Summary
Hier beschreiben wir ein einfaches und reproduzierbares Protokoll des Mausmodells der Infektion, um die Dämpfung der genetisch veränderten Stämme von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zur von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Escherichia coli für kommerzielle Anwendungen zu bewerten.
Abstract
Mikroorganismen sind genetisch vielseitig und vielfältig und haben sich zu einer wichtigen Quelle für viele kommerzielle Produkte und Biopharmazeutika entwickelt. Obwohl einige dieser Produkte natürlich von den Organismen produziert werden, erfordern andere Produkte Gentechnik des Organismus, um die Produktionserträge zu erhöhen. Avirulen-Stämme von Escherichia coli sind traditionell die bevorzugte Bakterienart für die Herstellung von Biopharmazeutika; einige Produkte sind jedoch für E. coli schwer herzustellen. So könnten avirulente Stämme anderer Bakterienarten nützliche Alternativen für die Produktion einiger kommerzieller Produkte bieten. Pseudomonas aeruginosa ist ein häufiges und gut untersuchtes Gram-negatives Bakterium, das eine geeignete Alternative zu E. colibieten könnte. P. aeruginosa ist jedoch ein opportunistischer menschlicher Erreger. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das verwendet werden kann, um nicht pathogene Stämme von P. aeruginosa durch sequenzielle genomische Deletionen mit dem pEX100T-NotI-Plasmid zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, einen markerfreien Stamm zu erzeugen. Diese Methode kann verwendet werden, um stark abgeschwächte P. aeruginosa-Stämme für die Herstellung kommerzieller Produkte zu erzeugen oder Stämme für andere spezifische Verwendungszwecke zu entwerfen. Wir beschreiben auch ein einfaches und reproduzierbares Mausmodell der bakteriellen systemischen Infektion durch intraperitoneale Injektion von validierten Teststämmen, um die Dämpfung des gentechnisch veränderten Stammes im Vergleich zum FDA-zugelassenen BL21-Stamm von E. colizu testen.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer bakterieller Erreger, der beim Menschen lebensbedrohliche Krankheiten verursachen kann, insbesondere bei immungeschwächten. Die Pathogenität von P. aeruginosa ist auf die Expression vieler Virulenzfaktoren, einschließlich Proteasen und Lipopolysaccharid, sowie seine Fähigkeit, einen schützenden Biofilm zubilden, zurückzuführen. Aufgrund seiner Fähigkeit, Virulenzfaktoren zu produzieren und Krankheiten beim Menschen verursachen, stellt die Verwendung von P. aeruginosa zur Herstellung kommerzieller Produkte Sicherheitsbedenken dar. Nichtpathogene Stämme von E. coli werden traditionell verwendet, um medizinische und kommerzielle Produkte für den menschlichen Gebrauch zu bioengineering. Jedoch, einige Produkte sind schwierig für E. coli zu machen, und viele sind in Inklusionsgremien verpackt, so dass Extraktion mühsam. Technische Bakterienstämme mit der Fähigkeit, bestimmte Produkte herzustellen und zu sezernieren, sind sehr wünschenswert, da die Sekretion wahrscheinlich die Ausbeute erhöhen und Reinigungsprozesse erleichtern würde. So können nicht pathogene Stämme anderer Bakterienarten (z. B. Arten, die mehr Sekretionswege nutzen) nützliche Alternativen zu E. coli bieten. Wir berichteten vor kurzem die Entwicklung eines Stammes von P. aeruginosa, PGN5, in dem die Pathogenität und Toxizität des Organismus stark abgeschwächt ist2. Wichtig ist, dass dieser Stamm immer noch große Mengen des Polysaccharidalginats produziert, einem kommerziell interessanten Bestandteil des Biofilms P. aeruginosa.
Der PGN5-Stamm wurde mit einem zweistufigen Allelic-Austauschverfahren mit dem pEX100T-NotI-Plasmid erzeugt, um fünf Gene(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) sequenziell zu löschen, die bekanntermaßen zur Pathogenität des Organismus beitragen. pEX100T-NotI wurde durch die Umwandlung des SmaI in eine NotI-Restriktionsenzymerkennungsstelle innerhalb der Mehrfachklonstelle des Plasmids pEX100T erzeugt, die im Labor von Herbert Schweizer entwickelt wurde3,4. Die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NotI ist eine seltenere DNA-Sequenz im Vergleich zu SmaI und ist weniger wahrscheinlich in geklonten Sequenzen vorhanden, daher ist es für Klonzwecke bequemer. Das Plasmid trägt Gene, die eine Selektion ermöglichen, einschließlich des bla-Gens, das ß-Lactamase kodiert und Resistenzen gegen Carbenicillin verleiht, und das B. subtilissacB-Gen, das die Empfindlichkeit gegenüber Saccharose verleiht (Abbildung 1A). Das Plasmid trägt auch einen Ursprung der Replikation (ori) kompatibel mit E. coli, und einen Ursprung der Übertragung (oriT), die plasmid Transfer von E. coli zu Pseudomonas Arten über Konjugation ermöglicht. Dem Plasmid fehlt jedoch ein mit Pseudomonaskompatibler Replikationsursprung und kann daher innerhalb der Pseudomonas-Arten nicht replizieren (d. h. es handelt sich um einen Pseudomonas-Selbstmordvektor). Diese Eigenschaften machen pEX100T-NotI ideal für die gezielte genetische Deletion aus dem Pseudomonas-Chromosom. Plasmid-Klonschritte werden mit E. coli durchgeführt und das resultierende Plasmid wird durch Umwandlung oder Konjugation auf Pseudomonas übertragen. Dann wird durch homologe Rekombinationsereignisse und selektive Schritte die gezielte In-Frame-Deletion generiert, markerfrei. Diese Methode, genomische Regionen sequenziell aus dem Chromosom von P. aeruginosa zu löschen, könnte verwendet werden, um stark abgeschwächte Pseudomonas-Stämme wie PGN5 zu erzeugen oder Stämme für andere spezifische Anwendungen zu entwerfen (z. B. Stämme, die einen Mangel an Endonukleasen für die Plasmidvermehrung haben, oder Stämme, die einen Mangel an Proteasen für die Produktion von Proteinen von Interesse haben).
Die allgemeine Virulenz von Bakterienstämmen wird durch Wachstumsbedingungen und Phasen beeinflusst, in denen Mutationen häufig auftreten. Daher kann die Messung der Sicherheit gentechnisch veränderter Stämme eine Herausforderung darstellen. Um bakterielle Isolate auf systemische Virulenz zu untersuchen, haben wir ein zuvor veröffentlichtes Infektionsprotokoll durch intraperitoneale Injektion von C57BL/6-Mäusen5angepasst. Wir haben dieses Verfahren modifiziert, um gefrorene Bakterienvorräte für die Injektion zu verwenden, was eine präzise Beweichung und eine einfache Validierung der verwendeten Stämme ermöglichte. In diesem Modell wurde der E. coli-Stamm BL21, der von der FDA für die Herstellung von Biopharmazeutika zugelassen ist, als Kontrollsicherheitsstandard für die Bestimmung der relativen Pathogenese des Stammes6,7,8verwendet. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Methode ist, dass es reproduzierbar ist und Variationsquellen minimiert, da infizierende Stämme für bakterielle Zellzahl, Phänotyp und genetische Marker sowohl vor als auch nach der Infektion validiert werden. Mit diesen kontrollierten Schritten wird die Anzahl der benötigten Tiere reduziert. In diesem Modell können P. aeruginosa-Stämme, die zu C57BL/6 murinen Sterblichkeitsraten von e. coli BL21 führen, wenn sie intraperitoneal injiziert werden, als abgeschwächt angesehen werden. Dieses einfache Mausmodell der Infektion kann auch verwendet werden, um die abgeschwächte Pathogenität von gentechnisch veränderten Stämmen anderer Arten unter Verwendung des von der FDA zugelassenen E. coli-Stamms als Referenz zu bewerten. In den Schritten 1-7 wird die Generierung sequenzieller genomischer Deletionen in P. aeruginosa (Abbildung 1) und die Schritte 8-12 detailliert die Verwendung eines Mausmodells zur Erprobung der Pathogenität von P. aeruginosa-Stämmen beschrieben.
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Protocol
Vor Beginn von Tierversuchen muss das anzuwendende Protokoll vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt werden. Die Zulassung für das beschriebene Protokoll wurde durch die IACUC an der Marshall University (Huntington, WV, USA) eingeholt.
1. Plasmid-Design
- Um eine genetische Deletion mit dem pEX100T-NotI-Plasmid zu erzeugen, klonen Sie die DNA-Bereiche, die die gewünschte Deletionssequenz flankieren, und fügen Sie sie in die NotI-Einschränkungsstelle des Plasmids ein. Der Plasmideinsatz sollte etwa 500 Nukleotide vor der Zielsequenz enthalten, die direkt an etwa 500 Nukleotide nach der Ziellöschsequenz angrenzen. Zusätzlich sollte der Einsatz die NotI-Erkennungssequenz (GCGGCCGC) an seinen 5' und 3' Enden enthalten (Abbildung 1B).
2. Plasmid-Vorbereitung
- Option 1: Verwenden Sie traditionelle Klonverfahren. Verwenden Sie PCR, um genomische Regionen vor und nach dem Gen von Interesse zu verstärken, gefolgt von Crossover PCR9,10, um die generierten Fragmente zu verbinden, Einschränkung Endonuklease Verdauung des PCR-Produkts und Plasmid, und Ligation11 (Abbildung 1B,C).
- Option 2: Nach dem Entwerfen der Löschsequenz in silico, vertragen Sie ein Unternehmen, das de novo synthetisiert es in das Plasmid pEX100T-NotI einfügen. Viele Unternehmen haben den Prozess des Klonens gestrafft, um schnell und effizient das Plasmid von Interesse zu generieren. Darüber hinaus überprüfen Sequenzen, ob die Plasmide vor der Lieferung mutationsfrei sind.
3. E. coli Transformation
- Transformieren Sie elektrokompetente E. coli mit dem Plasmid nach den Empfehlungen des Herstellers. Mit einer sterilen Impfschleife streifen Sie 10 l der Transformationsreaktion für isolierte Kolonien auf eine vorgewärmte Luria Broth (LB) Agarplatte, ergänzt mit 100 g/ml Carbenicillin und inkubieren sie über Nacht bei 37 °C.
HINWEIS: Alle Geräte und Medien, die zur Kultur von Bakterien verwendet werden, sollten gemäß den Sicherheitsrichtlinien der Institution behandelt werden. - Durchgang zweimal.
- Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und identifizieren Sie eine isolierte Kolonie. Mit einer sterilen Impfschleife, nehmen Sie die Kolonie und streifen eine vorgewärmte LB AgarPlatte ergänzt mit 100 g/ml Carbenicillin für isolierte Kolonien. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, um eine reine Kultur zu generieren.
- Mit einer sterilen Impfschleife 5 ml LB mit einer einzigen Kolonie aus der letzten Agarplatte impfen. Legen Sie die Kultur in einem schüttelten Inkubator bei 37 °C über Nacht. Am nächsten Tag 1 ml dieser Kultur mit 1 ml von 5% in einem Kryovial mischen und bei -80 °C lagern, um einen gefrorenen Bestand der Sorte zu erzeugen.
4. Bakterielle Dehnungspräparation und triparentale Konjugation
- Verwenden Sie eine einzige isolierte Kolonie aus Agarplatten der folgenden Stämme, um Brühekulturen zu impfen und in einem Schüttelbrutor über Nacht bei 37 °C zu platzieren.
- Fügen Sie E. coli pEX100T-NotI in 5 ml LB hinzu, ergänzt mit 100 g/ml Carbenicillin.
- P. aeruginosa-Stamm PAO1 in 5 ml Pseudomonas Isolation Broth (PIB) geben.
- Fügen Sie E. coli prk2013 in 5 ml LB hinzu, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin.
ANMERKUNG: Das prk2013 Plasmid ist ein Hilfsplasmid, das sich in E. coli, aber nicht in P. aeruginosarepliziert; es trägt die transwirkenden Transfergene, die das pEX100T-NotI-Plasmid vom E. coli-Spender mobilisieren, zum P. aeruginosa-Empfänger 12. P. aeruginosa ist ein Biosafety Level 2 (BSL-2) Erreger. Bitte befolgen Sie die Sicherheitsrichtlinien der Institution bei der Arbeit mit BSL-2-Organismen.
- Am nächsten Tag die Nachtkulturen aus dem Brutkasten entfernen und 0,5 ml jeder Kultur zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzufügen. Zentrifuge bei 6.000 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 50-100 l LB aus.
- Die gesamte Zellsuspension in einem Tröpfchen auf eine vorgewärmte LB-Agarplatte geben. Lassen Sie das Tröpfchen trocknen. Dann die Platte invertieren und bei 37 °C für 4-6 h inkubieren.
- Verwenden Sie nach der Inkubation eine sterile Impfschleife, um die Zellen in einem Mikrozentrifugenrohr in 1 ml LB zu sammeln. Pipette nach oben und unten, um die Zellen zu mischen.
- Mit Hilfe eines Zellstreuers streifen die Zellen gleichmäßig auf eine trockene vorgewärmte Pseudomonas Isolation Agar (PIA) Platte, ergänzt durch 300 g/ml Carbenicillin. Streifen Sie mehrere Platten mit zunehmenden Volumina des Zellgemisches (z. B. 10 l, 100 l, 500 l). Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
5. Nachweis von Single-Crossover-Rekombinanten von P. aeruginosa
- Entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und prüfen Sie auf isolierte Carbenicillin-resistente Kolonien. Da sich das pEX100T-NotI-Plasmid in P. aeruginosanicht replizieren kann, sollten Kolonien, die auf Carbenicillin-ergänzten Platten wuchsen, aus Zellen entstanden sein, in denen das Plasmid in das Chromosom integriert wurde.
- Wählen Sie mindestens 4 dieser Kolonien und Streifen für die Isolierung auf vorgewärmten Platten von PIA ergänzt mit 300 g/ml Carbenicillin. Teller über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und prüfen Sie das Wachstum. Carbenicillin-resistente Kolonien sollten Single-Crossover-Rekombinante sein (d.h. sie haben das Plasmid über ein Rekombinationsereignis zwischen einem homologen Bereich des Plasmideinsatzes und dem Chromosom von P. aeruginosain das Chromosom integriert).
- Patch 8 oder mehr Kolonien mit sterilen Zahnstochern auf vorgewärmten Platten von: 1) PIA ergänzt mit 300 g/ml Carbenicillin und 2) PIA, ergänzt durch 300 g/ml Carbenicillin und 10% Saccharose (ohne Glycerin).
- Wenn aus Schritt 5.1 kein Koloniewachstum gewonnen wurde, wiederholen Sie die Konjugation und erhöhen Sie das Volumen der in Schritt 4.5 gestreiften Zellmischung. Wenn zu viel Wachstum aufgetreten ist, wiederholen Konjugation und verringern Sie das Volumen gestreift.
- Wenn die Konjugation wiederholt fehlschlägt, bereiten Sie elektrokompetente Zellen des P. aeruginosa-Stamms vor und transformieren Sie direkt mit dem pEX100T-NotI-Plasmid. Detaillierte Protokolle zur Vorbereitung von elektrokompetenter P. aeruginosa und Transformation sind an anderer Stelle verfügbar13,14.
- Platten bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und prüfen Sie das Wachstum. Echte Single-Crossover-Rekombinanten werden Carbenicillin-resistent und saccharose-empfindlich sein (d.h. Kolonien, die auf PIA mit Carbenicillin ergänzt wuchsen, aber nicht auf PIA wuchsen, ergänzt mit Carbenicillin und Saccharose).
- Wählen Sie 4 oder mehr echte Single-Crossover-Rekombinanten und impfen Sie jeweils in 5 ml LB ohne Auswahl. Ineinem Inkubator bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Wenn keine Single-Crossover-Rekombinanten festgestellt wurden, wiederholen Sie die Konjugation.
6. Nachweis von Doppelüber-Rekombinanten von P. aeruginosa
- Für jede Brühekultur impfen Sie 10 L Kultur auf eine vorgewärmte Platte von PIA, ergänzt mit 10% Saccharose (ohne Glycerin) und Streifen für isolierte Kolonien. Teller über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Am nächsten Tag platten aus dem Inkubator entfernen und auf Wachstum untersuchen. Saccharoseresistente Kolonien sollten Doppel-Crossover-Rekombinante sein (d.h. das Plasmid aus dem Chromosom über ein Rekombinationsereignis zwischen dem anderen homologen Bereich des Plasmideinsatzes und dem P. aeruginosa-Chromosom entfernt haben).
- Aufbissen Sie mindestens 20 Kolonien mit sterilen Zahnstochern auf vorgewärmte Platten von: 1) PIA, 2) PIA, ergänzt mit 10% Saccharose (ohne Glycerin) und 3) PIA, ergänzt mit 300 g/ml Carbenicillin.
- Teller über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf Wachstum. Echte Doppel-Crossover-Rekombinanten werden Carbenicillin-empfindlich und saccharose-resistent sein (d.h. Kolonien, die auf PIA und PIA mit Saccharose ergänzt wuchsen, aber nicht auf PIA wuchsen, ergänzt mit Carbenicillin).
7. Gene Deletion Confirmation über Colony PCR
- Bereiten Sie 10-20 Kolonien für einen Löschbildschirm mit PCR vor.
- Nehmen Sie das Wachstum von einem vermuteten Doppel-Crossover-Rekombinant mit einem sterilen Zahnstocher auf und suspendieren Sie Zellen in 50 l 1x Phosphat gepufferter Saline (PBS). Aufhängung bei 100 °C für 10 min, Zentrifuge für 3 min bei 13.000 x gkochen und dann auf Eis legen.
- Führen Sie PCR durch, um Kolonien für die gezielte Löschung zu überprüfen.
- Verwenden Sie 1 l des Überstandes als Vorlage in einer 25-L-PCR-Reaktion, um die Deletion des gens von Interesse zu bestätigen.
- Verwenden Sie genspezifische Primer, die den Bereich der genomischen Deletion verstärken. Verwenden Sie Primer, die den Bereich der genomischen Deletion plus 100-200 bp flankierender vor- und nachgeschalteter Sequenzen verstärken.
- Bereiten Sie eine separate Steuer-PCR-Reaktion mit dem Elternstamm (z. B. PAO1) vor.
HINWEIS: Die Bedingungen für Thermocycler variieren je nach der optimalen Glühtemperatur für Primerpaare, dem verwendeten Polymerase-Cocktail und der Länge der zu verstärkenden Region.
- Führen Sie Agarose-Gel-Elektrophorese auf den PCR-Produkten durch. Kolonien, in denen die Region von Interesse gestrichen wurde, liefern kleinere Amplifikationsprodukte als Kolonien, denen die Streichung fehlt (Abbildung 2).
- Wählen Sie eine oder mehrere Kolonien mit der PCR-bestätigten Löschung. Streifen für isolierte Kolonien auf eine vorgewärmte PIA-Platte(n) und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Durchgang mindestens ein einziges Mal. Entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und identifizieren Sie eine isolierte Kolonie. Mit einer sterilen Impfschleife, nehmen Sie die Kolonie und streifen eine vorgewärmte PIA AgarPlatte für isolierte Kolonien. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Wählen Sie eine Kolonie aus jeder endgültigen Platte und verwenden Sie, um 5 ml PIB zu impfen. In einem Schüttelinkubator bei 37 °C über Nacht aufstellen.
- 1 ml dieser Kultur mit 1 ml 5% Magermilch in einem Kryovial mischen und bei -80 °C lagern, um einen Vorrat an der Sorte zu erzeugen.
- Mit dieser Kultur bereiten Sie genomische DNA aus dem Stamm vor (z. B. mit einem DNA-Reinigungskit). Verstärken Sie den genomischen Deletionsbereich mit PCR und Primern, die für die Region von Interesse spezifisch sind.
- Reinigen Sie diese PCR-Produkte (z. B. mit einem DNA-Reinigungskit oder Phenol-Chlorform-Extraktion) und sequenzieren Sie entweder direkt mit den genspezifischen Primern oder ligiert in einen Vektor zur Sequenzierung mit Plasmid-spezifischen Primern.
- Nachdem die Genlöschung durch Sequenzierung bestätigt wurde, wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem neuen Deletionsstamm, um sequenziell zahlreiche markerfreie genomische Deletionen zu generieren. Wenn der gewünschte Stamm erzeugt wird, verwenden Sie die gesamte Genomsequenzierung, um die gezielten Löschungen zu überprüfen und andere Veränderungen am Genom (im Vergleich zum Referenzstamm, z. B. PAO1), die während des gesamten Prozesses aufgetreten sind, zu erkennen. Nach der Anmerkung der Gene, hinterlegen Sie die Sequenz bei GenBank und notieren Sie beitrittszahlen.
8. Vorbereitung der bakteriellen Dehnung für Tierversuche
- Um auf abgeschwächte Pathogenität von P. aeruginosa-Stämmen zu testen, bereiten Sie zunächst validierte Kulturen und Bestände vor. Bereiten Sie die P. aeruginosa-Stämme von Interesse, einen wilden Stamm von P. aeruginosa (virulent) und einen von der FDA zugelassenen Stamm von E. coli (z. B. BL21) als nichtpathogene Sicherheitskontrolle vor.
- Streichen Sie die Stämme der Bakterien, die auf selektiven Agar aus sequenzierten und validierten gefrorenen Beständen getestet werden. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Mit einer sterilen Impfschleife, nehmen Sie eine einzelne Kolonie von jedem Stamm und Streifen für isolierte Kolonien auf selektive Medien wieder. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
- Entfernen Sie Platten aus dem Inkubator. Wählen Sie für jede Sorte eine einzelne Kolonie und Streifen für die Isolierung auf LB-Platten.
- Nach 24 h Wachstum bei 37 °C, impfen Sie einen 500 ml Kolben mit 250 ml LB mit einem einzigen Kolonieisolat aus jedem Stamm.
- Validierungsschritt: Mit den Resten derselben Kolonie, validieren Sie den Stamm mit PCR und dehnungsspezifischen Primern und/oder Primern, um das Vorhandensein genetischer Veränderungen am Stamm zu überprüfen. Verwenden Sie die Nachlierung unten für die Überprüfung der Stämme in dem vorgestellten Beispiel:
E. coli BL21:
T7 polymerase F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
T7 polymerase R:TTACGCGAACGCGAAGTCC
VE2 und PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC
- Validierungsschritt: Mit den Resten derselben Kolonie, validieren Sie den Stamm mit PCR und dehnungsspezifischen Primern und/oder Primern, um das Vorhandensein genetischer Veränderungen am Stamm zu überprüfen. Verwenden Sie die Nachlierung unten für die Überprüfung der Stämme in dem vorgestellten Beispiel:
- Inkubieren Sie die Kulturen in einem Schüttelinkubator bei 160 Rpm und 37 °C, bis sie das Wachstum der Logphase erreichen (d. h. OD600 Messung von 0,4-0,6 auf einem Spektralphotometer).
- Berechnen Sie unter Verwendung des OD600-Wertes, der bei der Erreichten Logphase ermittelt wurde, das Volumen der Brühe, das erforderlich ist, um 2,5 x 109 Koloniebildeinheiten (CFU) pro ml zu ergeben. Pellet das Volumen der Brühe in 50 ml Rohre bei 4.500 x g für 10 min berechnet.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Rohr mit 50 ml 1x PBS wieder auf, um die Zellen zu waschen. Zentrifuge wieder bei 4.500 x g für 10 min.
- Den Überstand entsorgen und das Pellet in 25 ml 5% Magermilch in 1x PBS wieder aufhängen.
- Validierungsschritt: Verwenden Sie eine Probe der 25-ml-Resuspension, um tragfähige Plattenzählungen durchzuführen, um die Anzahl der CFU/ml zu bestimmen.
- Aliquot die 25 ml Magermilchkultur Resuspension in 2 ml Kulturbestände in 2 ml Kryovials. Blitz einfrieren in flüssigem Stickstoff und mindestens über Nacht vor Gebrauch bei -80 °C lagern.
9. Validierung des Wachstums und der Stammbestände, die für Tierversuche gespeichert werden.
- Entfernen Sie für jede zu prüfende Sorte mindestens 3 Kryovials gefrorener Bestände aus -80 °C Lagerung und tauen Sie bei 4 °C für 2-4 h auf. Wenn ein gefrorener Vorrat übrig bleibt, kurz bei 37 °C warm.
- Nehmen Sie kleine Proben von jedem Kryovial, um jede Sorte zu validieren.
- Führen Sie lebensfähige Plattenzählungen durch, um die Anzahl der CFU/ml zu bestimmen. Es ist normal, weniger KBE/ml nach dem Einfrieren zu haben, aufgrund des Todes einiger Bakterienzellen.
- Verwenden Sie PCR und dehnungsspezifische Primer, um jeden Stamm zu validieren.
- Streichen Sie jeden Druck auf selektive Medien, um den Phänotyp zu verifizieren.
- Nach der Bestätigung, dass Stämme vom richtigen Genotyp und Phänotyp sind, und die Validierung von KBE/ml, gehen Sie zu Tierversuchen über.
10. Impfung von Tieren mit Bakterienstämmen durch Injektion
- Am Morgen der Injektionen, entfernen Sie Kryovials der getesteten Bakterienstämme und tauen Sie bei 4 °C für 3-4 h. Tauen Sie 0,5 ml für jede Maus, die injiziert wird. Halten Sie Fläschchen nach dem Auftauen auf Eis und injizieren Sie Mäuse innerhalb von 2 h.
- Nach dem Auftauen jedes Kryovial in ein neues 2 ml Rohr und zentrifugieren bei 4.500 x g für 10 min übertragen, den Überstand entsorgen und das Zellpellet in 1 ml 1x PBS wieder aufhängen.
- Zentrifuge wieder bei 4.500 x g für 10 m. Überstand entsorgen und Pellet in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 2,5 x 109 KBE/ml aussetzen. Um die Menge an 1x PBS zu bestimmen, die für die Wiederaufhängung benötigt wird, verwenden Sie die KBE/ml-Daten, die aus lebensfähigen Plattenzählungen für gefrorene Bestände in Schritt 2.2.1 gewonnen werden. Die genaue Menge der verwendeten 1x PBS variiert leicht zwischen den Stämmen.
- Nehmen Sie 3 Proben aus der endgültigen Suspension jedes Stammes, um KBE/ml, Genotyp und Phänotyp wie oben beschrieben zu validieren.
- Für jeden Stamm, aliquot 1,5 ml PBS/Zellsuspension in einem 2 ml Rohr pro 5 Mäuse, um die Anzahl der Einfuhr des Rohres zu begrenzen. Bereiten Sie auch Rohre von 1x PBS für Steuerinjektionen vor.
- Sammeln Sie Mäuse (10 männliche und 10 weibliche C57BL/6 pro Gruppe für dieses Experiment) und Materialien für Injektionen benötigt (Spritzen, Nadeln, scharfe Behälter, Marker, Stift und Papier,etc. ). Bewegen Sie sich in den sterilen Tierchirurgieraum. Wischen Sie alle Oberflächen mit Desonstierungstüchern ab.
- Um Not und Verletzungsrisiko für DenExperimenter zu beseitigen, bringen Sie jeweils nur eine Geschlechts- und Versuchsgruppe von Mäusen in den Operationssaal (z. B. eine Gruppe von 10 männlichen Mäusen, die mit einem bestimmten Stamm infiziert werden sollen). Tragen Sie zwei Paar Latexhandschuhe, um die Punktion von Handschuhen zu vermeiden, wenn sie gebissen werden. Tragen Sie Labormantel, Schutzbrille und Gesichtsmaske, um Verunreinigungen zu vermeiden.
- Beginnen Sie die Injektionen der Kontrollgruppe mit 1x PBS. Dadurch wird festgestellt, ob nebenwirkungende Auswirkungen allein durch Injektion entstehen.
- Entfernen Sie eine Maus aus dem Käfig. Entfernen Sie jeweils nur eine Maus.
- Wiegen Sie die Maus und markieren Sie ihren Schwanz mit permanenten Marker für Gewichtsverlust nach der Injektion zu verfolgen.
- Öffnen Sie eine neue 1 ml Spritze und 27 G Nadel (verwenden Sie eine neue Spritze und Nadel für jede Maus, um Verunreinigungen zu beseitigen) und injizieren Sie 200 l sterile 1x PBS.
- Schnappen Sie sich die Maus hinter den Ohren mit Daumen und Zeigefinger. Pinch, um Hautfalte am Nacken zu schaffen, um zu halten - eine engere Falte reduziert Nackenbewegung und das Risiko, während der Injektion gebissen zu werden. Sichern Sie Schwanz in die Handfläche mit dem Pinky, um Maus flach mit wenig Bewegung zu halten.
- Drehen Sie die Maus um und setzen Sie die Nadel im 30°-Winkel in die Peritonealhöhle auf der linken oder rechten Seite der Mittellinie ein. Heben Sie die Nadel leicht einmal eingesetzt, um sicherzustellen, dass sie in den intraperitonealen Bereich und nicht in Organe eingeführt wurde. Geben Sie die PBS langsam injizieren und ziehen Sie dann die Nadel zurück.
- Legen Sie die verwendete Nadel in einen ausgewiesenen Biohazard Sharps Behälter. Verwenden Sie die Spritze oder Nadel nicht wieder. Ein Bolus an der Injektionsstelle ist typisch.
- Nach der Injektion die Maus in einen separaten Käfig bewegen.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Maus. Nachdem alle Mäuse eines Käfigs injiziert werden, bringen Sie sie sofort in ihren ursprünglichen Käfig zurück.
- Nach der Injektion der Kontrollgruppe, beginnen Sie die Injektion Suspensionen von Stämmen nach dem gleichen Verfahren getestet werden.
- Injizieren Sie 200 l der Zellsuspension. Bei Beginn mit Zellsuspensionen von 2,5 x 109 KBE/ml erhält jede Maus 5 x 108 CFU.
HINWEIS: Diese Konzentrationen wurden mit vorläufiger Tierforschung optimiert, um die tödlichen Dosen jedes Stammes zu bestimmen. Die Dosierung muss möglicherweise für andere Stämme/Arten angepasst werden.
- Injizieren Sie 200 l der Zellsuspension. Bei Beginn mit Zellsuspensionen von 2,5 x 109 KBE/ml erhält jede Maus 5 x 108 CFU.
- Sobald alle Injektionen abgeschlossen sind, kehren Sie Mäuse in den Wohnraum zurück, um Not zu lindern. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinitiertüchern.
- Überwachen Sie die Tiere nach der Injektion auf sterblichkeit, indem Sie Käfige für tote Mäuse alle 3 h für 72 h und alle 12 stunden für 10 Tage überprüfen. Zeichnen Sie das Gewicht von Mäusen alle 12 h auf, um den Gewichtsverlust aufgrund einer Krankheit zu bestimmen.
- Zeichnen Sie negatives Verhalten in den Stunden nach der Injektion auf, wie z. B. Haltungsunterschiede, mangelnde Pflege oder Graben, Unbeweglichkeit oder Atemveränderungen. Mäuse, die an einer Verletzung im Zusammenhang mit der Injektion sterben, zeigen ein unerwünschtes Verhalten und sterben schnell nach der Injektion. Auf der anderen Seite, Mäuse, die an der Infektion sterben wird nicht beginnen, unerwünschtes Verhalten oder Tod bis nach 18 h zeigen. Alle Mäuse, die unerwünschtes Verhalten oder ausgedehnte Anzeichen von Morbidität aufweisen, einschließlich schneller oder mühsamer Atmung, Unbeweglichkeit, geknickter Körperhaltung, versunkener Augen, schwerer Dehydrierung oder anderen, sollten eingeschläfert werden, um unnötiges Leiden zu reduzieren (wie es in unserem genehmigten IACUC-Protokollen). In unseren Experimenten war jedoch für Mäuse während des Experiments keine Euthanametrie erforderlich. Überlebende Mäuse wurden 10 Tage nach Abschluss der Tests eingeschläfert.
- Nach Ablauf der 10-tägigen Überwachung können sich die verbleibenden Tiere vollständig erholen und sich von einer Infektion befreien, die während der Tests verabreicht wird. Einschläferne Tiere nach DEM IACUC-Verfahren.
11. Statistische Analyse der Tiersterblichkeit
- Führen Sie statistische Analysen mit Grafiksoftware durch. Jede Software, die in der Lage ist, Graphen zu erstellen und statistische Analysen durchzuführen, ist geeignet.
- Um die Mortalitätsdaten darzustellen, verwenden Sie die Spalte X, um die Zeit (h) und die Y-Spalte darzustellen, um die getesteten Gruppen darzustellen.
- Stellen Sie jede Maus oder jeden Gegenstand in der Studie mit Code = 0 (Null) oder Code = 1 dar, was auf Überleben bzw. Tod hinweist.
- Legen Sie für jedes Tier, das stirbt, eine 1 in die Y-Spalte dieser Gruppe zum Zeitpunkt des Todes auf der X-Spalte. Wenn es mehrere Todesfälle zu einem einzelnen Zeitpunkt innerhalb einer Gruppe gibt, kann eine Kopie dieses Zeitpunkts in der X-Spalte platziert werden. Wenn z. B. drei Probanden innerhalb einer Gruppe bei 3 h sterben, wird der 3 h-Zeitpunkt dreimal in der X-Spalte angezeigt.
- Platzieren Sie für alle überlebenden Tiere innerhalb einer Gruppe eine Null in der Y-Spalte zum letzten gemessenen Zeitpunkt. Wenn z. B. vier Mäuse überleben, platzieren Sie vier Endzeitpunktpunkte in der X-Spalte, die mit vier Nullen markiert ist, in der Y-Spalte.
- Nachdem Tierdaten für alle Gruppen eingegeben wurden, verwenden Sie eine Survival-Graph-Vorlage, um ein Überlebensdiagramm zu erstellen.
- Lassen Sie die Standardcodierung als 0 und 1.
- Legen Sie die Parameter für das Diagramm als Prozentsatz fest.
- Sobald Parameter für die Überlebenskurve ausgewählt sind, führen Sie statistische Analysen mit einem Mantel-Cox-Test (Log-Rank) durch.
- Formatieren Sie Kaplan-Meier-Plots mit statistischen Daten.
HINWEIS: Stämme, die Sterblichkeitsraten aufweisen, die kleiner oder gleich dem Stamm stammigen und dem von der FDA zugelassenen Stamm (z. B. E. coli BL21) entsprechen, können als abgeschwächt betrachtet werden.
12. Visualisierung der Infektion mit Biolumineszenz
- Um den Fortschritt der Infektion zu visualisieren, legen Sie einen chromosomalen biolumineszierenden Operon (luxCDABE) in den getesteten PGN5- und VE2-Stamm ein. Die Plasmide und das Protokoll, mit dem diese Stämme gekennzeichnet wurden, wurden im Schweizer Labor entwickelt und sind möglicherweise nicht mit allen Arten/Stämmen von Bakterien kompatibel13. Wichtig ist, dass die Visualisierung der Infektion optional ist; daher ist die genomische Einfügung dieses Operons nicht erforderlich, um die oben beschriebene Mortalitätsstudie durchzuführen.
- Vorbereiten und Validieren von Stämmen mit der oben beschriebenen Methode. Prüfen Sie außerdem bei jedem Validierungsschritt auf Biolumineszenz in markierten Stämmen.
- Nachdem Stämme vorbereitet wurden, injizieren Sie die Tiere in Gruppen von 10 mit den biolumineszierenden Stämmen nach den oben genannten Schritten.
- Die Tiere alle 3 h für 24 h mit einem Tierbildgebungssystem, das biolumineszieren kann, zu beleuchten.
- Bereiten Sie zuerst den Imager vor, indem Sie die Kameraparameter einstellen und die Bühne für die Tiere erwärmen. Stellen Sie auch den Sauerstoffstrom auf 1,5 l pro min ein (oder nach den Empfehlungen des Herstellers).
- Nachdem der Bildrund und das Stadium stabilisiert sind, legen Sie unmittelbar nach der Injektion eine Maus in die Anästhesiekammer und verabreichen Sie 3,5% Isofluran in die Kammer mitO2-Fluss ca. 4 min. Die Anästhesiemethoden können je nach verwendeter Kammer und/oder Anästhesie variieren; den Empfehlungen des Herstellers folgen. Bestimmen Sie die richtige Anästhesie mittels Entzugsreflextest.
- Bewegen Sie die Maus in die temperaturstabilisierte Stufe. Positionieren Sie die Maus auf dem Rücken mit ausgestreckten Armen und passen Sie die Maus mit einem Nasenkegel für die Verabreichung von 2,5% Isofluran während des gesamten Bildgebungsverfahrens.
- Schließen Sie die Tür und nehmen Sie biolumineszierende Bilder und Röntgenaufnahmen der Maus.
- Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, kehren Sie die Maus in ihren Käfig zurück und überwachen Sie sie. Die Maus sollte das Bewusstsein innerhalb von 3-5 min wiedererlangen.
- Fahren Sie mit dem Bild Von Mäusen alle 3 h für 24 h fort, jedes Mal mit einer anderen Maus aus jeder Gruppe. Stellen Sie eine Maus nicht innerhalb von 24 h wieder auf, da eine erneute Exposition gegenüber der Anästhesie auf nachteilige Auswirkungen zurückzuführen ist. Eine einzelne Maus sollte nur alle 24-36 h eine Dosis Anästhesie erhalten. Reinigen Sie die Bildplattform, nachdem jede Maus abgebildet wurde. Schalten Sie die Bildkamera zwischen den Bildzeitpunkten aus.
HINWEIS: Die Biolumineszenz verblasst, unabhängig von der injizierten Belastung. Die Intensität und Langlebigkeit der Biolumineszenz variiert je nach vielen Faktoren, einschließlich der Anzahl der injizierten Bakterien, Mausstamm, Bakterienstamm, etc.
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Representative Results
Wie in Abbildung 2dargestellt, kann die gezielte genomische Deletion mit Kolonie-PCR mit spezifischen Primern bestätigt werden, die die Interessensregion verstärken. Kolonien, die eine genomische Deletion tragen, ergeben eine kürzere PCR-Bandgröße im Vergleich zu Wildtypkolonien. Ein PCR-Bildschirm von 10-12 Kolonien ist in der Regel ausreichend, um mindestens eine Kolonie zu erkennen, die die gezielte Löschung trägt. Wenn nach mehreren Bildschirmrunden keine Löschungen erkannt werden, wiederholen Sie den Vorgang, der mit der Konjugation beginnt. Wenn die Löschung immer noch fehlschlägt, muss der Plasmideinsatz möglicherweise durch Sequenzierung, Neugestaltung oder tödliche Sequenz bestätigt werden. Nach der Überprüfung einer Genlöschung über PCR, bestätigen Sie die Löschung durch Sequenzierung. Der resultierende Stamm kann wiederholt dem Verfahren unterzogen werden, um sequenzielle genomische Modifikationen zu erzeugen.
Wie in Abbildung 3dargestellt, betrug die Sterblichkeit im Zusammenhang mit der intraperitonealen Injektion des abgeschwächten Stammes von P. aeruginosa PGN5 (+mucE) 0%, was der mit E. coli BL21 beobachteten Mortalität entsprach. Auf der anderen Seite war die intraperitoneale Injektion des Elternstamms (VE2) für 80% der Mäuse tödlich. Diese Ergebnisse wurden mit umfangreichen Schritten zur Validierung der injizierten Stämme erzielt. Während die genaue Todesursache bei diesen Mäusen unbekannt ist, kann sie zumindest teilweise auf die Expression von Virulenzfaktoren im Elternstamm zurückgeführt werden, die aus dem abgeschwächten PGN5-Stamm gelöscht wurden. Unterschiede in der Infektionsprogression wurden mit biolumineszenzmarkierten Eltern und abgeschwächten Stämmen verfolgt. Der abgeschwächte Stamm blieb an der Injektionsstelle lokalisiert, bis die Biolumineszenz verblasste (Abbildung 4). Die Clearance der Infektion fiel höchstwahrscheinlich mit dem Verblassen der Biolumineszenz zusammen. Die Biolumineszenz wurde 24 h nach der Injektion nicht nachgewiesen und Mäuse lebten wochenlang nach der Injektion, bis sie geopfert wurden, ohne dass Nebenwirkungen beobachtet wurden.
Abbildung 1: Generierung von Gendeletionen in P. aeruginosa mit pEX100T-NotI. (A) Karte des pEX100T-NotI Plasmids. (B) Erzeugung eines Konstrukts, das aus Regionen besteht, die direkt vor -gelb (gelb) und flussabwärts (blau) der Interessenregion (ROI) liegen und mit NotI-Beschränkungs-Enzymerkennungsstellen flankiert werden. Erstens, PCR-verstärken vor- und nachgelagerte Regionen unabhängig mit spezifischen Primern, die 5' NotI-Verdauungsstellen hinzufügen (z. B. NotI-aroA F CGCGGCCGCTGAAGGTCCTGGGCTCTTATCCGAAAGCGGTGCTCT und NotI-aroA R GCGGCCGCAGTTGGGTTGTGTGTGTGTGGGGGCGCCAGGCA) und 3' überlappende homologe Regionen (z.B. aroA-Crossover F CTCCAGGCGCGGGGGG ACA und aroA-Crossover R TGTTCTCCACGGCGACCGGCGTGACCACCTCACGCGCGCACCTTGCCCAGCGCCTGGAG. Verwenden Sie dann PCR mitNotI-haltigen Primern, um die vor- und nachgelagerten Produkte zu verbinden, die in der ersten PCR-Reaktion erzeugt wurden. (C) Das pEX100T-NotI Plasmid, bewaffnet und bereit. Ligate das NotI-verdaute Cross-over-PCR-Produkt in das NotI-verdautes Plasmid. (D) Flussdiagramm des Prozesses zum Löschen genomischer Regionen aus dem P. aeruginosa Chromosom mit dem pEX100T-NotI-Plasmid. Nachdem die gewünschte Deletion bestätigt und gereinigt wurde, kann der resultierende Stamm wiederholt durch das Verfahren genommen werden, um andere genomische Regionen aus dem Chromosom zu löschen. Wenn der gewünschte Stamm erhalten ist, sequenzieren Sie das gesamte Genom, um Deletionen und andere Veränderungen am Chromosom zu bestätigen. Die Pathogenität des Stammes kann dann an Mäusen nach dem in Teil II des Protokolls beschriebenen Verfahren getestet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gelelektrophorese von Kolonie-PCR-Produkten von einem Bildschirm für aroA-Deletion, um den abgeschwächten P. aeruginosa-Stamm, PGN5, zu erzeugen. Kolonie PCR-Produkte laufen in den Bahnen 2-5 und 8-11 zeigen Kolonien mit Wild-Typ aroA. Colony PCR-Produkte, die in den Bahnen 6 und 7 laufen, tragen die era-Genlöschung, die durch das kleinere PCR-Produkt (gelbe Sternchen) angezeigt wird. Die verwendeten Primer verstärkten speziell die genomische Region, die das aroA-Gen enthält: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGCUND und aroA-R: ATCTGGCTCGCTCTGCCGGTCC. Die erwartete PCR-Produktgröße in Wildkolonien betrug 2.548 Nukleotide (nt). Erwartete PCR-Produktgröße in Kolonien mit aroA Löschung war 307 nt. Eine DNA-Leiter wurde in den Bahnen 1 und 12 geführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gesamtsterblichkeit von Mäusen, die mit pathogenem P. aeruginosa-Stamm (VE2), abgeschwächtem P. aeruginosa-Stamm (PGN5+mucE) und FDA-Kontroll-E. coli-Stamm (BL21) injiziert wurden. Nur Mäuse, die mit pathogenem Elternstamm injiziert wurden, wiesen eine Sterblichkeit von 80 % auf. Abgeschwächter P. aeruginosa-Stamm und FDA-Kontroll-E. coli-Stamm wiesen eine Sterblichkeit von 0% auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bild der Maus 3 h nach der Injektion von abgeschwächtem Stamm von P. aeruginosa PGN5+mucE mit einem biolumineszierenden Marker. Die biolumineszierenden Bakterien waren bis 18-24 h nach der Injektion nachweisbar. Während dieser Zeit blieb die Biolumineszenz an der Injektionsstelle, was darauf hindeutet, dass die Bakterien an der Injektionsstelle lokalisiert blieben. Diese Maus vollständig erholt, ohne nachteilige Auswirkungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das pEX100T-Not1 Plasmid ist ein effizienter Vermittler sequenzieller genomischer Deletionen, die markerfrei und im Rahmen sind. Bei der Entwicklung von Bakterienstämmen für abgeschwächte Virulenz verringert das Löschen ganzer Gensequenzen anstatt Punktmutationen zu generieren, die Wahrscheinlichkeit einer Rückkehr zu einem virulenten Phänotyp. Zusätzlich dämtt jede Pathogenitätsgen-Deletion den Erreger weiter ab und verstärkt die Stabilität der Dämpfung.
Diese Methode kann auch verwendet werden, um andere genomische Modifikationen als Deletionen zu erzeugen, wie Punktmutationen und Einfügungen, einfach durch Änderung des Designs des Plasmideinsatzes. Diese Arten von Modifikationen können nützlicher sein als ganze Genlöschungen für technische Bakterien mit modifiziertem Stoffwechsel, zum Beispiel. Sequenzielle genomische Modifikation hat erhebliches Potenzial für die Erzeugung von Designer-Bakterienstämmen für spezifische Zwecke in Forschung und Industrie. Andere Methoden zur Erzeugung gewünschter markerfreier genomischer Modifikationen bei Bakterien wurden beschrieben15,16,17,18. Wie bei allen Genom-Editing-Methoden können versuchte Modifikationen an essentiellen Genomregionen tödlich und damit erfolglos sein. In diesen Fällen ist die Identifizierung verschiedener genetischer Modifikationen oder anderer Kandidatengene erforderlich, um den bakteriellen Stamm von Interesse zu erzeugen.
Angesichts der zahlreichen Replikationsereignisse und Passagen jeder Kolonie in diesem Protokoll werden unbeabsichtigte Veränderungen des Genoms an der erzeugten Sorte auftreten. Die genauen genomischen Veränderungen können durch DieSequenzierung des Ganzen Genoms identifiziert werden. Die Auswirkungen dieser Änderungen sind jedoch schwieriger zu bestimmen. Bei der Entwicklung von Bakterien für einen bestimmten Zweck sind genomische Veränderungen, die das Wachstum des Organismus oder der Zielwege nicht negativ beeinflussen, tolerierbar. Je nach erzeugtem Stamm kann es möglich sein, eine "Auslesung" zu identifizieren, um sicherzustellen, dass die Sorte weiterhin für den vorgesehenen Zweck nützlich ist. Mit PGN5 war es beispielsweise das Ziel, eine abgeschwächte Sorte zu erzeugen, die die Fähigkeit beibehielt, große Mengen Alginat zu produzieren. Nach dem Löschen von fünf Pathogenitätsgenen wurde die Menge und Zusammensetzung des von PGN5 produzierten Alginats gemessen und als vergleichbar mit anderen Alginat-produzierenden Stämmen ermittelt. So blieb die Alginatproduktion weder durch die fünf Genlöschungen noch durch die unbeabsichtigten genomischen Veränderungen beeinflusst, die während der Entwicklung von PGN5 auftraten.
Ein Modell der intraperitonealen Mausinjektion wurde verwendet, um festzustellen, ob ein technischer Stamm im Vergleich zum Stamm stammund und E. coli BL21, einem stammigen Stamm, der von der FDA für die Herstellung von Biopharmazeutika zugelassen wurde, abgeschwächt wurde. Die wichtigsten Schritte, die während dieses Tierversuchs unternommen wurden, waren die Vorbereitung und Validierung gefrorener Bakterienbestände. Die Präparation und Verwendung von gefrorenen Bakterienkulturen zur Injektion von Mäusen ist der Verwendung kontinuierlicher Kultur vorzuziehen, da sie die Anzahl der Mutationen reduziert, die natürlicherweise in Bakterienpopulationen auftreten19. Darüber hinaus sollten gefrorene Kulturen über Jahre lebensfähig bleiben. Die Anzahl der lebensfähigen Platten zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen der KBE/ml direkt nach der Vorbereitung der Bestände und drei Monaten nach der Zubereitung. Die Verwendung mehrerer Validierungsschritte während dieses Verfahrens stellte sicher, dass die Methode reproduzierbar war und die Ergebnisse nicht durch kontaminierende Bakterien verzerrt wurden. Darüber hinaus waren aufgrund der Anzahl der Zurgewährleistung der Reproduzierbarkeit weniger Tiere erforderlich. Mit einem bakteriellen Stamm, der FDA-zugelassen für die biopharmazeutische Produktion als Kontrolle (wie E. coli-Stamm BL21), Könnte diese Methode verwendet werden, um die Dämpfung von anderen gentechnisch veränderten Stämmen von P. aeruginosa, oder andere Arten von Bakterien zu testen.
Die Verwendung von Biolumineszenz als Marker ermöglicht eine zusätzliche Validierung der injizierten Bakterienstämme, da der Marker an der Injektionsstelle visualisiert werden kann. Die Einfügung des Biolumineszenzmarkers in das bakterielle Chromosom ist für die Biolumineszenz-Bildgebung erforderlich, ist aber möglicherweise nicht möglich, wenn sie mit inkompatiblen Stämmen/Arten arbeiten. Die Kennzeichnung von Stämmen mit Biolumineszenz ist jedoch nicht erforderlich, um die Dämpfung zu testen. Die in dieser Studie getesteten Stämme waren mit Biolumineszenz gekennzeichnet, die eine Visualisierung der Lokalisierungsunterschiede zwischen den Stämmen im Verlauf der Infektion ermöglichte. Wir beobachteten, dass sich der pathogene Stamm durch den Körper der Maus verbreitete, aber der nichtpathogene Stamm blieb an der Injektionsstelle. Während dieses Experiment nur zwei sehr eng verwandte Stämme von P. aeruginosagetestet hat, deutet es darauf hin, dass die bakterielle Verbreitung mit Virulenz verbunden ist, zumindest in P. aeruginosa. So könnte dieses Verfahren der Kennzeichnung mit Biolumineszenz zur Visualisierung des Fortschreitens der Infektion in Zukunft verwendet werden, um die Dämpfung von technischen Bakterienstämmen schnell zu bewerten.
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Disclosures
Der Autor Hongwei D. Yu ist Chief Science Officer und Mitbegründer von Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit (NIH) Stipendien R44GM1113545 und P20GM103434 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
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