Summary
Denne artikel præsenterer en modificeret cochlear-overflade forberedelsesmetode, der kræver afkalkning og brug af en celle og vævsklæber til at overholde delene af cochlear epitel til 10 mm runde Cover sedler til immun histokemi i voksne mus cochleae.
Abstract
Auditiv behandling i cochlea afhænger af integriteten af de mekanisosensoriske hårceller. Over et helt liv kan høretab erhverves fra talrige ætiologier såsom udsættelse for overdreven støj, brug af ototoksisk medicin, bakterielle eller virale øreinfektioner, hovedskader og aldringsprocessen. Tab af sensoriske hårceller er en fælles patologisk træk ved de sorter af erhvervet høretab. Desuden kan den indre hårcelle synapse blive beskadiget af milde fornærmelser. Derfor er overflade præparater af cochlear epithelia, i kombination med immunolabeling teknikker og konfokale billeder, et meget nyttigt værktøj til undersøgelse af cochlear-patologier, herunder tab af bånd synapser og sensoriske hårceller, ændringer i protein niveauer i hårceller og understøttende celler, hårcelle regenerering og bestemmelse af rapportens genekspression (dvs. GFP) til verifikation af vellykket transduktion og identifikation af transducerede celletyper. Cochlea, en Bony spiralformet struktur i det indre øre, besidder den auditive sensoriske ende orgel, orgel Corti (OC). Sensoriske hårceller og omgivende støtte celler i oC er indeholdt i cochlear kanalen og hviler på basilær membranen, organiseret i en tonotopisk mode med højfrekvens detektering, der forekommer i basen og lav frekvens i spidsen. Med tilgængeligheden af molekylære og genetiske oplysninger og evnen til at manipulere gener ved knockout og Knock-in teknikker, mus har været meget anvendt i biologisk forskning, herunder i hørelse videnskab. Men den voksne mus cochlea er minimal, og cochlear epitel er indkapslet i en knogle labyrint, hvilket gør microdissection vanskelig. Selv om dissektion teknikker er blevet udviklet og anvendes i mange laboratorier, denne modificerede microdissection metode ved hjælp af celle og væv klæbemiddel er lettere og mere bekvemt. Det kan bruges i alle typer af voksne mus cochleae efter afkalkning.
Introduction
Cochlea er dedikeret til påvisning af lyd og ansvarlig for hørelse. Cochlear kanalen er oprullet i en spiralform i knogle labyrinten og holder det auditive sensoriske ende organ, Corti-organet (OC). OC hviler på basilarmembranen, som udgør cochleepitel, med en længde på ca. 5,7 mm, når den ikke er coiled i voksne CBA/CAJ mus1,2. Fordi OC er tonotopisk organiseret med høje frekvenser detekteret i basen og lave frekvenser i spidsen, er cochleepitel ofte opdelt i tre dele til analytiske sammenligninger: apical, midterste og basal drejninger svarende til lav, henholdsvis mellem-og højfrekvens detektering. Ud over en række understøttende celler består OC af en række af indvendige hårceller (Ihc'er), der er placeret medielt og tre rækker af ydre hårceller (Ohc'er) placeret sideværts med hensyn til cochlear spiral.
Korrekt auditiv behandling afhænger af integriteten af de sensoriske hårceller i cochlea. Beskadigelse eller tab af sensoriske hårceller er et almindeligt patologisk træk ved erhvervet høretab, forårsaget af talrige ætiologier såsom udsættelse for overdreven støj, brug af ototoksisk medicin, bakterielle eller virale øreinfektioner, hovedskader og den aldrende proces3. Derudover kan integriteten og funktionen af den indre hårcelle/Auditive nerve synapser blive forringet af milde fornærmelser4. Med tilgængeligheden af molekylære og genetiske oplysninger og manipulation af gener ved knockout og Knock-in teknikker, har mus været meget udbredt i hørelse videnskab. Selvom den voksne mus cochlea er minuscule og cochlear epitel er omgivet af en knogle kapsel resulterer i teknisk vanskelige mikrodissektioner, overflade præparater af epitel i kombination med immunolabeling eller Immunhistokemi og konfokale billeder er blevet bredt anvendt til undersøgelse af cochlear-patologier, herunder tab af bånd synapser og hårceller, ændringer i niveauer af proteiner i sensoriske hårceller og understøttende celler og hårcelle regenerering. Cochlear-overflade præparater er også blevet brugt til at bestemme mønstret for ekspression af reporter gener (dvs. GFP) og bekræfte vellykket transduktion og identificere transducerede celletyper. Disse teknikker er tidligere blevet anvendt til studiet af molekylære mekanismer underliggende støj-induceret høretab ved hjælp af voksne CBA/J mus5,6,7,8,9.
I modsætning til immun histokemi ved brug af paraffin sektioner eller kryosektioner for at opnå små tværsnits dele af cochlea, der indeholder tre ydre hårceller (Ohc'er) og en inderhårcelle (IHC) på hver sektion, giver cochlear-overflade præparater visualisering af hele længden af OC for at tælle sensoriske hårceller og bånd synapser og immunolabeling af sensoriske hårceller svarende til specifikke funktionelle frekvenser. Tabel 1 viser kortlægningen af høre frekvenser som en funktion af afstanden langs cochlear spiralens længde i voksne CBA/J-mus i henhold til undersøgelser fra Muller1 og Viberg og canlon1,2. Cochlear-overflade præparater er blevet anvendt i vid udstrækning til undersøgelse af cochlear-patologier4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den samlede cochlear dissektion-metode blev oprindelig beskrevet i en bog redigeret af hans engstrom i 196616. Denne teknik blev efterfølgende raffineret og tilpasset til en række forskellige arter som beskrevet i litteraturen af en række videnskabsmænd i høre videnskab10,11,12,13, 15,17 og af Eaton-Peabody Laboratories i Massachusetts Eye og ear18. For nylig blev en anden cochlear dissektion-metode rapporteret af Montgomery et al.19. Microdissection af cochlea er et vigtigt og kritisk skridt for cochlear-overflade præparater. Men det er en teknisk udfordring at dissekende mus cochleae, og det kræver stor praksis. Her præsenteres en modificeret cochlear-overflade forberedelsesmetode til brug i en voksen mus cochleae. Denne metode kræver afkalkning og brug af celle-og vævsklæber (dvs. celle-tak) for at overholde delene af cochlear epitel til 10 mm runde dæksedler til immunolabeling. Celle-og vævsklæber er blevet anvendt i vid udstrækning til immun histokemi20. Denne modificerede cochlear microdissection metode er relativt enkel i forhold til de tidligere rapporterede18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forskningsprotokoller, der involverer mandlige voksne CBA/J mus i en alder af 10 – 12 uger og C57BL/6J mus i en alder af 6 – 8 uger blev godkendt af den institutionelle Animal Care og brug Committee (IACUC) på Medical University of South Carolina (MUSC). Dyrepasning var under tilsyn af fordelingen af laboratoriets dyreressourcer hos MUSC.
Bemærk: For procedurerne præsenteret nedenfor, er mus bedøvet med ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) via intraperitoneale injektioner. Mus er halshugget efter dyret ikke længere reagerer på smertefulde stimuli, såsom en tå knivspids.
1. udvinding af timelige knogler
- Decapitate musen umiddelbart postmortem med kirurgisk saks (17 cm lang) og skær kraniet knogle med en saks fra det bageste aspekt fremad langs midterlinjen af kraniet efter at udsætte kraniet knogle ved at trække huden anteriorly.
- Fjern hjernevæv ved hjælp af pincet og manuelt fjerne de tidsmæssige knogler med tommelfingeren og pegefingeren for mus tre måneder eller ældre. Brug lille kirurgisk saks (11 cm lang) til at skære den tidsmæssige knogle af mus yngre end tre måneder gammel.
- Sæt den tidsmæssige knogle i en Petri skål (30 mm i diameter) indeholdende iskold frisk 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning opløst i fosfat-bufferet saltvand (PBS), pH 7,4.
Bemærk: Forbered frisk 4% PFA opløsning og justere pH til 7,4 lige før fastsættelse af de tidsmæssige knogler, fordi forkert pH-afbalancering af PFA opløsning vil nedsætte kvaliteten af immunolabeling.
2. fiksering og perfusion
- Fjern hæklerne fra det ovale vindue og punktere den runde vindues membran med størrelse #5 pincet. Under en stereo dissektion mikroskop gør et lille hul i spidsen af cochlea ved hjælp af en 27 G nål tilsluttet en 1 ml sprøjte.
- Forsigtigt og langsomt perfuse cochlea med 4% PFA opløsning via de runde og ovale vinduer, indtil opløsningen skyller ud af det lille hul i spidsen. Cochlea overføres (en eller to cochleae pr. hætteglas) til 20 mL volumen scintillationshætte glas indeholdende 10 mL 4% PFA-opløsning.
- Du skal forsigtigt omryste scintillationshætte glassene ved stuetemperatur (RT) i 2 timer og lade natten ligge i køleskab (4 °C) på en rotator.
Bemærk: Fikserings tidspunktet kan justeres afhængigt af det anvendte antistof. For eksempel, begrænse fiksering til 1,5 h vil give mulighed for en vellykket immunolabeling af post synaptisk terminaler, når du bruger glua 2 antistof.
3. afkalkning af den tidsmæssige knogle
- Fjern PFA-opløsningen, og vask cochleae med frisk PBS 3x i 5 minutter hver.
- Der tilsættes 20 mL 4% ethylenediaminetraeddikesyre dinatriumsalt (EDTA) (pH 7,4) til scintillationshætte glasset og opbevares i køleskab i 48 – 72 timer på en rotator med blid agitation. Den daglige EDTA-opløsning ændres, indtil cochleae er afkalkerret. Kontrollér, om cochleae er afkaldet ved at berøre den benede vestibulære del med pincet for at vurdere elasticiteten eller blot klippe et lille stykke fra kanten af den vestibulære del. Hvis sådanne snit resulterer i et knust stykke, er cochlea ikke afkalkede.
Bemærk: EDTA-opløsningen kan interferere med samlet af primære antistoffer afhængigt af opløsningen koncentration. Forbered 4% EDTA i PBS og Juster pH til 7,4. For konsekvent afkalkning af temporale knogler anvendes frisk EDTA opløsning. - Skift opløsningen til PBS for microdissection efter afkalkning er afsluttet.
Bemærk: Hvis cochleae ikke er tilstrækkeligt afkalcificeret, kan dissektion af cochleae ikke udføres.
4. mikrodissektion af cochlear epitel
Bemærk: Når afkalkning er afsluttet, skal mikrodissektion af cochlear epitel til immunolabeling udføres så hurtigt som muligt. I en ren 30 mm Petri skål, der indeholder PBS, er det indre øre orienteret på følgende måde: med henvisning til Petri parabens top (låg) og bund, vender cochlears runde og ovale vinduer øverst. I forhold til dissector er cochlear delen orienteret mod fronten (væk fra dissector) og vestibulær del mod bagsiden (nær dissector). I det følgende beskrives trinnene i detaljer.
- Hold den vestibulære del af den temporale knogle med pincet og skær den apikale drejning med skalpel i en 45 ° vinkel som angivet af den røde linje (figur 1a).
- Skær lodret langs den svage linje mellem det runde vindue og det ovale vindue, som indikeret med den røde linje (figur 1b) for at adskille sneglen fra den vestibulære del (figur 1c).
Bemærk: Denne cochlear portion indeholder de midterste, basale og krog dele af epitel. - Placer cochlear-delen med den basale drejning mod bunden og den midterste drejning mod toppen af Petri skålen, og skær knogle kapslen og sidevæggen i midterdreje retningen mod enden, hvorfra den apikale sektion blev fjernet, som indikeret af den røde linje (Figu re 1d, e).
- Fortsæt med at skære til helt adskille den midterste del fra basal og krog regioner (figur 1f, g).
Bemærk: Krogen regionen af cochlea er enden af cochleepitel svarende til følsomhed over for toner 48 kHz og højere i mus. - Sæt basal-og krog delen med basilær-membran området orienteret mod bunden af skålen, og skær lodret modiolus ud af krog regionen for at fjerne modiolus som angivet af den lodrette røde linje (figur 1g).
Bemærk: Modiolus er den koniske formede centrale akse i cochlea, der består af svampet knogle og cochlear nerve samt spiral ganglion. Det kan være at foretrække at udføre dette snit med en saks. - Skær de basale og krog regioner som den anden røde linje indikerer i figur 1g at adskille krog portion (figur 1h).
Bemærk: Cochlea er nu blevet udskilt i apical, midterste, basal og krog portioner. De næste skridt vil være den sidste dissektion af hver af de enkelte sving, ved hjælp af den midterste sving som et eksempel. - Skær de relativt store portioner af knogle kapsel og side vægvævet i midtersving væk, som indikeret af den røde linje (figur 1i).
Bemærk: Den laterale væg af cochlear kanalen dannes af spiral ligament og Stria vascularis. - Hold sidevæggen med pincet for at justere knogle kapslen og lateral væggen med bunden af Petri skålen og skær disse væv fra basilær membranens side. Derefter samkopiere prøven for at orientere den sensoriske hårcelle overflade side op. Fjern resten af Bony-kapslen og sidevæggen (figur 1j).
- Fjern den tektoriale membran ved hjælp af pincet til fuldstændig at adskille den midterste region (figur 1k).
- Gentag trin 4.7 − 4,9 for de sidste dissektioner af de resterende drejninger eller regioner som vist i figur 1l.
- Forbered en 10 mm rund dækseddel til vedhæftning af det sensoriske epithelium. Brug en pipette til at hånd sprede 0,5 μL celle-og vævsklæber i midten af den runde dækseddel. Efter tørring (3 – 5 min ved RT) sættes dæksedlerne i PBS i Petri skåle.
- Stick alle fire stykker af den sensoriske epitel på 10 mm runde dækglas i Petri skålen. Hold derefter en kant af dæksedlen for at overføre den til en fire-brønd skål til immunolabeling eller Immunhistokemi (figur 1m).
Bemærk: figur 2 illustrerer placeringen af de store nedskæringer.
5. immunolabeling for cochlear synapser
Bemærk: Protokollen for immunolabeling for cochlear synapser fulgt i dette studie er tidligere beskrevet13. Præsynaptiske bånd blev mærket med et CtBP2 antistof (mus anti-carboxyl-Terminal binding protein 2 IgG1, mærkning B domæne af RIBEYE stilladser protein). Post synaptisk terminaler blev mærket med GluA2 antistof (mus anti-glutamat receptor 2 IgG2a, mærkning under enheder af AMPA-receptor).
- Vask det sensoriske epitel med PBS 3x i 5 min hver vask i en fire-brønd skål og tilsæt derefter 2 mL 2% nonionisk overfladeaktivt (dvs. Triton-X 100) i skålen i 30 minutter ved RT på en rotator.
- Fjern den nonioniske overfladeaktive opløsning fra skålen ved hjælp af en pipette, og tilsæt 100 μL blokerende opløsning indeholdende 10% normalt gede serum til hver brønd i 1 time på en rotator med blid agitation ved RT.
- Fjern blokerings opløsningen fra hver brønd, vask med PBS 3x i 5 min hver vask under blid agitation ved RT.
- Tilsæt 100 μL af de primære antistoffer fortyndet med PBS til hver brønd: mus anti-GluA2 IgG2a (1:2000), mus anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Dæk hver fire-brønd skål med låget og Placer den i en stor befuret beholder, der beskytter mod lys. Inkubere ved 37 °C i 24 timer.
Bemærk: Som en mulighed, kanin anti-myosin VIIa (1:400) for immunolabeling sensoriske hårceller kan tilsættes. - Vask 3x med PBS i 5 min hver vask med blid agitation ved RT.
- Tilsæt 100 μL af de sekundære antistoffer Alexa 594 Goat anti-Mouse IgG1a (1:1000), Alexa 488 ged anti-Mouse IgG2a (1:1000) fortyndet med PBS til hver brønd. Dæk hver fire-brønd skål med låget og Placer den i en stor befuret beholder, der beskytter mod lys. Inkuber ved 37 °C i 2 timer.
Bemærk: Hvis myosin VIIa anvendes, tilsættes Alexa 350 ged anti-kanin (1:200). - Vask 3x med PBS i 5 min. Overfør derefter den 10 mm runde dækseddel på et dias med prøverne på toppen.
- Tilsæt forsigtigt 8 μL fluoro-gel med Tris-buffer i midten af dæksedlen. Hold derefter kanten af en anden 10 mm rund dækseddel med pincet til at montere på toppen, klemning de to dæksedler sammen.
- Brug neglelak til at forsegle slides, sætte dem i en pap slide mappe, og opbevares i køleskabet.
Bemærk: Hvis nogle fluoro-gel siver ud mellem dæksedlerne under montering, Rengør kanterne på dæksedlerne, før du forsegler sliden med neglelak. Konfokale billeder skal tages inden for 7 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overflade præparater af cochlear epitel, i kombination med immunolabeling og confokale Imaging, er blevet anvendt bredt i høre videnskab til undersøgelse af cochlear-patologier, såsom kvantificering af bånd synapser, sensoriske hårceller, og protein ekspression i sensoriske hårceller5,6,7,8. Selv om dissektion af voksne mus cochleae til overflade præparater ikke er enkel, nye kandidatstuderende er i stand til at lære denne modificerede metode efter praktiserende med 10 – 15 ører (figur 1 og figur 2). Med denne teknik, i kombination med immunolabeling for CtBP2 (en markør for præsynaptiske bånd) og GluA2 (en markør for post synaptiske terminaler), tælle IHC/Auditive nerve synapser ved hjælp af konfokale billeder under Z fremskrivninger med 0,25 μm intervaller, baseret på størrelsen af musen bånd synapser, er muligt21. Dette er i overensstemmelse med offentliggjorte resultater4,6,13. Overflade præparater af CBA/J-mus (uden behandling) i en alder af 10 – 12 uger immunolabeled med CtBP2 (rød) og GluA2 (grøn) viste, at både præsynaptiske bånd og post synaptiske terminaler er placeret under IHC-kerner og er juxtaposed, hvilket indikerer funktionelle synapser (figur 3)6,13.
Ved immunolabeling overflade præparater med forskellige antistoffer, vurdering af molekylære signalering og struktur i sensoriske hårceller er muligt. For eksempel viser figur 4 resultaterne for immunolabeling for myosin VIIa og kontra farvning med phalloidin og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (dapi). Parallelle immunolabeling eksperimenter med og uden cellen og vævs klæberen ved hjælp af identiske opløsninger er blevet udført for at vurdere, om den anvendte klæbemiddel griber ind i immunoreaktionerne. Cochlear-overflade præparater var immunolabeled med myosin VIIa og modfarvet med phalloidin. Confokale billeder blev taget med en 63x forstørrelse linse under identiske betingelser og lige parameterindstillinger for laser gevinster og Photomultiplier Tube (PMT) gevinster. Der var ingen forskel i immunoreactions eller ensartethed med og uden cellen og vævs klæberen (figur 5). Ved hjælp af forskellige fiksere har overflade præparater givet grundlaget for scanning af elektronmikroskopi (SEM) billeder til visualisering af cochlear stereocilia9. C57BL/6J mus (uden behandling) i en alder af 6 – 8 uger viser velorganiserede V-formede stereocilier af Ohc'er i tre rækker (figur 6). Derudover er der anvendt cochlear-overflade præparater til at bestemme udtryks mønstret for et rapportgen (dvs. GFP) og bekræfte vellykket transduktion og identificere transducerede celletyper.
Figur 1: skildring af trinene for voksne mus overflade præparater. a) den timelige knogle ' cochlear Bony-kapsel vender opad. Den røde linje angiver det første snit for at adskille den apikale drejning. RW = rundt vindue, OW = oval vindue. b) spidsen adskilles fra cochlea som angivet med pilen. Den røde linje mellem det runde vindue og det ovale vindue indikerer det andet snit, der er lavet i sneglen. (c) den cochlear portion, der indeholder de midterste, basale og krog regioner er adskilt fra den vestibulære del. (d) cochlear-delen er placeret opad. Den røde linje angiver det tredje snit, rettet mod enden, hvorfra den apikale sektion blev fjernet. e) pilen angiver det hul, som er tilbage efter afslutningen af det tredje snit. (f) dette billede viser den midterste region. g) dette billede viser de kombinerede basal-og krog områder. Den lodrette røde linje angiver snittet mellem modiolus-og krog området. Snittet mellem de basale og krog regioner er angivet med den anden røde linje. h) basal-og krog regioner adskilles som angivet af pilene. i) denmidterste region af knogle kapslen skæres som angivet af den røde linje. j) billedet viser det midterste område, efter at den ene side af knogle kapslen er fjernet. (k) dette billede viser den midterste region efter afslutning af dissektion. l) alle fire regioner er fuldstændig dissekeret. m) cochlear-omdrejninger anbringes på en 10 mm rund dækseddel overført til en fire-brønd Petri skål med de fire regioner som angivet. Alle billeder blev taget under et stereo-Dissection mikroskop ved 1,2 x, 2.5 x og 0,6 x forstørrelser. Skala bjælker er angivet i hvert billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: placeringen af de store nedskæringer. Hele cochlear Bony-kapslen blev fjernet. Placeringen af de store udskæringer er angivet. 1) det sted, hvor den apikale turn er skåret. 2) det sted, hvor den midterste sving er adskilt. 3) det kritiske snit til at fjerne modiolus. 4) linjen for at opdele basal og krog regioner. Scale bar = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konfokale billeder afslører immunolabeling for CtBP2 og GluA2 på voksne mus overflade præparater. De apiske, midterste og basale regioner er mærket. De lavere forstørrelse konfokale billeder blev taget med en 10x linse. Rød = CtBP2, grøn = GluA2. Scale bar = 100 μm. Konfokale billeder af 5-, 16-og 32-kHz-områder blev taget med et 63x objektiv. Forstørrede visninger af de områder, som er angivet med de hvide rektangler i Apex-, mellem-og basisdele. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Konfokale billeder afslører immunolabeling af sensoriske hårceller i et overflade præparat fra 32-kHz-regionen. Alle billeder blev flettet Z-stack projektioner. Phalloidin (grøn) farvede strukturen af de tre rækker af Ohc'er og en række af IHCs. Myosin VIIa (rød) immunolabeled tre rækker af Ohc'er og en række af IHCs. DAPI-farvede hårcelle kerner. Fusionerede konfokale billeder blev rekonstrueret til sidevisninger af sensoriske hårceller. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: cochlear-overflade præparater med og uden celle-og vævsklæber blev behandlet parallelt, immunolabeled for myosin VII (rød) og med phalloidin (grøn) ved hjælp af identiske opløsninger. Den anvendte celle-og vævsklæber griber ikke ind i immunoreactions. Konfokale billeder blev taget med en 63x Forstørrelsesglas under identiske betingelser og lige parameterindstillinger. Billeder blev taget fra 32 kHz regionen. Immunolabeling for myosin VIIa og farvning for phalloidin i Ohc'er var den samme med og uden cellen og vævs klæberen. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: scannings elektronmikroskopi viser tre rækker OHC stereocilier fra C57BL/6J mus. Billeder blev taget fra den midterste region. a) en visning med lav forstørrelse af tre rækker ohc'er. (b) forstørrede billeder viser tre rækker af VELORGANISEREDE OHC-stereocilier, der vises i "V"-figurer. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | ||||||||
| Afstand fra spidsen (mm) | 0,4 | 1 | 2,4 | 3,3 | 3,9 | 4,7 | 5,7 | |
| Afstand fra spidsen (%) | 7,7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Frekvenser (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tabel 1: kortlægning af CBA/J-musens cochlear-frekvens følsomhed som en funktion af afstanden fra spidsen i henhold til Muller1 og Viberg og canlon2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cochlear microdissection af hele Mount overflade præparater i kombination med immunolabeling giver et grundlæggende værktøj til undersøgelse af indre øre patologier og molekylære mekanismer. Denne modificerede voksne mus cochlear dissektion metode ved hjælp af cellen og væv klæbemiddel forenkler denne vanskelige procedure.
Selv om denne modificerede cochlear-overflade forberedelsesmetode er relativt let og tilgængelig, kræver det stadig øvelse for at opnå færdig færdighed. For at foretage de rigtige nedskæringer, har dissektor behov for omhyggelig koncentration. Fordi cochlears sensoriske hårceller i basal turn er så tæt på spiral limbussen, er det svært at fjerne limbus-vævet helt, så overflade forberedelsen kan ligge fuldstændig fladt, men konfokale Z-projektioner kompenserer for dette problem. Derudover er krog regionen af cochlea stadig den sværeste del at dissekere. Der kan forekomme separationer mellem Ohc'er og Ihc'er i krog regionen. Krogen regionen viser store anatomiske variationer i mennesker og er vigtigt for knogle-ledning hørelse22,23. Baseret på den cochlear-frekvens kortlægning, der er rapporteret af Muller1 og Viberg og canlon2, svarer krog regionen, der begynder omkring 4,7 mm fra spidsen, til følsomhed over for 48 kHz toner og højere (tabel 1), hvorimod auditive funktionelle vurderinger af erhvervet høretab hos mus, herunder støj induceret, aminoglycoside-induceret høretab og aldersrelateret høretab, måles generelt ved 8, 16 og 32 kHz med auditiv hjernestammen respons (ABR)5,6 ,7,9,24 og fra 6 – 45 kHz med forvrængnings produkt otoakustisk emission (DPOAE)25. Efter aftale med Montgomery et al., er forvrængning af epitelet ikke almindeligt set, når spiralen er opdelt i 3 – 4 stykker19.
Den modificerede metode, der præsenteres her, indebærer at dissekerer cochlear spiral i kun fire stykker (Apex, Middle, basal drejninger og krog regionen), mens Eaton-Peabody teknik producerer seks stykker18. Eaton-Peabody-teknikken starter med en cochlear-bisection, som undgår at gøre tangentielle nedskæringer gennem epitelet for først at adskille den apiske drejning fra resten af spiralen, som beskrevet i denne modificerede teknik. Ved at producere mindre stykker, den Eaton-Peabody teknik er designet til at minimere den samkopiering kræves for at se et stort stykke med en fordybelse mål. Faktisk letter de større dele af vævet målingen af frekvens kortlægningen fra apikale til basal turn, i overensstemmelse med Montgomery et al.19. Desuden er en forskel mellem denne metode og Montgomery et al.19 , at den modificerede cochlear dissektion-metode, der er beskrevet her, anvender en skalpel for de fleste udskæringer, og kun ét trin udføres med en saks (dvs. adskillelsen af basal-og krog regioner som illustreret i det tredje snit i figur 2), hvorimod Montgomery et al.19 brugte en saks med en silikoneelastomer belagt dissektions skål til overflade præparater. For at undgå forvrængning af vævet er frakobling af basilær membranen for at fjerne modiolus kritisk.
Denne protokol bruger en celle-og vævsklæber (tabel over materialer) til vedhæftning af cochleært epitel til 10 mm runde Cover slip for immunolabeling eller immunohistochemistry, hvilket gør processerne mere bekvemme og undgår tab af epitel væv under multiple skylning af immunolabeling procedurer. Celle-og vævsklæber er en formulering af polyphenoliske proteiner, der klæber til celler og væv og har været almindeligt anvendt i mange almindeligt in vitro-teknikker, herunder immun histokemi, in situ-hybridisering og immunassays20. I overensstemmelse med forestillingen om, at cellen og vævs klæberen ikke forstyrrer immunoreactions, viser parallel immunolabeling af myosin VIIa med overflade præparater ingen forskel i immunoreactions eller ensartethed med og uden cellen og vævet Klæbende. Ved at sammenligne disse tre dissektion metoder (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, og den modificerede metode beskrevet), er de studerende i laboratoriet enige om, at denne modificerede metode ved hjælp af cellen og vævs klæberen er lettere at lære og Master.
Sammenfattende er fremstilling af hele Mount Adult mouseover flade præparater en grundlæggende færdighed for evaluering af cochlear-patologier. Den beskrevne modificerede protokol for voksne mus overflade præparater forenkler denne vanskelige procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Det beskrevne forskningsprojekt blev støttet af Grant R01 DC009222 fra det nationale Institut for døvhed og andre kommunikationsforstyrrelser, National Institutes of Health. Dette arbejde blev udført i WR Building i MUSC i renoveret rum understøttet af Grant C06 RR014516. Dyrene blev anbragt i MUSC CRI-dyre anlæg, der blev støttet af Grant C06 RR015455 fra det nationale center for forsknings ressourcers Extramural Research-program. Forfatterne takker Dr. Jochen Schacht for hans værdifulde kommentarer og Andra Talaska for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
