Summary
Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.
Abstract
Auditieve verwerking in de slakkenhuis hangt af van de integriteit van de mechanosensorische haarcellen. Gedurende een leven kan gehoorverlies worden verkregen uit tal van etiologie, zoals blootstelling aan overmatig lawaai, het gebruik van ototoxische medicatie, bacteriële of virale oorontstekingen, hoofd blessures en het verouderingsproces. Verlies van sensorische haarcellen is een veel voorkomend pathologisch kenmerk van de variëteiten van verworven gehoorverlies. Bovendien kan de binnenste Haarcel Synapse worden beschadigd door milde beledigingen. Daarom zijn oppervlakte preparaten van cochleaire epithei, in combinatie met immunolabeling-technieken en confocale beelden, een zeer nuttig hulpmiddel voor het onderzoek naar cochleaire pathologieën, inclusief het verlies van lint synapsen en sensorische haarcellen, veranderingen in de eiwit spiegels in haarcellen en ondersteunende cellen, haarcelregeneratie en de bepaling van de genexpressie van het rapport (d.w.z. GFP) voor de verificatie van succesvolle transductie en identificatie van getransduceerde celtypen. De cochlea, een Bony spiraalvormige structuur in het binnenoor, houdt het auditieve sensorische eind orgaan, het orgaan van Corti (OC). Sensorische haarcellen en omringende ondersteunende cellen in de OC zijn opgenomen in het cochleair kanaal en rusten op het basilaire membraan, georganiseerd in een tonotopische mode met hoogfrequente detectie die optreedt in de basis en lage frequentie in de Apex. Met de beschikbaarheid van moleculaire en genetische informatie en de mogelijkheid om genen te manipuleren door knockout en knock-in technieken, zijn muizen op grote schaal gebruikt in biologisch onderzoek, inclusief in de hoorwetenschap. Echter, de volwassen muis slakkenhuis is miniscule, en het cochleaire epitheel is ingekapseld in een Bony labyrint, waardoor micro dissectie moeilijk. Hoewel dissectie technieken zijn ontwikkeld en gebruikt in vele laboratoria, deze gemodificeerde microdissection methode met behulp van cel en weefsellijm is gemakkelijker en handiger. Het kan worden gebruikt in alle soorten volwassen muis cochleae na decalcificatie.
Introduction
De slakkenhuis is gewijd aan het opsporen van geluid en verantwoordelijk voor het horen. Het cochleaire kanaal wordt in een spiraalvorm in het Bony labyrint gewikkeld en houdt het auditieve sensorische eind orgaan, het orgaan van Corti (OC). De OC berust op het basilaire membraan, waaruit het cochleaire epitheel bestaat, met een lengte van ongeveer 5,7 mm wanneer het niet is opgerold bij volwassen CBA/CAJ muizen1,2. Omdat de OC tonotopisch georganiseerd is met hoge frequenties gedetecteerd in de basis en lage frequenties in de Apex, wordt het cochleaire epitheel vaak onderverdeeld in drie delen voor analytische vergelijkingen: de apicale, middelste en basale bochten die corresponderen met laag, middelste en hoogfrequente detectie. Naast een reeks ondersteunende cellen, bestaat de OC uit een rij binnenste haarcellen (Ihc's) die zich mediaal en drie rijen buitenste haarcellen (Ohc's) bevinden, die zich lateraal bevinden ten opzichte van de cochleaire spiraal.
De juiste auditieve verwerking is afhankelijk van de integriteit van de sensorische haarcellen in de cochlea. Beschadiging of verlies van sensorische haarcellen is een veel voorkomend pathologisch kenmerk van verworven gehoorverlies, veroorzaakt door tal van etiologieën zoals blootstelling aan overmatig lawaai, het gebruik van ototoxische medicatie, bacteriële of virale oorontstekingen, hoofdletsel en de veroudering proces3. Bovendien kan de integriteit en functie van de binnenste haar cel/auditieve zenuw synapsen worden aangetast door milde insulten4. Met de beschikbaarheid van moleculaire en genetische informatie en manipulatie van genen door knockout en knock-in technieken, zijn muizen op grote schaal gebruikt in de hoorwetenschap. Hoewel de volwassen muis slakkenhuis minuscule is en het cochleaire epitheel is omgeven door een Bony capsule, wat resulteert in technisch moeilijke micro dissecties, oppervlakte preparaten van het epitheel in combinatie met immunolabeling of immunohistochemie en confocale beelden zijn breed gebruikt voor onderzoek naar cochleaire pathologieën, met inbegrip van verliezen van lint synapsen en haarcellen, veranderingen in de niveaus van eiwitten in sensorische haarcellen en ondersteunende cellen, en haar celregeneratie. Er zijn ook cochleaire oppervlakte preparaten gebruikt om het patroon van de expressie van reporter genen (d.w.z. GFP) te bepalen en succesvolle transductie te bevestigen en getransduceerde celtypen te identificeren. Deze technieken zijn eerder gebruikt voor de studie van moleculaire mechanismen onderliggend gehoorverlies met behulp van volwassen CBA/J muizen5,6,7,8,9.
In tegenstelling tot immunohistochemie die paraffine secties of cryosecties gebruikt om kleine transversale delen van het slakken hoofd te verkrijgen die drie buitenste haarcellen (Ohc's) en één binnenste Haarcel (IHC) op elke sectie bevatten, kunnen cochleaire oppervlakte preparaten visualisatie van de volledige lengte van de OC voor het tellen van sensorische haarcellen en lint synapsen en immunolabeling van sensorische haarcellen overeenkomend met specifieke functionele frequenties. Tabel 1 toont de toewijzing van hoorfrequenties als een functie van afstand over de lengte van de cochleaire spiraal in volwassen CBA/J-muis volgens studies van Muller1 en Viberg en canlon1,2. Cochleaire oppervlakte preparaten worden op grote schaal gebruikt voor onderzoek naar cochleaire pathologieën4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. De Whole-Mount cochleaire dissectie methode werd oorspronkelijk beschreven in een boek bewerkt door Hans Engstrom in 196616. Deze techniek werd vervolgens verfijnd en aangepast aan een verscheidenheid aan soorten zoals beschreven in de literatuur door een aantal wetenschappers in de hoorwetenschappen10,11,12,13, 15,17 en door de Eaton-Peabody Laboratories bij Massachusetts Eye en ear18. Onlangs werd een andere cochleaire dissectie-methode gerapporteerd door Montgomery et al.19. Micro dissectie van de slakkenhuis is een essentiële en kritieke stap voor cochleaire oppervlakte preparaten. Het ontleden van de muis cochleae is echter een technische uitdaging en vereist een aanzienlijke praktijk. Hier wordt een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode gepresenteerd voor gebruik in volwassen muis cochleae. Deze methode vereist de decalcificatie en het gebruik van cel-en weefsellijm (d.w.z. cel-tak) om de stukjes cochleair epitheel te hechten aan 10 mm ronde dekstroken voor immunolabeling. Cel en weefsellijm is op grote schaal gebruikt voor immunohistochemie20. Deze gemodificeerde cochleaire microdissection-methode is relatief eenvoudig in vergelijking met de eerder gerapporteerde18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderzoeksprotocollen met betrekking tot mannelijke volwassen CBA/J muizen op de leeftijden van 10 – 12 weken en C57BL/6J muizen op de leeftijd van 6 – 8 weken werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de medische universiteit van South Carolina (MUSC). Animal Care stond onder toezicht van de scheiding van laboratorium dierlijk materiaal bij MUSC.
Opmerking: Voor de onderstaande procedures worden muizen verdomiliseerd met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) via intraperitoneale injecties. Muizen worden onthoofd nadat het dier niet meer reageert op pijnlijke stimuli, zoals een teen knijpen.
1. extractie van temporale botten
- Onthooi de muis onmiddellijk na het slachten met een chirurgische schaar (17 cm lang) en snijd het schedel been met een schaar van het achterste deel naar voren langs de middellijn van de schedel na het blootstellen van het schedel bot door de huid anteriorly te trekken.
- Verwijder het hersenweefsel met behulp van een tang en verwijder handmatig de temporale botten met de duim en wijsvinger voor muizen van drie maanden of ouder. Gebruik kleine chirurgische schaar (11 cm lang) om het temporale bot van muizen jonger dan drie maanden te snijden.
- Leg het temporale bot in een Petri schaaltje (30 mm in diameter) dat ijskoude verse 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing bevat, opgelost in fosfaat-gebufferde fysiologische Saline (PBS), pH 7,4.
Opmerking: Bereid verse 4% PFA oplossing en pas de pH op 7,4 vlak voor het fixeren van de temporale botten, omdat onjuiste pH balanceren van de PFA oplossing de kwaliteit van de immunolabeling zal afnemen.
2. fixatie en perfusie
- Verwijder de niet's uit het ovale venster en prik het ronde venster membraan met grootte #5 Tang. Onder een stereo-dissectie-Microscoop maakt u een klein gaatje in de Apex van het slakkenhuis met een 27 G-naald die is aangesloten op een 1 ml-spuit.
- Parfumeer zachtjes en langzaam de slakkenhuis met 4% PFA-oplossing via de ronde en ovale ramen totdat de oplossing uit het kleine gat bij de Apex Spost. Breng de slakkenhuis (één of twee slakken leer per injectieflacon) over naar 20 ml volume Scintillatie flesjes met 10 ml 4% PFA oplossing.
- Schud de injectieflacons met Scintillatie zachtjes op kamertemperatuur (RT) gedurende 2 uur en laat de nacht in een koelkast (4 °C) op een rotator rusten.
Opmerking: De tijd van fixatie kan worden aangepast afhankelijk van het gebruikte antilichaam. Bijvoorbeeld, het beperken van de fixatie tot 1,5 h zal toelaten voor succesvolle immunolabeling van post synaptische terminals bij het gebruik van de GluA 2 antilichamen.
3. decalcificatie van het temporale bot
- Verwijder de PFA oplossing en was de cochleae met verse PBS 3x voor 5 min elk.
- Voeg 20 ml van 4% ethyleendiaminetetraazijnzuurdinatriumzout (EDTA)-oplossing (pH 7,4) toe aan de Scintillatie flesjes en bewaar in een koelkast 48 – 72 h op een rotator met zachte opwinding. Verander de EDTA-oplossing dagelijks totdat de cochleae is gedecalcificeerd. Controleer of de cochleae zijn gedecalcificeerd door het aanraken van de Bony vestibulaire portie met een tang om te beoordelen voor elasticiteit of gewoon knippen een klein stukje van de rand van het vestibulaire gedeelte. Als een dergelijke snede in een verpletterd stuk resulteert, wordt het slakken blad niet gedecalcificeerd.
Opmerking: De EDTA-oplossing kan de immunoreactie van primaire antilichamen verstoren, afhankelijk van de concentratie van de oplossing. Bereid 4% EDTA in PBS en stel de pH in op 7,4. Voor een consistente decalcificatie van temporale botten wordt verse EDTA-oplossing gebruikt. - Wijzig de oplossing in PBS voor micro dissectie nadat de decalcificatie is voltooid.
Opmerking: Als de cochleae niet voldoende wordt ontlicht, kan een dissectie van het cochleae niet worden uitgevoerd.
4. micro dissectie van het cochleaire epitheel
Opmerking: Zodra de decalcificatie voltooid is, moet micro dissectie van cochleair epitheel voor immunolabeling zo snel mogelijk worden uitgevoerd. In een schone 30 mm Petri schaal die PBS bevat, is het binnenoor op de volgende manier georiënteerd: in verwijzing naar het bovenblad (deksel) en de bodem van de Petri schaaltjes staan de cochleaire ronde en ovale ramen op de top. In verband met Dissector is het cochleaire gedeelte gericht op de voorzijde (weg van Dissector) en vestibulaire gedeelte naar achteren (in de buurt van Dissector). Hieronder worden de stappen in detail beschreven.
- Houd het vestibulaire gedeelte van het temporale bot met een tang en snijd de apicale bocht met de scalpel in een hoek van 45 ° zoals aangegeven door de rode lijn (Figuur 1a).
- Knip verticaal langs de zwakke lijn tussen het ronde raam en het ovale venster, zoals aangegeven door de rode lijn (Figuur 1b) om het slakken land van het vestibulaire gedeelte te scheiden (Figuur 1c).
Opmerking: Dit cochleaire gedeelte bevat de middelste, basale en haak gedeelten van het epitheel. - Plaats het cochleair gedeelte met de basale draairichting de bodem en de middelste bocht naar de bovenkant van de Petri schaal en snijd de Bony capsule en de laterale wand van het midden naar het uiteinde van waaruit het apicale gedeelte is verwijderd, zoals aangegeven door de rode lijn (Figu Re 1d, e).
- Ga door met snijden om het middelste gedeelte van de basale en haak gebieden volledig te scheiden (Figuur 1f, g).
Opmerking: De haak regio van de slakkenhuis is het einde van het cochleaire epitheel overeenkomend met de gevoeligheid voor tonen 48 kHz en hoger bij muizen. - Plaats de basale en haak portie met de basilaire membraan site gericht op de bodem van het gerecht en snijd verticaal de Mossel uit de haak regio om de Mossel te verwijderen zoals aangegeven door de verticale rode lijn (Figuur 1g).
Opmerking: De mossel is de kegelvormige centrale as van de slakkenhuis die bestaat uit sponsachtig bot en cochlear zenuw, evenals de spiraal ganglion. Het kan beter zijn om deze snede met een schaar uit te voeren. - Snijd de basale en haak gebieden zoals de andere rode lijn aangeeft in Figuur 1g om het haak gedeelte te scheiden (Figuur 1h).
Opmerking: De slakkenhuis is nu gescheiden in apicale, middelste, basale en haak gedeelten. De volgende stappen zullen de laatste dissectie van elk van de individuele bochten zijn, met behulp van de middelste draai als voorbeeld. - Knip de relatief grote delen van de Bony capsule en zijwand weefsel van de middelste bocht weg zoals aangegeven door de rode lijn (Figuur 1i).
Opmerking: De laterale wand van het cochleair kanaal wordt gevormd door het spiraalvormige ligament en de Stria vascularis. - Houd de laterale wand met een tang om de Bony-capsule en de zijwand met de bodem van de Petri schaal uit te lijnen en snijd deze weefsels van de basilaire membraan zijde. Vervolgens afvlakken van het preparaat om te oriënteren de zintuiglijke haar cel oppervlak kant omhoog. Snijd de rest van de Bony capsule en zijwand (Figuur 1j) weg.
- Verwijder het tectoriale membraan met behulp van een tang om de middelste regio volledig te scheiden (Figuur 1k).
- Herhaal stap 4.7 − 4.9 voor de laatste dissecties van de resterende bochten of gebieden zoals weergegeven in Figuur 1l.
- Maak een ronde dekslip van 10 mm voor de hechting van het sensorische epitheel. Gebruik een pipet om 0,5 μL cel-en weefsellijm in het midden van de ronde Afdeklijst met de hand te verspreiden. Na droging (3 – 5 min bij RT), zet de dekstroken in PBS in Petri schalen.
- Plak alle vier de stukken van het sensorische epitheel op de 10 mm ronde afdek in de Petri schaal. Houd vervolgens één rand van de Afdeklijst vast om deze over te brengen naar een vier-goed-gerecht voor immunolabeling of immunohistochemie (Figuur 1m).
Opmerking: afbeelding 2 illustreert de locatie van de grote sneden.
5. immunolabeling voor cochleaire synapsen
Opmerking: Het protocol voor immunolabeling voor cochleaire synapsen gevolgd in deze studie is eerder beschreven13. Presynaptische linten werden gelabeld met een CtBP2 antilichaam (muis anti-carboxyl-terminale binding proteïne 2 IgG1, het labelen van het B-domein van de ribeye steigers eiwit). Post synaptische terminals werden gelabeld met GluA2 antilichaam (muis anti-glutamaat-receptor 2 IgG2a, labeling subeenheden van de AMPA-receptor).
- Was de sensorische epitheel met PBS 3x voor 5 min elke was in een vier-goed gerecht en voeg vervolgens 2 mL van 2% nonionische oppervlakteactieve stof (d.w.z. Triton-X 100) in het schaaltje gedurende 30 minuten bij RT op een rotator.
- Verwijder de nietionogene oppervlakteactieve oplossing uit de schaal met behulp van een pipet en voeg 100 μL blokkerende oplossing met 10% normaal geiten serum toe aan elk goed voor 1 uur op een rotator met zachte opwinding bij RT.
- Verwijder de blokkerende oplossing van elke put, was met PBS 3x gedurende 5 minuten elke was onder zachte opwinding bij RT.
- Voeg 100 μL van de primaire antilichamen verdund met PBS toe aan elk goed: muis anti-GluA2 IgG2a (1:2000), muis anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Bedek elke vier-put schotel met zijn deksel en plaats in een grote bevoficeerde container die beschermt tegen licht. Incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur.
Opmerking: Als optie kunnen konijnen anti-myosine VIIa (1:400) voor immunolabeling sensorische haarcellen worden toegevoegd. - Wassen 3x met PBS voor 5 min elke wassen met zachte roeren bij RT.
- Voeg 100 μL van de secundaire antilichamen Alexa 594 geit anti-muis IgG1a (1:1000), Alexa 488 geit anti-muis IgG2a (1:1000) verdund met PBS aan elke put. Bedek elke vier-put schotel met zijn deksel en plaats in een grote bevoficeerde container die beschermt tegen licht. Inincuberen bij 37 °C gedurende 2 uur.
Opmerking: Als myosin VIIa wordt gebruikt, voeg Alexa 350 geit anti-konijn (1:200). - Was 3x met PBS gedurende 5 min. Vervolgens, breng de 10 mm ronde afdek op een dia met de monsters bovenop.
- Voeg voorzichtig 8 μL fluoro-gel met tris-buffer toe aan het midden van de dekslip. Houd vervolgens de rand van een andere 10 mm ronde afdek met een tang om bovenop te monteren, waarbij de twee afdek stroken aan elkaar worden geklept.
- Gebruik nagellak om de dia's te verzegelen, plaats ze in een kartonnen Slide folder en bewaar ze in de koelkast.
Opmerking: Als sommige fluoro-gel tijdens het monteren tussen de afdek stroken lekt, reinig dan de randen van de afdek stroken voordat u de glijbaan met nagellak afsluit. Confocale beelden moeten binnen 7 dagen worden genomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oppervlakte preparaten van het cochleaire epitheel, in combinatie met immunolabeling en confocale beeldvorming, zijn algemeen gebruikt in de hoorwetenschappen voor het onderzoek naar cochleaire pathologieën, zoals kwantificering van lint synapsen, sensorische haarcellen, en eiwit expressie in sensorische haarcellen5,6,7,8. Hoewel de dissectie van volwassen muis cochleae voor oppervlakte preparaten niet eenvoudig is, zijn nieuwe graduate studenten in staat om deze gemodificeerde methode te leren na het oefenen met 10 – 15 oren (Figuur 1 en Figuur 2). Met deze techniek, in combinatie met immunolabeling voor CtBP2 (een marker voor presynaptische linten) en GluA2 (een marker voor post synaptische terminals), het tellen van IHC/auditieve zenuw synapsen met behulp van confocale beelden onder Z projecties met 0,25 μm intervallen, gebaseerd op de grootte van de muis lint synapsen, is mogelijk21. Dit komt overeen met de gepubliceerde resultaten4,6,13. Oppervlakte preparaten van CBA/J muizen (zonder behandeling) op de leeftijd van 10 – 12 weken immunolabeled met CtBP2 (rood) en GluA2 (groen) toonde aan dat zowel presynaptische linten en post synaptische terminals bevinden zich onder de IHC kernen en zijn juxtaposed, wat aangeeft functionele synapsen (Figuur 3)6,13.
Door immunolabeling oppervlakte preparaten met verschillende antilichamen is de beoordeling van moleculaire signalering en structuur in sensorische haarcellen mogelijk. Figuur 4 toont bijvoorbeeld de resultaten voor immunolabeling voor myosine VIIa en contra kleuring met phalloidine en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI). Parallelle immunolabeling experimenten met en zonder de cel en weefsellijm met identieke oplossingen zijn uitgevoerd om te beoordelen of de gebruikte lijm interfereert met de immunoreactions. Cochleaire oppervlakte preparaten waren immunolabeled met myosine VIIa en contra gekleurd met phalloidine. Confocale beelden werden genomen met een 63x vergroting lens onder identieke omstandigheden en gelijke parameter instellingen voor laser winsten en fotomultiplicator buis (PMT) winsten. Er was geen verschil in immunoreacties of uniformiteit met en zonder de cel-en weefsellijm (Figuur 5). Met behulp van verschillende Fixatieven hebben oppervlakte preparaten de basis verschaft voor het scannen van elektronenmicroscopie (SEM)-afbeeldingen voor visualisatie van cochleaire stereocilia9. C57BL/6J muizen (zonder behandeling) op de leeftijd van 6 – 8 weken vertonen goed georganiseerde V-vormige stereocilia van Ohc's in drie rijen (Figuur 6). Daarnaast zijn cochleaire oppervlakte preparaten gebruikt om het patroon van de expressie van een rapport-gen (d.w.z. GFP) te bepalen en succesvolle transductie te bevestigen en getransduceerde celtypen te identificeren.
Figuur 1: voorstelling van de stappen voor volwassen muis oppervlak preparaten. a) de cochleaire Bony-capsule van het temporale bot wordt geconfronteerd. De rode lijn geeft de eerste snede aan om de apicale bocht te scheiden. RW = rond venster, OW = ovaal venster. b) de Apex is gescheiden van het slakkenhuis, zoals aangegeven door de pijl. De rode lijn tussen het ronde raam en het ovale venster geeft de tweede snede aan die in de cochlea wordt gemaakt. c) het cochleaire gedeelte dat de middelste, basale en haak gebieden bevat, wordt van het vestibulaire gedeelte gescheiden. d) het cochleaire gedeelte ligt naar boven gericht. De rode lijn geeft de derde snede aan, gericht tegen het einde van waaruit de apicale sectie werd verwijderd. e) de pijl geeft de opening aan die na de voltooiing van de derde snede overblijft. (f) deze afbeelding toont de middelste regio. (g) deze afbeelding toont de gecombineerde basale en haak gebieden. De verticale rode lijn geeft de snede aan tussen de mossel en de haak regio. De snede tussen de basale en haak gebieden wordt aangegeven door de andere rode lijn. h) de basale en haak gebieden worden gescheiden zoals aangegeven door de pijlen. i) de middelste regio van de Bony-capsule wordt geknipt zoals aangegeven door de rode lijn. j) de afbeelding toont de middelste regio nadat de ene kant van de Bony-capsule is verwijderd. (k) deze afbeelding toont de middelste regio na voltooiing van dissectie. l) alle vier de regio's zijn volledig ontleed. m) de cochleaire bochten worden aangebracht op een 10 mm ronde Afdeklijst die wordt overgebracht naar een vier-goed Petri schaaltje met de vier gebieden zoals aangegeven. Alle beelden werden genomen onder een stereo-dissectie Microscoop op 1.2 x, 2.5 x, en 0.6 x magnifications. Schaalbalken worden in elke afbeelding aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: plaats van de grote sneden. De gehele cochlear Bony capsule werd verwijderd. De locaties van de grote sneden worden aangegeven. 1) de locatie waar de apicale turn wordt gesneden. 2) de plaats waar de middelste bocht wordt gescheiden. 3) de kritische snede om de Modiolus te verwijderen. 4) de lijn om de basale en haak gebieden te verdelen. Schaalbalk = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: confocale beelden onthullen immunolabeling voor CtBP2 en GluA2 op volwassen muis oppervlak preparaten. De apicale, middelste en basale gebieden worden geëtiketteerd. De onderste vergroting confocale beelden werden genomen met een 10x lens. Rood = CtBP2, groen = GluA2. Schaalbalk = 100 μm. confocale beelden van 5-, 16-en 32-kHz-regio's werden genomen met een 63x-objectief. Vergrote aanzichten van de gebieden die door de witte rechthoeken in de Apex, het midden en de basis gedeelten worden aangegeven. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: confocale beelden onthullen immunolabeling van sensorische haarcellen van een oppervlakte preparaat uit de 32-kHz regio. Alle afbeeldingen werden samengevoegd Z-stack projecties. Phalloidin (groen) bevlekt de structuur van de drie rijen Ohc's en één rij Ihc's. Myosin VIIa (rood) immunolabeled drie rijen OHCs en een rij van Ihc's. DAPI-gekleurd haar celkernen. Samengevoegde confocale beelden werden gereconstrueerd voor zijaanzicht van sensorische haarcellen. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: cochleaire oppervlakte preparaten met en zonder celstof en weefsellijm werden parallel verwerkt, immunolabeled voor myosine VII (rood), en met behulp van identieke oplossingen met phalloidine (groen) gecontrast. De gebruikte cel-en weefsellijm interfereert niet met immunoreactions. Confocale beelden werden genomen met een 63x vergrotings lens onder identieke omstandigheden en gelijke parameterinstellingen. Afbeeldingen zijn afkomstig uit de regio 32 kHz. Immunolabeling voor myosine VIIa en kleuring voor phalloidine in OHCs was vergelijkbaar met en zonder de cel en weefsellijm. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Scanning elektronenmicroscopie toont drie rijen OHC stereocilia van C57BL/6J muizen. Afbeeldingen zijn uit de middelste regio gehaald. a) eenweergave met een geringe vergroting van drie rijen ohc's. b) vergrote beelden vertonen drie rijen van goed georganiseerde ohc-stereocilia die in "V"-vormen worden weergegeven. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam | ||||||||
| Afstand tot de Apex (mm) | 0,4 | 1 | 2,4 | 3,3 | 3,9 | 4,7 | 5,7 | |
| Afstand tot de Apex (%) | 7,7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Frequenties (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tabel 1: mapping van de CBA/J muis cochleaire frequentie gevoeligheid als functie van afstand van de Apex volgens Muller1 en Viberg en canlon2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cochleaire microdissectie van complete-Mount oppervlakte preparaten in combinatie met immunolabeling biedt een fundamenteel hulpmiddel voor onderzoek naar pathologieën van het binnenoor en moleculaire mechanismen. Deze gemodificeerde volwassen muis cochleaire dissectie methode met behulp van de cel en weefsellijm vereenvoudigt deze moeilijke procedure.
Hoewel deze aangepaste bereidingsmethode voor cochleaire oppervlakken relatief eenvoudig en toegankelijk is, is er nog steeds praktijk nodig om vaardigheid te bereiken. Om de juiste bezuinigingen te maken, heeft de Dissector een zorgvuldige concentratie nodig. Omdat de cochleaire sensorische haarcellen in de basale bocht zo dicht bij de spiraalvormige limbus liggen, is het moeilijk om het limbusweefsel volledig te verwijderen om de oppervlakte voorbereiding volledig plat te laten liggen, maar confocale Z-projecties kunnen dit probleem compenseren. Bovendien is de haak regio van de slakkenhuis nog steeds het moeilijkste gedeelte om te ontleden. Er kunnen scheidingen tussen Ohc's en Ihc's van de Hook-regio optreden. De haak regio toont grote anatomische variaties bij de mens en is belangrijk voor het gehoor van de botgeleiding22,23. Op basis van de door Muller1 en Viberg en canlon2gerapporteerde cochleaire frequentie mapping komt de haak regio, beginnend rond 4,7 mm van de Apex, overeen met de gevoeligheid voor 48 kHz tonen en hoger (tabel 1), terwijl auditieve functionele beoordelingen van verworven gehoorverlies bij muizen, waaronder geluidsgeïnduceerde, aminoglycoside-geïnduceerde gehoorverlies en leeftijdsgebonden gehoorverlies, worden over het algemeen gemeten op 8, 16 en 32 kHz met auditieve hersenstam respons (ABR)5,6 ,7,9,24 en van 6 – 45 kHz met vervormings product otoacoustic-emissie (dpoae)25. In overeenstemming met Montgomery et al., wordt vervorming van het epitheel niet vaak gezien wanneer de spiraal is verdeeld in 3 – 4 stukken19.
De gewijzigde methode die hier wordt gepresenteerd, omvat het ontleden van de cochleaire spiraal in slechts vier stukken (Apex, midden, basale bochten en de haak regio), terwijl de Eaton-Peabody-techniek zes stuks produceert18. De Eaton-Peabody-techniek begint met een cochleaire Bisectie, die voorkomt dat tangentiële sneden door het epitheel worden geknipt om eerst de apicale bocht van de rest van de spiraal te scheiden, zoals beschreven in deze gemodificeerde techniek. Door kleinere stukken te produceren, is de Eaton-Peabody-techniek ontworpen om de afvlakking te minimaliseren die nodig is om een groot stuk met een immersie doelstelling te bekijken. In feite vergemakkelijkt de grotere delen van weefsel de meting van de frequentietoewijzing van de apicale naar de basale bocht, in lijn met Montgomery et al.19. Daarnaast is een verschil tussen deze methode en Montgomery et al.19 dat de gemodificeerde methode van cochleaire dissectie die hier wordt beschreven, een scalpel gebruikt voor de meeste sneden en slechts één stap wordt gedaan met een schaar (d.w.z. de scheiding van basale en haak gebieden als geïllustreerd in de derde snede in Figuur 2), terwijl Montgomery et al.19 een schaar gebruikte met een met siliconen elastomeer beklede dissectie schaal voor oppervlakte preparaten. Om vervorming van het weefsel te voorkomen, is de ontkoppeling van het basilaire membraan om de Mossel te verwijderen van cruciaal belang.
Dit protocol maakt gebruik van een cel-en weefsellijm (tabel met materialen) voor de hechting van de stukjes cochleair epitheel aan de 10 mm ronde Afdeklijst voor immunolabeling of immunohistochemie, waardoor de processen handiger worden en het verlies van epitheelweefsel tijdens het meervoudig wassen van immunolabeling procedures. Cel-en weefsellijm is een formulering van polyphenolische eiwitten die zich houdt aan cellen en weefsels en is op grote schaal gebruikt in veel voorkomende in-vitro-technieken, waaronder immunohistochemie, in-situ hybridisatie, en immunoassays20. In overeenstemming met de gedachte dat de cel en weefsellijm niet interfereren met immunoreacties, vertoont parallelle immunolabeling van myosine VIIa met oppervlakte preparaten geen verschil van immunoreacties of uniformiteit met en zonder de cel en het weefsel Lijm. Het vergelijken van deze drie dissectie methoden (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, en de gewijzigde methode beschreven), de afgestudeerde studenten in het lab zijn het erover eens dat deze gemodificeerde methode met behulp van de cel en weefsellijm is gemakkelijker te leren en Master.
Kortom, het produceren van volwassen muis oppervlakte preparaten op de hele berg is een basisvaardigheid voor de evaluatie van cochleaire pathologieën. Het beschreven gemodificeerde protocol voor volwassen muizen oppervlakte preparaten vereenvoudigt deze moeilijke procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het beschreven onderzoeksproject werd gesteund door Grant R01 DC009222 van het Nationaal Instituut voor doofheid en andere communicatiestoornissen, National Institutes of Health. Dit werk werd uitgevoerd in het WR-gebouw bij MUSC in een gerenoveerde ruimte ondersteund door Grant C06 RR014516. Dieren werden gehuisvest in MUSC CRI dier faciliteiten ondersteund door Grant C06 RR015455 van het Extramural Research facilities Program van het National Center for Research resources. De auteurs danken Dr. Jochen schacht voor zijn waardevolle commentaren en Andra Talaska voor het naleden van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
