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Neuroscience

成年小鼠中的科利耳表面制备

doi: 10.3791/60299 Published: November 6, 2019

Summary

本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法,该方法需要去钙化和使用细胞和组织粘合剂,将耳蜗上皮片粘附到10毫米圆盖滑片上,用于成年小鼠耳蜗的免疫组织化学。

Abstract

耳蜗的听觉处理取决于美发毛细胞的完整性。在一生中,听力损失可以从多种病因中获得,例如暴露于过度噪音、使用耳毒性药物、细菌或病毒性耳部感染、头部受伤和老化过程。感觉毛细胞的丧失是获得性听力损失的一个常见的病理特征。此外,内发细胞突触可能由轻度侮辱损坏。因此,耳蜗上皮的表面制剂,结合免疫标记技术和共聚焦图像,是研究耳蜗病理学,包括带状突触和感觉毛细胞损失的非常有用的工具,头发细胞和支持细胞中蛋白质水平的变化,毛细胞再生,以及报告基因表达(即GFP)的测定,用于验证转导细胞类型的成功转导和鉴定。耳蜗,内耳的骨螺旋形结构,持有听觉感觉端器官,Corti(OC)的器官。OC 中的感官毛细胞和周围的支撑细胞包含在耳蜗管中,并停留在罗勒膜上,以非同位素方式组织,在基底进行高频检测,在顶点进行低频检测。随着分子和遗传信息的提供,以及通过敲除和敲击技术操纵基因的能力,小鼠在生物学研究,包括听力科学中得到了广泛的应用。然而,成年小鼠耳蜗是微小的,和耳蜗上皮被封装在骨迷宫,使微解剖困难。虽然解剖技术已经在许多实验室开发和使用,这种使用细胞和组织粘合剂的经过修改的微解剖方法更容易和更方便。它可用于所有类型的成年小鼠耳蜗后去钙化。

Introduction

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耳蜗致力于声音的检测,并负责听力。耳蜗管盘绕在骨迷宫的螺旋形状,并持有听觉感觉端器官,Corti (OC) 的器官。OC位于巴西拉膜上,组成耳蜗上皮,在成年CBA/CaJ小鼠1,2中解开时,其长度约为5.7毫米。由于 OC 具有在基部检测到的高频和顶点的低频,因此耳蜗上皮通常分为三个部分进行分析比较:对应于低的尖心、中间和基底转,中检和高频检测。除了一系列支持细胞外,OC 由一排内毛细胞 (IHC) 组成,这些细胞位于地中海,三行外毛细胞 (OHC)相对于耳蜗螺旋横向位于。

正确的听觉处理取决于耳蜗中感觉毛细胞的完整性。感觉毛细胞受损或丧失是获得性听力损失的常见病理特征,由多种病因引起,如暴露于过度噪音、使用耳毒性药物、细菌或病毒性耳部感染、头部损伤和老化过程3.此外,内发细胞/听觉神经突触的完整性和功能可能受到轻度侮辱4的损伤。随着分子和遗传信息的提供,以及通过敲除和敲击技术对基因的操纵,小鼠在听力科学中得到了广泛的应用。虽然成年小鼠耳蜗是微小的,耳蜗上皮被骨质胶囊包围,导致技术难度的微分泌,但上皮的表面制剂与免疫标记或免疫组化学结合使用和共聚焦图像已广泛用于研究耳蜗病理学,包括带状突触和毛细胞的损失,感觉毛细胞和支持细胞中蛋白质水平的变化,以及毛细胞再生。科利耳表面制剂也用于确定报告基因(即GFP)的表达模式,确认成功的转导和识别转导细胞类型。这些技术以前曾用于研究分子机制基础噪声诱发听力损失使用成人CBA/J小鼠5,6,7,8,9。

与使用石蜡节或冷冻节进行免疫组织化学,以获得含有三个外毛细胞 (OHC) 和一个内发细胞 (IHC) 的耳蜗小横截面部分,耳蜗表面制剂允许用于计算感觉毛细胞和带状突触的OC的整个长度的可视化,以及与特定功能频率对应的感官毛细胞的免疫标记。表1显示了听力频率的映射,根据穆勒1和维伯格和Canlon1,2的研究,在成年CBA/J小鼠的耳蜗螺旋长度上,作为距离的函数。蜗表面制剂已广泛用于研究耳蜗病4,5,6,7,8,9,10 1112131415。全山耳蜗解剖法最初在1966年由汉斯·恩斯特罗姆编辑的一本书中描述。这项技术后来被改进,并适应各种物种,如文献中描述的一些科学家在听力科学10,11,12,13, 15,17和由伊顿皮博迪实验室在马萨诸塞州的眼睛和耳朵18。最近,蒙哥马利等人又报道了另一种耳蜗解剖方法。耳蜗的微解剖是耳蜗表面制剂的一个基本和关键步骤。然而,解剖小鼠耳蜗是一个技术挑战,需要大量练习。这里,提出了一种改良的耳蜗表面制备方法,用于成年小鼠耳蜗。该方法要求去化和使用细胞和组织粘合剂(即细胞-塔克)将耳蜗上皮片粘附到10毫米圆形盖玻片上,用于免疫标记。细胞和组织胶粘剂已广泛应用于免疫组织化学20。这种改良的耳蜗微解剖方法与之前报道的18、19相比相对简单。

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Protocol

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南卡罗来纳医科大学(MUSC)机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了所有涉及10-12周雄性成年CBA/J小鼠和6-8周C57BL/6J小鼠的研究方案。动物护理由MUSC实验室动物资源司监督。

注:对于下面介绍的程序,小鼠通过腹内注射用氯胺酮(100毫克/千克)和木拉津(10毫克/千克)麻醉。老鼠被斩首后,动物不再对痛苦的刺激,如脚趾捏作出反应。

1. 提取临时骨骼

  1. 用手术剪刀(17厘米长)立即斩首小鼠,在前部拉皮肤后,用剪刀从头骨的后部沿头骨中心线向前切开头骨。
  2. 使用钳子取出脑组织,用拇指和食指手动取出三个月或三个月以上小鼠的时态骨骼。使用小手术剪刀(11厘米长)切割3个月以下小鼠的骨骼。
  3. 将时间骨放入含有冰冷新鲜4%甲醛(PFA)溶液的培养皿(直径30毫米),溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,pH 7.4。
    注:在固定时间骨骼之前,准备新鲜的 4% PFA 溶液并将 pHH 调整到 7.4,因为 PFA 溶液的 pH 平衡不当会降低免疫标记的质量。

2. 固定和灌注

  1. 从椭圆形窗户上取下胶带,用大小#5钳刺穿圆形窗膜。在立体解剖显微镜下,使用连接到 1 mL 注射器的 27 G 针头,将一个小孔插入耳蜗顶。
  2. 通过圆形和椭圆形窗户轻轻缓慢地将 4% PFA 溶液注入耳蜗,直到溶液从顶点的小孔中流出。将耳蜗(每瓶一或两个耳蜗)转移到含有10 mL 4%PFA溶液的20 mL体积闪烁小瓶。
  3. 在室温 (RT) 下轻轻搅拌闪烁小瓶 2 小时,并在冰箱 (4 °C) 中过夜。
    注:固定时间可根据使用的抗体进行调整。例如,将固定时间限制在 1.5 小时,将有助于在使用 GluA 2 抗体时成功对突触后终端进行免疫标记。

3. 临时骨骼的去化

  1. 取出 PFA 溶液,用新鲜的 PBS 3x 清洗耳蜗,每次 5 分钟。
  2. 将 20 mL 的 4% 乙烯二甲酸二钠盐 (EDTA) 溶液 (pH 7.4) 加入闪烁小瓶中,并在带温和搅拌的旋转器上保存在冰箱中 48-72 小时。每天更换 EDTA 溶液,直到耳蜗去化。检查耳蜗是否通过接触骨前庭部分,用钳子评估弹性或简单地从前庭部分的边缘切一小块。如果这种切割导致碎块,耳蜗不去化。
    注:EDTA溶液可能会干扰原抗体的免疫反应,具体取决于溶液浓度。在 PBS 中制备 4% EDTA 并将 pHH 调整到 7.4。为了一致的时间骨骼去钙化,使用新鲜的EDTA溶液。
  3. 在去钙化完成后,将溶液更改为PBS进行微解剖。
    注:如果耳蜗没有充分去化,则无法对耳蜗进行解剖。

4. 耳蜗皮的微解剖

注:一旦去钙化完成,需要尽快进行用于免疫标记的耳蜗上皮的微分泌。在含有 PBS 的干净 30 mm 培养皿中,内耳以下列方式定向:参照培养皿的顶部(盖)和底部,耳蜗圆形和椭圆形窗户朝上。在除偏方面,耳蜗部分朝向前部(远离除界),前庭部分朝向背面(靠近除界)。下面详细介绍了这些步骤。

  1. 用钳子握住临时骨骼的前庭部分,用手术刀以 45° 角切割手术刀,如红线所示(图 1a)。
  2. 沿着圆形窗口和椭圆形窗口之间的微弱线垂直切割,如红线(图 1b)所示,将耳蜗和前庭部分分开(图 1c)。
    注:耳蜗部分包含上皮的中间部分、基底部分和钩部分。
  3. 放置耳蜗部分与基础转向底部和中间转向到培养皿的顶部,并削减骨胶囊和侧壁的中间转向从该部分被移除的末端,如红线(菲古)所示a 1d,e
  4. 继续切割,将中间部分与基底和钩区域完全分离(图1f,g)。
    注:耳蜗的钩区是耳蜗上皮的末端,对应于48 kHz和更高的音调灵敏度。
  5. 将基底和钩部分与面向盘子底部的巴西拉膜位点一起,垂直切断钩区,以去除垂直红线指示的模子(图1g)。
    注:耳蜗是耳蜗的圆锥形中轴,由海绵骨和耳蜗神经以及螺旋形结条组成。最好用剪刀进行这种切割。
  6. 切基和钩区域,如图 1g中所示的另一条红线指示分隔挂钩部分(图 1h)。
    注:耳蜗现已分为尖、中、基和钩部分。接下来的步骤是最后解剖每个单独的回合,使用中间转弯作为示例。
  7. 按照红线指示,切掉中圈中相对较大的骨胶囊和侧壁组织(图1i)。
    注:耳蜗管的侧壁由螺旋韧带和纹状血管形成。
  8. 用钳子握住侧壁,使骨胶囊和侧壁与培养皿底部对齐,并从巴西拉膜侧切割这些组织。然后平展标本,使感觉性毛细胞表面向上定向。修剪掉骨质胶囊和侧壁的其余部分 (图 1j)。
  9. 使用钳子取出膜,以完全分离中间区域 (图 1k)。
  10. 对剩余转弯或区域的最终解剖重复步骤 4.7_4.9,如图1l所示。
  11. 准备一个10毫米圆盖玻片,用于附着力感觉上皮。使用移液器将 0.5 μL 的细胞和组织粘合剂涂抹在圆形盖玻片的中心。干燥后(RT时3~5分钟),将盖玻片放入培养皿中。
  12. 在培养皿中的 10 mm 圆形盖玻上粘上所有四块感官上皮。然后握住盖玻片的一个边缘,将其转移到四井盘中,用于免疫标记或免疫组织化学(图1m)。
    注:图 2说明了主要切割的位置。

5. 耳蜗突起的免疫标签

注:在这项研究中遵循的耳蜗突触免疫标签方案已经描述了13。预突触带被标记为CtBP2抗体(小鼠抗血碱基终端结合蛋白2IgG1,标记RIBEYE支架蛋白的B域)。后突触终端被标记为GluA2抗体(小鼠抗谷氨酸受体2IgG2a,标记AMPA受体的亚单位)。

  1. 用PBS 3x洗5分钟,每次在四井盘中洗涤,然后将2 mL的2%非离子表面活性剂(即Triton-X 100)加入盘中30分钟,在RT旋转器上。
  2. 使用移液器从盘中取出非离子表面活性剂溶液,并在RT的旋转器上加入含有10%正常山羊血清的100μL阻断溶液,每次1小时。
  3. 从每口井中取出阻滞溶液,在RT的温和搅拌下用PBS 3x洗涤5分钟。
  4. 在每个井中加入100 μL用PBS稀释的主要抗体:小鼠抗GluA2 IgG2a(1:2,000),小鼠抗CtBP2 IgG1(1:400)。用盖子盖住每个四井盘,放入一个大的加湿容器中,防止光线照射。在37°C孵育24小时。
    注:作为一种选择,可以添加用于免疫标记感觉毛细胞的兔抗肌苷VIIa(1:400)。
  5. 用PBS洗涤3次,每次洗涤5分钟,在RT时轻轻搅拌。
  6. 加入100 μL的二级抗体Alexa 594山羊抗小鼠IgG1a(1:1,000),Alexa 488山羊抗小鼠IgG2a(1:1,000)稀释与PBS到每个井。用盖子盖住每个四井盘,放入一个大的加湿容器中,防止光线照射。在37°C孵育2小时。
    注:如果使用肌苷 VIIa,则添加 Alexa 350 山羊抗兔子 (1:200)。
  7. 用 PBS 清洗 3 次,5 分钟。然后,将 10 mm 圆形盖玻片转移到顶部样品的幻灯片上。
  8. 小心地将 8 μL 的氟凝胶与 Tris 缓冲液添加到盖玻片的中心。然后握住另一个 10 mm 圆形盖玻片的边缘,用钳子安装在顶部,将两个盖玻片夹在一起。
  9. 使用指甲油密封幻灯片,将它们放入纸板幻灯片文件夹,并存放在冰箱中。
    注:如果在安装过程中,某些氟胶在盖玻片之间泄漏,请先清洁盖玻片的边缘,然后再用指甲油密封滑片。共聚焦图像需要在 7 天内拍摄。

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Representative Results

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耳蜗上皮的表面制剂,结合免疫标记和共聚焦成像,已广泛应用于听力科学,用于研究耳蜗病理学,如色带突触的定量,感觉毛细胞,和感觉毛细胞5,6,7,8的蛋白质表达。虽然对成年小鼠耳蜗的表面准备进行解剖并不简单,但新生在练习10-15只耳朵后能够学习这种改良方法(图1图2)。通过此技术,结合 CtBP2(前突触带的标记)和 GluA2(突触后终端的标记)的免疫标记,使用 Z 投影下的共聚焦图像计算 IHC/听觉神经突触,间隔为 0.25 μm,基于大小小鼠带突触,是可能的21。这与已公布的结果4、6、13一致。在10-12周免疫标记下与CtBP2(红色)和GluA2(绿色)免疫的CBA/J小鼠(未经治疗)的表面制剂表明,前突触带和突触后端子均位于IHC核下方,并并列,表明功能突触 (图 36,13.

通过用不同抗体对表面制剂进行免疫标记,可以评估感觉毛细胞中的分子信号和结构。例如,图 4显示了肌苷 VIIa 的免疫标记结果,以及用 phalloidin 和 4',6-二酰胺-2-苯胺(DAPI)进行反染色的结果。使用相同溶液进行带或不使用细胞和组织粘合剂的平行免疫标记实验,以评估所使用的粘合剂是否干扰免疫反应。耳蜗表面制剂用肌苷VIIa进行免疫标记,并反染了磷球素。在相同的条件下,使用 63 倍放大镜头拍摄共聚焦图像,并采用相等的参数设置,用于激光增益和光电倍增管 (PMT) 增益。细胞和组织粘合剂的免疫反应或均匀性没有差异(图5)。表面制剂使用不同的固定剂,为扫描电子显微镜(SEM)图像提供了对耳蜗立体纤9的可视化的基础。C57BL/6J小鼠(未经治疗)在6-8周的年龄显示三排OHCs的V形立体纤(图6)。此外,耳蜗表面制剂已用于确定报告基因(即GFP)的表达模式,并确认成功的转导和识别转导细胞类型。

Figure 1
图1:成人小鼠表面准备步骤的描述。a) 时间骨的耳蜗骨胶囊朝上.红线表示要分离圆锥形转弯的第一个切口。RW = 圆形窗口,OW = 椭圆形窗口。(b) 顶点与耳蜗分离,如箭头所示。圆形窗口和椭圆形窗口之间的红线表示在耳蜗中进行的第二次切割。(c) 包含中间、基底和钩区的耳蜗部分与前庭部分分开。(d) 耳蜗部分朝上。红线表示第三个切口,指向从其移除的圆锥部分的末端。(e) 箭头表示完成第三次切割后留下的间隙。(f) 这张图片显示了中间区域.(g) 此图显示了基底和钩区的组合区域。垂直红线表示摩洛图斯和钩区之间的切口。基底区域和挂钩区域之间的切口由另一条红线指示。(h) 底状和钩状区域按箭头指示分离。(i) 骨胶囊的中间区域被红线所指示。(j) 图片显示骨胶囊一侧取出后的中间区域。(k) 此图显示解剖完成后的中间区域。(l) 所有四个区域都完全被解剖。(m) 科利耳将贴在10毫米圆盖玻片上,并转移到四井培养皿中,如所示,有四个区域。所有图像均以1.2倍、2.5倍和0.6倍的放大倍率在立体解剖显微镜下拍摄。比例条在每个图像中都显示。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:主要切割的位置。整个耳蜗骨胶囊被移除。指示主要削减的位置。1) 切割锥形转弯的位置。2) 中间转弯分开的站点。3) 关键切口,以去除模皮。4) 划分基底和钩区域的线。比例尺 = 0.5 mm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:共聚焦图像显示成人小鼠表面制剂上CtBP2和GluA2的免疫标签。标记的 apical、中间和基础区域。低倍率共聚焦图像是使用 10 倍镜头拍摄的。红色 = CtBP2,绿色 = GluA2。比例尺 = 100 μm. 使用 63x 镜头拍摄了 5、16 和 32 kHz 区域的共聚焦图像。由顶点、中间和基部分中的白色矩形指示的区域的放大视图。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:共聚焦图像显示来自32kHz区域表面制剂的感官毛细胞的免疫标记。所有图像都合并了 Z 堆栈投影。Phalloidin(绿色)染色了三排OHC和一排IHC的结构。肌苷 VIIa (红色) 免疫标记三行 OHC 和一行 IHC。DAPI染色的发细胞核。合并的共聚焦图像被重建为感觉毛细胞的侧视图。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:使用细胞和组织粘合剂的科利耳表面制剂进行平行处理,免疫标记为肌苷VII(红色),并使用相同的溶液与磷球素(绿色)进行反染色。使用的细胞和组织粘合剂不会干扰免疫反应。在相同的条件下和相等的参数设置下,使用 63 倍放大镜头拍摄共聚焦图像。图像是从 32 kHz 区域拍摄的。肌苷VIIa的免疫标记和OHCs中phalloidin的染色与细胞和组织粘合剂相似。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6:扫描电子显微镜显示来自C57BL/6J小鼠的三排OHC立体纤。图像是从中间区域拍摄的。(a) 三行 OHC 的低放大倍率视图.(b) 放大的图像显示三排组织良好的 OHC 立体形图,以"V"形出现。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

名字
与顶点的距离(毫米) 0.4 1 2.4 3.3 3.9 4.7 5.7
与顶点的距离 (%) 7.7 18 43 54 68 82 100
频率(千赫) 6 8 16 22 32 48

表1:根据穆勒1和维伯格和坎隆2,将CBA/J小鼠耳蜗频率灵敏度作为与顶点距离的函数进行映射。

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Discussion

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全座表面制剂的耳蜗微分泌与免疫标签相结合,为研究内耳病理和分子机制提供了基本工具。这种改性成人小鼠耳蜗解剖方法使用细胞和组织粘合剂简化了这一困难的过程。

虽然这种经过修改的耳蜗表面制备方法相对容易和容易获得,但它仍然需要练习才能达到熟练程度。为了进行正确的削减,分部门需要仔细集中。由于路耳蜗感觉毛细胞在基底转弯是如此接近螺旋边缘,很难完全去除边缘组织,使表面准备完全平,但共聚焦Z投影可以弥补这个问题。此外,耳蜗的钩区仍然是最难解剖的部分。可能发生钩区域的 OHC 和 IMC 之间的分离。钩区显示人类的解剖变化很大,对骨传导听力22、23很重要。根据穆勒1和维伯格和Canlon2报告的耳蜗频率映射,钩区从顶点开始约4.7毫米,对应于48 kHz音调和更高音调的灵敏度(表1),而听觉功能对小鼠的后天性听力损失的评估,包括噪音引起的、氨基糖苷引起的听力损失和与年龄相关的听力损失,一般在8、16和32 kHz时测量,同时使用听觉脑干反应(ABR)5,6 79,24和从 6-45 kHz 与失真产物声发射 (DPOAE)25.与蒙哥马利等人一致,当螺旋被分为3⁄4片19时,通常看不到上皮的变形。

这里提出的修改方法涉及将耳蜗螺旋解剖成四块(顶、中、基、钩区域),而伊顿-皮博迪技术则产生六件18。伊顿-皮博迪技术从耳蜗双截面开始,避免通过上皮进行切线切割,从而首先将螺旋体的切口与螺旋的其余部分分开,如此修改技术中所述。通过生产较小的件,伊顿皮博迪技术旨在最小化查看具有浸入目标的大块所需的展平。事实上,组织的更大部分有助于测量频率映射从顶向基底转弯,符合蒙哥马利等人19。此外,这种方法与蒙哥马利等人19年的区别在于,本文描述的改良耳蜗解剖方法使用手术刀进行大多数切割,只有一步用剪刀完成(即,将基底和钩区分离为图2的第三次切割中所示,而蒙哥马利等人19号使用剪刀与硅胶弹性体涂层解剖盘的表面制剂。为了避免组织变形,断开罗勒膜以去除模曲至关重要。

本方案使用细胞和组织粘合剂(材料表)将耳蜗上皮粘附到10毫米圆形盖玻片上,用于免疫标记或免疫组织化学,使过程更加方便,避免损失免疫标记程序多次处理期间,上皮组织。细胞和组织粘合剂是多酚蛋白的配方,附着在细胞和组织上,已广泛应用于许多常见的体外技术,包括免疫组织化学、原位杂交和免疫测定20。与细胞和组织粘合剂不干扰免疫反应的概念一致,肌苷 VIIa 与表面制剂的平行免疫标记与细胞和组织和无细胞和组织没有免疫反应或均匀性差异胶粘剂。比较这三种解剖方法(伊顿-皮博迪实验室,蒙哥马利等人19,和修改方法描述),实验室的研究生同意,这种修改的方法使用细胞和组织粘合剂更容易学习和主人。

总之,生产全座成年小鼠表面制剂是评价耳蜗病理学的基本技能。成人小鼠表面制剂的改良协议简化了这一困难的过程。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

所述研究项目得到了国家卫生研究院耳聋和其他通信障碍研究所R01 DC009222的资助。这项工作在MUSC的WR大楼内进行,在授予C06 RR014516支持的翻新空间内进行。动物被安置在MUSC CRI动物设施中,得到国家研究资源中心校外研究设施计划提供的C06 RR015455的资助。作者感谢约琴·沙赫特博士的宝贵评论和安德拉·特拉斯卡对手稿的校对。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm Rund Coverslips Microscopy products for science and industry 260367
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 Thermo Fisher Scientific A-21131
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 Thermo Fisher Scientific A-21125
Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A11012
Carboard Micro Slide Trays Fisher Scientific 12-587-10
Cell-Tak BD Biosciences 354240
Corning Petri Dishes Fisher Scientific 353004
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
Dumont #5 Forceps FST fine science tools 11251-20
EDTA Disodium Salt Sigma-Aldrich E5134
Fluoro-gel with Tris Buffer Electron Microscopy Sciences 17985-10
Four-well Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 627170
Goat Anti-myosin VIIa Antibody Proteus Biosciences 25-6790
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse Anti-CtBP2 Antibody BD Biosciences #612044
Mouse Anti-Glu2R Antibody Millipore MAB397
Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 31872
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Scalpel VWR 100491-038
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15001-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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成年小鼠中的科利耳表面制备
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Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).More

Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).

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