Generering av in-Frame gen radering mutanter i Pseudomonas aeruginosa och testning för virulens dämpning i en enkel musmodell av infektion

Summary

Här beskriver vi ett enkelt och reproducerbart protokoll av musmodell av infektion för att utvärdera försvagningen av den genetiskt modifierade stammar av Pseudomonas aeruginosa i jämförelse med USA Food and Drug Administration (FDA)-godkända Escherichia coli för kommersiella tillämpningar.

Abstract

Mikroorganismer är genetiskt mångsidig och varierande och har blivit en viktig källa till många kommersiella produkter och Biopharmaceuticals. Även om vissa av dessa produkter produceras naturligt av organismer, andra produkter kräver genteknik av organismen att öka avkastningen av produktionen. Avirulent stammar av Escherichia coli har traditionellt varit den föredragna Bakteriearten för att framställa biologiska läkemedel; emellertid, vissa produkter är svåra för E. coli att producera. Således kan Avirulenta stammar av andra bakteriearter ge användbara alternativ för produktion av vissa kommersiella produkter. Pseudomonas aeruginosa är en vanlig och väl studerat gramnegativ bakterie som kan ge ett lämpligt alternativ till E. coli. Emellertid, P. aeruginosa är en opportunistisk mänsklig patogen. Här, vi detalj en procedur som kan användas för att generera nonpatogena stammar av P. aeruginosa genom sekventiella genomiska borttagningar med hjälp av pEX100T- Den största fördelen med denna metod är att producera en markör-fri stam. Denna metod kan användas för att generera mycket försvagade P. aeruginosa -stammar för produktion av kommersiella produkter, eller för att konstruera stammar för andra specifika användningar. Vi beskriver också en enkel och reproducerbar musmodell av bakteriell systemisk infektion via intraperitoneal injektion av validerade test stammar för att testa försvagningen av den genetiskt modifierade stammen i jämförelse med FDA-godkända BL21 stam av E. coli.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa är en opportunistisk bakteriell patogen som kan orsaka livshotande sjukdomar hos människor, särskilt i den immunsupprimerade. Patogenicitet av P. aeruginosa beror på uttrycket av många virulensfaktorer, inklusive proteaser och lipopolysackarid, samt dess förmåga att bilda en skyddande biofilm¹. På grund av dess förmåga att producera virulensfaktorer och orsaka sjukdom hos människor, med hjälp av P. aeruginosa att göra kommersiella produkter presenterar säkerhetsproblem. Icke-patogena stammar av E. coli har traditionellt använts för att bioengineer medicinska och kommersiella produkter för humant bruk. Emellertid, vissa produkter är svåra för E. coli att göra, och många är förpackade i inkludering organ, vilket gör utvinning mödosam. Konstruerade bakteriestammar med förmågan att göra och utsöndra specifika produkter är mycket önskvärt, som sekretion skulle sannolikt öka avkastningen och lindra reningsprocesser. Sålunda, icke-patogena stammar av andra arter av bakterier (t. ex. arter som utnyttjar mer sekretion vägar) kan ge användbara alternativ till e. coli. Vi rapporterade nyligen utvecklingen av en stam av P. aeruginosa, PGN5, där patogenitet och toxicitet av organismen är mycket försvagade². Viktigare, denna stam producerar fortfarande stora mängder av polysackarid alginate, en kommersiellt intressant del av P. aeruginosa biofilm.

Den PGN5 stammen genererades med hjälp av en två-stegs alleliska utbyte förfarande med pEX100T-e plasmid att sekventiellt ta bort fem gener (toxa, plch, phzm, wapr, Aroa) kända för att bidra till patogeniteten av organismen. pEX100T-är en produkt som genereras genom att ändra Smai till en för att erkänna en sida av enzymet erkännande av multipel kloning av plasmid pEX100T, som utvecklades i Herbert schweizers labb^3,4. Erkännande platsen för restriktionsenzymen är en ovanligare DNA-sekvens jämfört med SmaI och mindre sannolikt att vara närvarande i sekvenser som klonas, vilket gör det bekvämare för kloning. Plasmiden bär gener som möjliggör val, inklusive bla genen, som kodar ß-Lactamase och ger resistens mot carbenicillin, och B. subtilissacB genen, som ger känslighet för sackaros (figur 1A). Plasmid bär också ett ursprung av replikering (Ori) kompatibel med E. coli, och ett ursprung av överföring (Orit) som möjliggör plasmid överföring från E. coli till Pseudomonas arter via konjugering. Emellertid, plasmiden saknar ett ursprung av replikering förenligt med Pseudomonas, och därmed inte kan replikera inom Pseudomonas arter (dvs., det är en Pseudomonas självmord vektor). Dessa egenskaper gör pEX100T-en idealisk för att rikta genetiska borttagningar från Pseudomonas -kromosomen. Plasmid kloning steg utförs med hjälp av E. coli och den resulterande plasmid överförs till Pseudomonas genom omvandling eller konjugering. Sedan, genom homolog rekombination händelser och selektiva steg, den riktade in-Frame radering genereras, markör-fri. Denna metod för sekventiellt ta bort genomiska regioner från kromosomen av P. aeruginosa kan användas för att generera mycket försvagade Pseudomonas stammar, som PGN5, eller att utforma stammar för andra specifika användningsområden (t. ex., stammar bristfällig i endonukleaser för plasmid förökning eller stammar brist på proteaser för produktion av proteiner av intresse).

Den totala virulens stammar av bakterier påverkas av tillväxtförhållanden och faser, under vilka mutationer förekommer ofta. Därför kan det vara utmanande att mäta säkerheten hos genetiskt modifierade stammar. För att utvärdera bakteriella isolat för systemisk virulens, anpassade vi ett tidigare publicerat protokoll för infektion genom intraperitoneal injektion av C57BL/6 möss⁵. Vi modifierade detta förfarande för att använda frysta bakteriella lager för injektion, som tillät exakt dosering och enkel validering av de stammar som används. I denna modell, E. coli stam BL21, som har FDA-godkänt för produktion av Biopharmaceuticals, användes som en kontroll säkerhetsstandard för att bestämma den relativa patogenesen av stammen^6,7,8. Den största fördelen med att använda denna metod är att det är reproducerbara och minimerar källor till variation, som infekterande stammar valideras för bakteriell cell nummer, fenotyp, och genetiska markörer både före och efter infektion. Med dessa kontrollerade steg minskar antalet djur som krävs. I denna modell, P. aeruginosa stammar som resulterar i C57BL/6 murin dödlighet priser lika med eller mindre än E. coli BL21 när injiceras intraperitonealt kan anses vara försvagade. Denna enkla musmodell av infektion kan också användas för att bedöma den försvagade patogenicitet av genetiskt modifierade stammar från andra arter med hjälp av FDA-godkända E. coli stam som referens. Steg 1-7 detalj generering av sekventiella genomiska borttagningar i p. aeruginosa (figur 1) och steg 8-12 detalj användning av en musmodell för att testa patogenicitet av p. aeruginosa stammar.

Protocol

Innan djurförsök inleds måste det protokoll som skall användas godkännas av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC). Godkännandet för det beskrivna protokollet erhölls genom IACUC vid Marshall University (Huntington, WV, USA).

1. plasmid design

1. För att generera en genetisk radering med hjälp av pEX100T-registrering plasmid, klona regionerna i DNA fladta önskad radering sekvens och infoga i den registrering av plasmid. Plasmid-insatsen bör innehålla omkring 500 nukleotider uppströms målsekvensen i direkt anslutning till ca 500 nukleotider nedströms av målraderingssekvensen. Dessutom ska skäret innehålla en (GCGGCCGC) av den s.k. "5" och "3"-sekvensen (figur 1B).

2. plasmid beredning

1. Alternativ 1: Använd traditionella klonings procedurer. Använd PCR för att förstärka genomiska regioner uppströms och nedströms av genen av intresse, följt av crossover PCR^9,10 att ansluta sig till de genererade fragment, begränsning Endonuklease nedbrytning av PCR-produkten och plasmid, och ligering¹¹ (figur 1B, C).
2. Alternativ 2: efter utformningen av raderingssekvensen i silico, kontrakt ett företag som de Novo syntetiserar den att infoga i plasmid pEX100T-. Många företag har effektiviserat kloningsprocessen för att snabbt och effektivt generera plasmiden av intresse. Dessutom, sekvens kontrollera plasmiderna att vara mutation-fri före leverans.

3. E. coli -omvandling

1. Omvandla elektrokompetent E. coli med plasmid enligt tillverkarens rekommendationer. Med hjälp av en steril vaccinera loop, strimma 10 μl av omvandlings reaktionen för isolerade kolonier på en förvärmda Luria buljong (lb) agar plattan kompletterad med 100 μg/ml carbenicillin och inkubera över natten vid 37 ° c.
   Anmärkning: all utrustning och alla medier som används för att odla bakterier bör behandlas enligt institutionens säkerhetsriktlinjer.
2. Passage två gånger.
   1. Ta bort plattan från inkubatorn och identifiera en isolerad koloni. Med hjälp av en steril vaccinera loop, plocka upp kolonin och strimma en pre-värmas lb agar plattan kompletteras med 100 μg/ml carbenicillin för isolerade kolonier. Inkubera över natten vid 37 ° c. Upprepa detta steg en gång till för att generera en renkultur.
3. Använd en steril vaccinera loop, Inokulera 5 ml lb med en enda koloni från den sista agarplattan. Placera kulturen i en skakande inkubator vid 37 ° c över natten. Nästa dag, blanda 1 mL av denna kultur med 1 mL 5% i en kryovial och lagra vid-80 ° c för att generera en fryst lager av stammen.

4. bakteriestam beredning och Triparental konjugation

1. Använd en enstaka isolerad koloni från agarplattor av följande stammar för att Inokulera buljong kulturer och placera i en skakande inkubator över natten vid 37 ° c.
   1. Tillsätt E. coli pEX100T-i 5 ml lb kompletterad med 100 μg/ml carbenicillin.
   2. Tillsätt P. aeruginosa stam PAO1 i 5 ml av Pseudomonas isolation buljong (PIB).
   3. Tillsätt E. coli prk2013 i 5 ml lb kompletterat med 50 μg/ml kanamycin.
      Anmärkning: den prk2013 plasmid är en hjälpare plasmid som replikerar i E. coli men inte P. aeruginosa; Det bär trans-tillförordnade överföringsgener som mobiliserar pEX100T-PFEN plasmid från den E. coli donatorn till den P. aeruginosa mottagaren¹². P. aeruginosa är en biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) patogen. Följ institutionens riktlinjer för säkerhet när du arbetar med BSL-2 organismer.
2. Nästa dag, ta bort natten kulturer från inkubator och tillsätt 0,5 mL av varje kultur till en 1,5 mL microcentrifug röret. Centrifugera vid 6 000 x g i 5 min. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten i 50-100 μl lb.
3. Pipettera hela cellsuspensionen i en droppe på en pre-warmed LB agar plattan. Låt droppet torka. Vänd sedan plattan och inkubera vid 37 ° c för 4-6 h.
4. Efter inkubationen, Använd en steril inympningslinga för att samla in cellerna i 1 mL LB i ett microcentrifugerör. Pipettera upp och ner för att blanda cellerna.
5. Med hjälp av en cell spridare, strimma celler jämnt på en torr förvärmda Pseudomonas isolation agar (Pia) plattan kompletteras med 300 μg/ml carbenicillin. Strimma flera plattor med ökande volymer av cell blandningen (t. ex. 10 μL, 100 μL, 500 μL). Inkubera över natten vid 37 ° c.

5. detektion av Single-crossover rekombinanter av P. aeruginosa

1. Ta bort plattorna från inkubatorn och inspektera för isolerade carbenicillin-resistenta kolonier. Eftersom pEX100T-en Plasmid inte kan replikera i P. aeruginosa, kolonier som växte på carbenicillin-kompletterade plattor bör ha uppstått från celler där plasmid integrerades i kromosomen.
   1. Välj minst 4 av dessa kolonier och strimma för isolering på förvärmda plåtar av PIA kompletterad med 300 μg/mL carbenicillin. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° c.
2. Ta bort plattorna från inkubatorn och inspektera för tillväxt. Carbenicillin-resistenta kolonier bör vara Single-crossover rekombinanter (dvs., de har införlivat plasmiden i kromosomen via en rekombination händelse mellan en homolog region i plasmid insatsen och kromosomen av P. aeruginosa).
   1. Plåster 8 eller fler kolonier med sterila tandpetare på förvärmda plåtar av: 1) PIA kompletterad med 300 μg/mL carbenicillin och 2) PIA kompletterad med 300 μg/mL carbenicillin och 10% sackaros (utan glycerol).
   2. Om ingen koloni tillväxt erhölls från steg 5,1, upprepa konjugering och öka volymen av cell blandningen strimmiga i steg 4,5. Om för mycket tillväxt inträffade, upprepa konjugering och minska volymen strimmiga.
   3. Om konjugering upprepade gånger misslyckas, förbereda elektrokompetenta celler av P. aeruginosa stam och omvandla direkt med pEX100T-en plasmid. Detaljerade protokoll för beredning av elektrokompetent P. aeruginosa och Transformation finns tillgängliga på andra ställen^13,14.
3. Inkubera plattorna vid 37 ° c över natten.
4. Ta bort plåtar från inkubator och inspektera för tillväxt. True Single-crossover rekombinanter kommer att vara carbenicillin-resistent och sackaros-känslig (dvs kolonier som växte på PIA kompletterades med carbenicillin, men inte växa på PIA kompletteras med carbenicillin och sackaros).
   1. Välja 4 eller mer sann enkel-crossover rekombinanter och Inokulera var in 5 mL av LB utan utväljande. Inkubera i en skakande inkubator vid 37 ° c över natten.
   2. Om inga enkelkorsnings rekombinanter upptäcktes, upprepa konjugering.

6. detektion av dubbel-crossover rekombinanter av P. aeruginosa

1. För varje buljong kultur, Inokulera 10 μL av kulturen på en förvärmda tallrik PIA kompletteras med 10% sackaros (utan glycerol) och strimma för isolerade kolonier. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° c.
2. Nästa dag, ta bort plattorna från inkubatorn och inspektera dem för tillväxt. Sackaros-resistenta kolonier bör dubbel-crossover rekombinanter (dvs., har avlägsnat plasmid från kromosomen via en rekombination händelse mellan den andra homolog regionen av plasmid insatsen och P. aeruginosa kromosomen).
   1. Plåster minst 20 kolonier med sterila tandpetare på förvärmda plåtar av: 1) PIA, 2) PIA kompletterad med 10% sackaros (utan glycerol) och 3) PIA kompletterad med 300 μg/mL carbenicillin.
3. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° c.
4. Ta bort plattorna från inkubatorn och undersök dem för tillväxt. True Double-crossover rekombinanter kommer att vara carbenicillin-känslig och sackaros-resistent (dvs kolonier som växte på PIA och PIA kompletterades med sackaros, men inte växa på PIA kompletterad med carbenicillin).

7. bekräftelse av genradering via Colony PCR

1. Förbered 10-20 kolonier för en borttagnings skärm med PCR.
   1. Plocka upp tillväxten från en misstänkt dubbel-crossover rekombinant med en steril tandpetare och suspendera celler i 50 μL av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Koka suspension vid 100 ° c i 10 min, Centrifugera i 3 min vid 13 000 x g, och sedan placera på isen.
2. Utför PCR för att avskärma kolonier för riktad radering.
   1. Använd 1 μL av supernatanten som mall i en 25 μL PCR-reaktion för att bekräfta strykningen av genen av intresse.
   2. Använd genspecifika primers som förstärker regionen för genomisk radering. Använd primers som förstärker regionen för genomisk radering plus 100-200 BP av flankning uppströms och nedströms sekvenser.
   3. Bered en separat kontroll-PCR-reaktion med den överordnade stammen (t. ex. PAO1).
      Obs: ThermoCycler villkor varierar beroende på den optimala glödgningstemperaturen för primer par, polymeras cocktail används, och längden på den region som skall förstärkas.
3. Utför agaros gel-elektrofores på PCR-produkterna. Kolonier där den intressanta regionen har raderats ger mindre förstärknings produkter än kolonier som saknar strykningen (figur 2).
4. Välj en eller flera kolonier med den PCR-bekräftade borttagningen. Strimma för isolerade kolonier på en förvärmda PIA-platta (s) och inkubera vid 37 ° c över natten.
5. Passage minst en gång till. Ta bort plattan/plattorna från inkubatorn och identifiera en isolerad koloni. Med hjälp av en steril vaccinera loop, plocka upp kolonin och strimma en förvärmda Pia agar plattan för isolerade kolonier. Inkubera över natten vid 37 ° c.
6. Välj en koloni från varje sista plattan och använda för att Inokulera 5 mL PIB. Placera i en skakande inkubator vid 37 ° c över natten.
   1. Blanda 1 mL av denna kultur med 1 mL 5% skummjölk i en kryovial och förvara vid-80 ° c för att generera ett lager av stammen.
   2. Genom att använda denna kultur, förbereda genomiskt DNA från stammen (t. ex. med hjälp av en DNA-rening Kit). Förstärka den genomiska borttagnings regionen med hjälp av PCR och primers som är specifika för regionen av intresse.
      1. Rena dessa PCR-produkter (t. ex. med en DNA-rening kit, eller fenol-kloroform extraktion) och antingen sekvens direkt med de genspecifika primers eller och ligaturer i en vektor för sekvensering med plasmid-specifika primers.
7. Efter genradering bekräftas genom sekvensering, upprepa detta förfarande med den nya strykningen stammen att sekventiellt generera många markör-fria genomiska borttagningar. När den önskade stammen genereras, Använd hela Genomsekvensering för att kontrollera riktade borttagningar och för att upptäcka andra förändringar i arvsmassan (jämfört med referens stammen, t. ex. PAO1) som inträffade under hela processen. Efter att ha kommenterat gener, deponera sekvensen till GenBank och registrera anslutningsnummer.

8. beredning av bakteriestam för djurförsök

1. För att testa för försvagad patogenicitet av P. aeruginosa stammar, först förbereda validerade kulturer och bestånd. Förbered p. aeruginosa stammar av intresse, en vild-typ stam av P. aeruginosa (virulent), och en FDA-godkänd stam av E. coli (t. ex., BL21) att fungera som en nonpatogena säkerhetskontroll.
2. Strimma bakteriestammar som testas på selektiva agar från sekvenserade och validerade frysta bestånd. Inkubera vid 37 ° c över natten.
3. Med en steril vaccinera loop, plocka upp en enda koloni från varje stam och strimma för isolerade kolonier på selektiv Media igen. Inkubera vid 37 ° c över natten.
4. Ta bort plattorna från inkubatorn. För varje stam, Välj en enda koloni och strimma för isolering på LB plattor.
5. Efter 24 h tillväxt vid 37 ° c, Inokulera en 500 mL kolv som innehåller 250 mL LB med ett enda koloniisolat från varje stam.
   1. Validering steg: att använda resterna av samma koloni, validera stammen med hjälp av PCR och stam-specifika primers, och/eller primers att kontrollera förekomsten av genetiska modifieringar som gjorts till stammen. Använd primers nedan för verifiering av stammar i exemplet presenteras:
      E. coli BL21:
      T7 polymeras f:tggctatcgctaatggtcttacg
      T7 polymeras r:ttacgcgaacgcgaagtcc
      
      VE2 och PGN5:
      Aroa F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
      Aroa R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
6. Inkubera kulturerna i en skakande inkubator vid 160 rpm och 37 ° c tills de når log fas tillväxt (dvs. OD₆₀₀ mätning av 0,4-0,6 på en spektrofotometer).
7. Med hjälp av OD₆₀₀ värde erhålls när log fasen uppnåddes, beräkna volymen av buljong som krävs för att ge 2,5 x 10⁹ Colony Forming enheter (CFU) per ml. Pelleten volymen av buljong beräknad i 50 mL rör vid 4 500 x g för 10 min.
8. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i ett rör med 50 mL 1x PBS för att tvätta cellerna. Centrifugera igen vid 4 500 x g i 10 min.
9. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 25 mL 5% skummjölk i 1x PBS.
   1. Validerings steg: Använd ett prov av 25 mL resuspension för att utföra gångbara plattantal för att bestämma antalet CFU/mL.
10. Aliquot den 25 mL skumma mjölk kulturen resuspension till 2 mL kultur bestånd i 2 mL cryovials. Blixten fryses i flytande kväve och förvaras vid-80 ° c minst över natten före användning.

9. validering av tillväxt och stam av bestånd som lagrats för djurförsök.

1. För varje stam som skall provas, ta bort minst 3 kryovials av frysta lager från-80 ° c lagring och Tina vid 4 ° c för 2-4 h. Om något fryst lager återstår, kort värma på 37 ° c.
2. Ta små prover från varje cryovial att validera varje stam.
   1. Utför gångbara plattantal för att bestämma antalet CFU/mL. Det är normalt att ha färre CFU/mL efter frysning, på grund av dödsfall av vissa bakterieceller.
   2. Använd PCR och stam-specifika primers att validera varje stam.
   3. Strimma varje stam på selektiv media för att kontrollera fenotyp.
3. Efter att ha bekräftat att stammar är av rätt genotyp och fenotyp, och validera CFU/mL, gå vidare till djurförsök.

10. ympning av djur med bakteriestammar genom injektion

1. På morgonen av injektioner, ta bort kryovials av bakteriestammar som testas och Tina vid 4 ° c för 3-4 h. Tina 0,5 mL för varje mus som kommer att injiceras. Förvara injektionsflaskorna på is efter upptinning och injicera möss inom 2 timmar.
2. Efter upptinning, överför varje cryovial till en ny 2 mL tub och centrifugera vid 4 500 x g i 10 min, Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 ml 1x PBS.
3. Centrifugera igen vid 4 500 x g i 10 m. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 1x PBS till en slutlig koncentration 2,5 x 10⁹ CFU/ml. För att bestämma mängden 1x PBS som behövs för resuspension, Använd CFU/mL-data som erhålls från livskraftiga platträkningar på frysta lager i steg 2.2.1. Den exakta mängden 1x PBS som används kommer att variera något mellan stammarna.
   1. Ta 3 prover från slutlig suspension av varje stam för att validera CFU/mL, genotyp, och fenotyp enligt beskrivningen ovan.
4. För varje stam, alikvot 1,5 mL PBS/cellsuspension i en 2 mL tub per 5 möss för att begränsa antalet gånger röret matas in. Förbered också rören med 1x PBS för kontroll injektioner.
5. Samla möss (10 manliga och 10 kvinnliga C57BL/6 per grupp för detta experiment) och material som behövs för injektioner (sprutor, nålar, kli behållare, markörer, penna och papper, etc.). Flytta till det sterila djuret kirurgiskt rum. Torka av alla ytor med sanering våtservetter.
   1. För att eliminera ångest och risk för skada på försöksledaren, bara föra en sex och experimentell grupp av möss till operationssalen i taget (t. ex. en grupp av 10 manliga möss som ska smittas med en viss stam). Bär två par latex handskar för att eliminera punktering av handskar om biten. Använd labbrock, skyddsglasögon och ansiktsmask för att undvika kontaminering.
6. Börja injektioner av kontrollgruppen med 1x PBS. Detta kommer att kontrollera om några negativa effekter resultat från injektion ensam.
   1. Ta bort en mus från buren. Ta bara bort en mus i taget.
   2. Väg musen och markera dess svans med permanent markör för att spåra för viktminskning efter injektion.
   3. Öppna en ny 1 mL spruta och 27 G nål (Använd en ny spruta och nål för varje mus för att eliminera kontaminering) och injicera 200 μL steril 1x PBS.
      1. Greppa musen bakom öronen med hjälp av tummen och pekfingret. Nyp för att skapa hudveck vid nacken för att hålla fast vid-en tätare veck minskar hals rörelsen och riskerar att bli biten under injektionen. Säker svans i handflatan med hjälp av Pinky att hålla musen platt med lite rörelse.
      2. Vrid musen över och sätt nålen i 30 ° vinkel i bukhålan till vänster eller höger sida av mittlinjen. Lyft nålen något en gång insatt för att säkerställa att den sattes in i det intraperitoneala området och inte i organ. Injicera PBS långsamt och dra sedan ut injektionsnålen.
      3. Placera den använda nålen i en utsedd container för Biohazard kli. Använd inte sprutan eller nålen igen. En bolus på injektionsstället är typiskt.
   4. Efter injektion, flytta musen till en separat bur.
   5. Upprepa proceduren med nästa mus. Efter alla möss i en bur injiceras, returnera dem till sin ursprungliga bur omedelbart.
7. Efter att ha injicerat kontrollgruppen, börja injicera suspensioner av stammar som ska testas enligt samma förfarande.
   1. Injicera 200 μL av cellsuspensionen. När börjar med cellsuspensioner av 2,5 x 10⁹ CFU/ml, varje mus får 5 x 10⁸ CFU.
      Notera: dessa koncentrationer optimerades med preliminär djur forskning för att bestämma dödliga doser av varje stam. Doseringen kan behöva justeras för andra stammar/arter.
8. När alla injektioner är klar, returnera möss till bostads rummet för att lindra ångest. Rengör arbetsområdet med sanering våtservetter.
9. Övervaka djuren för dödlighet efter injektion genom att kontrollera burar för döda möss var 3 h för 72 h och varje 12 h i 10 dagar. Registrera vikten av möss varje 12 h för att avgöra viktminskning på grund av sjukdom.
10. Rekord negativa beteende i timmar efter injektion, såsom skillnad i kroppshållning, brist på grooming eller grävande, orörlighet, eller förändringar i andning. Möss som avlider från skada i samband med injektion kommer att uppvisa negativt beteende och dör snabbt efter injektion. Å andra sidan, möss som avlider från smitta kommer inte att börja uppvisa negativt beteende eller död förrän efter 18 h. Alla möss som uppvisar negativt beteende eller omfattande tecken på sjuklighet, inklusive snabb eller ansträngd andning, orörlighet, böjd kroppshållning, insjunkna ögon, svår uttorkning, eller andra bör euthanized för att minska onödigt lidande (som uppfyller kraven i vår godkända IACUC-protokoll). Men i våra experiment var djur inte krävs för några möss under experimentet. Överlevande möss var euthanized 10 dagar efter avslutad testning.
11. Efter den 10 dagar höga övervakningsperioden, tillåta djuren att återhämta sig fullt ut och bli fri från en infektion som administreras under provningen. Euthanize djur efter IACUC förfarande.

11. statistisk analys av djurens dödlighet

1. Utföra statistisk analys med hjälp av grafräknare programvara. All programvara som kan producera grafer och utföra statistisk analys är lämplig.
2. Om du vill rita Dödlighetsdata använder du kolumnen X för att representera tiden (h) och Y-kolumnen för att representera de testade grupperna.
3. Representera varje mus eller ämne i studien med hjälp av kod = 0 (noll) eller kod = 1, vilket indikerar överlevnad eller dödsfall, respektive.
   1. För varje djur som dör, placera en 1 i Y-kolumnen i den gruppen vid tidpunkten för dödsfallet på X-kolumnen. Om det finns flera dödsfall vid en enda tidpunkt inom en grupp kan en kopia av den tidspunkten placeras i X-kolumnen. Om till exempel tre ämnen inom en grupp dör vid 3 timmar visas 3 h-punkten tre gånger i kolumnen X.
   2. För alla överlevande djur inom en grupp, placera en nolla i Y-kolumnen vid den sista tidspunkten mätt. Om till exempel fyra möss överlever placerar du fyra tidspunkter i X-kolumnen som är markerade med fyra nollor i Y-kolumnen.
4. När djurdata har angetts för alla grupper använder du en mall för överlevnads diagram för att skapa ett överlevnads diagram.
   1. Låt standardkodningen vara 0 och 1.
   2. Ange parametrarna för grafen i procent.
5. När parametrarna för överlevnads kurvan har valts, utför statistisk analys med ett mantel-Cox-test (log rank).
6. Format Kaplan-Meier-diagram med statistiska uppgifter.
   Anmärkning: stammar som uppvisar dödlighet som är mindre än eller lika med den överordnade stammen och FDA-godkända stammen (t. ex., e. coli BL21) kan anses vara försvagade.

12. visualisering av infektionen med bioluminescens

1. För att visualisera förloppet av infektionen, sätt in en kromosomal bioluminescerande operon (luxcdabe) i PGN5 och Ve2 stam testas. De plasmider och protokoll som används för att märka dessa stammar utvecklades i Schweizer Lab och kanske inte är förenliga med alla arter/stammar av bakterier¹³. Viktigt, visualisering av infektionen är frivillig; Således är genomisk insättning av denna operon inte nödvändigt att utföra den mortalitets undersökning som beskrivs ovan.
2. Förbered och validera stammar med den metod som beskrivs ovan. Dessutom kontrollera om mareld i märkta stammar vid varje validerings steg.
3. Efter stammar är beredda, injicera djuren i grupper om 10 med bioluminescerande stammar följa stegen ovan.
4. Bild djuren var 3 h för 24 h med hjälp av en djur avbildning system som kan bioluminescence.
   1. Förbered först kameran genom att ställa in kamerans parametrar och värma upp scenen för djuren. Också ställa in syreflödet till 1,5 L per minut (eller efter tillverkarens rekommendationer).
   2. Efter att kameran och scenen stabiliserats, placera en mus i anestesi kammaren omedelbart efter injektionen och administrera 3,5% isofluran i kammaren med O₂ flöde i ca 4 min. Anestesi metoderna kan variera beroende på den kammare och/eller det anestesimedel som används. Följ tillverkarens rekommendationer. Bestäm rätt anestesi via abstinens reflex test.
   3. Flytta musen till den temperatur stabiliserade scenen. Placera musen på ryggen med armarna utsträckta och passa musen med en näsa kon för administrering av 2,5% isofluran hela imaging förfarandet.
   4. Stäng dörren och ta bioluminescerande bilder och röntgenstrålar av mus.
   5. När bildbehandling är klar, returnera musen till dess bur och övervaka den. Musen bör återfå medvetandet inom 3-5 min.
   6. Fortsätt till bild möss var 3 h för 24 h, varje gång med hjälp av en annan mus från varje grupp. Inte Reimage en mus inom 24 h på grund av risken för negativa effekter på grund av åter exponering för anestesi. En enda mus bör bara få en dos av anestesi varje 24-36 h. Rengör bild plattformen efter att varje mus har avbildats. Stäng av kameran mellan avbildningstidpunkterna.
      Anmärkning: bioluminescence kommer att blekna, oavsett stammen injiceras. Intensiteten och livslängden av bioluminescens varierar beroende på många faktorer, inklusive antalet bakterier injiceras, mus stam, bakteriestam, etc.

Representative Results

Som framgår i figur 2, kan den riktade genomisk radering bekräftas med hjälp av Colony PCR med specifika primers som förstärker regionen av intresse. Kolonier som bär en genomisk radering kommer att ge en kortare PCR-bandstorlek jämfört med vildtyps-kolonier. En PCR-avskärma av 10-12 kolonier är vanligt tillräcklig för att upptäcka åtminstone en koloni som bär den riktade borttagningen. Om inga borttagningar upptäcks efter flera omgångar av skärmar upprepar du proceduren som börjar med konjugering. Om borttagningen fortfarande misslyckas kan plasmid-infogning behöva bekräftas genom sekvensering, omgjorda eller borttagningen kan vara dödlig. Bekräfta borttagningen genom sekvensering vid verifiering av en genradering via PCR. Den resulterande stammen kan utsättas för förfarandet upprepade gånger för att generera sekventiella genomiska modifieringar.

Som framgår av figur 3var dödligheten i samband med intraperitoneal injektion av den försvagade stammen av P. aeruginosa PGN5 (+ Muce) 0%, vilket var likvärdigt med dödlighet som observerats med E. coli BL21. Å andra sidan, intraperitoneal injektion av den överordnade stammen (VE2) var dödlig till 80% av möss. Dessa resultat erhölls med omfattande åtgärder för att validera de stammar injiceras. Medan den exakta dödsorsaken i dessa möss är okänd, kan det åtminstone delvis tillskrivas uttrycket av virulensfaktorer i den överordnade stammen som togs bort från den försvagade PGN5 stammen. Skillnader i infektionsprogression spårades med hjälp av bioluminescence-märkta överordnade och försvagade stammar. Den försvagade stammen förblev lokaliserad vidinjektionsstället tills bioluminescens bleknat (figur 4). Clearance av infektionen troligen sammanföll med blekning av bioluminescens. Bioluminescens upptäcktes inte 24 h efter injektion och möss levde i veckor efter injektionen tills de offrades, utan några negativa effekter observerades.

Figur 1: generering av genborttagningar i P. aeruginosa med pEX100T- (A) karta över pEX100T-e plasmid. (B) generering av en konstruktion som består av regioner direkt uppströms (gult) och nedströms (blått) i den region av intresse (ROI), flankerad med anmälan restriktionsenzymer enzym erkännande webbplatser. För det första, PCR-amplifiera uppströms och nedströms regioner självständigt med specifika primers som lägger till 5 ' anmälningar digestionsområden (t. ex. Jag har en c-Aroa F CGCGGCCGCTGAAGGTCCTGGGCTCCTATCCGAAAGCGGTGCTCT och för att-AROA R GCGGCCGCAGTTGGGTTGTTCTGCGATGGCGCCAGGCA) och 3 "överlappande homolog regioner som visas (t. ex. AROA-crossover F CTCCAGGCGCTGGGCAAGGTGCTGGCGCATGACTGAGGTCACGCCGGTCGCCGTGGAGAACA och Aroa-crossover R TGTTCTCCACGGCGACCGGCGTGACCTCAGTCATGCGCCAGCACCTTGCCCAGCGCCTGGAG. Använd sedan PCR med en ABC-innehållande grundfärg för att ansluta till de produkter uppströms och nedströms som genererats i den första PCR-reaktionen. (C) pEX100T-e-plasmid, beväpnad och klar. Den som har fått den intagna cross-over PCR-produkten i den inrövad plasmid. (D) flödesschema över processen för att ta bort genomiska regioner från P. aeruginosa -kromosomen med hjälp av pEX100T-e-postplasmid. Efter önskad radering har bekräftats och renats, den resulterande stammen kan tas genom förfarandet upprepade gånger för att ta bort andra genomisk regioner från kromosomen. När den önskade stammen erhålls, sekvens hela genomet för att bekräfta borttagningar och andra förändringar i kromosomen. Stammens patogenicitet kan sedan testas hos möss med hjälp av det förfarande som beskrivs i del II av protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: gel-elektrofores av kolonin PCR-produkter från en skärm för Aroa -radering för att generera den försvagade P. aeruginosa -stammen, PGN5. Colony PCR-produkter körs i körfält 2-5 och 8-11 indikerar kolonier med vildtyp Aroa. Kolonin PCR-produkter som körs i körfält 6 och 7 bär Aroa -genstrykningen som indikeras av den mindre PCR-produkten (gula asterisker). Primers som används specifikt förstärkt den genomiska regionen som innehåller Aroa genen: Aroa-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC, och AROA-R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC. Förväntad PCR-Produktstorlek i kolonier av vildtyp var 2 548 nukleotider (NT). Förväntad PCR-Produktstorlek i kolonier med Aroa -radering var 307 NT. En DNA-stege kördes i körfält 1 och 12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: total mortalitet för möss som injiceras med patogena p. aeruginosa -stam (VE2), försvagat p. aeruginosa -stam (PGN5 + MUCE) och FDA-kontroll E. coli -stam (BL21). Endast möss som injicerats med patogena moder stam uppvisade mortalitet på 80%. Försvagat P. aeruginosa stam och FDA kontroll E. coli stam uppvisade 0% dödlighet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: bild av mus 3 h efter injektion av försvagad stam av P. aeruginosa PGN5 + Muce bär en bioluminescerande markör. De bioluminescerande bakterierna var detekterbara tills 18-24 h efter injektion. Under denna period förblev Mareld på injektionsstället som indikerar att bakterierna stannade lokaliserade till injektionsstället. Denna mus helt återhämtat sig med några negativa effekter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den pEX100T-Not1 plasmid är en effektiv medlare av sekventiella genomiska borttagningar som är markör-fri och i-Frame. När tekniska bakteriestammar för försvagad virulens, borttagande av hela gensekvenser snarare än att generera punktmutationer minskar sannolikheten för återgång till en virulent fenotyp. Dessutom dämpar varje patogenicitet gen borttagning patogenen ytterligare, vilket förstärker stabiliteten i försvagningen.

Denna metod kan också användas för att generera genomiska modifieringar än borttagningar, såsom punktmutationer och infogningar, helt enkelt genom att ändra utformningen av plasmid-insatsen. Dessa typer av ändringar kan vara mer användbar än hela genborttagningar för tekniska bakterier med modifierad metabolism, till exempel. Sekventiell genomisk modifiering har stor potential för att generera designer bakteriestammar för att passa specifika ändamål inom forskning och industri. Andra metoder för att skapa önskade markör fria genomiska modifikationer i bakterier har beskrivits^15,16,17,18. Som med alla genomredigeringsmetoder kan försök till ändringar i viktiga genomiska regioner vara dödliga och därmed misslyckas. I dessa fall krävs identifiering av olika genetiska modifikationer eller andra kandidatgener för att generera bakterie stammen av intresse.

Med tanke på de många replikation händelser och passager av varje koloni i hela detta protokoll, oavsiktliga förändringar av genomet kommer att inträffa till den genererade stammen. De exakta genomiska förändringarna kan identifieras genom helgenomsekvensering. Effekten av dessa förändringar är dock svårare att avgöra. När tekniska bakterier för ett specifikt ändamål, genomiska förändringar som inte negativt påverkar tillväxten av organismen eller riktade vägen (er) är tolerabla. Beroende på vilken stam som genereras kan det vara möjligt att identifiera en "avläsning" för att säkerställa att stammen fortfarande är användbar för avsett ändamål. Till exempel, med PGN5, var målet att skapa en försvagad stam som behöll förmågan att producera stora mängder alginat. Efter att fem patogenicitetsgener har tagits bort, mättes mängden och sammansättningen av alginat från PGN5 och fastställdes vara jämförbara med andra alginatproducerande stammar. Alginatproduktionen påverkades således inte av de fem genborttagningarna, inte heller av de oavsiktliga genomiska förändringarna som inträffade under utvecklingen av PGN5.

En modell av intraperitoneal mus injektion användes för att avgöra om en konstruerad stam var försvagad jämfört med den överordnade stammen och E. coli BL21, en stam som godkänts av FDA för produktion av Biopharmaceuticals. De viktigaste stegen som togs under detta djurförsök var beredning och validering av frysta bakterie bestånd. Beredning och användning av frysta bakteriekulturer för att injicera möss är att föredra att använda kontinuerlig kultur, eftersom det minskar antalet mutationer som naturligt förekommer i bakterie populationer¹⁹. Dessutom bör frysta kulturer förbli livskraftiga i åratal. Gångbara plattantal visade ingen signifikant skillnad mellan CFU/mL direkt efter att lagren förberetts och tre månader efter beredning. Användningen av flera validerings steg under hela den här proceduren säkerställde att metoden var reproducerbar och att resultaten inte var skeva av kontaminerande bakterier. Dessutom behövdes färre djur med det antal försiktighetsåtgärder som vidtagits för att säkerställa reproducerbarheten. Med hjälp av en bakteriestam som är FDA-godkänd för biofarmaceutiska produktion som kontroll (såsom E. coli stam BL21), denna metod kan användas för att testa försvagning av andra genetiskt modifierade stammar av P. aeruginosa, eller andra arter av bakterier.

Användning av bioluminescens som markör ger ytterligare validering av de bakteriestammar som injiceras, eftersom markören kan visualiseras vidinjektionsstället. Införandet av Mareld-markören i bakterie kromosomen krävs för avbildning av bioluminescens, men kan inte vara möjligt om man arbetar med oförenliga stammar/arter. Det är dock inte nödvändigt att markera stammar med bioluminescens för att testa för dämpning. De stammar som testats i denna studie har markerats med bioluminescens, som tillät visualisering av lokalisering skillnader mellan stammar under hela infektionen. Vi konstaterade att den patogena stammen sprids genom kroppen av musen, men den icke-patogena stammen kvar på injektionsstället. Även detta experiment testade endast två mycket nära besläktade stammar av P. aeruginosa, tyder det på att bakteriell spridning är kopplad till virulens, åtminstone i P. aeruginosa. Sålunda, detta förfarande för märkning med Mareld att visualisera utvecklingen av infektionen kan användas i framtiden för att snabbt utvärdera försvagning av konstruerade stammar av bakterier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes with flat caps	ThermoScientific	AB-0620	via Fisher Scientific
1 mL Syringe	BD	22-253-260	via Fisher Scientific
1.5 mL disposable polystyrene cuvette	Fisher Scientific	14955127
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
27G needle	BD	14-821-13B	via Fisher Scientific
50 mL tubes	Fisher Scientific	05-539-13	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Benchtop Centrifuge 5804R	Eppendorf	04-987-372	via Fisher Scientific
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
Cabinet Incubator	VWR	1540
Carbenicillin disodium salt	Fisher Scientific	BP2648250
Culture Test Tube, Polystyrene	Fisher Scientific	14-956-6D	via Fisher Scientific
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)	Qiagen	12224-50	or preferred method/vendor
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)	Omega bio-tek	D6493-01	or preferred method/vendor
EcoRI-HF, restriction endonuclease	New England BioLabs	R3101L
Electroporation Cuvettes	Bulldog Bio	NC0492929	via Fisher Scientific
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
GoTaq G2 Colorless Master Mix	Promega	M7833	via Fisher Scientific
Isothesia Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29405
IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System	Perkins and Elmer	CLS136340
Kanamycin monosulfate	Fisher Scientific	BP906-5
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100
Noble agar, ultrapure	Affymetris/USB	AAJ10907A1	via Fisher Scientific
NotI-HF, restriction endonuclease	New England BioLabs	R3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Invitrogen	C404052	via Fisher Scientific
Phosphate buffered saline powder	Sigma	P3813-10PAK	Sigma-Aldrich
Prism 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation broth	Alpha Biosciences	P16-115	Custom made batch
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A24811
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	FB0875713
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Toothpicks, round	Diamond		Any brand of toothpicks, autoclaved
TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing	Invitrogen	45-0030
XAF-8 Anesthesia System Filters	Perkins and Elmer	118999
XGI 8 Gas Anesthesia System	Caliper Life Sciences/Xenogen