Summary
Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l'uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l'immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.
Abstract
L'elaborazione uditiva nella coclea dipende dall'integrità delle cellule ciliate meccanosensoriali. Nel corso della vita, la perdita dell'udito può essere acquisita da numerose eziologie come l'esposizione a rumori eccessivi, l'uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell'orecchio, lesioni alla testa, e il processo di invecchiamento. La perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune delle varietà di perdita dell'udito acquisita. Inoltre, la sinapsi delle cellule ciliate interne può essere danneggiata da lievi insulti. Pertanto, i preparati superficiali di epiteli cocleari, in combinazione con tecniche di immunoetichettatura e immagini confocali, sono uno strumento molto utile per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi del nastro e cellule ciliate sensoriali, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate e nelle cellule di supporto, rigenerazione delle cellule dei capelli e determinazione dell'espressione genica del rapporto (cioè GFP) per la verifica della trasduzione e l'identificazione dei tipi di cellule trasdotte. La coclea, una struttura a spirale osa nell'orecchio interno, contiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). Le cellule ciliate sensoriali e le cellule portante circostanti nell'OC sono contenute nel condotto cocleare e poggiano sulla membrana basilare, organizzate in modo tonotopico con rilevamento ad alta frequenza che si verifica nella base e a bassa frequenza nell'apice. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la capacità di manipolare i geni mediante tecniche di knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biologica, anche nella scienza dell'udito. Tuttavia, la coclea adulta del topo è minuscola, e l'epitelio cocleare è incapsulato in un labirinto osseo, rendendo difficile la microdissezione. Anche se le tecniche di dissezione sono state sviluppate e utilizzate in molti laboratori, questo metodo di microdissezione modificato utilizzando l'adesivo per cellule e tessuti è più facile e più conveniente. Può essere utilizzato in tutti i tipi di cocleari di topi adulti dopo la decalcificazione.
Introduction
La coclea è dedicata alla rilevazione del suono e responsabile dell'udito. Il condotto cocleare è arrotolato a spirale nel labirinto osseo e detiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). L'OC poggia sulla membrana basilare, che costituisce l'epitelio cocleare, con una lunghezza di circa 5,7 mm quando srotolato nei topi adulti CBA/CaJ1,2. Poiché l'OC è tonotopicamente organizzato con alte frequenze rilevate nella base e nelle basse frequenze nell'apice, l'epitelio cocleare è spesso diviso in tre parti per confronti analitici: i giri apicali, medi e basali corrispondenti a bassi, medio e ad alta frequenza, rispettivamente. Oltre a una serie di cellule di supporto, l'OC è composto da una fila di cellule ciliate interne (IHC) situate medialmente e tre file di cellule ciliate esterne (OHC) situate lateralmente rispetto alla spirale cocleare.
Una corretta elaborazione uditiva dipende dall'integrità delle cellule ciliate sensoriali nella coclea. Il danno o la perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune della perdita dell'udito acquisita, causata da numerose eziologie come l'esposizione a rumori eccessivi, l'uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell'orecchio, lesioni alla testa e l'invecchiamento processo3. Inoltre, l'integrità e la funzione delle cellule ciliate interne / sinapsi nervose uditive possono essere compromesse da lievi insulti4. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la manipolazione dei geni mediante tecniche knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell'udito. Anche se la coclea adulta del topo è minuscola e l'epitelio cocleare è circondato da una capsula ossea con conseguente microdissezioni tecnicamente difficili, le preparazioni superficiali dell'epitelio in combinazione con immunoetichettatura o immunohistochimica e le immagini confocali sono state ampiamente utilizzate per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi a nastro e cellule ciliate, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate sensoriali e nelle cellule di supporto, e rigenerazione delle cellule dei capelli. I preparati cocleari sono stati utilizzati anche per determinare il modello di espressione dei geni reporter (ad esempio, GFP) e confermare la trasduzione riuscita e identificare i tipi di cellule trasdotte. Queste tecniche sono state precedentemente utilizzate per lo studio di meccanismi molecolari alla base della perdita dell'udito indotta dal rumore utilizzando topi adulti CBA/J5,6,7,8,9.
A differenza dell'immunohistochimica che utilizza sezioni di paraffina o criosezioni per ottenere piccole porzioni trasversali della coclea che contengono tre cellule ciliate esterne (OHC) e una cellula pilifena interna (IHC) su ogni sezione, i preparati cocleari della superficie visualizzazione dell'intera lunghezza dell'OC per il conteggio delle cellule ciliate sensoriali e delle sinapsi a nastro e l'immunoetichettatura delle cellule ciliate sensoriali corrispondenti a specifiche frequenze funzionali. La tabella 1 mostra la mappatura delle frequenze uditive in funzione della distanza lungo la lunghezza della spirale cocleare nel topo CBA/J adulto secondo gli studi di Muller1 e Viberg e Canlon1,2. I preparati di superficie cocleare sono stati ampiamente utilizzati per lo studio delle patologie cocleari4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. L'intero metodo di dissezione cocleare è stato originariamente descritto in un libro edito da Hans Engstrom nel 196616. Questa tecnica è stata successivamente perfezionata e adattata a una varietà di specie, come descritto nella letteratura da un certo numero di scienziati nell'udito scientifico10,11,12,13, 15,17 e dagli Eaton-Peabody Laboratories presso Massachusetts Eye e Ear18. Recentemente, un altro metodo di dissezione cocleare è stato segnalato da Montgomery et al.19. La microdisezione della coclea è un passo essenziale e critico per le preparazioni della superficie cocleare. Tuttavia, la dissezione delle cocleari di topi è una sfida tecnica e richiede una pratica considerevole. Qui, viene presentato un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato per l'uso nelle cocleae dei topi adulti. Questo metodo richiede la decalcificazione e l'uso di adesivi cellulari e tissutali (ad esempio, Cell-Tak) per aderire ai pezzi di epitelio cocleare a 10 mm rotazioni rotonde per l'immunoetichettatura. L'adesivo per cellule e tessuti è stato ampiamente utilizzato per l'immunoistochimica20. Questo metodo di microdissezione cocleare modificato è relativamente semplice rispetto a quelli precedentemente riportati18,19.
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Protocol
Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgevano topi adulti maschi CBA/J all'età di 10-12 settimane e C57BL/6J topi all'età di 6-8 settimane sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Medical University of South Carolina (MUSC). La cura degli animali era sotto la supervisione della Divisione delle risorse animali di laboratorio del MUSC.
NOT: Per le procedure presentate di seguito, i topi sono anestesizzati con ketamina (100 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) tramite iniezioni intraperitive. I topi vengono decapitati dopo che l'animale non risponde più a stimoli dolorosi, come un pizzico di punta.
1. Estrazione di ossa temporali
- Decapitare immediatamente il topo post-mortem con forbici chirurgiche (17 cm di lunghezza) e tagliare l'osso del cranio con le forbici dall'aspetto posteriore in avanti lungo la linea centrale del cranio dopo aver esposto l'osso del cranio tirando la pelle anteriormente.
- Rimuovere il tessuto cerebrale con la pinze e rimuovere manualmente le ossa temporali con il pollice e l'indice per i topi di tre mesi di età o più. Utilizzare piccole forbici chirurgiche (11 cm di lunghezza) per tagliare l'osso temporale di topi di età inferiore ai tre mesi.
- Mettere l'osso temporale in una piastra Petri (30 mm di diametro) contenente una soluzione fresca 4% di paraformaldeide (PFA) disciolta in salina con tamponamenti di fosfati (PBS), pH 7.4.
NOT: Preparare una soluzione PFA fresca del 4% e regolare il pH a 7,4 appena prima di fissare le ossa temporali, perché il bilanciamento improprio del pH della soluzione PFA ridurrà la qualità dell'immunoetichettatura.
2. Fissazione e perfusione
- Togliere le stapes dalla finestra ovale e forare la membrana rotonda della finestra con dimensioni #5 pinze. Sotto un microscopio di dissezione stereo fare un piccolo foro nell'apice della coclea utilizzando un ago 27 G collegato a una siringa da 1 mL.
- Confondete delicatamente e lentamente la coclea con una soluzione PFA del 4% tramite le finestre rotonde e ovali fino a quando la soluzione non si lava dal piccolo foro all'apice. Trasferire la coclea (una o due cocleae per fiala) a fiale di scintillazione di volume da 20 mL contenenti 10 mL di soluzione PFA del 4%.
- Agitare delicatamente le fiale scintillanti a temperatura ambiente (RT) per 2 ore e lasciare per notare in frigorifero (4 gradi centigradi) su un rotatore.
NOT: Il tempo di fissazione può essere regolato a seconda dell'anticorpo utilizzato. Ad esempio, limitare la fissazione a 1,5 h consentirà di utilizzare con successo l'immunoetichettatura dei terminali post sinaptici quando si utilizza l'anticorpo GluA 2.
3. Decalcificazione dell'osso temporale
- Rimuovere la soluzione PFA e lavare le cocleae con PBS 3x fresco per 5 min ciascuno.
- Aggiungere alla luce le fiale scintillanti 20 mL del 4% di aquilonicadiata (EDTA) (pH 7.4) e conservarle in frigorifero per 48-72 h su un rotatore con agitazione delicata. Modificare la soluzione EDTA ogni giorno fino a quando le cocleae non vengono decalcolate. Controllare se le coclee sono decalcolate toccando la porzione vestibolare ossea con pinze per valutare l'elasticità o semplicemente tagliare un piccolo pezzo dal bordo della porzione vestibolare. Se tale taglio risulta in un pezzo schiacciato, la coclea non viene decalcolata.
NOT: La soluzione EDTA può interferire con l'immunoreazione degli anticorpi primari a seconda della concentrazione della soluzione. Preparare il 4% EDTA in PBS e regolare il pH a 7.4. Per una costante decalcificazione delle ossa temporali, viene utilizzata una soluzione EDTA fresca. - Modificare la soluzione in PBS per la microdissezione al termine della decalcificazione.
NOT: Se le cocleari non sono sufficientemente decalcolate, la dissezione delle coclee non può essere eseguita.
4. Microdisezione dell'epitelio cocleare
NOT: Una volta completata la decalcificazione, la microdissezione dell'epitelio cocleare per l'immunoetichettatura deve essere eseguita il prima possibile. In un piatto Petri pulito da 30 mm contenente PBS, l'orecchio interno è orientato nel modo seguente: in riferimento alla parte superiore (coperchio) del piatto Petri e al fondo, le finestre rotonde e ovali cocleari si affacciano sulla parte superiore. In riferimento al dissettore, la porzione cocleare è orientata verso la parte anteriore (lontano dal dissettore) e la porzione vestibolare verso la parte posteriore (vicino al dissettore). Di seguito vengono descritti in dettaglio i passaggi.
- Tenere la parte vestibolare dell'osso temporale con le pinze e tagliare la curva apicale con il bisturi ad un angolo di 45 gradi, come indicato dalla linea rossa (Figura 1a).
- Tagliare verticalmente lungo la linea di svenimento tra la finestra rotonda e la finestra ovale, come indicato dalla linea rossa (Figura 1b) per separare la coclea dalla parte vestibolare (Figura 1c).
NOT: Questa porzione cocleare contiene le porzioni centrali, basali e uncino dell'epitelio. - Posizionare la porzione cocleare con la curva basale verso il basso e il centro girare verso la parte superiore della piastra Petri e tagliare la capsula ossea e la parete laterale del centro girare verso l'estremità da cui è stata rimossa la sezione apicale, come indicato dalla linea rossa (Figu re 1d,e).
- Continuare il taglio per separare completamente la parte centrale dalle regioni basali e di aggancio (Figura 1f,g).
NOT: La regione gancio della coclea è la fine dell'epitelio cocleare corrispondente alla sensibilità ai toni 48 kHz e superiore nei topi. - Mettere la porzione basale e gancio con il sito della membrana basilare orientata verso il fondo del piatto e tagliare verticalmente il modiolo fuori dalla regione gancio per rimuovere il modiolus come indicato dalla linea rossa verticale (Figura 1g).
NOT: Il modiolo è l'asse centrale a forma conica della coclea che consiste di osso spugnoso e nervi cocleari, nonché il ganglio a spirale. Può essere preferibile eseguire questo taglio con le forbici. - Tagliare le regioni basale e gancio come indicato dall'altra linea rossa nella Figura 1g per separare la porzione di gancio (Figura 1h).
NOT: La coclea è ora stata separata in porzioni apicali, centrali, basali e gancio. I prossimi passi saranno la dissezione finale di ciascuna delle singole curve, utilizzando il turno centrale come esempio. - Tagliare le porzioni relativamente grandi di capsula ossea e tessuto a parete laterale del turno centrale come indicato dalla linea rossa (Figura 1i).
NOT: La parete laterale del condotto cocleare è formata dal legamento a spirale e dalla stria vascolari. - Tenere la parete laterale con pinze per allineare la capsula ossea e la parete laterale con il fondo del piatto Petri e tagliare questi tessuti dal lato della membrana basilare. Quindi appiattire il campione per orientare la superficie della cellula ciliata sensoriale verso l'alto. Tagliare via il resto della capsula ossea e parete laterale (Figura 1j).
- Rimuovere la membrana tectoriale utilizzando pinze per separare completamente la regione centrale (Figura 1k).
- Ripetere i passaggi di 4,7 x 4,9 per le dissezioni finali delle curve o delle regioni rimanenti, come illustrato nella Figura 1l.
- Preparare una vela rotonda da 10 mm per l'adesione dell'epitelio sensoriale. Utilizzare una pipetta per diffondere a mano 0,5 ll di adesivo di cellule e tessuti al centro della vesscio rotonda. Dopo l'essiccazione (3-5 min a RT), mettere i copricopertine in PBS in piatti Petri.
- Attaccare tutti e quattro i pezzi dell'epitelio sensoriale sulla planiglia rotonda da 10 mm nella parabola Petri. Quindi tenere un bordo della copertina per trasferirlo in un piatto di quattro pozzi per immunoetichettatura o immunohistochimica (Figura 1m).
NOTA: la figura 2 illustra la posizione dei tagli principali.
5. Immunolabeling per sinapsi di cocleare
NOT: Il protocollo per l'immunoetichettatura per le sinapsi cocleari seguito in questo studio è stato descritto in precedenza13. I nastri presilpatici sono stati etichettati con un anticorpo CtBP2 (proteina legante topo anti-carboxyl-terminale 2 IgG1, etichettando il dominio B della proteina di scaffolding RIBEYE). I terminali post sinaptici sono stati etichettati con l'anticorpo GluA2 (recettore del topi anti-glutammato 2 IgG2a, etichettatura delle sottounità del recettore AMPA).
- Lavare l'epitelio sensoriale con PBS 3x per 5 min ogni lavaggio in un piatto di quattro pozzetti e quindi aggiungere 2 mL del 2% di surfactant nonionico (cioè Triton-X 100) nel piatto per 30 min a RT su un rotatore.
- Togliere la soluzione surfactant nonionica dal piatto utilizzando una pipetta e aggiungere 100 l di soluzione di blocco contenente 10% siero di capra normale a ogni pozzo per 1 h su un rotatore con agitazione delicata a RT.
- Rimuovere la soluzione di blocco da ogni pozzo, lavare con PBS 3x per 5 min ogni lavaggio sotto agitazione delicata a RT.
- Aggiungere 100 l degli anticorpi primari diluiti con PBS per ogni pozzo: topo anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), topo anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Coprire ogni piatto di quattro pozzi con il coperchio e posizionarlo in un grande contenitore umidificato che protegge dalla luce. Incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore.
NOT: Come opzione, è possibile aggiungere il coniglio anti-miosina VIIa (1:400) per l'immunoetichettatura delle cellule ciliate sensoriali. - Lavare 3x con PBS per 5 min ogni lavaggio con agitazione delicata a RT.
- Aggiungere 100 l degli anticorpi secondari Alexa 594 capra anti-tono IgG1a (1:1,000), Alexa 488 capra anti-topo IgG2a (1:1,000) diluito con PBS per ogni bene. Coprire ogni piatto di quattro pozzi con il coperchio e posizionarlo in un grande contenitore umidificato che protegge dalla luce. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 ore.
NOT: Se si usa la miosina VIIa, aggiungere Alexa 350 capra anti-coniglio (1:200). - Lavare 3x con PBS per 5 min. Quindi, trasferire la vetritta rotonda da 10 mm su una diapositiva con i campioni in cima.
- Aggiungere con cura 8 -L di Fluoro-Gel con il tampone Tris al centro della coverslip. Quindi tenere il bordo di un altro coperchio rotondo da 10 mm con pinze da montare sulla parte superiore, inserendo le due coverlips insieme.
- Utilizzare smalto per sigillare i vetrini, metterli in una cartella di diapositive di cartone, e conservare in frigorifero.
NOT: Se alcuni Fluoro-Gel fuoriescono tra i copricapi durante il montaggio, pulire i bordi dei copricapi prima di sigillare lo scivolo con lo smalto. Le immagini confocali devono essere scattate entro 7 giorni.
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Representative Results
I preparati superficiali dell'epitelio cocleare, in combinazione con l'immunoetichettatura e l'imaging confocale, sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell'udito per lo studio di patologie cocleari, come la quantificazione delle sinapsi del nastro, le cellule ciliate sensoriali, ed espressione proteica nelle cellule ciliate sensoriali5,6,7,8. Anche se la dissezione delle cocleari di topi adulti per i preparativi superficiali non è semplice, i nuovi studenti laureati sono in grado di imparare questo metodo modificato dopo aver praticato con 10-15 orecchie (Figura 1 e Figura 2). Con questa tecnica, in combinazione con l'immunoetichettatura per CtBP2 (un marcatore per nastri presincinaptici) e GluA2 (un marcatore per i terminali post sinaptici), contando le sinapsi nervose IHC/udiriche utilizzando immagini confocali sotto proiezioni la dimensione delle sinapsi del nastro del mouse, è possibile21. Questo è coerente con i risultati pubblicati4,6,13. I preparati superficiali dei topi CBA/J (senza trattamento) all'età di 10-12 settimane immunoetichettati con CtBP2 (rosso) e GluA2 (verde) hanno mostrato che sia i nastri presnapitici che i terminali post sinaptici si trovano al di sotto dei nuclei IHC e sono giustapposti, sinapsi funzionali (Figura 3)6,13.
Con l'etichettatura dei preparati superficiali con diversi anticorpi, è possibile la valutazione della segnalazione molecolare e della struttura nelle cellule ciliate sensoriali. Ad esempio, la figura 4 mostra i risultati per l'immunoetichettatura per la miosina VIIa e la controtendenza con phalloidin e 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI). Sono stati condotti esperimenti di immunoetichettatura parallela con e senza l'adesivo di cellule e tessuti utilizzando soluzioni identiche per valutare se l'adesivo utilizzato interferisce con le immunoreazioni. I preparati di superficie cocleare sono stati immunoetichettati con la miosina VIIa e contromacchiati con phalloidin. Le immagini confocali sono state scattate con un obiettivo di ingrandimento 63x in condizioni identiche e impostazioni di parametro uguali per i guadagni laser e i guadagni del tubo fotomoltiplicatore (PMT). Non c'era differenza nelle immunoreazioni o nell'uniformità con e senza l'adesivo per cellule e tessuti (Figura 5). Utilizzando diversi fissativi, i preparati di superficie hanno fornito la base per la scansione delle immagini di microscopia elettronica (SEM) per la visualizzazione della stereocilia cocleare9. I topi C57BL/6J (senza trattamento) all'età di 6-8 settimane mostrano stereocili a forma di V ben organizzati di OHC in tre file (Figura 6). Inoltre, i preparati di superficie cocleare sono stati utilizzati per determinare il modello di espressione di un gene di rapporto (ad esempio, GFP) e confermare la trasduzione riuscita e identificare i tipi di cellule trasdotte.
Figura 1: Rappresentazione dei passaggi per i preparati alla superficie del mouse per adulti. (a) La capsula ossea cocleare dell'osso temporale si affaccia. La linea rossa indica il primo taglio per separare la svolta apicale. RW - finestra rotonda, Finestra ovale. (b) L'apice è separato dalla coclea come indicato dalla freccia. La linea rossa tra la finestra rotonda e la finestra ovale indica il secondo taglio fatto nella coclea. (c) La porzione cocleare che contiene le regioni centrali, basali e di gancio è separata dalla porzione vestibolare. (d) La porzione cocleare è situata rivolta verso l'alto. La linea rossa indica il terzo taglio, diretto verso la fine da cui è stata rimossa la sezione apicale. (e) La freccia indica lo spazio lasciato dopo il completamento del terzo taglio. (f) Questa immagine mostra la regione centrale. (g) Questa immagine mostra le regioni basali e gancio combinate. La linea rossa verticale indica il taglio tra la regione modiolus e hook. Il taglio tra le regioni basale e gancio è indicato dall'altra linea rossa. (h) Le regioni basali e gancio sono separate come indicato dalle frecce. (i) La regione centrale della capsula ossea è tagliata come indicato dalla linea rossa. (j) L'immagine mostra la regione centrale dopo la rimozione di un lato della capsula ossea. (k) Questa immagine mostra la regione centrale dopo il completamento della dissezione. (l) Tutte e quattro le regioni sono completamente sezionate. (m) Cochlear si trasforma in un coperchio rotondo da 10 mm trasferito in una teglia Petri di quattro pozzetti con le quattro regioni come indicato. Tutte le immagini sono state scattate al microscopio stereo-dissezione a 1,2x, 2,5x e 0,6 volte gli ingrandimenti. Le barre della scala sono indicate in ogni immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Posizione dei tagli principali. L'intera capsula ossea cocleare è stata rimossa. Sono indicate le posizioni dei tagli principali. 1) La posizione in cui viene tagliato il turno apicale. 2) Il sito in cui il turno centrale è separato. 3) Il taglio critico per rimuovere il modiolo. 4) La linea per dividere le regioni basale e gancio. Barra di scala - 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le immagini confocali rivelano l'immunoetichettatura per CtBP2 e GluA2 sui preparati alla superficie del topo adulto. Le aree apicali, centrali e basali sono etichettate. Le immagini confocali di ingrandimento inferiore sono state scattate con una lente 10x. Rosso: CtBP2, verde e GluA2. La barra di scala è stata scattata con una lente da 5, 16 e 32 kHz con un obiettivo da 63x. Viste ingrandite delle aree indicate dai rettangoli bianchi nelle parti apice, al centro e nella base. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Le immagini confocali rivelano l'immunoetichettatura delle cellule ciliate sensoriali di una preparazione superficiale dalla regione da 32 kHz. Tutte le immagini sono state unite proiezioni di stack z. Phalloidin (verde) macchiava la struttura delle tre file di OHC e una riga di IHC. Myosin VIIa (rosso) immunoetichettato tre file di OHC e una fila di IHC. Nuclei di cellule dei capelli macchiati DAPI. Le immagini confocali unite sono state ricostruite per viste laterali di cellule ciliate sensoriali. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I preparati di superficie cocleare con e senza l'adesivo di cellule e tessuti sono stati elaborati in parallelo, immunoetichettati per la miosina VII (rosso) e contromacchiati con phalloidin (verde) utilizzando soluzioni identiche. L'adesivo per cellule e tessuti utilizzato non interferisce con le immunoreazioni. Le immagini confocali sono state scattate con una lente di ingrandimento 63x in condizioni identiche e impostazioni di parametri uguali. Le immagini sono state scattate dalla regione da 32 kHz. L'immunoetichettatura per la miosina VIIa e la colorazione per la phalloidin negli OhC era simile con e senza l'adesivo per cellule e tessuti. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: La microscopia elettronica a scansione mostra tre file di stereocilia OHC da topi C57BL/6J. Sono state scattate immagini dalla regione centrale. (a) Una vista a basso ingrandimento di tre file di OHC. (b) Le immagini ingrandite mostrano tre file di stereocilia OHC ben organizzata che appaiono in forme "V". Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome | ||||||||
| Distanza dall'apice (mm) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| Distanza dall'apice (%) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Frequenze (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tabella 1: Mappatura della sensibilità della frequenza cocleare del topo CBA/J in funzione della distanza dall'apice secondo Muller1 e Viberg e Canlon2.
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Discussion
La microdissezione cocleare dei preparati superficiali a montaggio intero in combinazione con l'immunoetichettatura fornisce uno strumento di base per lo studio delle patologie dell'orecchio interno e dei meccanismi molecolari. Questo metodo di dissezione cocleare del topo adulto modificato utilizzando l'adesivo della cellula e del tessuto semplifica questa difficile procedura.
Anche se questo metodo di preparazione della superficie cocleare modificato è relativamente facile e accessibile, richiede ancora pratica per raggiungere la competenza. Per effettuare i tagli corretti, il dissettore ha bisogno di un'attenta concentrazione. Poiché le cellule ciliate sensoriali cocleari nel turno basale sono così vicine al limbo a spirale, è difficile rimuovere completamente il tessuto limbo per consentire alla preparazione della superficie di giacere completamente piatte, ma le proiezioni confocali possono compensare questo problema. Inoltre, la regione gancio della coclea è ancora la porzione più difficile da sezionare. Possono verificarsi separazioni tra OHC e IHC della regione hook. La regione gancio mostra grandi variazioni anatomiche negli esseri umani ed è importante per l'udito di conduzione ossea22,23. Sulla base della mappatura della frequenza cocleare riportata da Muller1 e Viberg e Canlon2, la regione gancio, a partire da circa 4,7 mm dall'apice, corrisponde alla sensibilità a i toni 48 kHz e superiore (Tabella 1), mentre uditorivo funzionale le valutazioni della perdita dell'udito acquisita nei topi, tra cui la perdita dell'udito indotta dal rumore, l'ipoacusia indotta da aminoglycoside e la perdita dell'udito legata all'età, sono generalmente misurate a 8, 16 e 32 kHz con risposta uditiva del tronco encefamatico (ABR)5,6 ,7,9,24 e da 6 a 45 kHz con distorsione prodotto otoacustica (DPOAE)25. In accordo con Montgomery et al., la distorsione dell'epitelio non è comunemente visibile quando la spirale è divisa in 3-4 pezzi19.
Il metodo modificato qui presentato prevede la sezionazione della spirale cocleare in soli quattro pezzi (apice, metà, curve basali e regione gancio), mentre la tecnica Eaton-Peabody produce sei pezzi18. La tecnica Eaton-Peabody inizia con una sesezione cocleare, che evita di fare tagli tangenziali attraverso l'epitelio per separare prima la svolta apicale dal resto della spirale, come descritto in questa tecnica modificata. Producendo pezzi più piccoli, la tecnica Eaton-Peabody è progettata per ridurre al minimo l'appiattimento necessario per visualizzare un pezzo di grandi dimensioni con un obiettivo di immersione. Infatti, le porzioni più grandi del tessuto facilitano la misurazione della mappatura della frequenza dall'apicale al turno basale, in linea con Montgomery et al.19. Inoltre, una differenza tra questo metodo e Montgomery et al.19 è che il metodo di dissezione cocleare modificato descritto qui impiega un bisturi per la maggior parte dei tagli e solo un passo è fatto con le forbici (cioè, la separazione delle regioni basale e gancio come illustrato nel terzo taglio della Figura 2), mentre Montgomery et al.19 utilizzavano le forbici con un piatto di dissezione rivestito in silicone rivestito di elastomer per i preparati superficiali. Per evitare distorsioni del tessuto, la disconnessione della membrana basilare per rimuovere il modiolo è fondamentale.
Questo protocollo utilizza un adesivo per cellule e tessuti (Tabella dei materiali) per l'adesione dei pezzi di epitelio cocleare alla vessilla rotonda di 10 mm per immunoetichettatura o immunohistochimica, che rende i processi più convenienti ed evita la perdita di tessuti epitelio durante i molteplici fusi delle procedure di immunoetichettatura. L'adesivo di cellule e tessuti è una formulazione di proteine pofenoliche che aderisce a cellule e tessuti ed è stata ampiamente utilizzata in molte tecniche comuni in vitro, tra cui immunohistochimica, ibridazione in situ e immunoassays20. Coerentemente con la nozione che l'adesivo per cellule e tessuti non interferisce con le immunoreazioni, l'immunoetichettatura parallela della miosina VIIa con i preparati superficiali non mostra alcuna differenza di immunoreazioni o uniformità con e senza la cellula e il tessuto Adesivo. Confrontando questi tre metodi di dissezione (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, e il metodo modificato descritto), gli studenti laureati in laboratorio concordano sul fatto che questo metodo modificato utilizzando l'adesivo cellulare e tissutale è più facile da imparare e Master.
In sintesi, la produzione di preparazioni di superficie adulta del topo a montaggio completo è un'abilità di base per la valutazione delle patologie cocleari. Il protocollo modificato descritto per i preparati superficiali dei topi adulti semplifica questa difficile procedura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il progetto di ricerca descritto è stato sostenuto dalla sovvenzione R01 DC009222 dell'Istituto Nazionale di Sordità e Altri Disturbi della Comunicazione, National Institutes of Health. Questo lavoro è stato condotto nel WR Building di MUSC in uno spazio ristrutturato supportato dalla sovvenzione C06 RR014516. Gli animali erano ospitati in strutture animali MUSC CRI supportate dalla sovvenzione C06 RR015455 dell'Extramural Research Facilities Program del National Center for Research Resources. Gli autori ringraziano il Dr. Jochen Schacht per i suoi preziosi commenti e Andra Talaska per la revisione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
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