Summary
Her beskriver vi en enkel og reproduserbar protokoll av mus modell av infeksjon for å evaluere demping av genmodifiserte stammer av Pseudomonas aeruginosa i forhold til USA Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-godkjent Escherichia coli for kommersielle applikasjoner.
Abstract
Mikroorganismer er genetisk allsidig og mangfoldig og har blitt en viktig kilde til mange kommersielle produkter og biopharmaceuticals. Selv om noen av disse produktene er naturlig produsert av organismer, andre produkter krever genetisk engineering av organismen for å øke avkastningen av produksjonen. Avirulent stammer av Escherichia coli har tradisjonelt vært den foretrukne bakterie arten for å produsere biopharmaceuticals; men noen produkter er vanskelig for E. coli å produsere. Dermed kan avirulent stammer av andre bakterielle arter gi nyttige alternativer for produksjon av noen kommersielle produkter. Pseudomonas aeruginosa er en felles og godt studert gram-negativ bakterie som kan gi et egnet alternativ til E. coli. Imidlertid er P. aeruginosa en opportunistiske menneskelig patogen. Her detalj vi en prosedyre som kan brukes til å generere patogeniske stammer av P. aeruginosa gjennom sekvensielle genomisk slettinger ved hjelp av PEX100T-NotI plasmider. Den største fordelen med denne metoden er å produsere en markør fri belastning. Denne metoden kan brukes til å generere svært svekket P. aeruginosa stammer for produksjon av kommersielle produkter, eller å designe stammer for andre spesifikke bruksområder. Vi beskriver også en enkel og reproduserbar musemodell av bakteriell systemisk infeksjon via intraperitoneal injeksjon av validerte test stammer for å teste demping av genetisk konstruert belastning i forhold til FDA-godkjente BL21 stamme av E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa er en opportunistiske bakterie patogen som kan forårsake livstruende sykdommer hos mennesker, spesielt i immunsupprimerte. Patogenitet av P. aeruginosa skyldes uttrykk for mange virulens faktorer, inkludert proteaser og lipopolysakkarid, så vel som dens evne til å danne en beskyttende biofilm1. På grunn av sin evne til å produsere virulens faktorer og forårsake sykdom hos mennesker, ved hjelp av P. aeruginosa å lage kommersielle produkter presenterer sikkerhet bekymringer. Patogeniske stammer av E. coli har tradisjonelt blitt brukt til å bioengineer medisinske og kommersielle produkter for menneskelig bruk. Men noen produkter er vanskelig for E. coli å gjøre, og mange er pakket i inkludering organer, noe som gjør utvinning arbeidskrevende. Konstruert bakteriell stammer med evnen til å lage og skille ut bestemte produkter er svært ønskelig, som sekresjon vil trolig øke utbyttet og lette rensing prosesser. Således, patogeniske stammer av andre arter av bakterier (f. eks, arter som utnytter mer sekresjon trasé) kan gi nyttige alternativer til e. coli. Vi har nylig rapportert utviklingen av en stamme av P. aeruginosa, PGN5, der patogenitet og toksisitet av organismen er svært svekket2. Viktigere, produserer denne belastningen fortsatt store mengder av polysakkarid alginat, en kommersielt interessant komponent i P. aeruginosa biofilm.
Den PGN5 stammen ble generert ved hjelp av en to-trinns allel utveksling prosedyre med pEX100T-NotI plasmider til sekvensielt slette fem gener (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) kjent for å bidra til patogenitet av organismen. pEX100T-NotI ble generert ved å endre SmaI til en NotI restriksjon enzym anerkjennelse området innenfor flere kloning området av plasmider pEX100T, som ble utviklet i Herbert Schweizer Lab3,4. Erkjennelsen nettstedet for begrensningen enzymet NotI er en sjeldnere DNA-sekvens i forhold til SmaI og mindre sannsynlighet for å være til stede i sekvenser blir klonet, og dermed er det mer praktisk for kloning formål. Plasmider bærer gener som tillater valg, inkludert Bla genet, som koder ß-laktamase og gir motstand mot carbenicillin, og B. subtilissacB Gene, som gir følsomhet for sukrose (figur 1A). Plasmider bærer også en opprinnelse av replikering(Ori) kompatibel med E. coli, og en opprinnelsen til overføring (oriT) som gjør det mulig for plasmider overføring fra E. coli til Pseudomonas arter via Bøyning. Imidlertid, det plasmider mangler en Origin av replikering forenlig med Pseudomonas, og således kan ikke duplisere innen Pseudomonas arter (i.e., det er en Pseudomonas selvmord vektor). Disse egenskapene gjør pEX100T-NotI ideelt for å målrette genetiske slettinger fra Pseudomonas -kromosom. Plasmider kloning trinnene er utført ved hjelp av E. coli og resulterende plasmider overføres til Pseudomonas ved transformasjon eller Bøyning. Så, igjennom homologe rekombinasjon begivenheter og selektiv skritt, det mål inne-rammen overstrekingen er utviklet, merke-ledig. Denne metoden for sekvensielt slette genomisk regioner fra kromosom av P. aeruginosa kan brukes til å generere svært svekket Pseudomonas stammer, som PGN5, eller å designe stammer for andre spesifikke bruksområder (f. eks, stammer mangelfull i endonucleases for plasmider forplantning eller stammer mangelfull i proteaser for produksjon av proteiner av interesse).
Den generelle virulens av bakteriestammer påvirkes av vekstforhold og faser, der mutasjoner forekommer hyppig. Derfor kan det være utfordrende å måle sikkerheten til genetisk konstruerte stammer. For å evaluere bakteriell isolat for systemisk virulens, tilpasset vi en tidligere publisert protokoll av infeksjon ved intraperitoneal injeksjon av C57BL/6 mus5. Vi endret denne prosedyren for å bruke frosne bakterielle aksjer for injeksjon, som tillot for presis dosering og enkel validering av stammene som brukes. I denne modellen, E. coli stamme BL21, som har vært FDA-godkjent for produksjon av biopharmaceuticals, ble brukt som en kontroll sikkerhet standard for å bestemme den relative patogenesen av belastningen6,7,8. Den største fordelen med å bruke denne metoden er at den er reproduserbar og minimerer kilder til variasjon, som infiserer stammer er validert for bakteriell celle nummer, fenotype, og genetiske markører både før og etter smitte. Med disse kontrollerte trinnene reduseres antallet dyr som kreves. I denne modellen, P. aeruginosa stammer som RESULTERER i C57BL/6 murine dødelighet lik eller mindre enn E. coli BL21 når injisert intraperitonealt kan betraktes som svekket. Denne enkle musen modell av infeksjon kan også brukes til å vurdere svekket patogenitet av genetisk konstruert stammer fra andre arter ved hjelp av FDA-godkjente E. coli stamme som referanse. Trinn 1-7 detaljer generering av sekvensiell genomisk slettinger i P. aeruginosa (figur 1) og trinn 8-12 detalj bruk av en musemodell for å teste patogenitet av P. aeruginosa stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før begynnelsen dyr eksperimenter, må protokollen som skal brukes godkjennes av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC). Godkjenning for protokollen beskrevet ble innhentet gjennom IACUC ved Marshall University (Huntington, WV, USA).
1. plasmider design
- For å generere en genetisk sletting ved hjelp av pEX100T-NotI plasmider, klone regionene DNA flankerer ønsket sletting sekvens og sette inn i NotI restriksjons området av plasmider. Den plasmider innsatsen skal inneholde ca 500 nukleotider oppstrøms av målet sekvensen direkte tilstøtende til ca 500 nukleotider nedstrøms av målet sletting sekvensen. I tillegg skal innsatsen inneholde NotI gjenkjennings sekvens (GCGGCCGC) på sine 5 ' og 3 ' ender (figur 1B).
2. plasmider forberedelse
- Alternativ 1: Bruk tradisjonelle kloning prosedyrer. Bruk PCR for å forsterke genomisk regioner oppstrøms og nedstrøms av genet av interesse, etterfulgt av crossover PCR9,10 for å delta i de genererte fragmentene, restriksjon endonuclease fordøyelsen av PCR-produktet og plasmider, og ligation11 (figur 1B, C).
- Alternativ 2: etter utformingen av slette sekvensen i silisiummangan, kontrakt et selskap som de Novo syntetiserer det å sette inn i plasmider pEX100T-NotI. Mange bedrifter har strømlinjeformet prosessen med kloning for å raskt og effektivt generere plasmider av interesse. I tillegg, sekvensen verifisere plasmider å være mutasjon-fri før levering.
3. E. coli transformasjon
- Transformer electrocompetent E. coli med plasmider i henhold til produsentens anbefalinger. Ved hjelp av en steril vaksinere sløyfe, stripe 10 μL av transformasjon reaksjonen for isolerte kolonier på en pre-varmet Luria buljong (LB) agar plate supplert med 100 μg/mL carbenicillin og ruge over natten ved 37 ° c.
Merk: alt utstyr og Media som brukes til kultur bakterier bør behandles i henhold til institusjonens retningslinjer for sikkerhet. - Passage to ganger.
- Fjern platen fra inkubator og identifisere en isolert koloni. Ved hjelp av en steril vaksinere sløyfe, plukke opp kolonien og strek en pre-varmet LB agar plate supplert med 100 μg/mL carbenicillin for isolerte kolonier. Ruge over natten ved 37 ° c. Gjenta dette trinnet en gang til for å generere en ren kultur.
- Ved hjelp av en steril vaksinere sløyfe, vaksinere 5 mL LB med en enkelt koloni fra den endelige agar plate. Plasser kulturen i en risting inkubator på 37 ° c over natten. Neste dag, bland 1 mL av denne kulturen med 1 mL 5% i en cryovial og lagre ved-80 ° c for å generere en frossen lager av belastningen.
4. bakteriell stamme forberedelse og Triparental Bøyning
- Bruk en enkelt isolert koloni fra agar plater av følgende stammer til vaksinere buljong kulturer og plasser i en risting inkubator over natten ved 37 ° c.
- Legg til E. coli PEX100T-NotI i 5 ml lb supplert med 100 μg/ml av carbenicillin.
- Legg P. aeruginosa stamme PAO1 i 5 ml Pseudomonas isolasjon buljong (PiB).
- Legg til E. coli prk2013 i 5 ml lb supplert med 50 μg/ml av kanamycin.
Merk: prk2013 plasmider er en hjelper plasmider som replikerer i E. coli , men ikke P. aeruginosa; det bærer trans-fungerende overføring gener som mobilisere pEX100T-NotI plasmider fra E. coli donor til P. aeruginosa mottaker12. P. aeruginosa er en biosafety Level 2 (BSL-2) patogen. Følg institusjonens retningslinjer for sikkerhet når du arbeider med BSL-2 organismer.
- Neste dag, fjerne over natten kulturer fra inkubator og tilsett 0,5 mL av hver kultur til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube. Sentrifuger på 6 000 x g i 5 min. kast supernatanten og suspendere celle pellet i 50-100 ΜL av lb.
- Pipetter hele celle suspensjonen i en dråpe på en pre-varmet LB agar plate. La dråpe tørke. Vend deretter platen og ruge ved 37 ° c for 4-6 h.
- Etter inkubasjons, bruk en steril inoculation løkke for å samle cellene i 1 mL LB i en mikrosentrifugen tube. Pipetter opp og ned for å blande cellene.
- Ved hjelp av en celle, strek celler jevnt på en tørr forvarmet Pseudomonas isolasjon AGAR (Pia) plate supplert med 300 μg/ml carbenicillin. Strek flere plater med økende volumer av celle blandingen (f.eks. 10 μL, 100 μL, 500 μL). Ruge over natten ved 37 ° c.
5. påvisning av single-crossover recombinants av P. aeruginosa
- Fjern plater fra inkubator og inspisere for isolerte carbenicillin kolonier. Fordi pEX100T-NotI-plasmider ikke kan replikere i P. aeruginosa, skulle kolonier som vokste på carbenicillin plater, ha oppstått fra celler der plasmider ble integrert i kromosom.
- Velg minst 4 av disse koloniene og stripe for isolasjon på pre-varmet plater av PIA supplert med 300 μg/mL av carbenicillin. Ruge plater over natten ved 37 ° c.
- Fjern plater fra inkubator og inspisere for vekst. Carbenicillin kolonier bør være single-crossover recombinants (dvs. de har innarbeidet plasmider inn i kromosom via en rekombinasjon hendelse mellom en homologe region av plasmider innsats og kromosom av P. aeruginosa).
- Patch 8 eller flere kolonier med steril tannpirkere på forvarmet plater av: 1) PIA supplert med 300 μg/mL carbenicillin og 2) PIA suppleres med 300 μg/mL carbenicillin og 10% sukrose (uten glyserol).
- Hvis det ikke ble oppnådd en koloni vekst fra trinn 5,1, gjentar du bøyning og øker volumet i celle blandingen stripete i trinn 4,5. Hvis det har vært for mye vekst, gjentar du bøyning og reduserer volum stripete.
- Hvis Bøyning gjentatte ganger mislykkes, forberede electrocompetent celler av P. aeruginosa belastning og transformere direkte med PEX100T-NotI plasmider. Detaljerte protokoller for utarbeidelse av electrocompetent P. aeruginosa og transformasjon er tilgjengelig andre steder13,14.
- Ruge plater ved 37 ° c over natten.
- Fjern platene fra inkubator og Inspiser for vekst. True single-crossover recombinants vil være carbenicillin-resistente og sukrose-sensitive (dvs. kolonier som vokste på PIA supplert med carbenicillin, men ikke vokse på PIA supplert med carbenicillin og sukrose).
- Velg 4 eller flere sanne single-crossover recombinants og vaksinere hver i 5 mL LB uten valg. Ruge i en risting inkubator på 37 ° c over natten.
- Hvis det ikke ble funnet noen recombinants med én crossover, gjentar du Bøyning.
6. påvisning av Double-crossover recombinants av P. aeruginosa
- For hver buljong kultur, vaksinere 10 μL av kultur på en forvarmet plate av PIA supplert med 10% sukrose (uten glyserol) og strek for isolerte kolonier. Ruge plater over natten ved 37 ° c.
- Neste dag, fjerne plater fra inkubator og inspisere dem for vekst. Sukrose-resistente kolonier bør være dobbel crossover recombinants (dvs. har fjernet plasmider fra kromosom via en rekombinasjon hendelse mellom de andre homologe regionen av plasmider innsats og P. aeruginosa kromosom).
- Patch minst 20 kolonier med sterile tannpirkere på forvarmet plater av: 1) PIA, 2) PIA supplert med 10% sukrose (uten glyserol), og 3) PIA supplert med 300 μg/mL av carbenicillin.
- Ruge plater over natten ved 37 ° c.
- Fjern plater fra inkubator og undersøke dem for vekst. True dobbel crossover recombinants vil være carbenicillin-sensitive og sukrose-resistente (dvs. kolonier som vokste på PIA og PIA supplert med sukrose, men ikke vokse på PIA supplert med carbenicillin).
7. gen sletting bekreftelse via Colony PCR
- Forbered 10-20 kolonier for en slette skjerm med PCR.
- Plukk opp veksten fra en mistenkt dobbel crossover rekombinant med en steril tannpirker og suspendere celler i 50 til 1x fosfat bufret saltvann (PBS). Kok suspensjon ved 100 ° c i 10 min, sentrifuger for 3 min ved 13 000 x g, og deretter plassere på isen.
- Utfør PCR til skjerm kolonier for målrettet sletting.
- Bruk 1 μL av supernatanten som mal i en 25 μL PCR-reaksjon for å bekrefte sletting av genet av interesse.
- Bruk gen-spesifikke primere som forsterker regionen i genomisk slettingen. Bruk primere som forsterke regionen av genomisk sletting pluss 100-200 BP av flankerer oppstrøms og nedstrøms sekvenser.
- Forbered en egen kontroll PCR reaksjon med den overordnede belastningen (f. eks, PAO1).
Merk: Thermocycler forhold vil variere avhengig av den optimale annealing temperatur for primer par, den polymerase cocktail brukes, og lengden på regionen som skal forsterkes.
- Utfør agarose gel-elektroforese på PCR-produktene. Kolonier der interesseområdet er slettet, gir mindre forsterknings produkter enn kolonier som mangler slettingen (figur 2).
- Velg ett eller flere kolonier med PCR-bekreftet slettingen. Stripe for isolerte kolonier på en pre-varmet PIA plate (er) og ruge ved 37 ° c over natten.
- Passage minst en gang til. Fjern plate (r) fra inkubator og identifisere en isolert koloni. Ved hjelp av en steril vaksinere loop, plukke opp kolonien og strek en pre-varmet PIA agar plate for isolerte kolonier. Ruge over natten ved 37 ° c.
- Velg en koloni fra hver siste plate og bruk den til å vaksinere 5 mL PIB. Plasser i en risting inkubator på 37 ° c over natten.
- Bland 1 mL av denne kulturen med 1 mL 5% skummet melk i en cryovial og oppbevar ved-80 ° c for å generere et lager av belastningen.
- Ved hjelp av denne kulturen, forberede genomisk DNA fra belastningen (f. eks, ved hjelp av en DNA rensing kit). Forsterk genomisk slette område ved hjelp av PCR og grunning som er spesifikke for interesseområdet.
- Rens disse PCR-produkter (f. eks, med en DNA rensing kit, eller fenol-kloroform ekstraksjon) og enten sekvens direkte med genet-spesifikke primere eller ligaturer inn i en vektor for sekvensering med plasmider-spesifikke primere.
- Etter at genet slettingen er bekreftet gjennom sekvensering, gjenta denne prosedyren med den nye slettingen belastningen til sekvensielt generere mange markør frie genomisk slettinger. Når den ønskede belastningen er generert, kan du bruke hele Genova sekvensering for å bekrefte målrettede slettinger og oppdage andre endringer i Genova (sammenlignet med referanse belastningen, for eksempel PAO1) som oppstod gjennom hele prosessen. Etter å kommentere genene, sette sekvensen til GenBank og registrere tiltredelse tall.
8. utarbeidelse av bakteriell stamme for Animal testing
- For å teste for svekket patogenitet av P. aeruginosa stammer, først forberede validerte kulturer og aksjer. Forbered p. aeruginosa stammer av interesse, en vill-type stamme av P. aeruginosa (ondartet), og en FDA-godkjent stamme av E. COLI (f. eks BL21) å tjene som en patogeniske sikkerhetskontroll.
- Strek stammene av bakteriene blir testet på selektiv agar fra sekvensert og validert frosne aksjer. Ruge ved 37 ° c over natten.
- Med en steril vaksinere sløyfe, plukke opp en enkelt koloni fra hver belastning og strek for isolerte kolonier på selektive medier igjen. Ruge ved 37 ° c over natten.
- Fjern platene fra inkubator. For hver stamme, Velg en enkelt koloni og strek for isolasjon på LB plater.
- Etter 24 h av vekst ved 37 ° c, vaksinere en 500 mL kolbe som inneholder 250 mL LB med en enkelt koloni isolere fra hver stamme.
- Validerings trinn: ved hjelp av restene av samme koloni, validere belastningen ved hjelp av PCR og belastnings spesifikk grunning, og/eller primere for å verifisere tilstedeværelsen av genetiske modifikasjoner gjort i belastningen. Bruk primere nedenfor for verifisering av stammer i eksempelet presentert:
E. coli BL21:
T7 polymerase F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
T7 polymerase R:TTACGCGAACGCGAAGTCC
VE2 og PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
- Validerings trinn: ved hjelp av restene av samme koloni, validere belastningen ved hjelp av PCR og belastnings spesifikk grunning, og/eller primere for å verifisere tilstedeværelsen av genetiske modifikasjoner gjort i belastningen. Bruk primere nedenfor for verifisering av stammer i eksempelet presentert:
- Ruge kulturene i en risting inkubator på 160 RPM og 37 ° c til de når loggen fase vekst (dvs. OD600 måling på 0,4-0,6 på en spektrofotometer).
- Ved hjelp av OD600 verdi oppnås når loggen fase ble oppnådd, beregne volumet av kjøttkraft som kreves for å gi 2,5 x 109 KOLONI forming enheter (CFU) per ml. Pellet volumet av buljong beregnet i 50 mL rør ved 4 500 x g i 10 min.
- Kast supernatanten og resuspend pellet i ett rør med 50 mL 1x PBS å vaske cellene. Sentrifuger igjen ved 4 500 x g i 10 min.
- Kast supernatanten og resuspend pellet i 25 mL 5% skummet melk i 1x PBS.
- Validerings trinn: Bruk et utvalg av 25 mL-blanding til å utføre levedyktige plate tellinger for å bestemme antall CFU/mL.
- Alikvot av 25 mL skummet melke kultur blanding i 2 mL kultur bestander i 2 mL cryovials. Flash fryse i flytende nitrogen og lagre ved-80 ° c minst over natten før bruk.
9. validering av vekst og stamme av aksjer lagret for Animal testing.
- For hver belastning som skal testes, må du fjerne minst 3 cryovials av frosne bestander fra-80 ° c lagring og tine ved 4 ° c for 2-4 h. Hvis det fortsatt er frosset lager, kan du kort varme ved 37 ° c.
- Ta små prøver fra hver cryovial for å validere hver belastning.
- Utfør levedyktige plate tellinger for å bestemme antall CFU/mL. Det er normalt å ha færre CFU/mL etter frysing, på grunn av død av noen bakterielle celler.
- Bruk PCR og belastnings spesifikk grunning for å validere hver belastning.
- Strek hver belastning på selektive medier for å verifisere fenotype.
- Etter å ha bekreftet at stammer er av riktig genotype og fenotype, og validere CFU/mL, gå videre til dyreforsøk.
10. inoculation av dyr med bakterielle stammer ved injeksjon
- Om morgenen injeksjoner, fjerne cryovials av bakteriestammer testes og tine ved 4 ° c for 3-4 h. Tin 0,5 mL for hver mus som skal injiseres. Hold hetteglass på isen etter tine og injisere mus innen 2 t.
- Etter tine, overføre hver cryovial til en ny 2 mL rør og sentrifuger på 4 500 x g i 10 min, kast supernatanten, og resuspend cellen pellet i 1 ml 1x PBS.
- Sentrifuger igjen ved 4 500 x g for 10 m. kast supernatanten og resuspend pellet i 1x PBS til en endelig konsentrasjon 2,5 x 109 CFU/ml. For å finne ut hvor mye 1x PBS nødvendig for blanding, bruke CFU/mL data innhentet fra levedyktig plate teller på frosne aksjer i trinn 2.2.1. Den nøyaktige mengden 1x PBS brukes vil variere litt mellom stammer.
- Ta 3 prøver fra endelig suspensjon av hver belastning for å validere CFU/mL, genotype, og fenotype som beskrevet ovenfor.
- For hver belastning, alikvot 1,5 mL av PBS/Cell suspensjon i ett 2 mL rør per 5 mus for å begrense antall ganger røret er angitt. Også forberede rør av 1x PBS for kontroll injeksjoner.
- Samle mus (10 mannlige og 10 kvinnelige C57BL/6 per gruppe for dette eksperimentet) og materialer som trengs for injeksjoner (sprøyter, nåler, skarpe beholdere, markører, penn og papir,etc.). Flytt til det sterile dyre operasjonsrommet. Tørk alle overflater med desinfiserende kluter.
- For å eliminere nød og risiko for skade på eksperimentator, bare ta med ett kjønn og eksperimentell gruppe av mus til operasjonsstuen om gangen (f. eks, en gruppe på 10 mannlige mus å være smittet med en bestemt belastning). Bruk to par latex hansker for å eliminere punktering av hansker hvis bitt. Bruk Laboratoriefrakk, vernebriller og ansiktsmaske for å unngå kontaminering.
- Begynn injeksjoner av kontrollgruppen med 1x PBS. Dette vil finne ut om noen negative effekter skyldes injeksjon alene.
- Fjern en mus fra buret. Fjern bare én mus om gangen.
- Veie musa og merke halen med permanent markør for å spore for vekttap etter injeksjon.
- Åpne en ny 1 mL sprøyte og 27 G nål (bruk en ny sprøyte og nål for hver mus for å eliminere forurensning) og Injiser 200 μL av steril 1x PBS.
- Grip musen bak ørene ved hjelp av tommelen og pekefingeren. Knip for å skape hud fold i nakken for å holde på-en strammere fold reduserer nakke bevegelse og risikoen for å bli bitt under injeksjon. Sikre halen inn i håndflaten ved hjelp av pinky å holde musen flatt med liten bevegelse.
- Snu musen over og sett nålen ved 30 ° vinkel inn i bukhulen til venstre eller høyre side av midtlinjen. Løft nålen litt en gang satt inn for å sikre at den ble satt inn i intraperitoneal området og ikke i organer. Injiser langsomt PBS og deretter trekke nålen.
- Plasser den brukte nålen i en egen avfallsbeholder for farlig biologisk Ikke bruk sprøyten eller nålen på nytt. En bolus på injeksjonsstedet er typisk.
- Etter injeksjon, flytte musen til et eget bur.
- Gjenta prosedyren med den neste musen. Etter at alle musene av ett bur injiseres, returnere dem til sin opprinnelige buret umiddelbart.
- Etter å ha injisert kontrollgruppen, begynner du å injisere suspensjoner av stammer som skal testes etter samme prosedyre.
- Injiser 200 μL av celle fjæringen. Når du begynner med celle suspensjoner av 2,5 x 109 CFU/ml, hver mus mottar 5 x 108 CFU.
Merk: disse konsentrasjonene ble optimalisert med foreløpige dyr forskning for å bestemme dødelige doser av hver stamme. Doseringen må kanskje justeres for andre stammer/arter.
- Injiser 200 μL av celle fjæringen. Når du begynner med celle suspensjoner av 2,5 x 109 CFU/ml, hver mus mottar 5 x 108 CFU.
- Når alle injeksjoner er fullført, returnere mus til bolig rommet for å lindre nød. Rent arbeidsområde med desinfiserende kluter.
- Dataskjerm dyrene for dødelighet fulgte injeksjon av avmerker burene for død mus enhver 3 h for 72 h og enhver 12 h for 10 dager. Registrere vekten av mus hver 12 h for å bestemme vekttap på grunn av sykdom.
- Ta opp uønskede atferd i timene etter injeksjon, slik som forskjell i holdning, mangel på grooming eller gravende, immobilitet, eller endringer i pusting. Mus som bortgang fra skade forbundet med injeksjon vil vise negativ atferd og dø raskt etter injeksjon. På den andre side, mus det bortgang fra infeksjon ville ikke starte å forevise ugunstig opptreden eller død til etter 18 h. Enhver mus som ikke utviser negativ adferd eller omfattende tegn på sykelighet, inkludert rask eller anstrengt åndedrett, immobilitet, bøyd holdning, forliste øyne, alvorlig dehydrering eller andre, bør euthanized for å redusere unødvendig lidelse (som overholder godkjente IACUC-protokoller). Men i våre eksperimenter, euthanization var ikke nødvendig for noen mus under eksperimentet. Overlevende mus ble euthanized 10 dager etter ferdigstillelse av testing.
- Etter 10-dagers overvåking periode, la dyrene gjenværende å komme seg helt og bli klar av eventuelle infeksjoner administrert under testing. Euthanize dyr etter IACUC prosedyre.
11. statistisk analyse av Animal dødelighet
- Utføre statistisk analyse ved hjelp av grafisk programvare. Enhver programvare som kan produsere grafer og utføre statistisk analyse er egnet.
- For å plotte dødelighet data, bruk X-kolonnen for å representere time (h) og Y kolonne for å representere gruppene testet.
- Representerer hver mus eller emne i studien ved hjelp av kode = 0 (null) eller kode = 1, indikerer overlevelse eller død, henholdsvis.
- For hvert dyr som dør, Plasser en 1 i Y-kolonnen i den gruppen på tidspunktet for dødsfallet på X-kolonnen. Hvis det er flere dødsfall på et enkelt tidspunkt i en gruppe, kan du plassere en kopi av dette tids punktet i X-kolonnen. Hvis for eksempel tre emner i en gruppe dør til 3 timer, vil 3 h-punktet vises tre ganger i X-kolonnen.
- For alle overlevende dyr i en gruppe plasserer du en null i Y-kolonnen på det siste punktet som måles. Hvis for eksempel fire mus overlever, plasserer du fire sluttidspunkt i X-kolonnen som er merket med fire nuller i Y-kolonnen.
- Når dyr data er lagt inn for alle grupper, bruke en overlevelse graf mal for å produsere en overlevelse graf.
- La standard koding være 0 og 1.
- Angi parametrene for grafen som prosent.
- Når parametere for Survival Curve er valgt, utføre statistisk analyse ved hjelp av en mantel-Cox (log Rank) test.
- Formater Kaplan-Meier-plott ved hjelp av statistiske data.
Merk: belastninger som viser dødelighet som er mindre enn eller lik den overordnede belastningen og FDA-godkjent belastning (f. eks e. coli BL21) kan betraktes som svekket.
12. visualisering av infeksjon med bioluminesens
- For å visualisere fremdriften av infeksjonen, sette inn en kromosom Puerto Mosquito operon (luxCDABE) i PGN5 og VE2 belastning testet. Den plasmider og protokollen som brukes til å merke disse stammene ble utviklet i Schweizer laboratoriet og kan ikke være kompatibel med alle arter/stammer av bakterier13. Viktigere er visualisering av infeksjonen valgfritt; genomisk innsetting av denne operon er derfor ikke nødvendig for å utføre dødeligheten som er beskrevet ovenfor.
- Klargjør og Valider belastninger ved hjelp av metoden som er beskrevet ovenfor. I tillegg kan du se etter bioluminesens i merkede stammer ved hvert validerings trinn.
- Etter at stammer er forberedt, injisere dyrene i grupper på 10 med Puerto Mosquito stammer følge trinnene ovenfor.
- Image dyrene enhver 3 h for 24 h benytter en dyr tenkelig system dugelig av bioluminesens.
- Først forberede imager ved å sette kameraet parametere og varme scenen for dyrene. Også sette oksygenstrømmen til 1,5 L per min (eller etter produsentens anbefalinger).
- Etter at imager og scenen er stabilisert, plasserer en mus i anestesi kammeret umiddelbart etter injeksjon og administrere 3,5% isoflurane inn i kammeret med O2 Flow i ca 4 min. Anestesi metoder kan variere avhengig av kammer og/eller bedøvelse agent brukes; følge produsentens anbefalinger. Bestem riktig anestesi via abstinens refleks test.
- Flytt musen til temperaturen stabilisert scenen. Plasser musen på ryggen med armene utstrakte og passer musen med en nese kjegle for administrasjon av 2,5% isoflurane hele Imaging prosedyre.
- Lukk døren og ta Puerto Mosquito bilder og røntgenstråler av mus.
- Når tenkelig er fullstendig, retur musa å dens bur og dataskjerm den. Musen skal gjenvinne bevisstheten innen 3-5 min.
- Fortsett til bilde mus hver 3 h for 24 h, hver gang ved hjelp av en annen mus fra hver gruppe. Ikke reimage en mus innen 24 h på grunn av muligheten for uønskede effekter på grunn av re-eksponering for anestesi. En enkelt mus skal bare få én dose anestesi hver 24-36 h. Rengjør bildebehandlings plattformen etter at hver mus er avbildet. Slå av imager mellom Imaging tid poeng.
Merk: bioluminesens vil falme, uavhengig av belastningen injisert. Intensiteten og levetiden til bioluminesens vil variere avhengig av mange faktorer, inkludert antall bakterier injisert, mus belastning, bakteriell belastning, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 2, kan den målrettede genomisk slettingen bekreftes ved hjelp av koloni PCR med spesifikk grunning som forsterker interesseområdet. Kolonier som har en genomisk sletting vil gi et kortere PCR-band størrelse i forhold til vill-type kolonier. En PCR-Screen av 10-12 kolonier er vanligvis tilstrekkelig til å oppdage minst en koloni som bærer målrettet sletting. Hvis det ikke oppdages noen slettinger etter flere runder med skjermbilder, gjentar du prosedyren som begynner med bøyning. Hvis slettingen fortsatt mislykkes, kan plasmider sette inn må bekreftes gjennom sekvensering, redesignet, eller slettingen kan være dødelig. Ved verifisering av en gen sletting via PCR, Bekreft slettingen gjennom sekvensering. Den resulterende belastningen kan bli utsatt for prosedyren gjentatte ganger for å generere sekvensiell genomisk modifikasjoner.
Som vist i Figur 3, var dødelighet assosiert med intraperitoneal injeksjon av den svekkede belastningen av P. aeruginosa PGN5 (+ mucE) 0%, noe som tilsvarer dødelighet som ble observert med E. coli BL21. På den annen side, intraperitoneal injeksjon av den overordnede belastningen (VE2) var dødelig for 80% av mus. Disse resultatene ble innhentet med omfattende tiltak for å validere stammene injisert. Mens den eksakte dødsårsaken i disse musene er ukjent, kan det i det minste delvis tilskrives uttrykk for virulens faktorer i den overordnede belastningen som ble slettet fra den svekkede PGN5-belastningen. Forskjeller i infeksjons progresjon ble sporet ved hjelp av bioluminesens-merkede foreldre og svekkede stammer. Den svekkede belastningen forble lokalisert på injeksjonsstedet inntil bioluminesens falmet (Figur 4). Clearance av infeksjonen mest sannsynlig falt sammen med falming av bioluminesens. Bioluminesens ble ikke påvist 24 timer etter injeksjon og mus levde i uker etter injeksjon inntil ofret, uten bivirkninger observert.
Figur 1: generering av gen slettinger i P. aeruginosa med PEX100T-NotI. (A) kart over PEX100T-NotI plasmider. (B) generering av en konstruksjon bestående av regioner direkte oppstrøms (gul) og nedstrøms (blå) i regionen av interesse (ROI), flankert med NotI restriksjon enzym anerkjennelse nettsteder. Først PCR-forsterke oppstrøms og nedstrøms regioner uavhengig med spesifikke primere som legger 5 ' NotI fordøyelse nettsteder (f. eks, NotI-aroA f CGCGGCCGCTGAAGGTCCTGGGCTCCTATCCGAAAGCGGTGCTCT og NotI-aroA R GCGGCCGCAGTTGGGTTGTTCTGCGATGGCGCCAGGCA) og 3 ' overlappende homologe regioner som vist (f. eks, aroA-crossover F CTCCAGGCGCTGGGCAAGGTGCTGGCGCATGACTGAGGTCACGCCGGTCGCCGTGGAGAACA og aroA-crossover r TGTTCTCCACGGCGACCGGCGTGACCTCAGTCATGCGCCAGCACCTTGCCCAGCGCCTGGAG. Bruk deretter PCR-withNotI primere til å bli med i oppstrøms-og nedstrøms produkter som genereres i den første PCR-reaksjonen. (C) PEX100T-NotI plasmider, bevæpnet og klar. Ombinde det NotI-fordøyd cross-over PCR produktet inn i NotI-fordøyd plasmider. (D) Flow diagram av prosessen for å slette genomisk regioner fra P. aeruginosa kromosom ved hjelp av pEX100T-NotI plasmider. Etter at den ønskede slettingen er bekreftet og renset, kan den resulterende belastningen tas gjennom prosedyren gjentatte ganger for å slette andre genomisk regioner fra kromosom. Når den ønskede belastningen er oppnådd, sekvensen hele Genova for å bekrefte slettinger og andre endringer i kromosom. Patogenitet av belastningen kan deretter testes hos mus ved hjelp av prosedyren som er beskrevet i del II av protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: gel elektroforese av kolonien PCR produkter fra en skjerm for aroA sletting å generere svekket P. AERUGINOSA stamme, PGN5. Colony PCR-produkter kjører i baner 2-5 og 8-11 indikere kolonier med vill-type aroA. Kolonien PCR-produkter kjører i baner 6 og 7 bære aroA gen sletting, indikert av det mindre PCR-produktet (gule stjerner). Primere brukes spesielt forsterket genomisk regionen inneholder aroA Gene: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC og aroA-R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC. Forventet PCR produktstørrelse i vill-type kolonier var 2 548 nukleotider (NT). Forventet PCR-produktstørrelse i kolonier med aroA sletting var 307 NT. En DNA-stige ble kjørt i baner 1 og 12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: samlet dødelighet av mus injisert med patogene p. aeruginosa STAMME (VE2), svekket p. AERUGINOSA stamme (PGN5 + MUCE), og FDA kontroll E. coli stamme (BL21). Bare mus injisert med patogene foreldre stamme utstilt dødelighet på 80%. Svekket P. aeruginosa belastning og FDA kontroll E. coli stamme utstilt 0% dødelighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bilde av mus 3 h etter injeksjon av svekket stamme av P. aeruginosa PGN5 + mucE bære en Puerto Mosquito markør. Puerto Mosquito bakterier ble synlig inntil 18-24 h etter injeksjon. I løpet av denne perioden, forble bioluminesens på injeksjonsstedet som indikerer at bakteriene ble lokalisert til injeksjonsstedet. Denne musen helt utvinnes uten bivirkninger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PEX100T-Not1-plasmider er en effektiv formidler av sekvensielle genomisk slettinger som er markør fri og i-ramme. Når engineering bakterielle stammer for svekket virulens, sletting av hele gen sekvenser snarere enn å generere punkt mutasjoner reduserer sannsynligheten for reversion til en voldsom fenotype. I tillegg, hver patogenitet gen sletting attenuates den patogen videre, forsterke stabiliteten av demping.
Denne metoden kan også brukes til å generere genomisk modifikasjoner enn slettinger, for eksempel punkt mutasjoner og innsettinger, ganske enkelt ved å endre utformingen av plasmider innsatsen. Disse typer modifikasjoner kan være mer nyttig enn hele genet slettinger for tekniske bakterier med modifisert metabolisme, for eksempel. Sekvensiell genomisk modifisering har betydelig potensial for generering designer bakterielle stammer som passer bestemte formål i forskning og industri. Andre metoder for å generere ønsket markør-gratis genomisk modifikasjoner i bakterier har blitt beskrevet15,16,17,18. Som med alle Genova-redigering metoder, forsøkte modifikasjoner til essensielle genomisk regioner kan være dødelig, og dermed mislykket. I disse tilfellene er identifisering av ulike genetiske modifikasjoner eller andre kandidat gener nødvendig for å generere bakteriell stamme av interesse.
Gitt de mange replikering hendelser og passasjer av hver koloni gjennom denne protokollen, utilsiktede endringer i Genova vil skje til den genererte belastningen. Den eksakte genomisk endringer kan identifiseres gjennom hele-Genova sekvensering. Imidlertid er virkningen av disse endringene vanskeligere å fastslå. Når engineering bakterier for et bestemt formål, genomisk endringer som ikke negativt påvirke veksten av organismen eller målrettede veien (e) er utholdelig. Avhengig av belastningen som genereres, kan det være mulig å identifisere en "avlesning" for å sikre at belastningen er fortsatt nyttig for sitt tiltenkte formål. For eksempel, med PGN5, var målet å skape en svekket belastning som beholdt evnen til å produsere store mengder alginat. Etter sletting av fem patogenitet gener, ble mengden og sammensetningen av alginat produsert av PGN5 målt og fast bestemt på å være sammenlignbare med andre alginat-produserende stammer. Dermed ble alginat produksjon upåvirket av de fem gen slettinger, heller ikke av utilsiktede genomisk endringer som oppsto under utviklingen av PGN5.
En modell av intraperitoneal mus injeksjon ble brukt til å avgjøre om en konstruert belastning ble svekket i forhold til den overordnede belastningen og E. coli BL21, en belastning godkjent av FDA for produksjon av biopharmaceuticals. De viktigste trinnene tatt i løpet av denne dyre testprosedyren var utarbeidelse og validering av frosne bakterielle aksjer. Tilberedning og bruk av frosne bakteriekulturer for å injisere mus er å foretrekke å bruke kontinuerlig kultur, da det reduserer antall mutasjoner som naturlig forekommer i bakterie populasjoner19. I tillegg bør frosne kulturer forbli levedyktig i årevis. Levedyktig plate teller viste ingen signifikant forskjell mellom CFU/mL direkte etter at bestandene var forberedt og tre måneder etter tilberedning. Bruken av flere validerings trinn gjennom hele denne prosedyren sørget for at metoden var reproduserbar, og resultatene ble ikke skjev av forurensende bakterier. I tillegg, med antall forholdsregler tatt for å sikre reproduserbarhet, var færre dyr nødvendig. Ved hjelp av en bakteriell stamme som er FDA-godkjent for biofarmasøytisk produksjon som kontroll (for eksempel E. coli stamme BL21), denne metoden kan brukes til å teste demping av andre genetisk konstruert stammer av P. aeruginosa, eller andre arter av bakterier.
Ved hjelp av bioluminesens som en markør gir ytterligere validering av bakteriestammer injisert, som markøren kan bli visualisere på injeksjonsstedet. Innsetting av bioluminesens markør inn i bakteriell kromosom er nødvendig for bioluminesens Imaging, men kan ikke være mulig hvis du arbeider med inkompatible stammer/arter. Det er imidlertid ikke nødvendig å merke stammer med bioluminesens for å teste for demping. Stammene testet i denne studien var merket med bioluminesens, som tillot visualisering av lokalisering forskjeller mellom stammer i løpet av infeksjonen. Vi observerte at sykdomsfremkallende belastningen spres gjennom kroppen av musen, men den ikke-patogene belastningen forble på injeksjonsstedet. Mens dette eksperimentet bare testet to svært nært beslektede stammer av P. aeruginosa, tyder det på at bakteriell formidling er knyttet til virulens, i hvert fall i P. aeruginosa. Således kan denne prosedyren for merking med bioluminesens for å visualisere progresjon av infeksjonen brukes i fremtiden for raskt å evaluere demping av konstruerte bakteriestammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Hongwei D. Yu er Chief Science Officer og medgrunnlegger av Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd R44GM113545 og P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
