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Immunology and Infection

स्यूडोमोनास एरुजिनोसा में इन-फ्रेम जीन विलोपन म्यूटेंट की पीढ़ी और संक्रमण के एक साधारण माउस मॉडल में विरुलेंस क्षीणन के लिए परीक्षण

Published: January 8, 2020 doi: 10.3791/60297
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

Summary

यहां, हम संयुक्त राज्य अमेरिका खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) की तुलना में स्यूडोमोनास एरुजिनोसा के आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों के क्षीणहोने का मूल्यांकन करने के लिए संक्रमण के माउस मॉडल के एक सरल और प्रजनन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं- वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के लिए एस्चेरिचिया कोलाई को मंजूरी दे दी।

Abstract

सूक्ष्मजीव आनुवंशिक रूप से बहुमुखी और विविध हैं और कई वाणिज्यिक उत्पादों और बायोफार्मास्युटिकल्स का एक प्रमुख स्रोत बन गए हैं। हालांकि इनमें से कुछ उत्पाद स्वाभाविक रूप से जीवों द्वारा उत्पादित होते हैं, लेकिन अन्य उत्पादों को उत्पादन की पैदावार बढ़ाने के लिए जीव की जेनेटिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है । एस्चेरिचिया कोलाई के एविरूलेंट उपभेद पारंपरिक रूप से बायोफार्मास्युटिकल्स के उत्पादन के लिए पसंदीदा जीवाणु प्रजातियां रही हैं; हालांकि, कुछ उत्पादों ई. कोलाई के लिए उत्पादन करने के लिए मुश्किल हैं । इस प्रकार, अन्य जीवाणु प्रजातियों के एविरूलेंट उपभेदों कुछ वाणिज्यिक उत्पादों के उत्पादन के लिए उपयोगी विकल्प प्रदान कर सकता है। स्यूडोमोनास एरुजिनोसा एक आम और अच्छी तरह से अध्ययन किया गया ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है जो ई कोलाईके लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रदान कर सकता है। हालांकि, पी aeruginosa एक अवसरवादी मानव रोगजनक है । यहां, हम एक प्रक्रिया का विस्तार करते हैं जिसका उपयोग pEX100T-NotI प्लाज्मिड का उपयोग करके अनुक्रमिक जीनोमिक विलोपन के माध्यम से पी एरुजिनोसा के नॉनपैथोजेनिक उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि का मुख्य लाभ मार्कर मुक्त तनाव का उत्पादन करना है। इस विधि का उपयोग वाणिज्यिक उत्पादों के उत्पादन के लिए अत्यधिक तनु पी एरुजिनोसा उपभेदों को उत्पन्न करने या अन्य विशिष्ट उपयोगों के लिए उपभेदों को डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है। हम ई कोलाईके एफडीए-अनुमोदित BL21 तनाव की तुलना में आनुवंशिक रूप से इंजीनियर तनाव के क्षीणहोने का परीक्षण करने के लिए मान्य परीक्षण उपभेदों के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से बैक्टीरियल प्रणालीगत संक्रमण के एक सरल और प्रजनन योग्य माउस मॉडल का भी वर्णन करते हैं।

Introduction

स्यूडोमोनास एरुजिनोसा एक अवसरवादी जीवाणु रोगजनक है जो मनुष्यों में जीवन के लिए खतरा पैदा कर सकता है, विशेष रूप से इम्यूनोसमझौता में। पी एरुजिनोसा की रोगजनकता कई उग्रता कारकों की अभिव्यक्ति के कारण है, जिसमें प्रोटीज़ और लिपोपॉलीसैक्जारिडी, साथ ही एक सुरक्षात्मक बायोफिल्म1बनाने की क्षमता भी शामिल है। क्योंकि इसकी क्षमता के लिए उग्रता कारकों का उत्पादन और मनुष्यों में रोग का कारण, पी aeruginosa का उपयोग करने के लिए वाणिज्यिक उत्पादों को सुरक्षा चिंताओं को प्रस्तुत करता है । ई. कोलाई के नॉनपैथोजेनिक उपभेदों का उपयोग पारंपरिक रूप से मानव उपयोग के लिए चिकित्सा और वाणिज्यिक उत्पादों को बायोइंजीनियर करने के लिए किया गया है। हालांकि, कुछ उत्पादों को ई. कोलाई बनाने के लिए मुश्किल है, और कई शामिल निकायों में पैक कर रहे हैं, निष्कर्षण श्रमसाध्य बना । विशिष्ट उत्पादों को बनाने और स्रावित करने की क्षमता के साथ इंजीनियर बैक्टीरियल उपभेदअत्यधिक वांछनीय है, क्योंकि स्राव की संभावना उपज में वृद्धि होगी और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं को कम करेगी। इस प्रकार, बैक्टीरिया की अन्य प्रजातियों के नॉनपैथोजेनिक उपभेदों (उदाहरण के लिए, प्रजातियां जो अधिक स्राव मार्गों का उपयोग करती हैं) ई कोलाईके लिए उपयोगी विकल्प प्रदान कर सकती हैं। हमने हाल ही में पी एरुजिनोसा,पीजीएन5 के तनाव के विकास की सूचना दी, जिसमें जीव की रोगजनकता और विषाक्तता अत्यधिक क्षीणहोगई है। महत्वपूर्ण बात, यह तनाव अभी भी बड़ी मात्रा में पॉलीसैकराइड अल्गिनेट का उत्पादन करता है, जो पी एरुगिनोसा बायोफिल्म का व्यावसायिक रूप से दिलचस्प घटक है।

PGN5 तनाव pEX100T-NotI प्लाज्मिड के साथ एक दो कदम allelic विनिमय प्रक्रिया का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था क्रमिक रूप से पांच जीन(विषाणु, पीएलएच, phzM, wapR, aroa)को हटाने के लिए जीव की रोगजनकता में योगदान करने के लिए जाना जाता है । pEX100T-NotI प्लाज्मिड pEX100T की कई क्लोनिंग साइट के भीतर एक नोटी प्रतिबंध एंजाइम मान्यता स्थल के लिए SMAI बदल कर उत्पन्न किया गया था, जो हर्बर्ट श्वाइज़र की प्रयोगशाला3,4में विकसित किया गया था । प्रतिबंध एंजाइम NotI के लिए मान्यता साइट SMAI की तुलना में एक दुर्लभ डीएनए अनुक्रम है और कम दृश्यों क्लोन किया जा रहा दृश्यों में मौजूद होने की संभावना है, इस प्रकार यह क्लोनिंग प्रयोजनों के लिए और अधिक सुविधाजनक है । प्लाज्मिड जीन है कि चयन के लिए अनुमति देते हैं, बला जीन सहित, जो ß-लैक्टामास को एन्कोड करता है और कार्बेनिकलिन के प्रतिरोध प्रदान करता है, और बी सबटिलिसाक बी जीन, जो सुक्रोज(चित्रा 1ए)के प्रति संवेदनशीलता प्रदान करता है । प्लाज्मिड में ई कोलाईके साथ संगत प्रतिकृति(ओरी)की उत्पत्ति और हस्तांतरण(ओरीटी)की उत्पत्ति भी होती है जो ई कोलाई से स्यूडोमोनास प्रजातियों को संजुगन के माध्यम से प्लाज्मिड हस्तांतरण की अनुमति देती है। हालांकि, प्लाज्मिड में स्यूडोमोनासके साथ संगत प्रतिकृति की उत्पत्ति का अभाव है, और इस प्रकार स्यूडोमोनास प्रजातियों के भीतर दोहराने नहीं जा सकता (यानी, यह एक स्यूडोमोनास आत्मघाती वेक्टर है)। ये विशेषताएं स्यूडोमोनास गुणसूत्र से आनुवंशिक विलोपन को लक्षित करने के लिए pEX100T-NotI आदर्श बनाती हैं। प्लाज्मिड क्लोनिंग चरण ई कोलाई का उपयोग करके किए जाते हैं और परिणामी प्लाज्मिड को परिवर्तन या संजुगन द्वारा स्यूडोमोनास में स्थानांतरित किया जाता है। फिर, समरूप पुनर्संयोजन घटनाओं और चयनात्मक चरणों के माध्यम से, लक्षित इन-फ्रेम हटाने उत्पन्न होता है, मार्कर मुक्त। क्रमिक रूप से पी aeruginosa के गुणसूत्र से जीनोमिक क्षेत्रों को हटाने की इस विधि का उपयोग उच्च तनु हुए स्यूडोमोनास उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जैसे PGN5, या अन्य विशिष्ट उपयोगों के लिए उपभेदों को डिजाइन करने के लिए (उदाहरण के लिए, प्लाज्मिड प्रचार के लिए एंडोन्यूलीज में कमी या उपभेदों की कमी प्रोटीन के निर्माण के लिए प्रॉजेक्ट्स में कमी) का उपयोग किया जा सकता है।

बैक्टीरिया के उपभेदों की समग्र उग्रता विकास की स्थिति और चरणों से प्रभावित होती है, जिसके दौरान उत्परिवर्तन अक्सर होते हैं। इसलिए, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर उपभेदों की सुरक्षा को मापने चुनौतीपूर्ण हो सकता है। प्रणालीगत उग्रता के लिए बैक्टीरियल आइसोलेट्स का मूल्यांकन करने के लिए, हमने C57BL/6 चूहों5के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा संक्रमण के पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया । हमने इंजेक्शन के लिए जमे हुए बैक्टीरियल स्टॉक का उपयोग करने के लिए इस प्रक्रिया को संशोधित किया, जिसने उपयोग किए गए उपभेदों के सटीक खुराक और आसान सत्यापन के लिए अनुमति दी। इस मॉडल में, ई कोलाई स्ट्रेन BL21, जिसे बायोफार्मास्युटिकल्स के उत्पादन के लिए एफडीए-अनुमोदित किया गया है, का उपयोग तनाव6,7,8के सापेक्ष रोगजनन का निर्धारण करने के लिए एक नियंत्रण सुरक्षा मानक के रूप में किया गया था। इस विधि का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रजनन योग्य है और भिन्नता के स्रोतों को कम करता है, क्योंकि संक्रमण से पहले और बाद में बैक्टीरियल सेल संख्या, फेनोटाइप और आनुवंशिक मार्कर के लिए संक्रमित उपभेदों को मान्य किया जाता है। इन नियंत्रित कदमों के साथ, आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो जाती है। इस मॉडल में, पी aeruginosa उपभेदों कि C57BL/6 murine मृत्यु दर के बराबर या ई. कोलाई BL21 से कम है जब इंट्रापेरिटोनी इंजेक्शन तनु माना जा सकता है । संक्रमण के इस सरल माउस मॉडल का उपयोग संदर्भ के रूप में एफडीए-अनुमोदित ई. कोलाई तनाव का उपयोग करके अन्य प्रजातियों से आनुवंशिक रूप से इंजीनियर उपभेदों की तनु रोगजनकता का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है। चरण 1-7 विस्तार पी aeruginosa में अनुक्रमिक जीनोमिक विलोपन की पीढ़ी(चित्रा 1)और चरण 8-12 विस्तार पी aeruginosa उपभेदों की रोगजनकता का परीक्षण करने के लिए एक माउस मॉडल के उपयोग ।

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Protocol

पशु प्रयोगों की शुरुआत करने से पहले, इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनुमोदन मार्शल विश्वविद्यालय (हंटिंगटन, डब्ल्यूवी, यूएसए) में आईएसएसीयूसी के माध्यम से प्राप्त किया गया था।

1. प्लाज्मिड डिजाइन

  1. pEX100T-NotI प्लाज्मिड का उपयोग करके एक आनुवंशिक विलोपन उत्पन्न करने के लिए, वांछित विलोपन अनुक्रम को फ्लैंकिंग डीएनए के क्षेत्रों का क्लोन करें और प्लाज्मिड की नोटी प्रतिबंध साइट में डालें। प्लाज्मिड डालने में लक्ष्य हटाने के अनुक्रम के लगभग 500 न्यूक्लियोटाइड्स डाउनस्ट्रीम से सीधे लक्ष्य अनुक्रम के लगभग 500 न्यूक्लियोटाइड्स अपस्ट्रीम होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, डालने में नोटी मान्यता अनुक्रम (GCGGCCGC) अपने 5 ' और 3 ' समाप्त होता है(चित्रा 1बी)शामिल होना चाहिए ।

2. प्लाज्मिड तैयारी

  1. विकल्प 1: पारंपरिक क्लोनिंग प्रक्रियाओं का उपयोग करें। उत्पन्न टुकड़ों में शामिल होने के लिए क्रॉसओवर पीसीआर9,10, पीसीआर उत्पाद और प्लाज्मिड के प्रतिबंध एंनोटुक पट्टा, और लिगेशन11 (चित्रा 1बी, सी)में शामिल होने के लिए, जीनोमिक क्षेत्रों को बढ़ाने के लिए पीसीआर का उपयोग करें।
  2. विकल्प 2: सिलिको में विलोपन अनुक्रम डिजाइन करने के बाद, एक कंपनी को अनुबंधित करें जो इसे प्लाज्मिड pEX100T-NotI में डालने के लिए संश्लेषित करती है। कई कंपनियों ने जल्दी और कुशलता से ब्याज के प्लाज्मिड उत्पन्न करने के लिए क्लोनिंग की प्रक्रिया को सुव्यवस्थित किया है। इसके अतिरिक्त, अनुक्रम प्रसव से पहले प्लाज्मिड को म्यूटेशन-फ्री होने के लिए सत्यापित करता है।

3. ई. कोलाई परिवर्तन

  1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार प्लाज्मिड के साथ इलेक्ट्रोसक्षम ई कोलाई को बदलें। एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग करना, एक पूर्व गर्म Luria शोरबा (पौंड) आगर प्लेट पर अलग कालोनियों के लिए परिवर्तन प्रतिक्रिया के 10 μL लकीर १०० μg/कार्बेनिकलिन के mL के साथ पूरक है और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनक्यूबेट ।
    नोट: सभी उपकरण और मीडिया संस्कृति बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया संस्था के सुरक्षा दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया जाना चाहिए ।
  2. दो बार मार्ग।
    1. इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और एक अलग कॉलोनी की पहचान करें। एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग करना, कॉलोनी लेने और लकीर एक पूर्व गरम पौंड आगर प्लेट १०० μg के साथ पूरक/ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। शुद्ध संस्कृति उत्पन्न करने के लिए इस कदम को एक बार और दोहराएं।
  3. एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग करना, अंतिम आगर प्लेट से एक ही कॉलोनी के साथ पौंड के 5 मिलील टीका । संस्कृति को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में रखें। अगले दिन, तनाव का एक जमे हुए स्टॉक उत्पन्न करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर - 80 डिग्री सेल्सियस पर - 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने में 5% के 1 मिलील के साथ इस संस्कृति का 1 मिलीसल मिलाएं।

4. बैक्टीरियल स्ट्रेन तैयारी और त्रिमाता-पिता का संयुग्म

  1. शोरबा संस्कृतियों का टीका लगाने के लिए निम्नलिखित उपभेदों की आगर प्लेटों से एक अलग कॉलोनी का उपयोग करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में रखें।
    1. कार्बेनिकलिन के 100 μg/mL के साथ पूरक एलबी के 5 मिलील में ई कोलाई pEX100T-NotI जोड़ें।
    2. पी aeruginosa तनाव PAO1 स्यूडोमोनास आइसोलेशन शोरबा (पीआईबी) के 5 mL में जोड़ें ।
    3. 50 μg/kanamycin के mL के साथ पूरक पौंड के 5 mL में ई. कोलाई prk2013 जोड़ें।
      नोट: prk2013 प्लाज्मिड एक सहायक प्लाज्मिड है जो ई. कोलाई में प्रतिकृति करता है लेकिन पी एरुगिनोसानहीं ; यह ट्रांस-एक्टिंग ट्रांसफर जीन करता है जो ई कोलाई डोनर से पी एरुजिनोसा प्राप्तकर्ता12तक pEX100T-NotI प्लाज्मिड जुटाता है। पी एरुजिनोसा एक बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल-2) रोगजनक है। बीएसएल-2 जीवों के साथ काम करते समय सुरक्षा के लिए संस्था के दिशा-निर्देशों का पालन करें।
  2. अगले दिन, इनक्यूबेटर से रातोंरात संस्कृतियों को हटा दें और प्रत्येक संस्कृति के 0.5 मिलील को 1.5 मिलीएम माइक्रोसेन्ट्रोफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। 5 मिन के लिए 6,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुपरनेटेंट को त्यागें और एलबी के 50-100 माइक्रोन में सेल पेलेट को निलंबित करें।
  3. एक पूर्व गर्म पौंड आगर प्लेट पर एक बूंद में पूरे सेल निलंबन पिपेट । बूंद को सूखने दें। फिर प्लेट को उलटा और 4-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. ऊष्मायन के बाद, एक बाँझ टीका पाश का उपयोग करने के लिए एक माइक्रोसेंस्ट्रीफ्यूज ट्यूब में पौंड के 1 mL में कोशिकाओं को इकट्ठा । कोशिकाओं को मिलाने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  5. एक सेल स्प्रेडर का उपयोग करना, लकीर कोशिकाओं को समान रूप से एक सूखी पूर्व गरम स्यूडोमोनास आइसोलेशन आगर (पिया) कार्बेनिकलिन के ३०० μg/mL के साथ पूरक थाली पर । सेल मिश्रण (जैसे, 10 μL, 100 μL, 500 μL) की बढ़ती मात्रा के साथ लकीर कई प्लेटें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

5. पी aeruginosa के एकल अंतरराष्ट्रीय Recombinants का पता लगाने

  1. इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाएं और अलग-थलग कार्बेनिकलिन प्रतिरोधी कॉलोनियों के लिए निरीक्षण करें। क्योंकि pEX100T-NotI प्लाज्मिड पी aeruginosaमें दोहराने नहीं कर सकते, कालोनियों कि कार्बेनिकलिन-पूरक प्लेटों पर वृद्धि हुई कोशिकाओं में प्लाज्मिड गुणसूत्र में एकीकृत किया गया था से पैदा होना चाहिए था ।
    1. इन कालोनियों में से कम से 4 चुनें और पीआईए की पूर्व-गरम प्लेटों पर अलगाव के लिए लकीर 300 μg/कार्बेनिकलिन के एमएल के साथ पूरक है। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  2. इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाएं और विकास के लिए निरीक्षण करें। कार्बेनिसिलिन प्रतिरोधी उपनिवेशएकल-क्रॉसओवर रिकॉम्बिनेंट होने चाहिए (यानी, उन्होंने प्लाज्मिड डालने के एक समरूप क्षेत्र और पी एरुजिनोसाके गुणसूत्र) के बीच एक पुनर्संयोजन घटना के माध्यम से गुणसूत्र में प्लाज्मिड को शामिल किया है।
    1. पैच 8 या अधिक कालोनियों के पूर्व गर्म प्लेटों पर बाँझ टूथपिक्स के साथ: 1) पिया ३०० μg/कार्बेनिकलिन और 2 के mL के साथ पूरक) पिया ३०० μg/कार्बेनिकलिन के mL और 10% सुक्रोज (ग्लाइसेरोल के बिना) के साथ पूरक ।
    2. यदि चरण 5.1 से कोई कॉलोनी विकास प्राप्त नहीं किया गया था, तो कॉन्जुरेशन दोहराएं और चरण 4.5 में लकीर वाले सेल मिश्रण की मात्रा बढ़ाएं। यदि बहुत अधिक वृद्धि हुई, तो संयुग्मको दोहराएं और वॉल्यूम को कम करें।
    3. यदि कॉन्जुर्गेशन बार-बार विफल रहता है, तो पी एरुजिनोसा तनाव की इलेक्ट्रोसक्षम कोशिकाओं को तैयार करें और सीधे pEX100T-NotI प्लाज्मिड के साथ बदलें। इलेक्ट्रोसक्षम पी एरुजिनोसा और परिवर्तन की तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल कहीं और उपलब्ध हैं13,14।
  3. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  4. इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाएं और विकास के लिए निरीक्षण करें। यह सच है कि एकल-क्रॉसओवर रिकॉम्बिनेंट कार्बेनिकलिन-प्रतिरोधी और सुक्रोज-संवेदनशील (यानी, पीआईए पर बढ़ी हुई उपनिवेशों को कार्बेनिकलिन और सुक्रोज के साथ पूरक पिया पर विकसित नहीं किया गया)।
    1. 4 या अधिक सच्चे एकल-क्रॉसओवर पुनर्संयोजन चुनें और चयन के बिना प्रत्येक को एलबी के 5 mL में टीका लगाएं। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट।
    2. यदि किसी एकल-क्रॉसओवर रिकॉम्बिनेंट का पता नहीं चला, तो कंजुगन दोहराएं।

6. पी aeruginosa के डबल-क्रॉसओवर रीकॉम्बिनेंट्स का पता लगाना

  1. प्रत्येक शोरबा संस्कृति के लिए, पिया की एक पूर्व गर्म थाली पर संस्कृति के 10 μL टीका 10% सुक्रोज (ग्लाइसेरोल के बिना) और अलग कालोनियों के लिए लकीर के साथ पूरक । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  2. अगले दिन इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाकर विकास के लिए उनका निरीक्षण करें। सुक्रोज प्रतिरोधी उपनिवेशों डबल-क्रॉसओवर रीकॉम्बिनेंट ्स होना चाहिए (यानी, प्लाज्मिड डालने के अन्य समरूप क्षेत्र और पी एरुजिनोसा गुणसूत्र) के बीच एक पुनर्संयोजन घटना के माध्यम से गुणसूत्र से प्लाज्मिड हटा दिया है।
    1. पैच के पूर्व गर्म प्लेटों पर बाँझ टूथपिक्स के साथ कम से 20 कालोनियों: 1) पिया, 2) पिया 10% सुक्रोज (ग्लाइसेरोल के बिना) के साथ पूरक है, और 3) पिया कार्बेनिकलिन के ३०० μg/mL के साथ पूरक ।
  3. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  4. इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और विकास के लिए उनकी जांच करें। यह सच है डबल-क्रॉसओवर रिकॉम्बिनेंट कार्बेनिकलिन-संवेदनशील और सुक्रोज प्रतिरोधी (यानी, पीआईए और पीआईए पर बढ़ी हुई उपनिवेशों को सुक्रोज के साथ पूरक किया जाएगा, लेकिन कार्बेनिकलिन के साथ पूरक पिया पर विकसित नहीं हुआ)।

7. कॉलोनी पीसीआर के माध्यम से जीन विलोपन पुष्टि

  1. पीसीआर के साथ डिलीट स्क्रीन के लिए 10-20 कॉलोनियां तैयार करें।
    1. एक बाँझ टूथपिक के साथ एक संदिग्ध डबल-क्रॉसओवर रिकॉम्बिनेंट से विकास उठाओ और 1x फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) के 50 माइक्रोन में कोशिकाओं को निलंबित करें। 10 मिन के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन उबालें, 13,000 x ग्रामपर 3 मिन के लिए अपकेंद्री, और फिर बर्फ पर रखें।
  2. लक्षित विलोपन के लिए कॉलोनियों को स्क्रीन करने के लिए पीसीआर प्रदर्शन करें।
    1. ब्याज के जीन को हटाने की पुष्टि करने के लिए 25 μL पीसीआर प्रतिक्रिया में टेम्पलेट के रूप में सुपरनेटेंट के 1 μL का उपयोग करें।
    2. जीन-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करें जो जीनोमिक विलोपन के क्षेत्र को बढ़ाता है। जीनोमिक विलोपन के क्षेत्र को बढ़ाने वाले प्राइमर का उपयोग करें और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम दृश्यों को फ्लैंकिंग करने के 100-200 बीपी।
    3. माता-पिता तनाव (जैसे, PAO1) के साथ एक अलग नियंत्रण पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें।
      नोट: थर्मोसाइकिलर की स्थिति प्राइमर जोड़े के लिए इष्टतम एनियलिंग तापमान, बहुलक कॉकटेल का उपयोग किया जाता है, और क्षेत्र की लंबाई को परिलक्षित करने के लिए भिन्न होगी।
  3. पीसीआर उत्पादों पर अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस करें। जिन कॉलोनियों में ब्याज के क्षेत्र को हटा दिया गया है, उन कॉलोनियों की तुलना में छोटे प्रवर्धन उत्पाद पैदा करते हैं, जिनमें हटाने की कमी है(चित्रा 2)।
  4. पीसीआर कन्फर्म डिलीट करने के साथ एक या एक से अधिक कॉलोनियों का चुनाव करें। एक पूर्व गर्म पिया प्लेट (एस) पर अलग कालोनियों के लिए लकीर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।
  5. कम से कम एक और समय बीतने। इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और एक अलग कॉलोनी की पहचान करें। एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग करना, कॉलोनी लेने और अलग कालोनियों के लिए एक पूर्व गर्म पिया आगर प्लेट लकीर । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. प्रत्येक अंतिम प्लेट से एक कॉलोनी चुनें और पीआईबी के 5 मिलील को टीका लगाने के लिए उपयोग करें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में रखें।
    1. तनाव का स्टॉक जेनरेट करने के लिए क्रायोवियल में 5% स्किम दूध के 1 मिलील के साथ इस संस्कृति का 1 मिलीकर मिलाएं और स्टोर करें - 80 डिग्री सेल्सियस।
    2. इस संस्कृति का उपयोग करके, तनाव से जीनोमिक डीएनए तैयार करें (उदाहरण के लिए, डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करना)। ब्याज के क्षेत्र के लिए विशिष्ट पीसीआर और प्राइमर का उपयोग करके जीनोमिक विलोपन क्षेत्र को बढ़ाना।
      1. इन पीसीआर उत्पादों (उदाहरण के लिए, डीएनए शुद्धिकरण किट, या फिनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के साथ) को शुद्ध करें और या तो जीन-विशिष्ट प्राइमर के साथ सीधे अनुक्रम करें या प्लाज्मिड-विशिष्ट प्राइमर के साथ अनुक्रमण के लिए एक वेक्टर में लिगाए।
  7. अनुक्रमण के माध्यम से जीन विलोपन की पुष्टि होने के बाद, क्रमिक रूप से कई मार्कर-मुक्त जीनोमिक विलोपन उत्पन्न करने के लिए नए विलोपन तनाव के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं। जब वांछित तनाव उत्पन्न होता है, तो लक्षित विलोपन को सत्यापित करने और जीनोम में अन्य परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग करें (संदर्भ तनाव की तुलना में, जैसे, PAO1) जो पूरे प्रक्रिया में हुआ। जीन का एनोटेट करने के बाद, अनुक्रम को जेनबैंक में जमा करें और परिग्रहण संख्या रिकॉर्ड करें।

8. पशु परीक्षण के लिए बैक्टीरियल तनाव की तैयारी

  1. पी aeruginosa उपभेदों की तनु रोगजनकता के लिए परीक्षण करने के लिए, पहले मान्य संस्कृतियों और शेयरों को तैयार करें । ब्याज के पी aeruginosa उपभेदों, पी aeruginosa (उग्र) के एक जंगली प्रकार तनाव, और एक एफडीए ई. कोलाई (जैसे, BL21) के तनाव को मंजूरी दे दी एक nonpathogenic सुरक्षा नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए तैयार करते हैं ।
  2. बैक्टीरिया के उपभेदों अनुक्रमित और मान्य जमे हुए शेयरों से चयनात्मक आगर पर परीक्षण किया जा रहा है । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. एक बाँझ inoculating पाश के साथ, प्रत्येक तनाव और चयनात्मक मीडिया पर अलग कालोनियों के लिए लकीर से एक ही कॉलोनी फिर से उठाओ । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. इनक्यूबेटर से प्लेटें हटा दें। प्रत्येक तनाव के लिए, एलबी प्लेटों पर अलगाव के लिए एक ही कॉलोनी और लकीर चुनें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे की वृद्धि के बाद, एक 500 मिलील फ्लास्क का टीका लगाते हुए एलबी का 250 मीटर होता है जिसमें एक ही कॉलोनी प्रत्येक तनाव से अलग होती है।
    1. सत्यापन कदम: एक ही कॉलोनी के अवशेषों का उपयोग करना, पीसीआर और तनाव-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके तनाव को मान्य करें, और/या प्राइमर तनाव में किए गए आनुवंशिक संशोधनों की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए। प्रस्तुत उदाहरण में उपभेदों के सत्यापन के लिए नीचे दिए गए प्राइमर का उपयोग करें:
      ई. कोलाई BL21:
      T7 पॉलीमरेज एफ: TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
      T7 पॉलीमरेज आर: TTACGCGAACGCGAAGTCC

      VE2 और PGN5:
      अरोआ एफ: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAAGC
      अरोआ आर: ATCTGGCTCGCGATGCGTCC
  6. 160 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें जब तक कि वे लॉग चरण वृद्धि तक न पहुंच जाएं (यानी, ओडी600 माप 0.4-0.6 के स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर)।
  7. लॉग चरण प्राप्त होने पर प्राप्त ओडी600 मूल्य का उपयोग करके, प्रति एमएमएल 2.5 x 109 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) को उपज देने के लिए आवश्यक शोरबा की मात्रा की गणना करें। पैलेट 10 मीटर के लिए 4,500 x ग्राम पर 50 मीटर ट्यूबों में गणना शोरबा की मात्रा।
  8. कोशिकाओं को धोने के लिए 1x पीबीएस के 50 मीटर का उपयोग करके एक ट्यूब में पैलेट को त्यागें और फिर से निलंबित करें। 10 मिन के लिए 4,500 x ग्राम पर फिर से सेंट्रलाइज।
  9. सुपरनेटेंट को त्यागें और 1x पीबीएस में 5% स्किम दूध के 25 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    1. सत्यापन चरण: सीएफयू/एमएल की संख्या निर्धारित करने के लिए व्यवहार्य प्लेट काउंट करने के लिए 25 एमसीएल पुनर्सस्पेंशन के नमूने का उपयोग करें।
  10. Aliquot 25 mL स्किम दुग्ध संस्कृति 2 mL क्रायोवियल्स में 2 mL संस्कृति शेयरों में पुनर्निलंबन । तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज और उपयोग से पहले कम से कम रात ोंरात -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. पशु परीक्षण के लिए संग्रहीत स्टॉक के विकास और तनाव का सत्यापन।

  1. प्रत्येक तनाव का परीक्षण करने के लिए, जमे हुए स्टॉक के कम से कम 3 क्रायोवियल्स को -80 डिग्री सेल्सियस स्टोरेज से हटा दें और 2-4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गल जाएं। यदि कोई जमे हुए स्टॉक रहता है, तो संक्षेप में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  2. प्रत्येक तनाव को मान्य करने के लिए प्रत्येक क्रायोवियल से छोटे नमूने लें।
    1. सीएफयू/एमएल की संख्या निर्धारित करने के लिए व्यवहार्य प्लेट मायने रखता है प्रदर्शन करें । कुछ बैक्टीरियल कोशिकाओं की मौत के कारण ठंड के बाद कम सीएफयू/एमएल होना सामान्य बात है ।
    2. प्रत्येक तनाव को मान्य करने के लिए पीसीआर और स्ट्रेन-स्पेसिफिक प्राइमर का उपयोग करें।
    3. फेनोटाइप को सत्यापित करने के लिए चुनिंदा मीडिया पर प्रत्येक तनाव को लकीर।
  3. पुष्टि करने के बाद कि उपभेदों सही जीनोटाइप और फेनोटाइप के हैं, और CFU/mL मान्य, पशु परीक्षण के लिए आगे बढ़ना ।

10. इंजेक्शन द्वारा बैक्टीरियल उपभेदों के साथ जानवरों का टीका

  1. इंजेक्शन की सुबह, परीक्षण किया जा रहा बैक्टीरियल उपभेदों के क्रायोवियल्स को हटा दें और प्रत्येक माउस के लिए 3-4 एच गल 0.5 मिलील के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गल जाएं जिसे इंजेक्ट किया जाएगा। विगलन के बाद बर्फ पर शीशियों रखें और चूहों को 2 घंटे के भीतर इंजेक्ट करें।
  2. विगलन के बाद, प्रत्येक क्रायोवियल को 10 मीटर के लिए 4,500 x ग्राम पर एक नया 2 एमएल ट्यूब और अपकेंद्री में स्थानांतरित करें, सुपरनेटेंट को त्यागें, और 1x पीबीएस के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  3. 10 मीटर के लिए ४,५०० x ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र सुपरनेट और 1x पीबीएस में पैलेट को अंतिम एकाग्रता २.५ x १०९ सीएफयू/एमएल में फिर से निलंबित करें । पुनर्निलंबन के लिए आवश्यक 1x पीबीएस की राशि निर्धारित करने के लिए, चरण २.२.१ में जमे हुए शेयरों पर व्यवहार्य प्लेट मायने रखता है से प्राप्त CFU/mL डेटा का उपयोग करें । उपयोग किए जाने वाले 1x पीबीएस की सही मात्रा उपभेदों के बीच थोड़ी भिन्न होगी।
    1. ऊपर वर्णित सीएफयू/एमएल, जीनोटाइप और फेनोटाइप को मान्य करने के लिए प्रत्येक तनाव के अंतिम निलंबन से 3 नमूने लें ।
  4. प्रत्येक तनाव के लिए, ट्यूब में प्रवेश करने के समय की संख्या को सीमित करने के लिए प्रति 5 चूहों में एक 2 मीटर ट्यूब में पीबीएस/सेल निलंबन के 1.5 mL को एलिकोट करें। साथ ही कंट्रोल इंजेक्शन के लिए 1x पीबीएस की ट्यूब तैयार करें।
  5. चूहों (10 पुरुष और 10 महिला C57BL/6 इस प्रयोग के लिए प्रति समूह) और इंजेक्शन के लिए आवश्यक सामग्री (सीरिंज, सुई, शार्प्स कंटेनर, मार्कर, कलम और कागज,आदि)इकट्ठा । बाँझ जानवर सर्जिकल कमरे में ले जाएं। सभी सतहों को साफ पोंछे के साथ पोंछें।
    1. प्रयोगकर्ता को चोट के संकट और जोखिम को खत्म करने के लिए, केवल एक समय में चूहों के एक लिंग और प्रयोगात्मक समूह को सर्जिकल कमरे में लाएं (उदाहरण के लिए, 10 पुरुष चूहों का एक समूह एक विशेष तनाव से संक्रमित होना)। काटा जाए तो दस्ताने के पंचर को खत्म करने के लिए लेटेक्स दस्ताने के दो जोड़े पहनें। संदूषण से बचने के लिए लैब कोट, सुरक्षा चश्मा और फेस मास्क पहनें।
  6. 1x पीबीएस के साथ नियंत्रण समूह के इंजेक्शन शुरू करें। इससे यह पता लगाया जाएगा कि क्या कोई प्रतिकूल प्रभाव अकेले इंजेक्शन से होता है।
    1. पिंजरे से एक माउस निकालें। एक समय में केवल एक माउस निकालें।
    2. माउस वजन और वजन घटाने के बाद इंजेक्शन के लिए ट्रैक करने के लिए स्थाई मार्कर के साथ अपनी पूंछ निशान ।
    3. एक नया 1 mL सिरिंज और 27 जी सुई खोलें (संदूषण को खत्म करने के लिए प्रत्येक माउस के लिए एक नई सिरिंज और सुई का उपयोग करें) और बाँझ 1x PBS के 200 μL इंजेक्ट।
      1. अंगूठे और तर्जनी का उपयोग कर अपने कानों के पीछे माउस पकड़ो। गर्दन के नैप पर त्वचा गुना बनाने के लिए चुटकी पर पकड़-एक सख्त गुना गर्दन आंदोलन और इंजेक्शन के दौरान काटा जा रहा है के जोखिम को कम कर देता है । थोड़ा आंदोलन के साथ माउस फ्लैट पकड़ करने के लिए पिंकी का उपयोग कर हथेली में सुरक्षित पूंछ।
      2. माउस को चालू करें और 30 डिग्री कोण पर सुई को पेरिटोनियल गुहा में मिडलाइन के बाईं या दाईं ओर डालें। सुई को थोड़ा बार उठाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इसे इंट्रापेरिटोनियल क्षेत्र में डाला गया था न कि अंगों में। धीरे-धीरे पीबीएस इंजेक्ट करें और फिर सुई वापस ले लें।
      3. इस्तेमाल की गई सुई को एक नामित बायोहैज़र्ड शार्प्स कंटेनर में रखें। सिरिंज या सुई का दोबारा इस्तेमाल न करें। इंजेक्शन की साइट पर एक बोलस विशिष्ट है।
    4. इंजेक्शन के बाद, माउस को एक अलग पिंजरे में ले जाएं।
    5. अगले माउस के साथ प्रक्रिया दोहराएं। एक पिंजरे के सभी चूहों को इंजेक्ट करने के बाद, उन्हें तुरंत अपने मूल पिंजरे में वापस कर दें।
  7. नियंत्रण समूह इंजेक्शन के बाद, एक ही प्रक्रिया के बाद परीक्षण किया जा करने के लिए उपभेदों के निलंबन इंजेक्शन शुरू करते हैं ।
    1. सेल निलंबन के 200 माइक्रोन इंजेक्ट। जब 2.5 x 109 सीएफयू/mL के सेल निलंबन के साथ शुरुआत, प्रत्येक माउस 5 x 108 CFU प्राप्त करता है।
      नोट: इन सांद्रता प्रारंभिक पशु अनुसंधान के साथ अनुकूलित करने के लिए प्रत्येक तनाव की घातक खुराक निर्धारित किया गया । खुराक को अन्य उपभेदों/प्रजातियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  8. एक बार सभी इंजेक्शन पूरे हो जाने के बाद, संकट को कम करने के लिए चूहों को आवास कक्ष में वापस करें। साफ पोंछे के साथ स्वच्छ कार्य क्षेत्र।
  9. 72 एच के लिए हर 3 घंटे और 10 दिनों के लिए हर 12 घंटे मृत चूहों के लिए पिंजरों की जांच करके इंजेक्शन के बाद मृत्यु के लिए जानवरों की निगरानी करें। बीमारी के कारण वजन घटाने का निर्धारण करने के लिए हर 12 घंटे चूहों का वजन रिकॉर्ड करें।
  10. इंजेक्शन के बाद के घंटों में प्रतिकूल व्यवहार रिकॉर्ड करें, जैसे आसन में अंतर, ग्रूमिंग या बिलिंग की कमी, गतिहीनता, या सांस लेने में परिवर्तन। चूहों कि इंजेक्शन के साथ जुड़े चोट से मृतक प्रतिकूल व्यवहार प्रदर्शन और इंजेक्शन के बाद जल्दी मर जाएगा । दूसरी ओर, चूहों कि संक्रमण से मृतक 18 घंटे के बाद तक प्रतिकूल व्यवहार या मौत का प्रदर्शन करने के लिए शुरू नहीं होगा । किसी भी चूहों कि प्रतिकूल व्यवहार या तेजी से या परिश्रम श्वसन, गतिहीनता, कूबड़ मुद्रा, धंसा आंखें, गंभीर निर्जलीकरण, या दूसरों को अनावश्यक दुख को कम करने के लिए इच्छामृत्यु होना चाहिए सहित रुग्णता के व्यापक संकेत प्रदर्शन करते है (हमारे में आज्ञाकारी के रूप में आईएसीयूसी प्रोटोकॉल को अनुमोदित किया गया है)। हालांकि, हमारे प्रयोगों में, प्रयोग के दौरान किसी भी चूहों के लिए इच्छामृत्यु की आवश्यकता नहीं थी। जीवित चूहों परीक्षण के पूरा होने के बाद 10 दिनों इच्छामृत्यु थे ।
  11. 10 दिन की निगरानी अवधि के बाद, शेष जानवरों को पूरी तरह से ठीक होने की अनुमति दें और परीक्षण के दौरान प्रशासित किसी भी संक्रमण से स्पष्ट हो जाते हैं। आईएसीयूसी प्रक्रिया का पालन करने वाले जानवरों को इच्छामृत्यु दें।

11. पशु मृत्यु दर का सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें। रेखांकन का उत्पादन करने और सांख्यिकीय विश्लेषण करने में सक्षम कोई भी सॉफ्टवेयर उपयुक्त है।
  2. मृत्यु दर डेटा को प्लॉट करने के लिए, परीक्षण किए गए समूहों का प्रतिनिधित्व करने के लिए समय (एच) और वाई कॉलम का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक्स कॉलम का उपयोग करें।
  3. कोड = 0 (शून्य) या कोड = 1 का उपयोग करके अध्ययन में प्रत्येक माउस या विषय का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो क्रमशः अस्तित्व या मृत्यु का संकेत देता है।
    1. मरने वाले प्रत्येक जानवर के लिए, एक्स कॉलम पर मृत्यु के समय उस समूह के वाई कॉलम में 1 रखें। यदि किसी समूह के भीतर एक ही समय बिंदु पर कई मौतें होती हैं, तो उस समय बिंदु की एक प्रति एक्स कॉलम में रखी जा सकती है। उदाहरण के लिए, यदि किसी समूह के भीतर तीन विषय 3 घंटे में मर जाते हैं, तो एक्स कॉलम में 3 एच टाइम पॉइंट तीन बार दिखाई देगा।
    2. एक समूह के भीतर सभी जीवित जानवरों के लिए, मापा अंतिम समय बिंदु पर वाई कॉलम में एक शून्य जगह है । उदाहरण के लिए, यदि चार चूहे जीवित रहते हैं, तो वाई कॉलम में चार शून्य के साथ चिह्नित एक्स कॉलम में चार समाप्त समय बिंदु रखें।
  4. पशु डेटा सभी समूहों के लिए दर्ज किए जाने के बाद, अस्तित्व ग्राफ का उत्पादन करने के लिए अस्तित्व ग्राफ टेम्पलेट का उपयोग करें।
    1. 0 और 1 के रूप में डिफ़ॉल्ट कोडिंग छोड़ दें।
    2. ग्राफ के लिए पैरामीटर प्रतिशत के रूप में निर्धारित करें।
  5. एक बार अस्तित्व वक्र के लिए मापदंडों का चयन कर रहे हैं, एक Mantel-कॉक्स (लॉग रैंक) परीक्षण का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं ।
  6. सांख्यिकीय डेटा का उपयोग करके प्रारूप काप्लान-मेयर भूखंड।
    नोट: उपभेदों कि प्रतिवर्ष तनाव से कम या माता पिता के तनाव के बराबर है और एफडीए को मंजूरी दे दी तनाव (जैसे, ई. कोलाई BL21) तनु माना जा सकता है प्रदर्शन ।

12. बायोल्यूमिनेसेंस के साथ संक्रमण का दृश्य

  1. संक्रमण की प्रगति की कल्पना करने के लिए, पीजीएन5 और VE2 तनाव परीक्षण में एक गुणसूत्र बायोल्यूमिनेसेंट ऑपरन(लक्सीडाब)डालें। इन उपभेदों को लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लाज्मिड और प्रोटोकॉल को श्वाइज़र लैब में विकसित किया गया था और यह बैक्टीरिया13की सभी प्रजातियों/उपभेदों के अनुकूल नहीं हो सकता है । महत्वपूर्ण बात, संक्रमण का दृश्य वैकल्पिक है; इस प्रकार, ऊपर वर्णित मृत्यु अध्ययन करने के लिए इस ऑपरन का जीनोमिक प्रविष्टि आवश्यक नहीं है।
  2. ऊपर वर्णित विधि का उपयोग करके उपभेदों को तैयार और मान्य करें। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक सत्यापन चरण में लेबल वाले उपभेदों में बायोल्यूमिनेसेंस की जांच करें।
  3. उपभेदों तैयार होने के बाद, ऊपर दिए गए चरणों के बाद बायोल्यूमिनेसेंट उपभेदों के साथ 10 के समूहों में जानवरों को इंजेक्ट करें।
  4. 24 एच के लिए हर 3 घंटे जानवरों की छवि बायोल्यूमिनेसेंस में सक्षम एक पशु इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर।
    1. सबसे पहले कैमरे के मापदंडों को सेट करके और जानवरों के लिए मंच को गर्म करके इमेजर तैयार करें। इसके अलावा 1.5 एल प्रति मिन (या निर्माता की सिफारिशों का पालन) के लिए ऑक्सीजन प्रवाह सेट।
    2. इमेजर और चरण स्थिर होने के बाद, इंजेक्शन के तुरंत बाद संज्ञाहरण कक्ष में एक माउस रखें और लगभग 4 मिन के लिए ओ2 प्रवाह के साथ कक्ष में 3.5% आइसोफ्लोरीन का प्रशासन करें। संज्ञाहरण विधियों चैंबर और/या एनेस्थेटिक एजेंट का इस्तेमाल के आधार पर भिन्न हो सकते हैं; निर्माता की सिफारिशों का पालन करें। वापसी पलटा परीक्षण के माध्यम से उचित संज्ञाहरण निर्धारित करें।
    3. माउस को तापमान स्थिर चरण में ले जाएं। हथियारों के साथ अपनी पीठ पर माउस की स्थिति फैलाया और इमेजिंग प्रक्रिया भर में २.५% isoflurane के प्रशासन के लिए एक नाक शंकु के साथ माउस फिट ।
    4. दरवाजा बंद करें और माउस की बायोल्यूमिनेसेंट छवियां और एक्स-रे लें।
    5. जब इमेजिंग पूरी हो जाए, तो माउस को अपने पिंजरे में वापस कर दें और इसकी निगरानी करें। माउस को 3-5 मिनट के भीतर चेतना हासिल करनी चाहिए।
    6. हर बार प्रत्येक समूह से एक अलग माउस का उपयोग करके, 24 घंटे के लिए हर 3 घंटे चूहों की छवि जारी रखें। संज्ञाहरण के लिए फिर से जोखिम के कारण प्रतिकूल प्रभाव की संभावना के कारण 24 घंटे के भीतर एक माउस को फिर से इमेज न करें। एक माउस को केवल हर 24-36 एच संज्ञाहरण की एक खुराक प्राप्त करनी चाहिए। प्रत्येक माउस को इमेजअप करने के बाद इमेजिंग प्लेटफॉर्म को साफ करें। इमेजिंग टाइम पॉइंट्स के बीच इमेजर बंद करें।
      नोट: बायोल्यूमिनेसेंस फीका होगा, चाहे इंजेक्शन तनाव की परवाह किए बिना। बायोल्यूमिनेसेंस की तीव्रता और दीर्घायु कई कारकों के आधार पर भिन्न होगी, जिसमें इंजेक्शन वाले बैक्टीरिया की संख्या, माउस तनाव, बैक्टीरियल तनाव आदि शामिल हैं।

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Representative Results

जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, लक्षित जीनोमिक विलोपन की पुष्टि विशिष्ट प्राइमर के साथ कॉलोनी पीसीआर का उपयोग करके की जा सकती है जो ब्याज के क्षेत्र को बढ़ाती है। जीनोमिक विलोपन करने वाली कॉलोनियां जंगली प्रकार की कॉलोनियों की तुलना में एक छोटे पीसीआर बैंड का आकार प्राप्त करेंगी। 10-12 कॉलोनियों की पीसीआर-स्क्रीन आमतौर पर कम से कम एक कॉलोनी का पता लगाने के लिए पर्याप्त होती है जो लक्षित विलोपन करती है। यदि स्क्रीन के कई दौर के बाद कोई हटाने का पता नहीं चला है, तो conjugation से शुरू होने वाली प्रक्रिया को दोहराएं। यदि हटाने अभी भी विफल रहता है, प्लाज्मिड डालने अनुक्रमण, बदल दिया, या हटाने घातक हो सकता है के माध्यम से पुष्टि की जा करने की आवश्यकता हो सकती है । पीसीआर के माध्यम से जीन विलोपन के सत्यापन पर, अनुक्रमण के माध्यम से हटाने की पुष्टि करें। परिणामस्वरूप तनाव अनुक्रमिक जीनोमिक संशोधनों को उत्पन्न करने के लिए बार-बार प्रक्रिया के अधीन हो सकता है।

जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, पी एरुजिनोसा पीजीएन5 (+म्यूस) के तनु तनाव के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन से जुड़ी मृत्यु दर 0% थी, जो ई कोलाई BL21 के साथ देखी गई मृत्यु दर के बराबर थी। दूसरी ओर, माता-पिता तनाव (VE2) का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 80% चूहों के लिए घातक था। इन परिणामों को इंजेक्शन उपभेदों को मान्य करने के लिए व्यापक कदम ों के साथ प्राप्त किया गया था । जबकि इन चूहों में मौत का सही कारण अज्ञात है, यह कम से कम भाग में माता पिता के तनाव में उग्रता कारकों की अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो तनु PGN5 तनाव से हटा दिया गया था। संक्रमण प्रगति में अंतर बायोल्यूमिनेसेंस-चिह्नित माता-पिता और तनु उपभेदों का उपयोग करके ट्रैक किया गया था। तनु तनाव इंजेक्शन की साइट पर स्थानीयकृत रहे जब तक बायोल्यूमिनेसेंस फीका(चित्रा 4)। संक्रमण की निकासी सबसे अधिक संभावना बायोल्यूमिनेसेंस की लुप्त होती के साथ हुई। इंजेक्शन के बाद बायोल्यूमिनेसेंस का 24 घंटे का पता नहीं चला और चूहों ने बलिदान तक इंजेक्शन के बाद हफ्तों तक रहते थे, जिसमें कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: pEX100T-NotI के साथ पी aeruginosa में जीन विलोपन पैदा करना। (A)pEX100T-NotI प्लाज्मिड का नक्शा। (ख)हित क्षेत्र (आरओआई) के सीधे अपस्ट्रीम (पीले) और डाउनस्ट्रीम (ब्लू) से बने निर्माण की पीढ़ी, नोटी प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों के साथ घिरा हुआ है । सबसे पहले, पीसीआर-अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम क्षेत्रों को विशिष्ट प्राइमर के साथ स्वतंत्र रूप से बढ़ाना है जो 5 'नोटी पाचन साइटें जोड़ते हैं (उदाहरण के लिए, नोटी-अरोआ एफ सीजीसीजीजीसीसीजीसीटीजीजीजीटीसीजीजीसीसीटीजीएजीजीजीजीजीसीटीसीटी और नोटी-एआरओए आर जीसीजीजीसीजीजीजीजीटीजीटीजीटीसीटीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजी सीए) और 3 ' ओवरलैपिंग अारोपी समरूप क्षेत्र जैसा दिखाया गया है (जैसे, अरोआ-क्रॉसओवरएफ CTCCAGGCGCGGCAAGGGCGTGGCGCGGGCGGGGGGGGCGACTGAG ACA और aroA-क्रॉसओवर आर टीजीटीटीसीटीसीसीजीसीजीसीजीसीजीसीजीजीजीजीजीजीटीसीसीएजीटीकैगजीसीकैगसीसीटीटीजीसीसीजीसीसीटीजीजीसीसीटीजीजीसीटीजीजीसीटीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीएजीए। फिर, पहले पीसीआर प्रतिक्रिया में उत्पन्न अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम उत्पादों में शामिल होने के लिए पीसीआर विदनोटी युक्त प्राइमर का उपयोग करें। (ग)pEX100T-NotI प्लाज्मिड, सशस्त्र और तैयार है । नोटी-पचाने वाले क्रॉस-ओवर पीसीआर उत्पाद को नोटी-डाइजेस्ट प्लाज्मिड में लिगेट करें। (घ)pEX100T-NotI प्लाज्मिड का उपयोग करपी aeruginosa गुणसूत्र से जीनोमिक क्षेत्रों को हटाने के लिए प्रक्रिया के प्रवाह आरेख । वांछित विलोपन की पुष्टि और शुद्ध होने के बाद, परिणामी तनाव गुणसूत्र से अन्य जीनोमिक क्षेत्रों को हटाने के लिए बार-बार प्रक्रिया के माध्यम से लिया जा सकता है। जब वांछित तनाव प्राप्त हो जाता है, तो गुणसूत्र में विलोपन और अन्य परिवर्तनों की पुष्टि करने के लिए पूरे जीनोम को अनुक्रम करें। तनाव की रोगजनकता तो प्रोटोकॉल के भाग द्वितीय में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर चूहों में परीक्षण किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तनु पी aeruginosa तनाव, PGN5 उत्पन्न करने के लिए aroa हटाने के लिए एक स्क्रीन से कॉलोनी पीसीआर उत्पादों के जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस । कॉलोनी पीसीआर उत्पाद गलियों में 2-5 और 8-11 जंगली प्रकार के अरोआके साथ कालोनियों का संकेत देते हैं । कॉलोनी पीसीआर उत्पाद लेन 6 और 7 में चलते हैं, जो छोटे पीसीआर उत्पाद (पीले तारक) द्वारा इंगित एआरओए जीन विलोपन ले जाते हैं। प्राइमर्स विशेष रूप से एआरओए जीन युक्त जीनोमिक क्षेत्र को परिलक्षित करते थे: अरोआ-एफ: जीसीगाएसीजीसीसीएसीएजीसीजीजीजीएएजीसी, और एआरओए-आर:ATCTGGCTCGATGCCGCCसीसी। जंगली प्रकार की कॉलोनियों में अपेक्षित पीसीआर उत्पाद का आकार 2,548 न्यूक्लियोटाइड्स (एनटी) था। एआरओए हटाने वाली कॉलोनियों में पीसीआर उत्पाद का आकार 307 एनटी था। गलियों 1 और 12 में डीएनए सीढ़ी चलाई गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: रोगजनक पी aeruginosa तनाव (VE2), तनु पी aeruginosa तनाव (PGN5 + mucE), और एफडीए नियंत्रण ई. कोलाई तनाव (BL21) के साथ इंजेक्शन चूहों की समग्र मृत्यु दर । केवल चूहों रोगजनक माता पिता तनाव के साथ इंजेक्शन ८०% पर मृत्यु दर का प्रदर्शन किया । तनु पी aeruginosa तनाव और एफडीए नियंत्रण ई. कोलाई तनाव 0% मृत्यु का प्रदर्शन किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माउस की छवि 3 एच के बाद पी aeruginosa PGN5 + mucE एक बायोल्यूमिनेसेंट मार्कर ले जाने के तनु तनाव के इंजेक्शन । इंजेक्शन के बाद 18-24 घंटे तक बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया का पता लगाया जा सकता था । इस अवधि के दौरान, बायोल्यूमिनेसेंस इंजेक्शन की साइट पर बना रहा जो बैक्टीरिया को इंजेक्शन साइट पर स्थानीयकृत रहने का संकेत देता था। यह माउस पूरी तरह से कोई प्रतिकूल प्रभाव के साथ बरामद किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

pEX100T-Not1 प्लाज्मिड अनुक्रमिक जीनोमिक विलोपन का एक कुशल मध्यस्थ है जो मार्कर-मुक्त और इन-फ्रेम हैं। जब इंजीनियरिंग बैक्टीरियल तनु उग्रता के लिए उपभेदों, बिंदु उत्परिवर्तन पैदा करने के बजाय पूरे जीन दृश्यों को हटाने के बजाय एक उग्र फेनोटाइप के लिए प्रतिवर्तन की संभावना कम हो जाती है । इसके अतिरिक्त, प्रत्येक रोगजनकता जीन विलोपन रोगजनक को और क्षीण कर देता है, जिससे क्षीणता की स्थिरता मजबूत होती है।

इस विधि का उपयोग विलोपन के अलावा जीनोमिक संशोधनों को उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि पॉइंट म्यूटेशन और सम्मिलन, बस प्लाज्मिड डालने के डिजाइन को संशोधित करके। संशोधनों के इन प्रकार के संशोधित चयापचय के साथ इंजीनियरिंग बैक्टीरिया के लिए पूरे जीन विलोपन से अधिक उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए । अनुक्रमिक जीनोमिक संशोधन में अनुसंधान और उद्योग में विशिष्ट उद्देश्यों के अनुरूप डिजाइनर बैक्टीरियल उपभेदों को उत्पन्न करने की महत्वपूर्ण क्षमता है। बैक्टीरिया में वांछित मार्कर मुक्त जीनोमिक संशोधन ों को उत्पन्न करने के अन्य तरीकों को15, 16 ,17,18वर्णित किया गया है । सभी जीनोम-संपादन विधियों के साथ, आवश्यक जीनोमिक क्षेत्रों में संशोधनों का प्रयास घातक हो सकता है, और इस प्रकार असफल हो सकता है। इन मामलों में, ब्याज के जीवाणु तनाव उत्पन्न करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक संशोधनों या अन्य उम्मीदवार जीन की पहचान की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में प्रत्येक कॉलोनी की कई प्रतिकृति घटनाओं और मार्गों को देखते हुए, जीनोम में अनपेक्षित परिवर्तन उत्पन्न तनाव में होंगे। सटीक जीनोमिक परिवर्तन ों को पूरे जीनोम अनुक्रमण के माध्यम से पहचाना जा सकता है। हालांकि, इन परिवर्तनों का प्रभाव निर्धारित करने के लिए कठिन है । जब किसी विशिष्ट उद्देश्य के लिए इंजीनियरिंग बैक्टीरिया होते हैं, तो जीनोमिक परिवर्तन जो जीव के विकास को नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं करते हैं या लक्षित मार्ग (एस) सहनीय होते हैं। उत्पन्न किए जा रहे तनाव के आधार पर, यह सुनिश्चित करने के लिए "readout" की पहचान करना संभव हो सकता है कि तनाव अभी भी अपने इच्छित उद्देश्य के लिए उपयोगी है। उदाहरण के लिए, PGN5 के साथ, लक्ष्य के लिए एक तनु तनाव है कि अल्जीनेट की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की क्षमता को बनाए रखा बनाने के लिए किया गया था । पांच रोगजनकता जीन को हटाने के बाद, PGN5 द्वारा उत्पादित एल्गिनेट की मात्रा और संरचना को मापा गया और अन्य अल्गिनेट-उत्पादक उपभेदों के बराबर होना निर्धारित किया गया था। इस प्रकार, अल्जीनेट उत्पादन पांच जीन विलोपन से अप्रभावित था, न ही पीजीएन5 के विकास के दौरान हुए अनपेक्षित जीनोमिक परिवर्तनों से।

इंट्रापेरिटोनियल माउस इंजेक्शन के एक मॉडल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या माता-पिता के तनाव और ई कोलाई BL21 की तुलना में एक इंजीनियर तनाव को क्षीण कर दिया गया था, जो बायोफार्मास्युटिकल्स के उत्पादन के लिए एफडीए द्वारा अनुमोदित तनाव था। इस पशु परीक्षण प्रक्रिया के दौरान उठाए गए सबसे महत्वपूर्ण कदम जमे हुए जीवाणु भंडारों की तैयारी और सत्यापन थे । चूहों को इंजेक्ट करने के लिए जमे हुए बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी और उपयोग निरंतर संस्कृति का उपयोग करने के लिए बेहतर है, क्योंकि यह बैक्टीरियल आबादी19में स्वाभाविक रूप से होने वाले संख्या उत्परिवर्तनों को कम करता है। इसके अतिरिक्त, जमे हुए संस्कृतियों साल के लिए व्यवहार्य रहना चाहिए । व्यवहार्य प्लेट मायने रखता है CFU के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया/सीधे स्टॉक तैयार किए जाने के बाद और तैयारी के तीन महीने बाद । इस प्रक्रिया में कई सत्यापन चरणों के उपयोग ने यह सुनिश्चित किया कि विधि प्रजनन योग्य थी, और परिणाम बैक्टीरिया को दूषित करके विषम नहीं थे। इसके अतिरिक्त, प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए उठाए गए एहतियाती कदमों की संख्या के साथ, कम जानवरों की जरूरत थी । एक जीवाणु तनाव का उपयोग करना जो एफडीए-नियंत्रण (जैसे ई कोलाई स्ट्रेन BL21) के रूप में बायोफार्मा उत्पादन के लिए अनुमोदित है, इस विधि का उपयोग पी एरुजिनोसा,या बैक्टीरिया की अन्य प्रजातियों के अन्य आनुवंशिक रूप से इंजीनियर उपभेदों के क्षीणता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

एक मार्कर के रूप में बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग करने से इंजेक्शन बैक्टीरियल उपभेदों का अतिरिक्त सत्यापन होता है, क्योंकि मार्कर को इंजेक्शन साइट पर कल्पना की जा सकती है। बैक्टीरियल क्रोमोसोम में बायोल्यूमिनेसेंस मार्कर का सम्मिलन बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के लिए आवश्यक है लेकिन यदि असंगत उपभेदों/प्रजातियों के साथ काम करना संभव नहीं हो सकता है । हालांकि, क्षीणता के लिए परीक्षण करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस के साथ उपभेदों को चिह्नित करने की आवश्यकता नहीं है। इस अध्ययन में परीक्षण किए गए उपभेदों को बायोल्यूमिनेसेंस के साथ चिह्नित किया गया था, जिसने संक्रमण के दौरान उपभेदों के बीच स्थानीयकरण मतभेदों के दृश्य के लिए अनुमति दी थी। हमने देखा कि रोगजनक तनाव माउस के शरीर के माध्यम से प्रसारित किया गया, लेकिन गैर-रोगजनक तनाव इंजेक्शन के स्थल पर बना रहा। हालांकि इस प्रयोग ने केवल पी एरुजिनोसाके दो बहुत बारीकी से संबंधित उपभेदों का परीक्षण किया, लेकिन यह पता चलता है कि बैक्टीरियल प्रसार उग्रता से जुड़ा हुआ है, कम से कम पी aeruginosaमें । इस प्रकार, संक्रमण की प्रगति की कल्पना करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस के साथ लेबलिंग की इस प्रक्रिया का उपयोग भविष्य में बैक्टीरिया के इंजीनियर उपभेदों के क्षीणहोने का जल्दी से मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक होंगवेई डी यू मुख्य विज्ञान अधिकारी और प्रोजेनेसिस टेक्नोलॉजीज, एलएलसी के सह-संस्थापक हैं ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान R44GM113545 और P20GM103434 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL tubes with flat caps ThermoScientific AB-0620 via Fisher Scientific
1 mL Syringe BD 22-253-260 via Fisher Scientific
1.5 mL disposable polystyrene cuvette Fisher Scientific 14955127
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials Corning 430659 via Fisher Scientific
27G needle BD 14-821-13B via Fisher Scientific
50 mL tubes Fisher Scientific 05-539-13 via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath Labnet NC0205808 via Fisher Scientific
Benchtop Centrifuge 5804R Eppendorf 04-987-372 via Fisher Scientific
Benchtop Microcentrifuge Sorvall 75-003-287 via Fisher Scientific
Cabinet Incubator VWR 1540
Carbenicillin disodium salt Fisher Scientific BP2648250
Culture Test Tube, Polystyrene Fisher Scientific 14-956-6D via Fisher Scientific
Diposable Inoculation Loops Fisher Scientific 22-363-597
Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) Qiagen 12224-50 or preferred method/vendor
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) Omega bio-tek D6493-01 or preferred method/vendor
EcoRI-HF, restriction endonuclease New England BioLabs R3101L
Electroporation Cuvettes Bulldog Bio NC0492929 via Fisher Scientific
FastLink II DNA Ligation Kit Epicentre Technologies LK6201H via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate Fisher Scientific BP918-1
Glycerol Fisher Scientific BP229-4
GoTaq G2 Colorless Master Mix Promega M7833 via Fisher Scientific
Isothesia Isoflurane Henry Schein Animal Health 29405
IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System Perkins and Elmer CLS136340
Kanamycin monosulfate Fisher Scientific BP906-5
LE agarose Genemate 3120-500 via Fisher Scientific
Luria Broth Difco 240230 via Fisher Scientific
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100
Noble agar, ultrapure Affymetris/USB AAJ10907A1 via Fisher Scientific
NotI-HF, restriction endonuclease New England BioLabs R3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli Invitrogen C404052 via Fisher Scientific
Phosphate buffered saline powder Sigma P3813-10PAK Sigma-Aldrich
Prism 7 GraphPad https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas isolation agar Difco 292710 via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation broth Alpha Biosciences P16-115 Custom made batch
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 or preferred method/vendor
Shaking Incubator New Brunswick Scientific Innova 4080 shake at 200 rpm
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems A24811
Skim Milk Difco DF0032-17-3 via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) Fisher Scientific FB0875713
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 or preferred method/vendor
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Toothpicks, round Diamond Any brand of toothpicks, autoclaved
TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing Invitrogen 45-0030
XAF-8 Anesthesia System Filters Perkins and Elmer 118999
XGI 8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/Xenogen

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References

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<em>स्यूडोमोनास एरुजिनोसा</em> में इन-फ्रेम जीन विलोपन म्यूटेंट की पीढ़ी और संक्रमण के एक साधारण माउस मॉडल में विरुलेंस क्षीणन के लिए परीक्षण
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Valentine, M. E., Kirby, B. D., Yu,… More

Valentine, M. E., Kirby, B. D., Yu, H. D. Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (155), e60297, doi:10.3791/60297 (2020).

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