Summary
Este artigo apresenta um método de preparação da superfície coclear modificado que requer decaltificação e uso de um adesivo de células e tecidos para aderir aos pedaços de epélia coclear a 10 mm de cobertura redonda para imunohistoquímica em córquia de camundongo adulto.
Abstract
O processamento auditivo na cóconlea depende da integridade das células ciliadas mecanosensorias. Ao longo da vida, a perda auditiva pode ser adquirida a partir de inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o processo de envelhecimento. A perda de células ciliadas sensoriais é uma característica patológica comum das variedades de perda auditiva adquirida. Além disso, a sinapse da célula ciliada interna pode ser danificada por insultos leves. Portanto, as preparações superficiais da epitélia coclear, em combinação com técnicas de imunorotulagem e imagens confocais, são uma ferramenta muito útil para a investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas sensoriais, alterações nos níveis de proteína nas células ciliadas e células de apoio, regeneração de células ciliadas e determinação da expressão gênica do relatório (ou seja, GFP) para verificação de transdução e identificação bem-sucedidas de tipos de células transinduzidas. A cócrolea, uma estrutura óssea em forma de espiral no ouvido interno, contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). Células ciliadas sensoriais e células de apoio circundantes no OC estão contidas no duto coclear e descansam na membrana basilar, organizada de forma tonotópica com detecção de alta frequência ocorrendo na base e baixa frequência no ápice. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e a capacidade de manipular genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados em pesquisas biológicas, inclusive na ciência auditiva. No entanto, a cócroes de camundongo adulto é minúscula, e o epitélio coclear é encapsulado em um labirinto ósseo, dificultando a microdissecção. Embora as técnicas da dissecação foram desenvolvidas e usadas em muitos laboratórios, este método modificado da microdissecção usando o adesivo da pilha e do tecido é mais fácil e mais conveniente. Ele pode ser usado em todos os tipos de cócroes de camundongoadulto após a decalcificação.
Introduction
A cóconlea é dedicada à detecção de som e responsável pela audição. O duto coclear é enrolado em forma espiral no labirinto ósseo e contém o órgão auditivo da extremidade sensorial, o órgão de Corti (OC). O OC repousa sobre a membrana basilar, tornando-se o epitélio coclear, com um comprimento de cerca de 5,7 mm quando desenrolado em adultos CBA / CaJ ratos1,2. Como o OC é organizado tonotópicamente com altas frequências detectadas na base e baixas frequências no ápice, o epitélio coclear é muitas vezes dividido em três partes para comparações analíticas: as voltas apical, média e basal correspondentes a baixa, detecção média e de alta frequência, respectivamente. Além de uma variedade de células de apoio, o OC é composto por uma fileira de células ciliadas internas (IHCs) localizadas medialmente e três fileiras de células ciliadas externas (OHCs) localizadas lateralmente no que diz respeito à espiral coclear.
O processamento auditivo correto depende da integridade das células ciliadas sensoriais na cóconlea. Danos ou perda de células ciliais sensoriais é uma característica patológica comum da perda auditiva adquirida, causada por inúmeras etiologias, como exposição ao ruído excessivo, o uso de medicamentos ototóxicos, infecções bacterianas ou virais no ouvido, lesões na cabeça e o envelhecimento processo3. Além disso, a integridade e função da célula ciliada interna / sinapses nervosas auditivas podem ser prejudicadas por insultos leves4. Com a disponibilidade de informações moleculares e genéticas e manipulação de genes por nocaute e técnicas de knock-in, os ratos têm sido amplamente utilizados na ciência auditiva. Embora a cócrolea de camundongo adulto seja minúscula e o epitélio coclear seja cercado por uma cápsula óssea, resultando em microdisseses tecnicamente difíceis, preparações superficiais do epitélio em combinação com imunorotulagem ou imunohistoquímica e imagens confocais têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares, incluindo perdas de sinapses de fita e células ciliadas, alterações nos níveis de proteínas nas células ciliadas sensoriais e células de apoio, e regeneração de células ciliadas. As preparações da superfície coclear também têm sido usadas para determinar o padrão de expressão de genes de repórter (ou seja, GFP) e confirmar a transdução bem-sucedida e identificar tipos de células transinduzidas. Essas técnicas têm sido usadas anteriormente para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à perda auditiva induzida pelo ruído usando camundongos ADULTOS CBA/J5,6,7,8,9.
Ao contrário da imunohistoquímica usando seções de parafina ou criosecção para obter pequenas porções transversais da córcia que contêm três células ciliadas externas (OHCs) e uma célula ciliada interna (IHC) em cada seção, as preparações da superfície coclear visualização de todo o comprimento do OC para a contagem de células ciliadas sensoriais e sinapses de fita e imunorotulagem de células ciliadas sensoriais correspondentes a freqüências funcionais específicas. A Tabela 1 mostra o mapeamento das frequências auditivas em função da distância ao longo do comprimento da espiral coclear em camundongo adulto CBA/J de acordo com estudos de Muller1 e Viberg e Canlon1,2. As preparações da superfície coclear têm sido amplamente utilizadas para investigação de patologias cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. O método de dissecção coclear de montagem inteira foi originalmente descrito em um livro editado por Hans Engstrom em 196616. Esta técnica foi posteriormente refinada e adaptada a uma variedade de espécies descritas na literatura por um número de cientistas na ciência auditiva10,11,12,13, 15,17 e pelos Laboratórios Eaton-Peabody em Massachusetts Eye and Ear18. Recentemente, outro método de dissecção coclear foi relatado por Montgomery et al.19. A microdissecção da cóconlea é um passo essencial e crítico para as preparações da superfície coclear. No entanto, dissecar cócroes de rato é um desafio técnico e requer uma prática considerável. Aqui, um método de preparação de superfície coclear modificado é apresentado para uso em cócroes de camundongos adultos. Este método requer decalcificação e uso de adesivo celular e tecido (ou seja, Cell-Tak) para aderir aos pedaços de epitélio coclear para 10 mm cobres redondos para imunorotulagem. O adesivo da pilha e do tecido foi amplamente utilizado para a imunohistoquímica20. Este método modificado de microdissese coclear é relativamente simples em comparação com os relatados anteriormente18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os protocolos de pesquisa envolvendo camundongos CBA/J adultos do sexo masculino com idades entre 10 e 12 semanas e camundongos C57BL/6J com idades entre 6 e 8 semanas foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade Médica da Carolina do Sul (MUSC). O cuidado animal estava a supervisão da divisão de recursos animais do laboratório em MUSC.
Nota: Para os procedimentos apresentados abaixo, os camundongos são anestesiados com cetamina (100 mg/kg) e xilamina (10 mg/kg) através de injeções intraperitoneal. Os ratos são decapitados depois que o animal já não responde aos estímulos dolorosos, tais como uma pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.
1. Extração de Ossos Temporais
- Decapite o rato imediatamente após a morte com tesoura cirúrgica (17 cm de comprimento) e corte o osso do crânio com uma tesoura do aspecto posterior para a frente ao longo da linha central do crânio depois de expor o osso do crânio, puxando a pele anteriormente.
- Retire o tecido cerebral usando fórceps e remover manualmente os ossos temporais com o polegar eo dedo indicador para ratos três meses de idade ou mais. Use pequenas tesouras cirúrgicas (11 cm de comprimento) para cortar o osso temporal de camundongos com menos de três meses de idade.
- Coloque o osso temporal em uma placa de Petri (30 mm de diâmetro) contendo solução de paraformaldeído fresco de 4% (PFA) esfriada em fosfato, pH 7.4.
Nota: Prepare a nova solução PFA de 4% e ajuste o pH para 7,4 pouco antes de fixar os ossos temporais, pois o equilíbrio inadequado de pH da solução PFA diminuirá a qualidade da imunorotulagem.
2. Fixação e Perfusão
- Retire as fitas da janela oval e perfurar a membrana da janela redonda com tamanho #5 fórceps. um microscópio estéreo da dissecação faz um furo pequeno no ápice do cochlea usando uma agulha de 27 G conectada a uma seringa de 1 mL.
- Perfuse delicadamente e lentamente o cochlea com a solução de PFA de 4% através das janelas redondas e ovais até que a solução lave fora do furo pequeno no ápice. Transfira a cóconlea (uma ou duas córdeias por frasco) para frascos de cintilação de volume de 20 mL contendo 10 mL de solução PFA de 4%.
- Agita delicadamente os frascos da cintilação na temperatura ambiente (RT) por 2 h e deixe durante a noite em um refrigerador (4 °C) em um rotator.
Nota: O tempo de fixação pode ser ajustado dependendo do anticorpo usado. Por exemplo, limitar a fixação a 1,5 h permitirá a imunorotulagem bem-sucedida de terminais pós-sinápticos ao usar o anticorpo GluA 2.
3. Decalcificação do Osso Temporal
- Retire a solução PFA e lave a cócona com PBS 3x fresco para 5 min cada.
- Adicione 20 mL de 4% de etilediáceoss solução de sal disódio (EDTA) solução (pH 7.4) para os frascos de clinização e manter em uma geladeira por 48-72 h em um rotador com agitação suave. Mude a solução EDTA diariamente até que as cócones sejam descalcificadas. Verifique se as cólicas são descalcificadas tocando a porção vestibular óssea com fórceps para avaliar a elasticidade ou simplesmente cortar um pequeno pedaço da borda da porção vestibular. Se tal corte resultar em uma peça esmagada, a cóclea não é descalcificada.
Nota: A solução EDTA pode interferir com a imunoreação dos anticorpos primários, dependendo da concentração da solução. Prepare 4% EDTA na PBS e ajuste o pH para 7,4. Para decalqueificação consistente de ossos temporais, a solução EDTA fresca é usada. - Mude a solução para PBS para microdissese após a decalcificação estiver completa.
Nota: Se as cómas não forem suficientemente descalcificadas, a dissecação das cócones não pode ser realizada.
4. Microdissese do Epitélio Coclear
Nota: Uma vez que a decalcificação esteja completa, a microdissese do epitélio coclear para imunorotulagem precisa ser realizada o mais rápido possível. Em uma placa de Petri limpa de 30 mm contendo PBS, a orelha interna é orientada da seguinte maneira: em referência à parte superior da placa de Petri (tampa) e inferior, as janelas coclearas redondas e ovais e voltas à parte superior. Em referência ao dessetor, a porção coclear é orientada para a frente (longe do dessetor) e porção vestibular em direção à parte de trás (quase dessetor). O seguinte descreve as etapas em detalhe.
- Segure a porção vestibular do osso temporal com fórceps e corte a curva apical com o bisturi em um ângulo de 45°, conforme indicado pela linha vermelha(Figura 1a).
- Corte verticalmente ao longo da tênue linha entre a janela redonda e a janela oval, como indicado pela linha vermelha(Figura 1b)para separar a cóconlea da porção vestibular (Figura 1c).
Nota: Esta porção coclear contém as porções médias, basais e de gancho do epitélio. - Coloque a porção coclear com a volta basal em direção ao fundo e a volta do meio em direção ao topo da placa de Petri e corte a cápsula óssea e a parede lateral da curva do meio em direção ao final do qual a seção apical foi removida, como indicado pela linha vermelha (Figu re 1d,e).
- Continue cortando para separar completamente a parte média das regiões basal e do gancho(figura 1f,g).
Nota: A região do gancho da cóconlea é o fim do epitélio coclear correspondente à sensibilidade aos tons 48 kHz e mais elevado em camundongos. - Coloque a porção basal e gancho com o local da membrana basilar orientada para a parte inferior do prato e verticalmente cortar o modiolus fora da região do gancho para remover o modiolus como indicado pela linha vermelha vertical (Figura 1g).
Nota: O modiolus é o eixo central cônico da córdia que consiste em osso esponjoso e nervo coclear, bem como o gânglio espiral. Pode ser preferível realizar este corte com tesoura. - Corte as regiões basal e gancho como a outra linha vermelha indica na Figura 1g para separar a porção de gancho(Figura 1h).
Nota: A cócrolea foi separada em porções apical, médias, basais e de gancho. Os próximos passos serão a dissecação final de cada uma das voltas individuais, usando a curva do meio como exemplo. - Corte as porções relativamente grandes de cápsula óssea e tecido de parede lateral da curva do meio, como indicado pela linha vermelha (Figura 1i).
Nota: A parede lateral do duto coclear é formada pelo ligamento espiral e pela stria vascularis. - Segure a parede lateral com fórceps para alinhar a cápsula óssea e parede lateral com o fundo da placa de Petri e cortar esses tecidos do lado da membrana basilar. Em seguida, achatar o espécime para orientar o lado da superfície da célula do cabelo sensorial para cima. Aparar o resto da cápsula óssea e parede lateral(Figura 1j).
- Retire a membrana tectorial usando fórceps para separar completamente a região média(Figura 1k).
- Repita os passos 4,7-4,9 para as dissecções finais das voltas ou regiões restantes, como mostrado na Figura 1l.
- Prepare um coverslip redondo de 10 mm para a adesão do epitélio sensorial. Use uma pipeta para espalhar à mão 0,5 μL de adesivo celular e tecido no centro do coverslip redondo. Depois de secar (3-5 min em RT), coloque os coverslips em PBS em placas de Petri.
- Coloque todos os quatro pedaços do epitélio sensorial no coverslip redondo de 10 mm na placa de Petri. Em seguida, segure uma borda do coverslip para transferi-lo para um prato de quatro poços para imunorotulagem ou imunohistoquímica (Figura 1m).
NOTA: Figura 2 ilustra a localização dos grandes cortes.
5. Imunorotulagem para Sinapses Coclear
Nota: O protocolo de imunorotulagem para sinapses cocleares seguidoneste estudo foi previamente descrito13. Fitas pré-sinápticas foram rotuladas com um anticorpo CtBP2 (proteína de ligação anti-carboxílica-terminal de camundongos 2 IgG1, rotulando o domínio B da proteína de andaimeRIBEYE). Terminais pós-sinápticos foram rotulados com anticorpoglu2 (receptor anti-glutamato de camundongo 2 IgG2a, rotulando subunidades do receptor AMPA).
- Lave o epitélio sensorial com PBS 3x para 5 min cada lavagem em um prato de quatro poços e, em seguida, adicione 2 mL de 2% surfactante nonionic (ou seja, Triton-X 100) no prato por 30 minutos em RT em um rotador.
- Retire a solução surfactante nonionic do prato usando uma pipeta e adicione 100 μL de solução de bloqueio contendo 10% de soro de cabra normal para cada bem para 1 h em um rotador com agitação suave no RT.
- Remova a solução de bloqueio de cada poço, lave com PBS 3x por 5 min cada lavagem agitação suave no RT.
- Adicione 100 μL dos anticorpos primários diluídos com PBS a cada poço: mouse anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), mouse anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Cubra cada prato de quatro poços com sua tampa e coloque em um grande recipiente umidificado que protege da luz. Incubar a 37 °C para 24 h.
Nota: Como opção, coelho anti-miosina VIIa (1:400) para imunorotulagem células ciliadas sensoriais podem ser adicionados. - Lave 3x com PBS por 5 min cada lavagem com agitação suave em RT.
- Adicione 100 μL dos anticorpos secundários Alexa 594 cabra anti-mouse IgG1a (1:1,000), Alexa 488 cabra anti-mouse IgG2a (1:1,000) diluído com PBS para cada poço. Cubra cada prato de quatro poços com sua tampa e coloque em um grande recipiente umidificado que protege da luz. Incubar a 37 °C para 2 h.
Nota: Se a miosina VIIa for usada, adicione Alexa 350 cabra anti-coelho (1:200). - Lave 3x com PBS por 5 min. Em seguida, transfira o coverslip redondo de 10 mm para um slide com as amostras por cima.
- Adicione cuidadosamente 8 μL de Fluoro-Gel com Tris buffer no centro do coverslip. Em seguida, segure a borda de outro coverslip rodada de 10 mm com fórceps para montar em cima, imprensando os dois coverslips juntos.
- Use esmalte para selar os slides, colocá-los em uma pasta de papelão slide, e armazenar na geladeira.
Nota: Se algum Fluoro-Gel vazar entre os lábios durante a montagem, limpe as bordas dos lábios antes de selar o slide com esmalte. As imagens confocal precisam ser tiradas dentro de 7 dias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
As preparações superficiais do epitélio coclear, em combinação com imunorotulagem e imagem confocal, têm sido amplamente utilizadas na ciência auditiva para a investigação de patologias cocleares, como quantificação de sinapses de fita, células ciliadas sensoriais, e expressão de proteína em células ciliadas sensoriais5,6,7,8. Embora a dissecação de cóciqueiros de camundongos adultos para a preparação da superfície não seja simples, os novos alunos de pós-graduação são capazes de aprender este método modificado depois de praticar com 10-15 orelhas (Figura 1 e Figura 2). Com esta técnica, em combinação com imunorotulagem para CtBP2 (marcador para fitas pré-sinápticas) e GluA2 (marcador para terminais pós-sinápticos), contando sinapses de ihc/nervo auditivo usando imagens confocais projeções Z com intervalos de 0,25 μm, com base em o tamanho das sinapses da fita do rato, é possível21. Isso é consistente com os resultados publicados4,6,13. As preparações de superfície dos camundongos CBA/J (sem tratamento) com a idade de 10 a 12 semanas imunoetiquetadas com CtBP2 (vermelho) e GluA2 (verde) mostraram que ambas as fitas pré-sinápticas e terminais pós-sinápticos estão localizados abaixo dos núcleos do IHC e são justapostos, indicando sinapses funcionais (Figura 3)6,13.
Ao imunorotular as preparações de superfície com diferentes anticorpos, a avaliação da sinalização molecular e estrutura em células ciliadas sensoriais é possível. Por exemplo, a Figura 4 mostra os resultados da imunorotulagem para miosina VIIa e contra-manchacom faloide e 4',6-diamidino-2-fenillindole (DAPI). Experimentos de imunorotulagem paralela com e sem o adesivo celular e tecido usando soluções idênticas foram realizados para avaliar se o adesivo usado interfere com as imunoreações. As preparações da superfície coclear foram imunoetiquetadas com miosina VIIa e contatadas com faloide. Imagens confocais foram tiradas com uma lente de ampliação 63x em condições idênticas e configurações de parâmetros iguais para ganhos a laser e ganhos de tubo fotomultiplicador (PMT). Não houve diferença nas imunoreações ou uniformidade com e sem o adesivo celular e tecido(Figura 5). Usando diferentes fixadores, as preparações de superfície forneceram a base para a digitalização de imagens de microscopia eletrônica (SEM) para visualização de estereoslia coclear9. Camundongos C57BL/6J (sem tratamento) com a idade de 6-8 semanas mostram estereocilia bem organizada em forma de V de OHCs em três linhas (Figura 6). Além disso, as preparações da superfície coclear têm sido usadas para determinar o padrão de expressão de um gene de relatório (ou seja, GFP) e confirmar a transdução bem-sucedida e identificar tipos de células transinduzidas.
Figura 1: Representação dos passos para os preparativos para a superfície do mouse adulto. (a)A cápsula óssea coclear do osso temporal enfrenta. A linha vermelha indica o primeiro corte para separar a curva apical. RW = janela redonda, OW = janela oval. (b)O ápice é separado da córdia, como indicado pela seta. A linha vermelha entre janela redonda e janela oval indica o segundo corte feito na córdia. (c)A porção coclear que contém as regiões média, basal e anzol é separada da porção vestibular. (d)A porção coclear está situada de frente para cima. A linha vermelha indica o terceiro corte, direcionado para o final a partir do qual a seção apical foi removida. (e)A seta indica a lacuna deixada após a conclusão do terceiro corte. (f)Esta imagem mostra a região do meio. (g)Esta imagem mostra as regiões basais e anzol combinadas. A linha vermelha vertical indica o corte entre a região do modiolus e do gancho. O corte entre as regiões basal e gancho é indicado pela outra linha vermelha. (h)As regiões basal e de gancho são separadas como indicado pelas setas. (i)A região média da cápsula óssea é cortada como indicado pela linha vermelha. (j)A imagem mostra a região média depois que um lado da cápsula óssea é removido. (k)Esta imagem mostra a região média após a conclusão da dissecação. (l)Todas as quatro regiões estão completamente dissecadas. (m)Cochlear fica afixada a um coverslip redondo de 10 mm transferido para uma placa de Petri de quatro poços com as quatro regiões, conforme indicado. Todas as imagens foram tiradas um microscópio de dissecção estéreo em 1,2x, 2,5x e 0,6 x ampliações. Barras de escala são indicadas em cada imagem. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Localização dos principais cortes. Toda a cápsula óssea coclear foi removida. Os locais dos principais cortes são indicados. 1) A localização onde a curva apical é cortada. 2) O local onde a volta do meio é separada. 3) O corte crítico para remover o modiolus. 4) A linha para dividir as regiões basal e do gancho. Barra de escala = 0,5 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: As imagens confocal revelam a imunorotulagem para CtBP2 e GluA2 em preparações da superfície do rato adulto. As regiões apical, média, e basal são etiquetadas. As imagens confocal de ampliação inferior foram tiradas com uma lente 10x. Vermelho = CtBP2, verde = GluA2. Barra de escala = 100 μm. Imagens confocal de regiões de 5, 16 e 32 kHz foram tiradas com uma lente 63x. Vistas ampliadas das áreas indicadas pelos retângulos brancos nas porções de ápice, meio e base. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Imagens confocais revelam imunorotulagem de células ciliadas sensoriais de uma preparação superficial da região de 32 kHz. Todas as imagens foram fundidas projeções Z-stack. Phalloidin (verde) manchou a estrutura das três fileiras de OHCs e uma fileira de IHCs. Myosin VIIa (vermelho) imunolabeled três fileiras de OHCs e uma fileira de IHCs. Núcleos de células ciliadas manchados de DAPI. As imagens confocal fundidas foram reconstruídas para vistas laterais de pilhas sensoriais do cabelo. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: As preparações da superfície coclear com e sem o adesivo celular e tecido foram processadas em paralelo, imunoetiquetadas para miosina VII (vermelho) e contatadas com faloide (verde) usando soluções idênticas. O adesivo celular e tecido utilizado não interfere com imunoreações. Imagens confocais foram tiradas com uma lente de ampliação 63x em condições idênticas e configurações de parâmetros iguais. As imagens foram tiradas da região de 32 kHz. A imunorotulagem para miosina VIIa e coloração para faloide em OHCs foi semelhante com e sem a célula e o adesivo de tecido. Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: A microscopia eletrônica de varredura mostra três fileiras de estestereocilia do OHC dos ratos de C57BL/6J. As imagens foram tiradas da região do meio. (a)Uma visão de baixa ampliação de três linhas de OHCs. (b) Imagens ampliadas mostram três linhas de estereocilia OHC bem organizadas que aparecem em formas de "V". Barra de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Nome | ||||||||
| Distância do ápice (mm) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| Distância do ápice (%) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Frequências (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tabela 1: Mapeamento da sensibilidade da frequência coclear do rato CBA/J em função da distância do ápice de acordo com Muller1 e Viberg e Canlon2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A microdissecção coclearde de preparações de superfície de montagem inteira em combinação com imunorotulagem fornece uma ferramenta básica para a investigação de patologias do ouvido interno e mecanismos moleculares. Este método de dissecção coclear adulto modificado do rato usando o adesivo da pilha e do tecido simplifica este procedimento difícil.
Embora este método de preparação coclear modificado da superfície seja relativamente fácil e acessível, ainda exige a prática a fim conseguir a proficiência. Para fazer os cortes corretos, o dessetor precisa de uma concentração cuidadosa. Como as células do cabelo sensorial coclear na curva basal estão tão próximas do membro espiral, é difícil remover totalmente o tecido límbico para permitir que a preparação superficial esteja completamente plana, mas projeções célcráticas confocais podem compensar esse problema. Além disso, a região do gancho da cóconlea ainda é a porção mais difícil de dissecar. As separações entre ACS e IHCs da região do gancho podem ocorrer. A região do gancho exibe grandes variações anatômicas em seres humanos e é importante para a audição de condução óssea22,23. Com base no mapeamento de frequência coclear relatado por Muller1 e Viberg e Canlon2,a região do gancho, a partir de cerca de 4,7 mm do ápice, corresponde à sensibilidade a 48 tons kHz e superior (Tabela 1), enquanto o auditivo funcional as avaliações da perda auditiva adquirida em camundongos, incluindo perda auditiva induzida por aminoglicoídeos induzidos por ruído e perda auditiva relacionada à idade, são geralmente medidas em 8, 16 e 32 kHz com resposta auditiva de troncos no cérebro (ABR)5,6 ,7,9,24 e de 6-45 kHz com produto de distorção emissão otoacústica (DPOAE)25. De acordo com Montgomery et al., a distorção do epitélio não é comumente vista quando a espiral é dividida em 3-4 peças19.
O método modificado aqui apresentado envolve dissecar a espiral coclear em apenas quatro peças (ápice, curvas médias e basais e região do gancho), enquanto a técnica Eaton-Peabody produz seis peças18. A técnica Eaton-Peabody começa com uma bissecção coclear, que evita fazer cortes tangenciais através do epitélio para separar primeiro a volta apical do resto da espiral, como descrito nesta técnica modificada. Ao produzir peças menores, a técnica Eaton-Peabody é projetada para minimizar o achatamento necessário para ver uma grande peça com um objetivo de imersão. Na verdade, as porções maiores de tecido facilitar a medição do mapeamento de freqüência do apical para a curva basal, em consonância com Montgomery et al.19. Além disso, uma diferença entre este método e Montgomery et al.19 é que o método de dissecção coclear modificado descrito aqui emprega um bisturi para a maioria dos cortes e apenas um passo é feito com tesoura (ou seja, a separação das regiões basais e anzol as ilustrado no terceiro corte na Figura 2), enquanto Montgomery et al.19 usaram tesouras com um prato de dissecação revestido de elastômero de silicone para preparações de superfície. Para evitar a distorção do tecido, a desconexão da membrana basilar para remover o modiolus é crítica.
Este protocolo utiliza um adesivo celular e tecido(Tabela de Materiais)para adesão dos pedaços de epitélio coclear para o coverslip redondo de 10 mm para imunorotulagem ou imunohistoquímica, o que torna os processos mais convenientes e evita a perda de tecidos de epitélio durante as múltiplas lavações de procedimentos de imunorotulagem. O adesivo celular e tecido é uma formulação de proteínas polifenóis que adere às células e tecidos e tem sido amplamente utilizada em muitas técnicas in vitro comuns, incluindo imunohistoquímica, hibridização in situ e imunoensaios20. Consistente com a noção de que o adesivo celular e tecido não interfere com imunoreações, imunorotulagem paralela da miosina VIIa com preparações de superfície não mostra diferença de imunoreações ou uniformidade com e sem a célula e tecido Adesivo. Comparando esses três métodos de dissecação (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, e o método modificado descrito), os alunos de pós-graduação no laboratório concordam que este método modificado usando o adesivo celular e tecido é mais fácil de aprender e Mestre.
Em resumo, produzir preparações de superfície de camundongoadulto de montagem inteira é uma habilidade básica para avaliação de patologias cocleares. O protocolo modificado descrito para as preparações da superfície dos ratos adultos simplifica este procedimento difícil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
O projeto de pesquisa descrito foi apoiado pela concessão R01 DC0009222 do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação, Institutos Nacionais de Saúde. Este trabalho foi realizado no Edifício WR no MUSC em espaço renovado apoiado pela concessão C06 RR014516. Os animais foram alojados em instalações animais MUSC CRI apoiadas pela concessão C06 RR015455 do Programa de Instalações de Pesquisa Extramural do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa. Os autores agradecem ao Dr. Jochen Schacht por seus comentários valiosos e Andra Talaska pela revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
