 2) PIA complété avec 10% de saccharose (sans glycérol), et 3) PIA complété par 300 g/mL de carbenicilline.
- Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 oC.
- Retirez les plaques de l'incubateur et examinez-les pour la croissance. Les vrais recombinants à double croisement seront sensibles à la carbenicilline et résistants au saccharose (c.-à-d., les colonies qui ont grandi sur PIA et PIA complétées par le saccharose, mais n'ont pas grandi sur PIA complétée avec de la carbenicilline).
7. Confirmation de suppression de gène par l'intermédiaire de la colonie PCR
- Préparer 10-20 colonies pour un écran de suppression avec PCR.
- Récupérez la croissance d'un recombinant à double croisement suspecté avec un cure-dent stérile et suspendez les cellules dans 50 l 'L de 1x phosphate tamponné salin (PBS). Faire bouillir la suspension à 100 oC pendant 10 min, la centrifugeuse pendant 3 min à 13 000 x g,puis la placer sur la glace.
- Effectuer PCR pour filtrer les colonies pour la suppression ciblée.
- Utilisez 1 L du supernatant comme modèle dans une réaction PCR de 25 L pour confirmer la suppression du gène d'intérêt.
- Utilisez des amorces spécifiques aux gènes qui amplifient la région de la suppression génomique. Utilisez des amorces qui amplifient la région de la suppression génomique plus 100-200 bp de séquences en amont et en aval.
- Préparer une réaction PCR de contrôle séparée avec la souche parente (p. ex., PAO1).
REMARQUE : Les conditions de thermocycler varient en fonction de la température d'annealing optimale pour les paires d'amorces, du cocktail de polymérase utilisé et de la longueur de la région à amplifier.
- Effectuer l'électrophoresis de gel d'agarose sur les produits de PCR. Les colonies dans lesquelles la région d'intérêt a été supprimée produisent des produits d'amplification plus petits que les colonies qui n'ont pas la suppression (Figure 2).
- Choisissez une ou plusieurs colonies avec la suppression confirmée par pcR. Stries pour les colonies isolées sur une plaque PIA préréchauffée et incuber à 37 oC pendant la nuit.
- Passage au moins une fois de plus. Retirez les plaques de l'incubateur et identifiez une colonie isolée. À l'aide d'une boucle d'isolation stérile, ramasser la colonie et silloner une plaque d'agar PIA préréchauffée pour les colonies isolées. Incuber toute la nuit à 37 oC.
- Choisissez une colonie dans chaque assiette finale et utilisez-la pour inoculer 5 ml de PIB. Placer dans un incubateur secouant à 37 oC pendant la nuit.
- Mélanger 1 ml de cette culture avec 1 ml de lait écrémé de 5 % dans un cryovial et conserver à -80 oC pour produire un stock de la souche.
- À l'aide de cette culture, préparer l'ADN génomique de la souche (p. ex., à l'aide d'un kit de purification de l'ADN). Amplifiez la région de suppression génomique à l'aide de PCR et d'amorces spécifiques à la région d'intérêt.
- Purifiez ces produits PCR (p. ex., avec un kit de purification de l'ADN, ou extraction de phénol-chloroforme) et séquencez directement avec les amorces spécifiques aux gènes ou ligats dans un vecteur de séquençage avec des amorces spécifiques au plasmide.
- Après que la suppression de gène soit confirmée par le séquençage, répétez cette procédure avec la nouvelle contrainte de suppression pour générer séquentiellement de nombreuses suppressions génomiques sans marqueur. Lorsque la souche désirée est générée, utiliser le séquençage du génome entier pour vérifier les suppressions ciblées et détecter d'autres changements au génome (par rapport à la souche de référence, par exemple, PAO1) qui se sont produits tout au long du processus. Après avoir annoté les gènes, déposez la séquence à GenBank et enregistrez les numéros d'adhésion.
8. Préparation de souches bactériennes pour l'expérimentation animale
- Pour tester la pathogénicité atténuée des souches de P. aeruginosa, préparez d'abord les cultures et les stocks validés. Préparer les souches d'intérêt De P. aeruginosa, une souche sauvage de P. aeruginosa (virulente) et une souche approuvée par la FDA d'E. coli (p. ex. BL21) pour servir de contrôle de sécurité non pathogène.
- Ststreak les souches de la bactérie testée sur l'agar sélective à partir de stocks congelés séquencés et validés. Incuber à 37 oC pendant la nuit.
- À l'' inoculante, prenez une seule colonie de chaque souche et strie pour les colonies isolées sur les médias sélectifs. Incuber à 37 oC pendant la nuit.
- Retirer les plaques de l'incubateur. Pour chaque souche, choisissez une seule colonie et une strie pour l'isolement sur des plaques LB.
- Après 24 h de croissance à 37 oC, inoculer un flacon de 500 ml contenant 250 ml de LB avec une seule colonie isolée de chaque souche.
- Étape de validation : en utilisant les restes d'une même colonie, validez la souche à l'aide de PCR et d'amorces spécifiques à la souche, et/ou d'amorces pour vérifier la présence de modifications génétiques apportées à la souche. Utilisez les amorces ci-dessous pour la vérification des souches dans l'exemple présenté :
E. coli BL21:
T7 polymérase F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
T7 polymérase R:TTACGCGAACGCGAAGTCC
VE2 et PGN5:
aroA (en) F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAAGC
aroA (en) R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
- Étape de validation : en utilisant les restes d'une même colonie, validez la souche à l'aide de PCR et d'amorces spécifiques à la souche, et/ou d'amorces pour vérifier la présence de modifications génétiques apportées à la souche. Utilisez les amorces ci-dessous pour la vérification des souches dans l'exemple présenté :
- Incuber les cultures dans un incubateur secouant à 160 tr/min et 37 oC jusqu'à ce qu'elles atteignent la croissance en phase de journal (c.-à-d., mesure OD600 de 0,4-0,6 sur un spectrophotomètre).
- À l'aide de la valeur OD600 obtenue lors de la phase de journal, calculez le volume de bouillon nécessaire pour produire 2,5 x 109 unités de formation de colonies (CFU) par mL. Pelleter le volume de bouillon calculé dans des tubes de 50 ml à 4 500 x g pendant 10 min.
- Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans un tube en utilisant 50 ml de 1x PBS pour laver les cellules. Centrifugeuse à nouveau à 4500 x g pendant 10 min.
- Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 25 ml de lait écrémé de 5 % dans 1 x PBS.
- Étape de validation : Utilisez un échantillon de la suspension de 25 ml pour effectuer des dénombrements de plaques viables afin de déterminer le nombre de CFU/mL.
- Aliquot la résuspension de la culture du lait écrémé de 25 ml en stocks de culture de 2 ml en cryovials de 2 ml. Congélation éclair dans l'azote liquide et conserver à -80 oC au moins toute la nuit avant l'utilisation.
9. Validation de la croissance et de la souche des stocks stockés pour l'expérimentation animale.
- Pour que chaque souche soit testée, retirer au moins 3 cryovials de stocks congelés à partir d'un stockage de -80 oC et décongeler à 4 oC pendant 2 à 4 h. S'il reste du bouillon congelé, réchauffez-le brièvement à 37 oC.
- Prenez de petits échantillons de chaque cryovial pour valider chaque souche.
- Effectuer des dénombrements de plaques viables pour déterminer le nombre de CFU/mL. Il est normal d'avoir moins de CFU/mL après la congélation, en raison de la mort de certaines cellules bactériennes.
- Utilisez PCR et des amorces spécifiques à la souche pour valider chaque souche.
- Serriant chaque souche sur des supports sélectifs pour vérifier le phénotype.
- Après avoir confirmé que les souches sont du génotype et du phénotype corrects, et après avoir validé l'UFC/mL, procéder à des essais sur les animaux.
10. Inoculation d'animaux avec des souches bactériennes par injection
- Le matin des injections, retirer les cryovials des souches bactériennes testées et décongeler à 4 oC pendant 3 à 4 h. Décongeler 0,5 ml pour chaque souris qui sera injectée. Garder les flacons sur la glace après la décongélation et injecter des souris dans les 2 h.
- Après la décongélation, transférer chaque cryovial dans un nouveau tube et centrifugeuse de 2 ml à 4 500 x g pendant 10 min, jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de 1 x PBS.
- Centrifugeà nouveau à 4 500 x g pendant 10 m. Jeter le supernatant et resuspendre le granule en 1x PBS à une concentration finale de 2,5 x 109 CFU/mL. Pour déterminer la quantité de 1x PBS nécessaire à la suspension, utilisez les données CFU/mL obtenues à partir de dénombrements viables de plaques sur les stocks gelés à l'étape 2.2.1. La quantité exacte de 1x PBS utilisée variera légèrement entre les souches.
- Prélever 3 échantillons de la suspension finale de chaque souche pour valider l'UC/mL, le génotype et le phénotype tel que décrit ci-dessus.
- Pour chaque souche, aliquot 1,5 ml de suspension PBS/cellule dans un tube de 2 ml par 5 souris pour limiter le nombre de fois que le tube est entré. Aussi, préparer des tubes de 1x PBS pour les injections de contrôle.
- Rassembler les souris (10 mâles et 10 femelles C57BL/6 par groupe pour cette expérience) et les matériaux nécessaires pour les injections (seringues, aiguilles, récipients à aiguiser, marqueurs, stylo et papier, etc. . . .. Déplacez-vous vers la salle de chirurgie des animaux stériles. Essuyez toutes les surfaces à l'eau avec des lingettes anitantes.
- Pour éliminer la détresse et le risque de blessures à l'expérimentateur, n'apportez qu'un seul groupe sexuel et expérimental de souris à la salle de chirurgie à la fois (p. ex., un groupe de 10 souris mâles à être infectés par une souche particulière). Portez deux paires de gants en latex pour éliminer la perforation des gants si on les mord. Portez une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et un masque facial pour éviter toute contamination.
- Commencer les injections du groupe témoin avec 1x PBS. Cela permettra de vérifier si les effets indésirables résultent de l'injection seule.
- Retirez une souris de la cage. Enlevez seulement une souris à la fois.
- Pesez la souris et marquez sa queue avec un marqueur permanent pour suivre la perte de poids après l'injection.
- Ouvrez une nouvelle seringue de 1 ml et une aiguille de 27 G (utilisez une nouvelle seringue et une aiguille pour chaque souris afin d'éliminer la contamination) et injectez 200 l de 1x PBS stérile.
- Prenez la souris derrière ses oreilles à l'aide du pouce et de l'index. Pincez pour créer le pli de peau à la nuque pour tenir dessus - un pli plus serré réduit le mouvement de cou et le risque d'être mordu pendant l'injection. Fixer la queue dans la paume en utilisant le rose pour tenir la souris à plat avec peu de mouvement.
- Retournez la souris et insérez l'aiguille à un angle de 30 degrés dans la cavité péritonéale du côté gauche ou droit de la ligne médiane. Soulevez légèrement l'aiguille une fois insérée pour s'assurer qu'elle a été insérée dans la zone intrapéritonéale et non dans les organes. Injecter lentement le PBS, puis retirer l'aiguille.
- Placer l'aiguille usagée dans un contenant de pointes de biorisque désigné. Ne réutilisez pas la seringue ou l'aiguille. Un bolus au site d'injection est typique.
- Après l'injection, déplacer la souris dans une cage séparée.
- Répétez la procédure avec la souris suivante. Après que toutes les souris d'une cage sont injectées, les retourner à leur cage d'origine immédiatement.
- Après l'injection du groupe témoin, commencez à injecter des suspensions de souches à tester selon la même procédure.
- Injecter 200 l l de la suspension cellulaire. Au début avec des suspensions cellulaires de 2,5 x 109 CFU/mL, chaque souris reçoit 5 x 108 CFU.
REMARQUE : Ces concentrations ont été optimisées avec la recherche animale préliminaire pour déterminer des doses mortelles de chaque souche. Le dosage peut devoir être ajusté pour d'autres souches/espèces.
- Injecter 200 l l de la suspension cellulaire. Au début avec des suspensions cellulaires de 2,5 x 109 CFU/mL, chaque souris reçoit 5 x 108 CFU.
- Une fois que toutes les injections sont terminées, retournez les souris à la salle d'habitation pour soulager la détresse. Nettoyer l'aire de travail avec des lingettes assainissantes.
- Surveillez la mortalité des animaux après l'injection en vérifiant les cages des souris mortes tous les 3 h pendant 72 h et tous les 12 h pendant 10 jours. Enregistrez le poids des souris toutes les 12 h pour déterminer la perte de poids due à la maladie.
- Enregistrez les comportements indésirables dans les heures qui suivent l'injection, comme la différence de posture, le manque de toilettage ou de terrier, l'immobilité ou les changements de respiration. Les souris qui décèdent des blessures associées à l'injection présenteront un comportement défavorable et mourront rapidement après l'injection. D'autre part, les souris qui décèdent de l'infection ne commenceront pas à montrer un comportement défavorable ou la mort jusqu'à ce qu'après 18 h. Toute souris qui présente un comportement défavorable ou des signes étendus de morbidité, y compris la respiration rapide ou laborieuse, l'immobilité, la posture voûtée, les yeux enfoncés, la déshydratation sévère, ou d'autres devraient être euthanasiés pour réduire les souffrances inutiles (comme conforme dans notre protocoles approuvés par l'IACUC). Cependant, dans nos expériences, l'euthanasiation n'était pas nécessaire pour les souris pendant l'expérience. Les souris survivantes ont été euthanasiées 10 jours après l'achèvement des essais.
- Après la période de surveillance de 10 jours, permettre aux animaux restants de récupérer complètement et de se dégager de toute infection administrée pendant les tests. Euthanasier les animaux selon la procédure de l'IACUC.
11. Analyse statistique de la mortalité animale
- Effectuer une analyse statistique à l'aide d'un logiciel de graphique. Tout logiciel capable de produire des graphiques et d'effectuer une analyse statistique est approprié.
- Pour tracer les données de mortalité, utilisez la colonne X pour représenter le temps (h) et la colonne Y pour représenter les groupes testés.
- Représenter chaque souris ou sujet de l'étude à l'aide du code 0 (zéro) ou du code 1, indiquant la survie ou la mort, respectivement.
- Pour chaque animal qui meurt, placez un 1 dans la colonne Y de ce groupe au moment du décès sur la colonne X. S'il y a plusieurs décès à un seul moment au sein d'un groupe, une copie de ce point de temps peut être placée dans la colonne X. Par exemple, si trois sujets d'un groupe meurent à 3 h, le point de temps de 3 h apparaîtra trois fois dans la colonne X.
- Pour tous les animaux survivants d'un groupe, placez un zéro dans la colonne Y au dernier moment mesuré. Par exemple, si quatre souris survivent, placez quatre points de fin dans la colonne X marquées de quatre zéros dans la colonne Y.
- Une fois que les données animales sont saisies pour tous les groupes, utilisez un modèle de graphique de survie pour produire un graphique de survie.
- Laissez le codage par défaut comme 0 et 1.
- Définiz les paramètres du graphique en pourcentage.
- Une fois les paramètres de la courbe de survie sélectionnés, effectuez une analyse statistique à l'aide d'un test Mantel-Cox (log rank).
- Format Kaplan-Meier trace à l'aide de données statistiques.
REMARQUE : Les souches dont les taux de mortalité sont inférieurs ou égaux à la souche parente et à la souche approuvée par la FDA (p. ex. E. coli BL21) peuvent être considérées comme atténuées.
12. Visualisation de l'infection par bioluminescence
- Pour visualiser l'évolution de l'infection, insérez un operon bioluminescent chromosomique (luxCDABE) dans la souche PGN5 et VE2 testée. Les plasmides et le protocole utilisés pour étiqueter ces souches ont été développés dans le laboratoire De Schweizer et peuvent ne pas être compatibles avec toutes les espèces/souches de bactéries13. Fait important, la visualisation de l'infection est facultative; ainsi, l'insertion génomique de cet opéron n'est pas nécessaire pour effectuer l'étude de mortalité décrite ci-dessus.
- Préparer et valider les souches en utilisant la méthode décrite ci-dessus. En outre, vérifiez la bioluminescence dans les souches étiquetées à chaque étape de validation.
- Après la préparation des souches, injectez les animaux en groupes de 10 avec les souches bioluminescentes suivant les étapes ci-dessus.
- Imagez les animaux tous les 3 h pour 24 h à l'aide d'un système d'imagerie animale capable de bioluminescence.
- Préparez d'abord l'imageur en fixant les paramètres de la caméra et en chauffant la scène pour les animaux. Définir également le débit d'oxygène à 1,5 L par min (ou suivant les recommandations du fabricant).
- Après que l'imageur et le stade soient stabilisés, placez une souris dans la chambre d'anesthésie immédiatement après l'injection et administrez 3.5% d'isoflurane dans la chambre avec le flux o2 pendant environ 4 min. Les méthodes d'anesthésie peuvent varier selon la chambre et/ou l'agent anesthésique utilisé; suivre les recommandations du fabricant. Déterminer l'anesthésie appropriée par l'essai réflexe de retrait.
- Déplacez la souris au stade stabilisé par la température. Placez la souris sur le dos avec les bras tendus et adaptez-la à la souris avec un cône de nez pour l'administration de 2,5% isoflurane tout au long de la procédure d'imagerie.
- Fermez la porte et prenez des images bioluminescentes et des radiographies de souris.
- Lorsque l'imagerie est terminée, retournez la souris dans sa cage et surveillez-la. La souris doit reprendre conscience dans les 3-5 minutes.
- Continuez à imager les souris tous les 3 h pendant 24 h, chaque fois à l'aide d'une souris différente de chaque groupe. Ne pas réimager une souris dans les 24 h en raison de la possibilité d'effets indésirables dus à la réexposition à l'anesthésie. Une seule souris ne devrait recevoir qu'une dose d'anesthésie tous les 24-36 h. Nettoyez la plate-forme d'imagerie après l'image de chaque souris. Éteignez l'imageur entre les points de temps d'imagerie.
REMARQUE : La bioluminescence s'estompera, quelle que soit la souche injectée. L'intensité et la longévité de la bioluminescence varient en fonction de nombreux facteurs, y compris le nombre de bactéries injectées, la souche de souris, la souche bactérienne, etc.
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Representative Results
Comme le montre la figure 2, la suppression génomique ciblée peut être confirmée à l'aide de la colonie PCR avec des amorces spécifiques qui amplifient la région d'intérêt. Les colonies qui portent une suppression génomique donneront une taille plus courte de bande de PCR par rapport aux colonies sauvages-type. Un écran PCR de 10-12 colonies est généralement suffisant pour détecter au moins une colonie qui porte la suppression ciblée. Si aucune suppression n'est détectée après plusieurs tours d'écrans, répétez la procédure commençant par la conjugaison. Si la suppression échoue encore, l'insert plasmide peut devoir être confirmé par le séquençage, redessiné, ou la suppression peut être mortelle. Lors de la vérification d'une suppression de gène par PCR, confirmer la suppression par séquençage. La souche résultante peut être soumise à la procédure à plusieurs reprises pour générer des modifications génomiques séquentielles.
Comme le montre la figure 3, la mortalité associée à l'injection intrapéritonéale de la souche atténuée de P. aeruginosa PGN5 (mucE) était de 0 %, ce qui équivaut à la mortalité observée avec E. coli BL21. D'autre part, l'injection intrapéritonéale de la souche parente (VE2) a été mortelle pour 80% des souris. Ces résultats ont été obtenus par des étapes approfondies pour valider les souches injectées. Bien que la cause exacte de la mort chez ces souris soit inconnue, elle peut au moins en partie être attribuée à l'expression de facteurs de virulence dans la souche parente qui ont été supprimées de la souche PGN5 atténuée. Les différences dans la progression d'infection ont été suivies utilisant le parent bioluminescence-marqué et les souches atténuées. La souche atténuée est demeurée localisée au site d'injection jusqu'à ce que la bioluminescence s'estompe (figure 4). Le dégagement de l'infection a probablement coïncidé avec la décoloration de la bioluminescence. La bioluminescence n'a pas été détectée 24 h après injection et les souris ont vécu pendant des semaines suivant l'injection jusqu'à ce qu'elles soient sacrifiées, sans effets indésirables observés.
Figure 1 : Génération de suppressions de gènes chez P. aeruginosa avec pEX100T-NotI. (A) Carte du plasmide pEX100T-NotI. (B) Génération d'une construction composée de régions directement en amont (jaune) et en aval (bleu) de la région d'intérêt (ROI), flanquée de sites de reconnaissance d'enzymes de restriction NotI. Tout d'abord, les régions en amont et en aval de PCR amplifient indépendamment avec des amorces spécifiques qui ajoutent des sites de digestion NotI de 5' (p. ex., NotI-aroA F CGCGGCCGCTGAAGGTCCTGGGCTCCTATCCGAAAGCGGTGCTCT et NotI-aroA R GCGGCCGCAGTTGGGTTGTTGTTCTGC GATGGCGCCAGGCA) et 3' régions homologues qui se chevauchent comme indiqué (par exemple, aroA-crossover F CTCCAGGCGCTGGGCAAGGTGGCGCATGACTGAGGTCACCACAGGGGGTCGCCGTGGAGAACA et aroA-crossover R TGTTCCTCCACCGCGACCCGTGACCTCAGTCATGCGCAGCACCTTTGCCCAGCGCCTGGAG. Ensuite, utilisez PCR avec des amorces contenant NotI pour rejoindre les produits en amont et en aval générés lors de la première réaction PCR. (C) Le plasmide pEX100T-NotI, armé et prêt. Ligate le produit pcR transversal digéré par NotI dans le plasmide digéré par NotI. (D) Diagramme de flux du processus pour supprimer les régions génomiques du chromosome P. aeruginosa à l'aide du plasmide pEX100T-NotI. Après que la suppression désirée ait été confirmée et purifiée, la contrainte résultante peut être prise par la procédure à plusieurs reprises pour supprimer d'autres régions génomiques du chromosome. Lorsque la souche désirée est obtenue, séquencer l'ensemble du génome pour confirmer les suppressions et autres changements au chromosome. La pathogénie de la souche peut ensuite être testée chez la souris en utilisant la procédure décrite dans la partie II du Protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Gel électrophoresis des produits PCR de colonie à partir d'un écran pour la suppression d'aroA pour générer la souche atténuée de P. aeruginosa, PGN5. Les produits DE LA colonie PCR circulent dans les voies 2-5 et 8-11 indiquent des colonies avec aroAde type sauvage. Les produits Demp de colonie s'exécutent dans les voies 6 et 7 portent la suppression de gène aroA, indiquée par le produit plus petit de PCR (astérisques jaunes). Les amorces utilisées ont spécifiquement amplifié la région génomique contenant le gène aroA : aroA-F : GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC, et aroA-R: ATCTGGCTCGCGATGCCGCTCC. La taille prévue des produits PCR dans les colonies de type sauvage était de 2 548 nucléotides (nt). La taille prévue du produit PCR dans les colonies avec suppression d'aroA était de 307 nt. Une échelle d'ADN a été utilisée dans les voies 1 et 12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mortalité globale des souris injectées avec la souche pathogène de P. aeruginosa (VE2), la souche atténuée de P. aeruginosa (PGN5-mucE), et la souche de contrôle de FDA d'E. coli (BL21). Seules les souris injectées avec une souche parente pathogène présentaient une mortalité de 80 %. La souche atténuée de P. aeruginosa et la souche de contrôle de FDA E. coli ont montré la mortalité de 0%. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Image de souris 3 h post-injection de souche atténuée de P. aeruginosa PGN5-mucE portant un marqueur bioluminescent. Les bactéries bioluminescentes étaient détectables jusqu'à 18-24 h après injection. Pendant cette période, la bioluminescence est restée au site de l'injection indiquant que les bactéries sont restées localisées au site d'injection. Cette souris entièrement récupérée sans effets indésirables. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le plasmide pEX100T-Not1 est un médiateur efficace des suppressions génomiques séquentielles qui sont sans marqueur et dans le cadre. Lorsque l'ingénierie des souches bactériennes pour la virulence atténuée, la suppression de séquences génétiques entières plutôt que de générer des mutations ponctuelles diminue la probabilité de retour à un phénotype virulent. En outre, chaque suppression de gène de pathogénie atténue davantage l'agent pathogène, renforçant la stabilité de l'atténuation.
Cette méthode peut également être utilisée pour générer des modifications génomiques autres que les suppressions, telles que les mutations ponctuelles et les insertions, simplement en modifiant la conception de l'insert plasmide. Ces types de modifications peuvent être plus utiles que des suppressions de gènes entiers pour les bactéries d'ingénierie avec un métabolisme modifié, par exemple. La modification génomique séquentielle a un potentiel important pour produire des souches bactériennes de concepteur pour adapter des buts spécifiques dans la recherche et l'industrie. D'autres méthodes de génération de modifications génomiques sans marqueur s'y sont apportées par les bactéries15,16,17,18. Comme avec toutes les méthodes d'édition de génome, les tentatives de modification s'est apportée aux régions génomiques essentielles peut être mortelle, et donc infructueuse. Dans ces cas, l'identification de différentes modifications génétiques ou d'autres gènes candidats est nécessaire pour générer la souche bactérienne d'intérêt.
Compte tenu des nombreux événements de réplication et des passages de chaque colonie tout au long de ce protocole, des changements imprévus au génome se produiront à la souche générée. Les changements génomiques exacts peuvent être identifiés par le séquençage du génome entier. Cependant, l'impact de ces changements est plus difficile à déterminer. Lorsque l'ingénierie des bactéries à un but précis, les changements génomiques qui n'affectent pas négativement la croissance de l'organisme ou la voie ciblée sont tolérables. Selon la souche générée, il peut être possible d'identifier une « lecture » pour s'assurer que la souche est toujours utile aux fins prévues. Par exemple, avec PGN5, l'objectif était de créer une souche atténuée qui conservait la capacité de produire de grandes quantités d'alginate. Après suppression de cinq gènes de pathogénie, la quantité et la composition de l'alginate produite par PGN5 ont été mesurées et déterminées comme comparables à d'autres souches productrices d'alginate. Ainsi, la production d'alginate n'a pas été affectée par les cinq suppressions de gènes, ni par les changements génomiques involontaires qui se sont produits pendant le développement de PGN5.
Un modèle d'injection intrapéritonéale de souris a été utilisé pour déterminer si une souche modifiée a été atténuée par rapport à la souche parente et E. coli BL21, une souche approuvée par la FDA pour la production de produits biopharmaceutiques. Les mesures les plus importantes prises au cours de cette procédure d'expérimentation animale ont été la préparation et la validation des stocks bactériens congelés. La préparation et l'utilisation de cultures bactériennes congelées pour injecter des souris est préférable à l'utilisation de la culture continue, car elle réduit le nombre de mutations qui se produisent naturellement dans les populations bactériennes19. En outre, les cultures congelées devraient rester viables pendant des années. Les dénombrements viables de plaques n'ont montré aucune différence significative entre l'UFC/mL directement après la préparation des stocks et trois mois après la préparation. L'utilisation de plusieurs étapes de validation tout au long de cette procédure a assuré que la méthode était reproductible, et les résultats n'ont pas été biaisés par la contamination des bactéries. De plus, avec le nombre de mesures de précaution prises pour assurer la reproductibilité, moins d'animaux étaient nécessaires. Utilisant une souche bactérienne qui est approuvée par la FDA pour la production biopharmaceutique comme le contrôle (tel que la souche E. coli BL21), cette méthode pourrait être utilisée pour tester l'atténuation d'autres souches génétiquement modifiées de P. aeruginosa, ou d'autres espèces de bactéries.
L'utilisation de la bioluminescence comme marqueur permet de valider de plus en plus les souches bactériennes injectées, car le marqueur peut être visualisé au site d'injection. L'insertion du marqueur de bioluminescence dans le chromosome bactérien est nécessaire pour l'imagerie par bioluminescence, mais peut ne pas être possible si vous travaillez avec des souches/espèces incompatibles. Cependant, le marquage des souches avec la bioluminescence n'est pas nécessaire pour tester l'atténuation. Les souches testées dans cette étude ont été marquées avec la bioluminescence, ce qui a permis de visualiser les différences de localisation entre les souches tout au long de l'infection. Nous avons observé que la souche pathogène disséminée à travers le corps de la souris, mais la souche non pathogène est restée au site d'injection. Bien que cette expérience n'ait testé que deux souches très étroitement apparentées de P. aeruginosa, elle suggère que la dissémination bactérienne est liée à la virulence, du moins chez P. aeruginosa. Ainsi, cette procédure d'étiquetage avec bioluminescence pour visualiser la progression de l'infection pourrait être utilisée à l'avenir pour évaluer rapidement l'atténuation des souches de bactéries modifiées.
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Disclosures
L'auteur Hongwei D. Yu est le directeur scientifique et co-fondateur de Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions R44GM113545 et P20GM103434 des National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
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