Summary
تقدم هذه المقالة طريقه تعديل سطح القوقعة التي تتطلب الكلس واستخدام لاصقه الخلية والانسجه للالتزام قطع من ظهاره قوقعة الراس إلى 10 مم زلة غطاء الجولة لمناعي في قوقعة الماوس الكبار.
Abstract
المعالجة السمعية في القوقعة تعتمد علي سلامه خلايا الشعر الميكانيكية. علي مدي العمر ، يمكن الحصول علي فقدان السمع من مسببات عديده مثل التعرض للضوضاء المفرطة ، واستخدام الادويه السامة للاذن ، والتهابات الاذن البكتيرية أو الفيروسية ، وإصابات الراس ، وعمليه الشيخوخة. فقدان خلايا الشعر الحسية هو سمه مرضيه شائعه من أنواع فقدان السمع المكتسبة. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تتلف المشبك الداخلي لخلايا الشعر بالإهانات الخفيفة. لذلك ، تعد الاستعدادات السطحية لظهاره قوقعة الاذن ، بالاشتراك مع تقنيات المناعة والتصوير البؤري ، أداه مفيده جدا للتحقيق في امراض القوقعة ، بما في ذلك فقدان المشابك الشريطية وخلايا الشعر الحسية ، التغيرات في مستويات البروتين في خلايا الشعر والخلايا الداعمة ، وتجديد خلايا الشعر ، وتحديد التعبير الجيني للتقرير (اي GFP) للتحقق من التوصيل الناجح وتحديد أنواع الخلايا المحولة. والقوقعة ، وهي بنيه عظميه حلزونية الشكل في الاذن الداخلية ، تحمل جهاز النهاية الحسية السمعية ، وهو جهاز كورتي (OC). يتم تضمين خلايا الشعر الحسية والخلايا الداعمة المحيطة بها في قناه القوقعة والباقي علي الغشاء القاعدي ، والتي يتم تنظيمها بطريقه اللوزتين مع الكشف عن الترددات العالية التي تحدث في القاعدة والتردد المنخفض في القمه. مع توافر المعلومات الجزيئية والوراثية والقدرة علي التلاعب بالجينات بواسطة الضربة القاضية وتقنيات الطرق ، وقد استخدمت الفئران علي نطاق واسع في البحوث البيولوجية ، بما في ذلك في السمع العلم. ومع ذلك ، فان قوقعة الماوس البالغة ضئيله ، ويتم تغليف ظهاره القوقعة في متاهة عظميه ، مما يجعل التشريح المجهري صعبا. علي الرغم من انه تم تطوير تقنيات التشريح واستخدامها في العديد من المختبرات ، فان طريقه التشريح المجهري المعدلة باستخدام لاصق الخلايا والانسجه أسهل وأكثر ملاءمة. ويمكن استخدامه في جميع أنواع قوقعة الماوس الكبار بعد الكلس.
Introduction
وتكرس القوقعة للكشف عن الصوت والمسؤولة عن السمع. يتم لف القناة القوقعة في شكل حلزوني في المتاهة العظمية ويحمل الجهاز السمعي الحسي النهاية ، وجهاز كورتي (OC). يعتمد OC علي غشاء بأزيار ، مما يشكل ظهاره قوقعة ، مع طول حوالي 5.7 ملم عندما غير ملفوف في الفئران CBA/caj الكبار1،2. ونظرا لان درجه التردد العالي التي يتم تنظيمها بالترددات المرتفعة المكتشفة في القاعدة والترددات المنخفضة في القمه ، فان ظهاره القوقعة غالبا ما تنقسم إلى ثلاثه أجزاء للمقارنة التحليلية: المنعطفات المتوسطة والقاعدية المقابلة لمنخفضه ، المتوسطة ، والكشف عن الترددات العالية ، علي التوالي. بالاضافه إلى مجموعه من الخلايا الداعمة ، تتكون OC من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية (IHCs) الموجودة في الوسيط وثلاثه صفوف من خلايا الشعر الخارجية (OHCs) الموجودة بشكل أفقي فيما يتعلق بدوامه القوقعة.
المعالجة السمعية الصحيحة تعتمد علي سلامه خلايا الشعر الحسية في القوقعة. تلف أو فقدان خلايا الشعر الحسية هو سمه مرضيه شائعه لفقدان السمع المكتسبة ، الناجمة عن العديد من المسببات مثل التعرض للضوضاء المفرطة ، واستخدام الادويه السامة للاذن ، والتهابات الاذن البكتيرية أو الفيروسية ، وإصابات الراس ، والشيخوخة عمليه3. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تضعف سلامه ووظيفة الخلية الداخلية للشعر/العصب السمعي العصبية بالإهانات الخفيفة4. مع توافر المعلومات الجزيئية والوراثية والتلاعب في الجينات بالضربة القاضية وتقنيات الطرق ، وقد استخدمت الفئران علي نطاق واسع في السمع العلم. علي الرغم من ان قوقعة الماوس الكبار هي ضئيله وتحيط ظهاره القوقعة بكبسوله عظميه مما يؤدي إلى الأجزاء المجهرية الصعبة من الناحية الفنية ، والاستعدادات السطحية لظهاره في تركيبه مع المناعة أو مناعي وقد استخدمت الصور المحورية علي نطاق واسع للتحقيق في امراض القوقعة ، بما في ذلك فقدان الشريط العصبي وخلايا الشعر ، والتغيرات في مستويات البروتينات في خلايا الشعر الحسية وخلايا الدعم ، وتجديد خلايا الشعر. كما تم استخدام مستحضرات سطح القوقعة لتحديد نمط التعبير عن جينات المراسلين (اي GFP) وتاكيد التوصيل الناجح وتحديد أنواع الخلايا المحولة. وقداستخدمت هذه التقنيات في السابق لدراسة أليات الجزيئية الكامنة وراء فقدان السمع الناجم عن الضوضاء باستخدام الفئران CBA/J الكبار5,6,7,8,9.
خلافا لمناعي باستخدام أقسام البارافين أو الحلوى للحصول علي أجزاء صغيره مقطعه عبر القوقعة التي تحتوي علي ثلاثه خلايا الشعر الخارجي (OHCs) وخليه واحده الشعر الداخلي (IHC) علي كل قسم ، والاستعدادات سطح القوقعة تسمح التصور من طول OC للعد خلايا الشعر الحسية والمشابك الشريط والمناعة من خلايا الشعر الحسية المقابلة للترددات وظيفية محدده. ويبين الجدول 1 رسم الترددات السمعية كداله للمسافة علي طول دوامه القوقعة في الماوس البالغ CBA/J وفقا للدراسات التي أجريت من مولر1 وفيبرغ وكانلون1،2. وقد استخدمت علي نطاق واسع الاستعدادات سطح قوقعة للتحقيق في امراض القوقعة4،5،6،7،8،9،10 ،11،12،13،14،15. تم وصف الطريقة الكاملة لتشريح القوقعة في كتاب حرره هانز انجستروم في 196616. وتم صقل هذه التقنية فيما بعد وتكييفها مع مجموعه متنوعة من الأنواع علي النحو الموصوف في الأدبيات التي كتبها عدد من العلماء في العلوم السمعية10و11و12و13و 15,17 وبواسطة مختبرات ايتون-peabody في ماساتشوستس العين والاذن18. وفي الاونه الاخيره ، أبلغت شركه مونتغمري وآخرون19عن طريقه أخرى لتشريح القوقعة. يعد التشريح المجهري لقوقعة الزرع خطوه أساسيه وحاسمه لتحضيرات سطح القوقعة. ومع ذلك ، فان تشريح قوقعة الماوس يمثل تحديا فنيا ويتطلب ممارسه كبيره. هنا ، يتم تقديم طريقه معدله لتحضير سطح القوقعة للاستخدام في قوقعة الماوس البالغة. هذا الأسلوب يتطلب الكلس واستخدام لاصقه الخلية والانسجه (اي ، خليه تاك) للتقيد قطع ظهاره قوقعة الراس إلى 10 ملم الشفتين المستديرة للمناعة. وقد استخدمت علي نطاق واسع الخلية والانسجه لاصقه لمناعي20. هذه الطريقة المعدلة لتشريح القوقعة المجهرية بسيطه نسبيا مقارنه بتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع البروتوكولات البحثية التي تنطوي علي الذكور الكبار CBA/J الفئران في سن 10-12 أسابيع و C57BL/6J الفئران في سن 6 – 8 أسابيع من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) في الجامعة الطبية في ولاية كارولينا الجنوبية (MUSC). وكانت رعاية الماشية تحت اشراف شعبه الموارد الحيوانية المختبرية في MUSC.
ملاحظه: النسبة للإجراءات الواردة أدناه ، يتم تخدير الفئران بالكيتامين (100 ملغم/كغ) واكسيليازين (10 ملغم/كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. قطع الفئران مقطوعة الراس بعد ان لم يعد الحيواني يستجيب للمؤثرات المؤلمة ، مثل قرصه اصبع القدم.
1. استخراج العظام الصدغية
- قطع راس الماوس علي الفور بعد الوفاة مع مقص الجراحية (17 سم طويلة) وقص عظم الجمجمة مع مقص من الجانب الخلفي إلى الامام علي طول الخط الأوسط من الجمجمة بعد تعريض عظم الجمجمة عن طريق سحب الجلد انتييواورلي.
- أزاله انسجه المخ باستخدام ملقط وأزاله العظام المؤقتة يدويا مع الإبهام والسبابة للفئران ثلاثه أشهر من العمر أو أكبر. استخدم مقصا جراحيا صغيرا (طوله 11 سم) لقطع العظم الصدغي للفئران التي تقل اعمارها عن ثلاثه أشهر.
- وضع العظم الصدغي في طبق بيتري (30 ملم في القطر) التي تحتوي علي الجليد الباردة الطازجة 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) حل المذاب في الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) ، pH 7.4.
ملاحظه: اعداد الطازجة 4% الحل PFA وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 فقط قبل تحديد العظام الصدغية ، لان غير لائق توازن الحموضة من الحل PFA سوف تقلل من نوعيه المناعة.
2. التثبيت و Perfusion
- أزاله الدعامات من النافذة البيضاوية وثقب غشاء النافذة المستديرة مع حجم #5 ملقط. تحت المجهر تشريح ستيريو جعل ثقب صغير في قمة القوقعة باستخدام ابره 27 G متصلة حقنه 1 مل.
- برفق وببطء حقنت القوقعة مع 4% الحل PFA عبر النوافذ المستديرة والبيضاوي حتى يغسل الحل من ثقب صغير في قمة. نقل القوقعة (واحد أو اثنين من القوقعة لكل قارورة) إلى 20 قارورة حجم التلالؤ مل تحتوي علي 10 مل من 4 ٪ من الحل PFA.
- ضع قارورة التلالؤ برفق في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 2 ساعة واتركه بين عشيه وضحيها في الثلاجة (4 درجات مئوية) علي المدور.
ملاحظه: ويمكن تعديل وقت التثبيت اعتمادا علي الأجسام المضادة المستخدمة. علي سبيل المثال ، الحد من التثبيت إلى 1.5 h سيسمح للمناعة ناجحه من المحطات الطرفية متشابك آخر عند استخدام الأجسام المضادة GluA 2.
3. الكلس من العظم الصدغي
- أزاله الحل PFA وغسل القوقعة مع تلفزيونيه جديده 3x لمده 5 دقائق لكل منهما.
- أضافه 20 مل من 4 ٪ من محلول الصوديوم الملح (أدتا) حمض ايثيلليندياميتاتيتاسياستيك (الأس الهيدروجيني 7.4) إلى قوارير التلالؤ والاحتفاظ في الثلاجة ل 48-72 ح علي مدور مع الانفعالات لطيف. تغيير الحل أدتا يوميا حتى يتم الكلس القوقعة. تحقق مما إذا كانت القوقعة منزوعة الكلس عن طريق لمس الجزء الدهليزي العظمي مع ملقط لتقييم المرونة أو ببساطه قطع قطعه صغيره من حافه الجزء الدهليزي. وإذا أسفرت هذه القطع عن قطعه مسحوقه ، فان القوقعة ليست منزوعة الكلس.
ملاحظه: قد يتداخل الحل أدتا مع المناعية من الأجسام المضادة الاوليه اعتمادا علي تركيز الحل. اعداد 4% أدتا في الاذاعه التلفزيونية وضبط درجه الحموضة إلى 7.4. للحصول علي الكلس متسقة من العظام الصدغية ، يتم استخدام حل أدتا الطازجة. - تغيير الحل إلى التلفزيونية الدقيقة لتشريح الدقيق بعد اكتمال الكلس.
ملاحظه: وإذا لم يكن القوقعة منزوعة الكلس بما فيه الكفاية ، فلا يمكن تشريح القوقعة.
4. التشريح المجهري لظهاره القوقعة
ملاحظه: بمجرد اكتمال الكلس ، يحتاج التشريح المجهري لظهاره القوقعة المناعية إلى القيام به في أقرب وقت ممكن. في طبق بيتري نظيف بحجم 30 ملم يحتوي علي برامج تلفزيونيه ، يتم توجيه الاذن الداخلية بالطريقة التالية: في اشاره إلى اعلي طبق بيتري (الغطاء) والقاع ، فان جولة القوقعة والنوافذ البيضاوية تواجه القمه. في اشاره إلى dissector ، يتم توجيه جزء القوقعة نحو الجبهة (بعيدا عن الانفصال) والجزء الدهليزي نحو الخلف (بالقرب من التفكك). يصف التالي الخطوات بالتفصيل.
- امسك الجزء الدهليزي من العظم الصدغي بالملقط واقطع المنعطف الابيكي مع المشرط عند زاوية 45 درجه كما هو مبين في الخط الأحمر (الشكل 1ا).
- تقطع عموديا علي طول الخط الخافت بين النافذة المستديرة والنافذة البيضاوية ، كما هو مبين في الخط الأحمر (الشكل 1ب) لفصل القوقعة عن الجزء الدهليزي (الشكل 1ج).
ملاحظه: يحتوي هذا الجزء من القوقعة علي أجزاء من الظهاره المتوسطة والقاعدية والخطاف. - ضع جزء القوقعة مع المنعطف القاعدي نحو الأسفل والمنعطف الأوسط نحو اعلي طبق بيتري واقطع الكبسولة العظمية والجدار الجانبي للمنعطف الأوسط نحو النهاية التي أزيل منها القسم الابيكي ، كما هو مبين بالخط الأحمر (اكتشاف أعاده 1د ، ه).
- مواصله القطع لفصل تماما الجزء الأوسط من المناطق القاعدية وهوك (الشكل 1و ، ز).
ملاحظه: منطقه الخطاف من القوقعة هي نهاية ظهاره القوقعة المقابلة للحساسية لنغمات 48 كيلوهرتز واعلي في الفئران. - وضع الجزء القاعدي وهوك مع موقع غشاء بأزيار المنحى نحو الجزء السفلي من الطبق وقطع عموديا موديولوس قباله المنطقة هوك لأزاله موديولوس كما هو مبين من الخط الأحمر العمودي (الشكل 1ز).
ملاحظه: المحور المخروطي الشكل المحوري لقوقعة التي تتكون من العظام الاسفنجيه والعصب القوقعة وكذلك العقدة الحلزونية. قد يكون من الأفضل لتنفيذ هذا القطع مع مقص. - قطع القاعدية والمناطق هوك كما يشير الخط الأحمر الآخر في الشكل 1ز لفصل الجزء هوك (الشكل 1ح).
ملاحظه: وقد تم الآن فصل القوقعة إلى أجزاء apical والوسطي والقاعدية والخطاف. الخطوات التالية ستكون التشريح النهائي لكل من المنعطفات الفردية ، وذلك باستخدام المنعطف الأوسط كمثال. - اقطع الأجزاء الكبيرة نسبيا من الكبسولة العظمية ونسيج الجدار الجانبي في المنعطف الأوسط كما هو مبين في الخط الأحمر (الشكل 1).
ملاحظه: يتم تشكيل الجدار الجانبي للقناه القوقعة من الرباط الحلزوني والاوعيه الدموية. - عقد الجدار الجانبي مع ملقط لمحاذاة الكبسولة العظمية والجدار الجانبي مع الجزء السفلي من طبق بيتري وقطع هذه الانسجه من الجانب الغشاء بأزيار. ثم تسطيح العينة لتوجيه الشعر الحسي الجانب سطح الخلية حتى. تقليم بعيدا بقية الكبسولة العظمية والجدار الجانبي (الشكل 1ي).
- أزاله الغشاء الفني باستخدام ملقط لفصل المنطقة الوسطي تماما (الشكل 1k).
- كرر الخطوات 4-7 − 4.9 للأجزاء النهائية من المنعطفات أو المناطق المتبقية كما هو موضح في الشكل 1l.
- اعداد المشبك جولة 10 ملم للتصاق ظهاره الحسية. استخدم الماصة لنشر 0.5 μL من الخلايا والانسجه اللاصقة علي مركز الشفة المستديرة. بعد التجفيف (3-5 دقيقه في RT) ، ووضع الشفتين في التليفزيون في اطباق بيتري.
- ألصق كل القطع الاربعه من ظهاره الحسية علي الشفة المستديرة 10 ملم في طبق بيتري. ثم عقد حافه واحده من كوفيرسليب لنقله إلى طبق أربعه ابار للمناعة أو مناعي (الشكل 1م).
ملاحظه: يوضح الشكل 2 موقع التخفيضات الرئيسية.
5. المناعة للحصول علي القوقعة العصبية
ملاحظه: تم وصف البروتوكول الخاص بالتحصين المناعي لوصلات القوقعة العصبية المتبعة في هذه الدراسة في السابق13. وقد وصفت شرائط presynaptic مع الأجسام المضادة CtBP2 (الماوس لمكافحه-الكربوكسيل-محطه ملزمه البروتين 2 IgG1 ، وسم المجال B من البروتين السقالات RIBEYE). وقد وصفت المحطات بعد متشابك مع الأجسام المضادة GluA2 (الماوس لمكافحه الغلوتامات مستقبلات 2 IgG2a, وصفت وحدات فرعيه من مستقبلات امبا).
- غسل ظهاره الحسية مع تلفزيوني 3x لمده 5 دقائق كل غسل في طبق أربعه ابار ثم أضافه 2 مل من السطحي غير أيوني 2 ٪ (اي ، تريتون-X 100) في الطبق لمده 30 دقيقه في RT علي المدورة.
- أزاله محلول السطح غير الايونيه من الطبق باستخدام ماصه وأضافه 100 μL من المحلول المانع الذي يحتوي علي 10% مصل الماعز الطبيعي لكل بئر لمده 1 ساعة علي مدور مع الانفعالات لطيف في RT.
- أزاله الحل حجب من كل بئر ، وغسل مع 3x تلفزيوني لمده 5 دقائق كل غسل تحت الانفعالات لطيف في RT.
- أضافه 100 μL من الأجسام المضادة الاساسيه المخففة مع تلفزيوني لكل بئر: الماوس المضادة لGluA2 IgG2a (1:2000) ، الماوس المضادة لCtBP2 IgG1 (1:400). يغطي كل طبق بأربعه ابار مع غطاءه ويضعه في وعاء مرطب كبير يحمي من الضوء. احتضان في 37 درجه مئوية ل 24 ساعة.
ملاحظه: كخيار ، ويمكن أضافه الأرنب المضادة ميوسين VIIa (1:400) لخلايا الشعر الحسية المناعية. - غسل 3x مع تلفزيوني لمده 5 دقائق كل غسل مع الانفعالات لطيف في RT.
- أضافه 100 μL من الأجسام المضادة الثانوية اليكسا 594 الماعز المضادة للماوس IgG1a (1:1000) ، اليكسا 488 الماعز المضادة للماوس IgG2a (1:1000) المخفف مع تلفزيوني لكل بئر. يغطي كل طبق بأربعه ابار مع غطاءه ويضعه في وعاء مرطب كبير يحمي من الضوء. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 2 ساعة.
ملاحظه: إذا تم استخدام ميوسين VIIa ، أضافه اليكسا 350 الماعز المضادة للأرانب (1:200). - غسل 3x مع تلفزيوني لمده 5 دقائق. ثم انقل المشبك المستدير بحجم 10 ملم علي شريحة مع العينات الموجودة في الأعلى.
- أضافه بعناية 8 μL من Fluoro هلام مع تريس العازلة في وسط الشفة. ثم عقد حافه أخرى 10 ملم المستديرة المشتركة مع ملقط لجبل علي القمه ، يقحم اثنين من الشفتين معا.
- استخدام طلاء الأظافر لختم الشرائح ، ووضعها في مجلد شريحة من الورق المقوي ، وتخزينها في الثلاجة.
ملاحظه: إذا تسربت بعض فلورو هلام بين الشفتين اثناء التركيب ، وتنظيف حواف الشفتين قبل ختم الشريحة مع طلاء الأظافر. يجب ان تؤخذ الصور المنسقة في غضون 7 أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدمت الاستعدادات السطحية لظهاره القوقعة ، بالاشتراك مع التصوير المناعي والتصويري البؤري ، علي نطاق واسع في علم السمع للتحقيق في امراض القوقعة ، مثل القياس الكمي لمشابك الشريط العصبي ، وخلايا الشعر الحسية ، والبروتين التعبير في خلايا الشعر الحسية5،6،7،8. علي الرغم من ان تشريح قوقعة الفار الكبار للتحضيرات السطحية ليست بسيطه ، وطلاب الدراسات العليا الجديدة قادره علي تعلم هذه الطريقة المعدلة بعد ممارسه مع 10-15 أذان (الشكل 1 والشكل 2). مع هذه التقنية ، في تركيبه مع المناعية ل CtBP2 (علامة لشرائط بريسينابتيك) و GluA2 (علامة لمحطات متشابك آخر) ، والعد ihc/العصب السمعي العصبية باستخدام الصور مبائر تحت Z الإسقاطات مع فترات 0.25 μm ، استنادا إلى حجم الماوس الشريط المشابك ، هو ممكن21. وهذا يتسق مع النتائج المنشورة4و6و13. الاستعدادات السطحية من الفئران CBA/J (بدون علاج) في سن 10-12 أسابيع المناعية مع CtBP2 (الأحمر) و GluA2 (الأخضر) وأظهرت ان كلا شرائط بريسينابتيك واخر المحطات متشابك تقع تحت نوى ihc ومتجاورة ، مشيرا إلى الاشتباكات العصبية الوظيفية (الشكل 3)6,13.
عن طريق الاستعدادات السطحية المناعية مع الأجسام المضادة المختلفة ، وتقييم الإشارات الجزيئية وهيكل في خلايا الشعر الحسية من الممكن. علي سبيل المثال ، يظهر الشكل 4 النتائج الخاصة بالتطعيم المناعي ل ميوسين فيسيا والتلوين المضاد مع الفيفيبين و 4 ' ، 6-دياميدينو-2-فينيلانديول (dapi). وقد أجريت تجارب المناعية موازيه مع وبدون الخلية والانسجه لاصقه باستخدام حلول مماثله لتقييم ما إذا كان اللاصق المستخدم يتداخل مع الإجراءات المناعية. وكانت المستحضرات السطحية قوقعة المناعي مع ميوسين VIIa والملطخة مع phخلائط idin. تم التقاط الصور المنسقة بعدسه تكبير بنسبه 63x تحت ظروف متطابقة وإعدادات متساوية للمعلمات لتحقيق مكاسب بالليزر وتحقيق مكاسب في أنبوب مضخم (pmt). لم يكن هناك فرق في الإجراءات المناعية أو التوحيد مع وبدون الخلية والانسجه لاصقه (الشكل 5). باستخدام مثبتات مختلفه ، وفرت الاستعدادات السطحية الأساس لمسح الصور المجهرية الكترون (SEM) لتصور الفراغية القوقعة9. C57BL/6J الفئران (بدون علاج) في سن 6 – 8 أسابيع تظهر المنظمة تنظيما جيدا المجسمات علي شكل V من OHCs في ثلاثه صفوف (الشكل 6). بالاضافه إلى ذلك ، تم استخدام مستحضرات سطح القوقعة لتحديد نمط التعبير عن جين التقرير (اي GFP) وتاكيد المحول الناجح وتحديد أنواع الخلايا المحولة.
الشكل 1: تصوير الخطوات الخاصة بإعدادات سطح الفاره البالغة. (ا) تواجه الكبسولة العظمية قوقعة العظام في العظم الصدغي. يشير الخط الأحمر إلى القطع الأول للفصل بين المنعطف الابيكي. RW = اطار الجولة ، OW = الإطار البيضاوي. (ب) يتم فصل القمه عن القوقعة كما هو مبين بالسهم. يشير الخط الأحمر بين الإطار الدائري والإطار البيضاوي إلى القطع الثاني المصنوع في القوقعة. (ج) يتم فصل جزء القوقعة الذي يحتوي علي المناطق الوسطي والقاعدية والخطاف عن الجزء الدهليزي. (د) يقع الجزء الخاص بالقوقعة الخاصة في مواجهه. يشير الخط الأحمر إلى القطع الثالث ، الموجه نحو النهاية التي أزيل منها القسم الابيكي. (ه) يشير السهم إلى الفجوة المتبقية بعد الانتهاء من القطع الثالث. (f) تظهر هذه الصورة المنطقة الوسطي. (ز) تظهر هذه الصورة المناطق القاعدية والخطاف المدمجة. يشير الخط الأحمر العمودي إلى القطع بين منطقه موديولوس والخطاف. أشرت القطع بين القاعدية و [هوك] مناطق بالأخرى خط حمراء. (ح) يتم فصل المناطق القاعدية والخطاف كما هو مبين في الأسهم. (i) يتم قطع المنطقة الوسطي من الكبسولة العظمية كما هو مبين في الخط الأحمر. (ي) تظهر الصورة المنطقة الوسطي بعد أزاله جانب واحد من الكبسولة العظمية. (k) هذه الصورة تظهر المنطقة الوسطي بعد الانتهاء من تشريح. (ل) جميع المناطق الأربع قد تم تشريحها بالبالكامل. (م) تحول القوقعة المثبتة باللون المستدير الدائري بعيار 10 ملم إلى طبق بتري بأربعه ابار مع المناطق الأربع كما هو مبين. وقد اتخذت جميع الصور تحت مجهر تشريح ستيريو في 1.2 x, 2.5 x, و 0.6 x تكبير. يتم الاشاره إلى أشرطه المقياس في كل صوره. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: موقع التخفيضات الرئيسية. تمت أزاله الكبسولة العظمية القوقعة بأكملها. ويشار إلى مواقع التخفيضات الرئيسية. 1) الموقع حيث يتم قطع بدوره قمي. 2) الموقع حيث يتم فصل المنعطف الأوسط. 3) القطع الحرجة لأزاله موديولوس. 4) خط لتقسيم المناطق القاعدية وهوك. شريط مقياس = 0.5 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تكشف الصور المحورية المناعية لCtBP2 و GluA2 علي الاستعدادات سطح الماوس الكبار. وتوصف المناطق القاعدية والوسطي والقاعدية. تم التقاط الصور المخروطية ذات التكبير المنخفض بعدسه 10x. الأحمر = CtBP2 ، الأخضر = GluA2. شريط مقياس = 100 μm. التقطت الصور البؤرية للمناطق 5-، 16-، و 32 kHz مع عدسه 63x. المناظر الموسعة للمناطق التي تشير اليها المستطيلات البيضاء في الأجزاء العليا والمتوسطة والاساسيه. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الصور البؤرية تكشف عن مناعة خلايا الشعر الحسية من اعداد سطح من منطقه 32 kHz. تم دمج جميع الصور بإسقاطات المكدس Z. الملونة phسبائك (الأخضر) هيكل الصفوف الثلاثة من OHCs وصف واحد من IHCs. ميوسين VIIa (الأحمر) المناعية ثلاثه صفوف من OHCs وصف واحد من IHCs. نواه خلايا الشعر الملونة DAPI. تم أعاده بناء الصور المحورية المدمجة لمشاهده الجانب من خلايا الشعر الحسية. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تمت معالجه مستحضرات سطح القوقعة مع وبدون الخلية واللاصقة النسيجية بالتوازي ، مناعية لميوسين السابع (الأحمر) ، والملطخة باللون الأخضر باستخدام الحلول المتطابقة. الخلية والانسجه اللاصقة المستخدمة لا تتداخل مع الإجراءات المناعية. تم التقاط الصور المنسقة بعدسه تكبير مقاس 63x تحت ظروف متطابقة وإعدادات متساوية للمعلمات. تم التقاط الصور من منطقه 32 kHz. وكان المناعي ل ميوسين VIIa وتلطيخ ل phمسبوك في OHCs مماثله مع وبدون الخلية والانسجه لاصقه. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الفحص المجهري الكترون يظهر ثلاثه صفوف من المجسمات OHC من الفئران C57BL/6J. وأخذت الصور من المنطقة الوسطي. (ا) رؤية منخفضه التكبير لثلاثه صفوف من ohcs. (ب) تظهر الصور الموسعة ثلاثه صفوف من المجسمات الفراغية ohc المنظمة تنظيما جيدا والتي تظهر في اشكال "V". شريط مقياس = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| اسم | ||||||||
| المسافة من قمة (مم) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| المسافة من قمة (٪) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| الترددات (كيلوهرتز) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
الجدول 1: رسم خرائط لحساسية تردد قوقعة الCBA/J بالماوس كداله للمسافة من القمه وفقا ل مولر1 وفيبرغ وكانلون2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر التشريح المجهري لقوقعة الاذن من المستحضرات السطحية كامله التركيب بالاشتراك مع المناعة المناعية أداه أساسيه لتحقيق الامراض الداخلية للاذن واليات الجزيئية. هذه الطريقة المعدلة لتشريح قوقعة الفاره باستخدام الخلية ولاصق الانسجه يبسط هذا الاجراء الصعب.
علي الرغم من ان هذه الطريقة المعدلة لاعداد سطح القوقعة سهله نسبيا ويمكن الوصول اليها ، الا انها لا تزال تتطلب الممارسة من أجل تحقيق الكفاءة. ولاجراء التخفيضات الصحيحة ، يحتاج التشوه إلى تركيز دقيق. لان خلايا الشعر الحسية القوقعة في المنعطف القاعدي قريبه جدا من الدوامة الحلزونية ، فانه من الصعب أزاله الانسجه الرشيقة بالبالكامل للسماح بالاعداد السطحي للكذب مسطحه تماما ، ولكن يمكن للإسقاطات البؤرية Z التعويض عن هذه المشكلة. بالاضافه إلى ذلك ، لا تزال منطقه هوك من قوقعة الجزء الأكثر صعوبة لتشريح. قد تحدث حالات انتهاء الفصل بين OHCs و IHCs من منطقه الربط. المنطقة هوك يعرض الاختلافات التشريحية الكبيرة في البشر والمهم بالنسبة العظام التوصيل السمع22,23. استنادا إلى تعيين تردد القوقعة التي ابلغ عنها مولر1 وفيبرغ و canlon2، ومنطقه هوك ، ابتداء من حوالي 4.7 ملم من قمة ، ويقابل حساسية لنغمات 48 kHz واعلي (الجدول 1) ، في حين وظيفية السمعية يتم قياس تقييمات فقدان السمع المكتسب في الفئران ، بما في ذلك فقدان السمع المستحث بالضوضاء ، والاميننوغليكوزيد ، وفقدان السمع المرتبط بالسن ، بشكل عام عند 8 و 16 و 32 كيلوهرتز مع استجابه جذع الدماغ السمعي (abr)5،6 ،7،9،24 ومن 6-45 كيلوهرتز مع تشويه المنتج الصوتية الانبعاثات (dpoae)25. بالاتفاق مع مونتغمري وآخرون ، تشويه ظهاره لا ينظر عاده عندما يتم تقسيم دوامه إلى 3-4 قطع19.
الطريقة المعدلة المعروضة هنا تتضمن تشريح دوامه القوقعة إلى أربع قطع فقط (القمه ، الوسط ، المنعطفات القاعدية ، ومنطقه الخطاف) ، في حين ان تقنيه ايتون-بيبودي تنتج ست قطع18. تبدا تقنيه ايتون-بيبودي بالتقشير بالقوقعة الاصطناعية ، والذي يتجنب اجراء التخفيضات العرضية من خلال ظهاره لفصل المنعطف الأول عن بقية الدوامة ، كما هو موضح في هذه التقنية المعدلة. من خلال إنتاج قطع أصغر ، تم تصميم تقنيه ايتون-بيبودي لتقليل التسطيح المطلوب لعرض قطعه كبيره مع هدف الغمر. وفي الواقع ، فان الأجزاء الأكبر من الانسجه تسهل قياس رسم خرائط الترددات من الدورة القاعدية إلى المنعطف ، تمشيا مع مونتغمري وآخرون19. بالاضافه إلى ذلك ، فان الفرق بين هذه الطريقة و مونتغمري وآخرون19 هو ان طريقه تشريح القوقعة المعدلة الموصوفة هنا توظف مشرطا لمعظم التخفيضات ويتم القيام بخطوه واحده فقط مع المقص (اي فصل المناطق القاعدية والخطاف موضحه في القطع الثالث في الشكل 2) ، في حين ان مونتغمري وآخرون19 استخدام مقص مع طبق السيليكون المطاطي المغلفة تشريح للتحضيرات السطحية. لتجنب تشويه الانسجه ، وقطع الغشاء بأزيار لأزاله موديولوس أمر بالغ الاهميه.
يستخدم هذا البروتوكول لاصقه الخلية والانسجه (جدول المواد) للتصاق قطع ظهاره قوقعة الراس إلى 10 ملم المستديرة الشفة للمناعة أو مناعي ، مما يجعل العمليات أكثر ملاءمة ويتجنب فقدان الانسجه ظهاره خلال يغسل متعددة من الإجراءات المناعية. لاصقه الخلايا والانسجه هي عبارة عن تركيبه من البروتينات الpolyphenolicه التي تلتصق بالخلايا والانسجه ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في العديد من التقنيات الشائعة في المختبر ، بما في ذلك مناعي ، والتهجين في الموقع ، واختبارات المناعة20. وفقا لفكره ان الخلية والانسجه لاصقه لا تتداخل مع الإجراءات المناعية ، والمناعية موازيه من ميوسين VIIa مع الاستعدادات السطحية لا يظهر اي فرق من الإجراءات المناعية أو التوحيد مع وبدون الخلية والانسجه لاصقه. مقارنه طرق التشريح الثلاثة هذه (مختبرات ايتون-بيبودي ، مونتغمري وآخرون19، والطريقة المعدلة الموصوفة) ، يوافق طلاب الدراسات العليا في المختبر علي ان هذه الطريقة المعدلة باستخدام لاصق الخلايا والانسجه أسهل في التعلم الرئيسي.
وباختصار ، إنتاج كامل جبل الاستعدادات سطح الماوس الكبار هو المهارة الاساسيه لتقييم امراض القوقعة. البروتوكول المعدل الموصوف لإعدادات أسطح الفئران البالغة يبسط هذا الاجراء الصعب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان المشروع البحثي الموصوف مدعوما بمنحه R01 DC009222 من المعهد الوطني لامراض الصمم وغيرها من اضطرابات الاتصالات ، والمعاهد الوطنية للصحة. وقد اجري هذا العمل في مبني WR في MUSC في المساحة التي تم تجديدها بدعم من منحه C06 RR014516. تم إسكان الماشية في مرافق الحيوانية MUSC CRI بدعم من منحه C06 RR015455 من برنامج مرافق البحوث خارج الأورال للمركز الوطني للموارد البحثية. ويشكر المؤلفون الدكتور جوتشين شاخت علي تعليقاته القيمة وعلي اندرا تالاسكا لتصحيح المخطوطات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
