Summary
Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.
Abstract
Le traitement auditif de la cochlée dépend de l'intégrité des cellules ciliées mécanosensorielles. Au cours d'une vie, la perte auditive peut être acquise à partir de nombreuses étiologies telles que l'exposition à un bruit excessif, l'utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l'oreille, les traumatismes crâniens et le processus de vieillissement. La perte de cellules ciliées sensorielles est une caractéristique pathologique commune des variétés de perte auditive acquise. En outre, la synapse de cellules de cheveux internes peuvent être endommagées par des insultes légères. Par conséquent, les préparations de surface de l'épithélie cochléaire, en combinaison avec les techniques d'étiquetage immunoetsetaux et l'imagerie confocale, sont un outil très utile pour l'étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules capillaires sensorielles, changements des niveaux de protéines dans les cellules ciliées et les cellules de soutien, la régénération des cellules ciliées et la détermination de l'expression du gène de rapport (c.-à-d., GFP) pour la vérification de la transduction réussie et l'identification des types de cellules transductées. La cochlée, une structure osseuse en forme de spirale dans l'oreille interne, détient l'organe auditif de fin sensorielle, l'organe de Corti (OC). Les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien environnantes dans le CO sont contenues dans le conduit cochléaire et reposent sur la membrane basilaire, organisée de façon tonotopique avec détection à haute fréquence se produisant dans la base et basse fréquence dans l'apex. Avec la disponibilité de l'information moléculaire et génétique et la capacité de manipuler des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la recherche biologique, y compris dans la science de l'audition. Cependant, la cochlée de souris adulte est minuscule, et l'épithélium cochléaire est encapsulé dans un labyrinthe osseux, rendant la microdissection difficile. Bien que des techniques de dissection aient été développées et utilisées dans de nombreux laboratoires, cette méthode modifiée de microdissection utilisant l'adhésif de cellules et de tissu est plus facile et plus commode. Il peut être utilisé dans tous les types de cochlée de souris adultes après la décalcification.
Introduction
La cochlée est dédiée à la détection du son et responsable de l'audition. Le conduit cochléaire est enroulé dans une forme spirale dans le labyrinthe osseux et tient l'organe d'extrémité sensorielle auditive, l'organe de Corti (OC). Le CO repose sur la membrane basilaire, constituant l'épithélium cochléaire, d'une longueur d'environ 5,7 mm lorsqu'il est désenroulé chez les souris adultes CBA/ CaJ1,2. Parce que le CO est tonotopiquement organisé avec des hautes fréquences détectées dans la base et les basses fréquences dans l'apex, l'épithélium cochléaire est souvent divisé en trois parties pour des comparaisons analytiques: les tours asphériques, moyens et basaux correspondant à faible, détection moyenne et haute fréquence, respectivement. En plus d'un éventail de cellules de soutien, le CO est composé d'une rangée de cellules ciliées internes (IHC) situées médially et de trois rangées de cellules ciliées externes (CCO) situées latéralement par rapport à la spirale cochléaire.
Le traitement auditif correct dépend de l'intégrité des cellules ciliées sensorielles dans la cochlée. Les dommages ou la perte de cellules ciliées sensorielles sont une caractéristique pathologique commune de la perte auditive acquise, causée par de nombreuses étiologies telles que l'exposition à un bruit excessif, l'utilisation de médicaments ototoxiques, les infections bactériennes ou virales de l'oreille, les traumatismes crâniens et le vieillissement processus3. En outre, l'intégrité et la fonction de la cellule capillaire interne / synapses nerveuses auditives peuvent être altérées par des insultes légères4. Avec la disponibilité de l'information moléculaire et génétique et la manipulation des gènes par KO et knock-in techniques, les souris ont été largement utilisés dans la science de l'audition. Bien que la cochlée adulte de souris soit minuscule et que l'épithélium cochléaire soit entouré d'une capsule osseuse entraînant des microdissections techniquement difficiles, des préparations de surface de l'épithélium en combinaison avec l'immunolabeling ou l'immunohistochimie et l'imagerie confocale ont été largement utilisées pour l'étude des pathologies cochléaires, y compris les pertes de synapses de ruban et de cellules ciliées, les changements dans les niveaux de protéines dans les cellules ciliées sensorielles et les cellules de soutien, et la régénération des cellules capillaires. Des préparations de surface cochléaires ont également été utilisées pour déterminer le modèle d'expression des gènes des journalistes (c.-à-d. GFP) et confirmer la transduction réussie et identifier les types de cellules transductées. Ces techniques ont été précédemment utilisées pour l'étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la perte auditive induite par le bruit à l'aide de souris adultes CBA / J5,6,7,8,9.
Contrairement à l'immunohistochimie utilisant des sections de paraffine ou des cryosections pour obtenir de petites parties transversales de la cochlée qui contiennent trois cellules ciliées externes (CCO) et une cellule capillaire interne (IHC) sur chaque section, les préparations de surface cochléaire permettent visualisation de toute la longueur de l'OC pour le comptage des cellules ciliées sensorielles et des synapses de ruban et de l'immunolabeling des cellules ciliées sensorielles correspondant à des fréquences fonctionnelles spécifiques. Le tableau 1 montre la cartographie des fréquences auditives en fonction de la distance le long de la spirale cochléaire chez la souris adulte CBA/J selon des études de Muller1 et Viberg et Canlon1,2. Les préparations de surface cochléaires ont été largement utilisées pour l'étude des pathologies cochléaires4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. La méthode de dissection cochléaire à monture entière a été décrite à l'origine dans un livre édité par Hans Engstrom en 196616. Cette technique a ensuite été affinée et adaptée à une variété d'espèces telles que décrites dans la littérature par un certain nombre de scientifiques en sciences de l'audition10,11,12,13, 15,17 et par les laboratoires Eaton-Peabody au Massachusetts Eye and Ear18. Récemment, une autre méthode de dissection cochléaire a été rapportée par Montgomery et coll.19. La microdissection de la cochlée est une étape essentielle et critique pour les préparations de surface cochléaires. Cependant, disséquer les cochléées de souris est un défi technique et nécessite une pratique considérable. Ici, une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire est présentée pour une utilisation dans les cochléae adultes de souris. Cette méthode nécessite la décalcification et l'utilisation d'adhésif cellulaire et tissulaire (c.-à-d. Cell-Tak) pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire à des couvertures rondes de 10 mm pour l'immunoétiquetage. L'adhésif de cellules et de tissu a été employé couramment pour l'immunohistochimie20. Cette méthode de microdissection cochléaire modifiée est relativement simple par rapport à celles précédemment rapportées18,19.
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Protocol
Tous les protocoles de recherche impliquant des souris adultes mâles de l'ABC/J à l'âge de 10-12 semaines et des souris c57BL/6J à l'âge de 6-8 semaines ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'université médicale de Caroline du Sud (MUSC). Les soins aux animaux étaient sous la supervision de la Division des ressources animales de laboratoire du MUSC.
REMARQUE: Pour les procédures présentées ci-dessous, les souris sont anesthésiés avec de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) par injections intrapéritones. Les souris sont décapitées après que l'animal ne répond plus aux stimuli douloureux, comme une pincée d'orteil.
1. Extraction d'os temporels
- Décapiter la souris immédiatement post mortem avec des ciseaux chirurgicaux (17 cm de long) et couper l'os du crâne avec des ciseaux de l'aspect postérieur vers l'avant le long de la ligne centrale du crâne après avoir exposé l'os du crâne en tirant la peau antérieurement.
- Retirez le tissu cérébral à l'aide de forceps et enlevez manuellement les os temporels avec le pouce et l'index pour les souris de trois mois ou plus. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux (11 cm de long) pour couper l'os temporal des souris de moins de trois mois.
- Mettre l'os temporel dans un plat Petri (30 mm de diamètre) contenant de la glace fraîche 4% paraformaldéhyde frais (PFA) solution dissous dans le phosphate tamponné saline (PBS), pH 7.4.
REMARQUE: Préparer la solution PFA fraîche de 4% et ajuster le pH à 7.4 juste avant de fixer les os temporels, parce que l'équilibrage incorrect de pH de la solution PFA diminuera la qualité de l'immunolabeling.
2. Fixation et perfusion
- Retirez les rubans de la fenêtre ovale et perforez la membrane de la fenêtre ronde avec des #5 des forceps. Sous un microscope stéréo dissection faire un petit trou dans le sommet de la cochlée à l'aide d'une aiguille de 27 G connecté à une seringue de 1 ml.
- Perfuse doucement et lentement la cochlée avec la solution PFA de 4% par les fenêtres rondes et ovales jusqu'à ce que la solution se lave hors du petit trou à l'apex. Transférer la cochlée (une ou deux cochlée par flacon) sur des flacons de scintillation de volume de 20 ml contenant 10 ml de solution PFA de 4 %.
- Agiter doucement les flacons de scintillation à température ambiante (RT) pendant 2 h et laisser passer la nuit au réfrigérateur (4 oC) sur un rotateur.
REMARQUE: Le moment de fixation peut être ajusté en fonction de l'anticorps utilisé. Par exemple, limiter la fixation à 1,5 h permettra d'immunolabeling réussie des terminaux post-synaptiques lors de l'utilisation de l'anticorps GluA 2.
3. Décalcification de l'os temporel
- Retirer la solution PFA et laver les cochlée avec du PBS 3x frais pendant 5 min chacun.
- Ajouter 20 ml de 4 % de sel disodium d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) de sel disodium (EDTA) solution (pH 7,4) aux flacons de scintillation et conserver dans un réfrigérateur pendant 48 à 72 h sur un rotateur avec une agitation douce. Changez la solution EDTA tous les jours jusqu'à ce que les cochlées soient décalcifiées. Vérifiez si les cochlées sont décalcifiées en touchant la partie vestibulaire osseuse avec des forceps pour évaluer l'élasticité ou simplement couper un petit morceau du bord de la partie vestibulaire. Si une telle coupe entraîne une pièce écrasée, la cochlée n'est pas décalcifiée.
REMARQUE: La solution EDTA peut interférer avec l'immunoréaction des anticorps primaires en fonction de la concentration de la solution. Préparer 4% EDTA en PBS et ajuster le pH à 7,4. Pour une décalcification cohérente des os temporels, la solution EDTA fraîche est utilisée. - Changer la solution à PBS pour la microdissection après la décalcification est terminée.
REMARQUE: Si les cochlées ne sont pas suffisamment décalcifiées, la dissection des cochlées ne peut pas être effectuée.
4. Microdissection de l'épithélium cochléaire
REMARQUE: Une fois la décalcification terminée, la microdissection de l'épithélium cochléaire pour l'immunolabeling doit être effectuée dès que possible. Dans un plat Petri propre de 30 mm contenant du PBS, l'oreille interne est orientée de la manière suivante : en référence au haut (couvercle) et au bas du plat Petri, les fenêtres rondes et ovales cochléaires donnent sur le dessus. En ce qui concerne le dissecteur, la partie cochléaire est orientée vers l'avant (loin du secteur) et la partie vestibulaire vers l'arrière (presque dissector). Ce qui suit décrit les étapes en détail.
- Maintenez la partie vestibulaire de l'os temporel avec des forceps et coupez le tour acalique avec le scalpel à un angle de 45 degrés comme indiqué par la ligne rouge (Figure 1a).
- Couper verticalement le long de la ligne faible entre la fenêtre ronde et la fenêtre ovale, comme l'indique la ligne rouge (figure 1b) pour séparer la cochlée de la partie vestibulaire (Figure 1c).
REMARQUE: Cette partie cochléaire contient les parties moyennes, basales et crochetdelées de l'épithélium. - Placez la partie cochléaire avec le basal tourner vers le bas et le virage du milieu vers le haut du plat Petri et couper la capsule osseuse et la paroi latérale du virage du milieu vers l'extrémité à partir de laquelle la section apale a été enlevée, comme indiqué par la ligne rouge (Figu re 1d,e).
- Continuer à couper pour séparer complètement la partie médiane des régions basales et des hameçons(figure 1f,g).
REMARQUE: La région de crochet de la cochlée est l'extrémité de l'épithélium cochléaire correspondant à la sensibilité aux tons 48 kHz et plus élevé chez les souris. - Mettre la partie basale et crochet avec le site de la membrane basilaire orienté vers le bas du plat et couper verticalement le modiolus de la région du crochet pour enlever le modiolus comme indiqué par la ligne rouge verticale (Figure 1g).
REMARQUE: Le modiolus est l'axe central conique de la cochlée qui se compose d'os spongieux et de nerf cochléaire ainsi que le ganglion en spirale. Il peut être préférable d'effectuer cette coupe avec des ciseaux. - Couper les régions basales et crochetées comme l'indique l'autre ligne rouge à la figure 1g pour séparer la partie du crochet (Figure 1h).
REMARQUE: La cochlée a maintenant été séparée en parties apicales, moyennes, basales et crochets. Les prochaines étapes seront la dissection finale de chacun des virages individuels, en utilisant le tour du milieu comme exemple. - Couper les portions relativement grandes de capsule osseuse et de tissu latéral du tour du milieu, comme l'indique la ligne rouge (figure 1i).
REMARQUE: La paroi latérale du conduit cochléaire est formée par le ligament spiralé et la stria vascularis. - Tenez la paroi latérale avec des forceps pour aligner la capsule osseuse et la paroi latérale avec le fond de la vaisselle Petri et coupez ces tissus du côté de la membrane basilaire. Aplatir ensuite le spécimen pour orienter le côté de la surface des cellules capillaires sensorielles vers le haut. Couper le reste de la capsule osseuse et la paroi latérale (Figure 1j).
- Enlever la membrane tectoriale à l'aide de forceps pour séparer complètement la région du milieu (Figure 1k).
- Répéter les étapes 4.7-4.9 pour les dissections finales des tours ou des régions restants comme indiqué dans la figure 1l.
- Préparer un bordereau rond de 10 mm pour l'adhérence de l'épithélium sensoriel. Utilisez une pipette pour répandre à la main 0,5 l d'adhésif cellulaire et tissulaire au centre de la feuille de couverture ronde. Après le séchage (3 à 5 min à RT), mettre les couvertures dans PBS dans les plats Petri.
- Coller les quatre morceaux de l'épithélium sensoriel sur la couverture ronde de 10 mm dans le plat Petri. Ensuite, tenez un bord de la couverture pour le transférer dans un plat à quatre puits pour l'immunolabeling ou l'immunohistochemistry (Figure 1m).
REMARQUE : La figure 2 illustre l'emplacement des compressions majeures.
5. Immunolabeling pour Cochlear Synapses
REMARQUE: Le protocole pour l'immunolabeling pour des synapses cochléaires suivis dans cette étude a été précédemment décrit13. Les rubans présynaptiques ont été étiquetés avec un anticorps CtBP2 (protéine de liaison anti-carboxyl-terminal de souris 2 IgG1, étiquetant le domaine B de la protéine d'échafaudage RIBEYE). Les terminaux post-synaptiques ont été étiquetés avec l'anticorps GluA2 (récepteur anti-glutamate de souris 2 IgG2a, sous-unités d'étiquetage du récepteur AMPA).
- Laver l'épithélium sensoriel avec PBS 3x pendant 5 min chaque lavage dans un plat à quatre puits, puis ajouter 2 ml de surfactant nonionic 2 % (c.-à-d., Triton-X 100) dans le plat pendant 30 min à RT sur un rotateur.
- Retirez la solution de surfactant nonionic du plat à l'aide d'une pipette et ajoutez 100 L de solution de blocage contenant 10% de sérum de chèvre normal à chaque puits pendant 1 h sur un rotateur avec une douce agitation à RT.
- Retirez la solution de blocage de chaque puits, lavez-la avec PBS 3x pendant 5 min chaque lavage sous une douce agitation à RT.
- Ajouter 100 l des anticorps primaires dilués avec du PBS à chaque puits : souris anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), souris anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Couvrir chaque plat à quatre puits avec son couvercle et le placer dans un grand récipient humidifié qui protège de la lumière. Incuber à 37 oC pendant 24 h.
REMARQUE: En option, lapin anti-myosin VIIa (1:400) pour immunolabeling cellules ciliées sensorielles peuvent être ajoutés. - Laver 3x avec PBS pendant 5 min chaque lavage avec une agitation douce à RT.
- Ajoutez 100 l des anticorps secondaires Alexa 594 chèvre anti-souris IgG1a (1:1,000), Alexa 488 chèvre anti-souris IgG2a (1:1,000) dilué avec PBS à chaque puits. Couvrir chaque plat à quatre puits avec son couvercle et le placer dans un grand récipient humidifié qui protège de la lumière. Incuber à 37 oC pendant 2 h.
REMARQUE: Si la myosine VIIa est utilisée, ajouter Alexa 350 chèvre anti-lapin (1:200). - Laver 3x avec PBS pendant 5 min. Ensuite, transférez la glissière ronde de 10 mm sur une glissière avec les échantillons sur le dessus.
- Ajouter délicatement 8 L de Fluoro-Gel avec tampon Tris au centre de la couverture. Puis tenez le bord d'un autre coverslip rond de 10 mm avec des forceps à monter sur le dessus, en sandwich les deux couvertures ensemble.
- Utilisez du vernis à ongles pour sceller les lames, les mettre dans un dossier de diapositives en carton et conserver au réfrigérateur.
REMARQUE: Si un peu de Fluoro-Gel fuit entre les couvertures pendant le montage, nettoyez les bords des couvertures avant de sceller la lame avec du vernis à ongles. Les images confocales doivent être prises dans les 7 jours.
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Representative Results
Les préparations de surface de l'épithélium cochléaire, combinées à l'immunolabeling et à l'imagerie confocale, ont été largement utilisées dans la science auditive pour l'étude des pathologies cochléaires, telles que la quantification des synapses de ruban, des cellules capillaires sensorielles, et l'expression des protéines dans les cellules ciliées sensorielles5,6,7,8. Bien que la dissection des cochléées de souris adultes pour les préparations de surface ne soit pas simple, les nouveaux étudiants des cycles supérieurs sont en mesure d'apprendre cette méthode modifiée après avoir pratiqué avec 10 à 15 oreilles(figure 1 et figure 2). Avec cette technique, en combinaison avec l'immunolabeling pour CtBP2 (un marqueur pour les rubans présynaptiques) et GluA2 (un marqueur pour les terminaux post synaptiques), en comptant les synapses de nerf IHC/auditive à l'aide d'images confocales sous des projections Z avec des intervalles de 0,25 m, basés sur la taille des synapses de ruban de souris, est possible21. Ceci est compatible avec les résultats publiés4,6,13. Les préparations de surface des souris CBA/J (sans traitement) à l'âge de 10 à 12 semaines immunolabeled avec CtBP2 (rouge) et GluA2 (vert) ont montré que les rubans presynaptiques et les terminaux post synaptiques sont situés sous les noyaux d'IHC et sont juxtaposés, indiquant synapses fonctionnelles (Figure 3)6,13.
En immunolabeling préparations de surface avec différents anticorps, l'évaluation de la signalisation moléculaire et la structure dans les cellules ciliées sensorielles est possible. Par exemple, la figure 4 montre les résultats de l'immunoétiquetage pour la myosine VIIa et la contre-coloration avec la phalloïde et 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Des expériences d'immunolabeling parallèles avec et sans l'adhésif de cellules et de tissu utilisant des solutions identiques ont été conduites pour évaluer si l'adhésif utilisé interfère avec les immunoréactions. Les préparations de surface cochléaires ont été immunolabeled avec la myosine VIIa et contrestained avec la phalloidin. Des images confocales ont été prises avec une lentille de grossissement 63x dans des conditions identiques et des paramètres égaux pour les gains laser et les gains de tube photomultiplicateur (PMT). Il n'y avait aucune différence dans les immunoréactions ou l'uniformité avec et sans l'adhésif de cellules et de tissu (figure 5). À l'aide de différents fixatifs, les préparations de surface ont servi de base à la numérisation d'images de microscopie électronique (SEM) pour la visualisation des stéréocilia cochléaires9. Les souris C57BL/6J (sans traitement) à l'âge de 6 à 8 semaines montrent des stéréocilia en forme de V bien organisées d'OhC en trois rangées (figure 6). De plus, des préparations de surface cochléaires ont été utilisées pour déterminer le modèle d'expression d'un gène de rapport (c.-à-d. GFP) et confirmer la transduction réussie et identifier les types de cellules transductées.
Figure 1 : Représentation des étapes pour les préparations de surface de souris adultes. (a) La capsule osseuse cochléaire de l'os temporel fait face vers le haut. La ligne rouge indique la première coupe pour séparer le virage apaïque. RW - fenêtre ronde, OW et fenêtre ovale. (b) L'apex est séparé de la cochlée comme indiqué par la flèche. La ligne rouge entre la fenêtre ronde et la fenêtre ovale indique la deuxième coupe faite dans la cochlée. (c) La partie cochléaire qui contient les régions moyennes, basales et crochetest séparée de la partie vestibulaire. d) La partie cochléaire est située face vers le haut. La ligne rouge indique la troisième coupe, dirigée vers l'extrémité à partir de laquelle la section apanique a été enlevée. (e) La flèche indique l'écart laissé après l'achèvement de la troisième coupe. (f) Cette image montre la région du milieu. (g) Cette image montre les régions basales et crochet s'entremêlons. La ligne rouge verticale indique la coupe entre le modiolus et la région du crochet. La coupe entre les régions basales et les régions de crochet est indiquée par l'autre ligne rouge. h) Les régions basales et crochetsont séparées comme indiqué par les flèches. (i) La région médiane de la capsule osseuse est coupée comme indiqué par la ligne rouge. (j) L'image montre la région du milieu après qu'un côté de la capsule osseuse a été enlevé. (k) Cette image montre la région du milieu après l'achèvement de la dissection. (l) Les quatre régions sont complètement disséquées. (m) Les virages cochléaires sont fixés sur un bordereau rond de 10 mm transféré sur un plat Petri à quatre puits avec les quatre régions indiquées. Toutes les images ont été prises sous un microscope stéréo-dissection à 1.2x, 2.5x, et 0.6x grossissements. Les barres d'échelle sont indiquées dans chaque image. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Emplacement des coupures majeures. La capsule osseuse cochléaire entière a été enlevée. Les emplacements des compressions majeures sont indiqués. 1) L'endroit où le tour apical est coupé. 2) Le site où le virage du milieu est séparé. 3) La coupe critique pour enlever le modiolus. 4) La ligne pour diviser les régions basales et crochet. Barre d'échelle de 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les images confocales révèlent l'immunolabeling pour CtBP2 et GluA2 sur les préparations de surface de souris adultes. Les régions apaïques, moyennes et basales sont étiquetées. Les images confocales de grossissement inférieureont ont été prises avec une lentille de 10x. Rouge et CtBP2, vert et GluA2. La barre d'échelle de 100 m. Les images confocales des régions de 5, 16 et 32 kHz ont été prises avec une lentille de 63x. Vues agrandies des zones indiquées par les rectangles blancs dans les parties apex, milieu et base. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Les images confocales révèlent l'immunoétiquetage des cellules ciliées sensorielles d'une préparation de surface de la région de 32 kHz. Toutes les images ont été fusionnées Z-stack projections. La phalloidine (verte) a souillé la structure des trois rangées de CSO et d'une rangée de CSI. Myosin VIIa (rouge) immunolabeled trois rangées d'OHC et une rangée de CSI. Noyaux de cellules de cheveux DAPI-tachés. Des images confocales fusionnées ont été reconstruites pour des vues latérales des cellules ciliées sensorielles. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Les préparations de surface cochléaires avec et sans l'adhésif de cellules et de tissu ont été traitées en parallèle, immunolabeled pour la myosine VII (rouge), et contre-tachées avec la phalloidin (verte) utilisant des solutions identiques. L'adhésif cellulaire et tissulaire utilisé n'interfère pas avec les immunoréactions. Des images confocales ont été prises avec une lentille de grossissement 63x dans des conditions identiques et des paramètres égaux. Des images ont été prises dans la région de 32 kHz. L'immunolabeling pour la myosine VIIa et la coloration pour la phalloidin dans les OHCs était semblable avec et sans l'adhésif de cellules et de tissu. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : La microscopie électronique à balayage montre trois rangées de stéréocilia d'OHC provenant de souris C57BL/6J. Des images ont été prises de la région du milieu. (a) Une vue de faible grossissement de trois rangées de CSO. ( b) Les images agrandies montrent trois rangées de stéréocilia OHC bien organisées qui apparaissent dans des formes « V ». Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nom | ||||||||
| Distance de l'apex (mm) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| Distance de l'apex (%) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Fréquences (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tableau 1 : Cartographie de la sensibilité à la fréquence cochléaire de la souris CBA/J en fonction de la distance par rapport à l'apex selon Muller1 et Viberg et Canlon2.
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Discussion
La microdissection cochléaire des préparations de surface de montage entier en combination avec l'immunolabeling fournit un outil de base pour l'étude des pathologies d'oreille interne et des mécanismes moléculaires. Cette méthode de dissection cochléaire de souris adulte modifiée utilisant l'adhésif de cellules et de tissu simplifie cette procédure difficile.
Bien que cette méthode modifiée de préparation de surface cochléaire soit relativement facile et accessible, elle nécessite toujours de la pratique pour atteindre ses compétences. Pour faire les bonnes coupures, le dissector a besoin d'une concentration soigneuse. Puisque les cellules capillaires sensorielles cochléaires dans le tour basal sont si près du limbus spiralé, il est difficile d'enlever complètement le tissu de limbus pour permettre à la préparation de surface de se coucher complètement plate, mais les Z-projections confocales peuvent compenser ce problème. En outre, la région de crochet de la cochlée est toujours la partie la plus difficile à disséquer. Des séparations peuvent se produire entre les CCO et les CSI de la région du crochet. La région de crochet affiche de grandes variations anatomiques chez l'homme et est importante pour l'audition de la conduction osseuse22,23. D'après la cartographie de la fréquence cochléaire rapportée par Muller1 et Viberg et Canlon2, la région du crochet, à partir d'environ 4,7 mm de l'apex, correspond à la sensibilité à 48 kHz tons et plus élevé (tableau 1), tandis que fonctionnelle auditive les évaluations de la perte auditive acquise chez la souris, y compris la perte auditive induite par le bruit, induite par l'aminoglycoside et la perte auditive liée à l'âge, sont généralement mesurées à 8, 16 et 32 kHz avec réponse auditive du tronc cérébral (ABR)5,6 ,7,9,24 et de 6 à 45 kHz avec émission otoacoustique du produit de distorsion (DPOAE)25. En accord avec Montgomery et coll., la distorsion de l'épithélium n'est pas souvent observée lorsque la spirale est divisée en 3 à 4 pièces19.
La méthode modifiée présentée ici consiste à disséquer la spirale cochléaire en seulement quatre pièces (apex, milieu, virages basaux, et la région du crochet), tandis que la technique Eaton-Peabody produit six pièces18. La technique Eaton-Peabody commence par une bisection cochléaire, qui évite de faire des coupes tangentielles à travers l'épithélium pour d'abord séparer le virage apanique du reste de la spirale, tel que décrit dans cette technique modifiée. En produisant des pièces plus petites, la technique Eaton-Peabody est conçue pour minimiser l'aplatissement requis pour voir une grande pièce avec un objectif d'immersion. En fait, les plus grandes parties de tissu facilitent la mesure de la cartographie de fréquence de l'apical au tour basal, en ligne avec Montgomery et autres19. En outre, une différence entre cette méthode et Montgomery et coll.19 est que la méthode modifiée de dissection cochléaire décrite ici emploie un scalpel pour la plupart des coupes et qu'une seule étape est faite avec des ciseaux (c.-à-d., la séparation des régions basales et de crochet comme illustré dans la troisième coupe de la figure 2), tandis que Montgomery et coll.19 utilisaient des ciseaux munis d'un plat de dissection recouvert d'élastomère en silicone pour les préparations de surface. Pour éviter la distorsion du tissu, la déconnexion de la membrane basilaire pour enlever le modiolus est critique.
Ce protocole utilise un adhésif cellulaire et tissulaire (Table of Materials) pour l'adhérence des morceaux d'épithélium cochléaire à la couverture ronde de 10 mm pour l'immunolabeling ou l'immunohistochimie, ce qui rend les processus plus pratiques et évite la perte de tissus d'épithélium pendant les lavages multiples des procédures d'immunolabeling. L'adhésif cellulaire et tissulaire est une formulation de protéines polyphénoliques qui adhère aux cellules et aux tissus et a été largement utilisée dans de nombreuses techniques in vitro courantes, y compris l'immunohistochimie, l'hybridation in situ et les immunossays20. Conformément à l'idée que l'adhésif cellulaire et tissulaire n'interfère pas avec les immunoréactions, l'immunolabeling parallèle de la myosine VIIa avec les préparations de surface ne montre aucune différence d'immunoréactions ou d'uniformité avec et sans la cellule et le tissu Adhésif. En comparant ces trois méthodes de dissection (Laboratoires Eaton-Peabody, Montgomery et coll.19, et la méthode modifiée décrite), les étudiants diplômés du laboratoire conviennent que cette méthode modifiée utilisant l'adhésif cellulaire et tissulaire est plus facile à apprendre et Maître.
En résumé, la production de préparations de surface de souris adultes à monture entière est une compétence de base pour l'évaluation des pathologies cochléaires. Le protocole modifié décrit pour les préparations de surface de souris adultes simplifie cette procédure difficile.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Le projet de recherche décrit a été soutenu par la subvention R01 DC009222 du National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Ces travaux ont été réalisés dans l'édifice WR du MUSC dans un espace rénové soutenu par la subvention C06 RR014516. Les animaux ont été logés dans des installations musC CRI pour animaux, appuyés par la subvention C06 RR015455 du Programme des installations de recherche extra-muros du National Center for Research Resources. Les auteurs remercient le Dr Jochen Schacht pour ses précieux commentaires et Andra Talaska pour la relecture du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
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