Summary
Dieser Artikel stellt eine modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode vor, die eine Entkalkung und Verwendung eines Zell- und Gewebeklebers erfordert, um die Stücke der Cochlea-Epithel an 10 mm runden Abdeckungsscheinen für die Immunhistochemie bei erwachsenen Mauscochleae zu haften.
Abstract
Die auditive Verarbeitung in der Cochlea hängt von der Integrität der mechanosensorischen Haarzellen ab. Im Laufe eines Lebens kann Hörverlust aus zahlreichen Ätiologien wie der Exposition gegenüber übermäßigem Lärm, der Verwendung von ototoxischen Medikamenten, bakteriellen oder viralen Ohrinfektionen, Kopfverletzungen und dem Alterungsprozess erworben werden. Der Verlust sensorischer Haarzellen ist ein häufiges pathologisches Merkmal der Varianten des erworbenen Hörverlusts. Zusätzlich kann die innere Haarzellsynapse durch leichte Beleidigungen beschädigt werden. Daher sind Oberflächenpräparate von Cochlea-Epithelien in Kombination mit Immunetikettierungstechniken und konfokalen Bildern ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien, einschließlich des Verlustes von Bandsynapsen und sensorischen Haarzellen, Veränderungen des Proteinspiegels in Haarzellen und unterstützenden Zellen, die Regeneration der Haarzellen und die Bestimmung der Berichtsgenexpression (d. h. GFP) zur Überprüfung der erfolgreichen Transduktion und Identifizierung von transduzierten Zelltypen. Die Cochlea, eine knöcherne spiralförmige Struktur im Innenohr, hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Sensorische Haarzellen und umgebende Stützzellen im OC sind im Cochlea-Kanal enthalten und ruhen auf der Basilarmembran, die tonotopisch mit hochfrequenter Detektion in der Basis und niederfrequenter Inderin im Scheitelpunkt organisiert ist. Mit der Verfügbarkeit molekularer und genetischer Informationen und der Fähigkeit, Gene durch Knockout- und Knock-in-Techniken zu manipulieren, wurden Mäuse in der biologischen Forschung weit verbreitet, auch in der Hörwissenschaft. Die erwachsene Mauscochlea ist jedoch winzig, und das Cochlea-Epithel ist in einem knöchernen Labyrinth eingekapselt, was die Mikrodissektion erschwert. Obwohl In vielen Laboratorien Seziertechniken entwickelt und eingesetzt wurden, ist diese modifizierte Mikrodissektionsmethode mit Zell- und Gewebeklebstoff einfacher und bequemer. Es kann in allen Arten von erwachsenen Maus Cochleae nach Entkalkung verwendet werden.
Introduction
Die Cochlea ist der Erkennung von Klang gewidmet und für das Hören verantwortlich. Der Cochlea-Kanal ist spiralförmig im knöchernen Labyrinth gewickelt und hält das auditive Sinnes-Endorgan, das Organ von Corti (OC). Das OC ruht auf der Basilarmembran, die das Cochlea-Epithel mit einer Länge von etwa 5,7 mm besteht, wenn es bei erwachsenen CBA/CaJ-Mäusen1,2abgewickelt wird. Da das OC tonotopisch mit hohen Frequenzen in der Basis und niedrigen Frequenzen in der Spitze detektiert ist, wird das Cochlea-Epithel oft in drei Teile für analytische Vergleiche unterteilt: die apikalen, mittleren und basalen Drehungen, die niedrigen, mittlere bzw. hochfrequente Erkennung. Zusätzlich zu einer Reihe von unterstützenden Zellen besteht das OC aus einer Reihe von inneren Haarzellen (IHCs), die sich medial befinden, und drei Reihen von äußeren Haarzellen (OHCs), die sich seitlich in Bezug auf die Cochlea-Spirale befinden.
Die korrekte auditive Verarbeitung hängt von der Integrität der sensorischen Haarzellen in der Cochlea ab. Die Schädigung oder der Verlust sensorischer Haarzellen ist ein häufiges pathologisches Merkmal erworbener Hörverluste, verursacht durch zahlreiche Ätiologien wie die Exposition gegenüber übermäßigem Lärm, die Verwendung von ototoxischen Medikamenten, bakterielle oder virale Ohrinfektionen, Kopfverletzungen und die Alterung Prozess3. Zusätzlich kann die Integrität und Funktion der inneren Haarzelle/Auditorennervensynapsen durch leichte Beleidigungen beeinträchtigt werden4. Mit der Verfügbarkeit molekularer und genetischer Informationen und der Manipulation von Genen durch Knockout- und Knock-in-Techniken sind Mäuse in der Hörwissenschaft weit verbreitet. Obwohl die adulte Mauscochlea winzig ist und das Cochlea-Epithel von einer knöchernen Kapsel umgeben ist, die zu technisch schwierigen Mikrodissektionen, Oberflächenpräparaten des Epithels in Kombination mit Immunlabeling oder Immunhistochemie führt. und konfokale Bilder wurden weit verbreitet für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien verwendet, einschließlich Verluste von Bandsynapsen und Haarzellen, Veränderungen in der Menge an Proteinen in sensorischen Haarzellen und unterstützenden Zellen, und Haarzellenregeneration. Cochlea-Oberflächenpräparate wurden auch verwendet, um das Muster der Expression von Reportergenen (d. h. GFP) zu bestimmen und eine erfolgreiche Transduktion zu bestätigen und transduzierte Zelltypen zu identifizieren. Diese Techniken wurden zuvor für die Untersuchung molekularer Mechanismen verwendet, die einem lärminduzierten Hörverlust zugrunde liegen, mit erwachsenen CBA/J-Mäusen5,6,7,8,9.
Im Gegensatz zur Immunhistochemie mit Paraffinabschnitten oder Kryoschnitten, um kleine Querschnittsteile der Cochlea zu erhalten, die drei äußere Haarzellen (OHCs) und eine innere Haarzelle (IHC) auf jedem Abschnitt enthalten, ermöglichen Cochlea-Oberflächenpräparate Visualisierung der gesamten Länge des OC zum Zählen sensorischer Haarzellen und Bandsynapsen und Immunolabeling von sensorischen Haarzellen entsprechend bestimmten Funktionellen Frequenzen. Tabelle 1 zeigt die Kartierung von Hörfrequenzen als Funktion der Entfernung entlang der Länge der Cochlea-Spirale in erwachsenen CBA/J-Maus nach Studien von Müller1 und Viberg und Canlon1,2. Cochlea-Oberflächenpräparate wurden weit verbreitet für die Untersuchung von Cochlea-Pathologien4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Die ganzmontierte Cochlea-Sektionsmethode wurde ursprünglich in einem Buch beschrieben, das 1966 von Hans Engstrom herausgegeben wurde16. Diese Technik wurde anschließend verfeinert und an eine Vielzahl von Arten angepasst, wie in der Literatur von einer Reihe von Wissenschaftlern in der Hörwissenschaftbeschrieben 10,11,12,13, 15,17 und von den Eaton-Peabody Laboratories at Massachusetts Eye and Ear18. Kürzlich wurde eine weitere Cochlea-Sektionsmethode von Montgomery et al.19berichtet. Die Mikrodissektion der Cochlea ist ein wesentlicher und kritischer Schritt für Cochlea-Oberflächenpräparate. Die Sezieren von Mauscochleae ist jedoch eine technische Herausforderung und erfordert umfangreiche Übung. Hier wird ein modifiziertes Cochlea-Oberflächenpräparat zur Verwendung bei erwachsenen Mauscochleae vorgestellt. Diese Methode erfordert eine Entkalkung und Verwendung von Zell- und Gewebeklebstoff (d. h. Cell-Tak), um die Stücke des Cochlea-Epithels an 10 mm runden Abdeckungen für die Immunkennzeichnung zu kleben. Zell- und Gewebeklebstoff wurde weit verbreitet für die Immunhistochemieverwendet 20. Diese modifizierte Cochlea-Mikrodissektionsmethode ist relativ einfach im Vergleich zu denen zuvor berichtet18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Forschungsprotokolle, an denen männliche erwachsene CBA/J-Mäuse im Alter von 10–12 Wochen und C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen beteiligt waren, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medical University of South Carolina (MUSC) genehmigt. Die Tierpflege stand unter der Aufsicht der Abteilung Labortierressourcen am MUSC.
HINWEIS: Für die nachstehend dargestellten Verfahren werden Mäuse durch intraperitoneale Injektionen mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anbeet. Mäuse werden enthauptet, nachdem das Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize wie eine Zehenzange reagiert.
1. Extraktion von Temporalknochen
- Enthaupten Sie die Maus sofort postmortem mit chirurgischen Schere (17 cm lang) und schneiden Sie den Schädelknochen mit einer Schere aus dem hinteren Aspekt nach vorne entlang der Mittellinie des Schädels nach der Exposition des Schädelknochens durch ziehen die Haut vordergründ.
- Entfernen Sie das Hirngewebe mit Zangen und entfernen Sie manuell die zeitlichen Knochen mit dem Daumen und Zeigefinger für Mäuse im Alter von drei Monaten oder älter. Verwenden Sie eine kleine chirurgische Schere (11 cm lang), um den zeitlichen Knochen von Mäusen zu schneiden, die jünger als drei Monate sind.
- Den Temporalknochen in eine Petrischale (30 mm Durchmesser) geben, die eiskalte frische 4%-Paraformaldehyd(PFA)-Lösung in phosphatgepufferter Saline (PBS), pH 7,4 gelöst enthält.
HINWEIS: Bereiten Sie frische 4% PFA-Lösung vor und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 kurz vor der Fixierung der temporalen Knochen ein, da ein unsachgemäßer pH-Ausgleich der PFA-Lösung die Qualität der Immunkennzeichnung verringert.
2. Fixierung und Perfusion
- Entfernen Sie die Bänder aus dem ovalen Fenster und durchstechen Sie die runde Fenstermembran mit der Größe #5 Zangen. Unter einem Stereo-Sektionsmikroskop machen Sie ein kleines Loch in die Spitze der Cochlea mit einer 27 G Nadel, die mit einer 1 ml Spritze verbunden ist.
- Die Cochlea mit 4% PFA-Lösung durchdringen Sie sanft und langsam über die runden und ovalen Fenster, bis die Lösung aus dem kleinen Loch an der Spitze wäscht. Übertragen Sie die Cochlea (ein oder zwei Cochlea pro Durchstechflasche) auf 20 ml Volumenszintillationsfläge mit 10 ml 4% PFA-Lösung.
- Rühren Sie die Szintillationsfläschchen bei Raumtemperatur (RT) vorsichtig 2 h und lassen Sie sie über Nacht im Kühlschrank (4 °C) auf einem Rotator.
HINWEIS: Die Fixierungszeit kann je nach verwendetem Antikörper angepasst werden. Beispielsweise ermöglicht die Begrenzung der Fixierung auf 1,5 h eine erfolgreiche Immunkennzeichnung von postsynaptischen Klemmen bei Verwendung des GluA 2-Antikörpers.
3. Entkalkung des Temporalknochens
- Entfernen Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Cochleae mit frischen PBS 3x für jeweils 5 min.
- 20 ml 4% Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA)-Lösung (pH 7.4) in die Szintillationsfläschchen geben und 48–72 h auf einem Rotator mit sanfter Rührung im Kühlschrank aufbewahren. Ändern Sie die EDTA-Lösung täglich, bis die Cochleae entkalkt sind. Prüfen Sie, ob die Cochleae entkalkt werden, indem Sie den knöchernen vestibulären Teil mit Zangen berühren, um die Elastizität zu beurteilen, oder schneiden Sie einfach ein kleines Stück vom Rand des vestibulären Teils. Wenn ein solcher Schnitt zu einem zerkleinerten Stück führt, wird die Cochlea nicht entkalkt.
HINWEIS: Die EDTA-Lösung kann die Immunreaktion von Primärantikörpern je nach Lösungskonzentration beeinträchtigen. Bereiten Sie 4% EDTA in PBS vor und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Zur konsequenten Entkalkung der temporalen Knochen wird eine frische EDTA-Lösung verwendet. - Ändern Sie die Lösung in PBS für die Mikrodissektion, nachdem die Entkalkung abgeschlossen ist.
HINWEIS: Wenn die Cochleae nicht ausreichend entkalkt sind, kann die Zerlegung der Cochleae nicht durchgeführt werden.
4. Mikrodissektion des Cochlea-Epithels
HINWEIS: Sobald die Entkalkung abgeschlossen ist, muss die Mikrodissektion des Cochlea-Epithels zur Immunkennzeichnung so schnell wie möglich durchgeführt werden. In einer sauberen 30 mm Petrischale, die PBS enthält, ist das Innenohr wie folgt ausgerichtet: In Bezug auf die Oberseite (Deckel) und den Boden der Petrischale zeigen sich die runden und ovalen Fenster der Cochlea nach oben. In Bezug auf dissector ist der Cochlea-Anteil nach vorne (weg vom Dissektor) und vestibulären Teil nach hinten (nahezu dissektor) ausgerichtet. Im Folgenden werden die Schritte ausführlich beschrieben.
- Halten Sie den vestibulären Teil des temporalen Knochens mit Zangen und schneiden Sie die apikale Drehung mit dem Skalpell in einem 45°-Winkel, wie durch die rote Linie angegeben (Abbildung 1a).
- Schneiden Sie vertikal entlang der schwachen Linie zwischen dem runden Fenster und dem ovalen Fenster, wie durch die rote Linie (Abbildung 1b) angegeben, um die Cochlea vom vestibulären Teil zu trennen (Abbildung 1c).
HINWEIS: Dieser Cochlea-Teil enthält die mittleren, basalen und Hakenabschnitte des Epithels. - Legen Sie den Cochlea-Teil mit der Basaldrehung nach unten und die mittlere Drehung zur Spitze der Petrischale und schneiden Sie die knöcherne Kapsel und die Seitenwand der mittleren Drehung gegen ende, von dem der apikale Abschnitt entfernt wurde, wie durch die rote Linie (Figu) angezeigt re 1d,e).
- Weiter schneiden, um den mittleren Teil vollständig von den Basal- und Hakenbereichen zu trennen (Abbildung 1f,g).
HINWEIS: Der Hakenbereich der Cochlea ist das Ende des Cochlea-Epithels entsprechend der Empfindlichkeit gegenüber Tönen 48 kHz und höher bei Mäusen. - Legen Sie den Basal- und Hakenteil mit der Basilarmembran-Stelle nach unten der Schale und schneiden Sie den Modiolus vertikal aus dem Hakenbereich, um den Modiolus zu entfernen, wie durch die vertikale rote Linie angezeigt (Abbildung 1g).
HINWEIS: Der Modiolus ist die konisch geformte Mittelachse der Cochlea, die aus schwammigen Knochen- und Cochlea-Nerven sowie dem Spiralganglion besteht. Es kann vorzuziehen sein, diesen Schnitt mit einer Schere durchzuführen. - Schneiden Sie die Basal- und Hakenbereiche, wie die andere rote Linie in Abbildung 1g angibt, um den Hakenteil zu trennen (Abbildung 1h).
HINWEIS: Die Cochlea wurde nun in apikale, mittlere, basale und Hakenabschnitte unterteilt. Die nächsten Schritte sind die endgültige Zerlegung jeder einzelnen Drehung, am Beispiel der mittleren Drehung. - Schneiden Sie die relativ großen Teile der knöchernen Kapsel und des seitlichen Wandgewebes der mittleren Drehung weg, wie durch die rote Linie angegeben (Abbildung 1i).
HINWEIS: Die Seitenwand des Cochlea-Kanals wird durch das Spiralband und die Stria vascularis gebildet. - Halten Sie die Seitenwand mit Zangen, um die knöcherne Kapsel und die Seitenwand mit der Unterseite der Petrischale auszurichten und schneiden Sie diese Gewebe von der Basilarmembranseite. Dann glätten Sie die Probe, um die sensorische Haarzellenoberfläche seitlich nach oben zu richten. Schneiden Sie den Rest der knöchernen Kapsel und der seitenwand ab (Abbildung 1j).
- Entfernen Sie die tektoriale Membran mit Zangen, um den mittleren Bereich vollständig zu trennen (Abbildung 1k).
- Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.9 für die letzten Abschnitte der verbleibenden Umdrehungen oder Regionen, wie in Abbildung 1ldargestellt.
- Bereiten Sie einen 10 mm runden Deckelfürleg zur Haftung des sensorischen Epithels vor. Verwenden Sie eine Pipette, um 0,5 l Zell- und Gewebekleber in der Mitte des runden Deckellipsvon handverbreitern. Nach dem Trocknen (3–5 min bei RT), legen Sie die Deckel in PBS in Petrischalen.
- Alle vier Teile des Sinnesepithels auf den 10 mm runden Deckelschlupf in der Petrischale kleben. Halten Sie dann eine Kante des Coverslips, um ihn auf eine Vier-Well-Schale für Die Immunetikettierung oder Immunhistochemie zu übertragen (Abbildung 1m).
ANMERKUNG: Abbildung 2 zeigt die Position der hauptwichtigsten Schnitte.
5. Immunolabeling für Cochlea Synapsen
HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Protokoll zur Immunkennzeichnung von Cochlea-Synapsen wurde bereits beschrieben13. Präsynaptische Bänder wurden mit einem CtBP2-Antikörper (Maus-Anti-Carboxyl-Terminal-Bindungsprotein 2 IgG1, das die B-Domäne des RIBEYE Gerüstproteins kennzeichnen) gekennzeichnet. Postsynaptische Terminals wurden mit GluA2-Antikörpern (Maus-Antiglutamatrezeptor 2 IgG2a, Beschriftung unter Einheiten des AMPA-Rezeptors) gekennzeichnet.
- Waschen Sie das sensorische Epithel mit PBS 3x für 5 min jede Wäsche in einer Vier-Brunnen-Schale und fügen Sie dann 2 ml 2% nichtionisches Tensid (d.h. Triton-X 100) in die Schale für 30 min bei RT auf einem Rotator.
- Entfernen Sie die nichtionische Tensidlösung mit einer Pipette aus der Schale und fügen Sie 100 L Blockierlösung, die 10% normales Ziegenserum enthält, zu jedem Brunnen für 1 h auf einem Rotator mit sanfter Rührung bei RT hinzu.
- Entfernen Sie die Blockierlösung von jedem Brunnen, waschen Sie mit PBS 3x für 5 min jede Wäsche unter sanfter Rührung bei RT.
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 l der primären Antikörper hinzu, die mit PBS verdünnt wurden: Maus-Anti-GluA2-IgG2a (1:2.000), Maus-Anti-CtBP2-IgG1 (1:400). Bedecken Sie jede Vier-Brunnen-Schale mit ihrem Deckel und legen Sie sie in einen großen befeuchteten Behälter, der vor Licht schützt. Bei 37 °C für 24 h inkubieren.
HINWEIS: Optional können Kaninchen-Antimyosin VIIa (1:400) zur Immunkennzeichnung sensorischer Haarzellen hinzugefügt werden. - Waschen Sie 3x mit PBS für 5 min jede Wäsche mit sanfter Rührung bei RT.
- Fügen Sie 100 l der sekundären Antikörper Alexa 594 Ziege Anti-Maus IgG1a (1:1,000), Alexa 488 Ziege Anti-Maus IgG2a (1:1,000) mit PBS zu jedem Brunnen verdünnt. Bedecken Sie jede Vier-Brunnen-Schale mit ihrem Deckel und legen Sie sie in einen großen befeuchteten Behälter, der vor Licht schützt. Bei 37 °C für 2 h inkubieren.
HINWEIS: Wenn Myosin VIIa verwendet wird, fügen Sie Alexa 350 Ziege Anti-Kaninchen (1:200). - 3x mit PBS für 5 min waschen. Dann übertragen Sie den 10 mm runden Deckelaufschub auf einen Schlitten mit den Proben oben.
- Fügen Sie vorsichtig 8 l Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in die Mitte des Deckels ein. Halten Sie dann die Kante eines weiteren 10 mm runden Deckelslip mit Zangen auf der Oberseite zu montieren, Sandwiching die beiden Abdeckungen zusammen.
- Verwenden Sie Nagellack, um die Dias zu versiegeln, legen Sie sie in einen Papp-Dia-Ordner, und im Kühlschrank zu speichern.
HINWEIS: Wenn während der Montage ein Fluoro-Gel zwischen den Abdeckungen austritt, reinigen Sie die Kanten der Abdeckungen, bevor Sie den Schlitten mit Nagellack abdichten. Konfokale Bilder müssen innerhalb von 7 Tagen aufgenommen werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oberflächenpräparate des Cochlea-Epithels in Kombination mit Immunolabeling und konfokaler Bildgebung wurden in der Hörwissenschaft zur Untersuchung von Cochlea-Pathologien, wie z. B. Quantifizierung von Bandsynapsen, sensorischen Haarzellen, und Proteinexpression in sensorischen Haarzellen5,6,7,8. Obwohl die Zerlegung der erwachsenen Mauscochleae für Oberflächenpräparate nicht einfach ist, können neue Absolventen diese modifizierte Methode nach dem Üben mit 10–15 Ohren lernen(Abbildung 1 und Abbildung 2). Mit dieser Technik, in Kombination mit Immunolabeling für CtBP2 (ein Marker für präsynaptische Bänder) und GluA2 (ein Marker für postsynaptische Klemmen), Zählen Von IHC/Auditoren Nervensynapsen mit konfokalen Bildern unter Z-Projektionen mit 0,25 m Intervallen, basierend auf die Größe der Maus Band Synapsen, ist möglich21. Dies entspricht den veröffentlichten Ergebnissen4,6,13. Oberflächenpräparate von CBA/J-Mäusen (ohne Behandlung) im Alter von 10–12 Wochen immunlabeliert mit CtBP2 (rot) und GluA2 (grün) zeigten, dass sich sowohl präsynaptische Bänder als auch postsynaptische Klemmen unterhalb der IHC-Kerne befinden und funktionale Synapsen (Abbildung 3)6,13.
Durch die Immunkennzeichnung von Oberflächenpräparaten mit verschiedenen Antikörpern ist eine Bewertung der molekularen Signalisierung und Struktur in sensorischen Haarzellen möglich. Beispiel 4 zeigt die Ergebnisse für die Immunkennzeichnung von Myosin VIIa und Gegenfärbung mit Phalloidin und 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Parallele Immunlabeling-Experimente mit und ohne Zell- und Gewebeklebstoff mit identischen Lösungen wurden durchgeführt, um zu beurteilen, ob der verwendete Klebstoff die Immunreaktionen stört. Cochlea-Oberflächenpräparate wurden mit Myosin VIIa immunmarkiert und mit Phalloidin kontrakariert. Konfokale Bilder wurden mit einer 63-fachen Vergrößerungslinse unter identischen Bedingungen und gleichen Parametereinstellungen für Lasergewinne und Photomultiplier-Rohrgewinne (PMT) aufgenommen. Es gab keinen Unterschied in Immunreaktionen oder Gleichförmigkeit mit und ohne Zell- und Gewebekleber (Abbildung 5). Mit Hilfe verschiedener Fixative n.A. bilden Oberflächenpräparate die Grundlage für Rasterelektronenmikroskopie (SEM)-Bilder zur Visualisierung von Cochlea-Stereocilia9. C57BL/6J-Mäuse (ohne Behandlung) im Alter von 6–8 Wochen zeigen gut organisierte V-förmige Stereocilia von OHCs in drei Reihen (Abbildung 6). Zusätzlich wurden Cochlea-Oberflächenpräparate verwendet, um das Expressionsmuster eines Berichtsgens (d. h. GFP) zu bestimmen und eine erfolgreiche Transduktion zu bestätigen und transduzierte Zelltypen zu identifizieren.
Abbildung 1: Darstellung der Schritte für Erwachsene Maus Oberflächenvorbereitungen. (a) Die Cochlea-Knochenkapsel des Temporalknochens zeigt sich nach oben. Die rote Linie zeigt den ersten Schnitt an, um die apikale Drehung zu trennen. RW = rundes Fenster, OW = ovales Fenster. (b) Der Scheitelpunkt ist von der Cochlea getrennt, wie durch den Pfeil angegeben. Die rote Linie zwischen rundem und ovalem Fenster zeigt den zweiten Schnitt in der Cochlea an. (c) Der Cochlea-Teil, der die mittleren, basalen und Hakenbereiche enthält, wird vom vestibulären Teil getrennt. (d) Der Cochlea-Teil befindet sich nach oben. Die rote Linie zeigt den dritten Schnitt an, der auf das Ende gerichtet ist, von dem der apikale Abschnitt entfernt wurde. (e) Der Pfeil zeigt die Lücke an, die nach Abschluss des dritten Schnitts übrig geblieben ist. (f) Dieses Bild zeigt den mittleren Bereich. (g) Dieses Bild zeigt die kombinierten Basal- und Hakenbereiche. Die vertikale rote Linie zeigt den Schnitt zwischen dem Modiolus- und dem Hakenbereich an. Der Schnitt zwischen den Basal- und Hakenbereichen wird durch die andere rote Linie angezeigt. (h) Basal- und Hakenbereiche sind durch die Pfeile angegeben getrennt. (i) Der mittlere Bereich der knöchernen Kapsel wird durch die rote Linie angegeben geschnitten. (j) Das Bild zeigt den mittleren Bereich, nachdem eine Seite der knöchernen Kapsel entfernt wurde. (k) Dieses Bild zeigt den mittleren Bereich nach Abschluss der Zerlegung. (l) Alle vier Regionen sind vollständig seziert. (m) Cochlea dreht sich auf einem 10 mm runden Deckslip, der auf eine Vier-Well-Petrischale mit den vier angegebenen Bereichen übertragen wird. Alle Bilder wurden unter einem Stereo-Sezieren-Mikroskop mit 1,2x, 2,5x und 0,6x Vergrößerungen aufgenommen. Maßstabsleisten werden in jedem Bild angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Position der hauptschneidenden Schnitte. Die gesamte Cochlea-Knochenkapsel wurde entfernt. Die Standorte der großen Einschnitte sind angegeben. 1) Die Stelle, an der die apikale Kurve geschnitten wird. 2) Der Ort, an dem die mittlere Kurve getrennt ist. 3) Der kritische Schnitt, um den Modiolus zu entfernen. 4) Die Linie, um die Basal- und Hakenbereiche zu teilen. Maßstabsleiste = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Konfokale Bilder zeigen die Immunkennzeichnung für CtBP2 und GluA2 auf Oberflächenpräparaten für Erwachsene. Die apikalen, mittleren und basalen Bereiche sind gekennzeichnet. Die konfokalen Bilder der unteren Vergrößerung wurden mit einem 10-fachen Objektiv aufgenommen. Rot = CtBP2, grün = GluA2. Skala bar = 100 'm. Konfokalbilder von 5-, 16- und 32-kHz-Regionen wurden mit einem 63-fachen Objektiv aufgenommen. Vergrößerte Ansichten der Bereiche, die durch die weißen Rechtecke in den Spitzen-, Mittel- und Basisteilen angezeigt werden. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Konfokale Bilder zeigen die Immunkennzeichnung sensorischer Haarzellen einer Oberflächenpräparation aus dem 32-kHz-Bereich. Alle Bilder wurden Z-Stack-Projektionen zusammengeführt. Phalloidin (grün) färbte die Struktur der drei Reihen von OHCs und einer Reihe von IHCs. Myosin VIIa (rot) immunmarkiert drei Reihen von OHCs und eine Reihe von IHCs. DAPI-gebeizte Haarzellkerne. Zusammengeführte konfokale Bilder wurden für Seitenansichten sensorischer Haarzellen rekonstruiert. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Cochlea-Oberflächenpräparate mit und ohne Zell- und Gewebeklebstoff wurden parallel verarbeitet, immunlabeliert für Myosin VII (rot) und mit Phalloidin (grün) mit identischen Lösungen gegengefärbt. Der verwendete Zell- und Gewebeklebstoff stört immunauflöst nicht. Konfokale Bilder wurden mit einer 63-fachen Vergrößerungslinse unter identischen Bedingungen und gleichen Parametereinstellungen aufgenommen. Die Bilder stammen aus dem 32-kHz-Gebiet. Die Immunolabelierung für Myosin VIIa und die Färbung von Phalloidin in OHCs war ähnlich mit und ohne Zell- und Gewebeklebstoff. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt drei Reihen von OHC-Stereocilia von C57BL/6J-Mäusen. Die Bilder stammen aus dem mittleren Raum. (a) Eine Ansicht mit geringer Vergrößerung von drei Reihen von OHCs. (b) Vergrößerte Bilder zeigen drei Reihen gut organisierter OHC-Stereokilia, die in "V"-Formen erscheinen. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | ||||||||
| Abstand vom Scheitelpunkt (mm) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| Entfernung vom Scheitelpunkt (%) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Frequenzen (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tabelle 1: Kartierung der Cochlea-Frequenzempfindlichkeit cbA/J-Maus in Abhängigkeit von der Entfernung vom Scheitel punktiv nach Müller1 und Viberg und Canlon2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Cochlea-Mikrodissektion von Flächenpräparaten mit ganzer Montage in Kombination mit Derimmunolabeling stellt ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung von Innenohrpathologien und molekularen Mechanismen bereit. Diese modifizierte Cochlea-Sektionsmethode für Erwachsene mit zell- und Gewebeklebstoff vereinfacht dieses schwierige Verfahren.
Obwohl diese modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode relativ einfach und zugänglich ist, erfordert sie dennoch Praxis, um Fähigkeiten zu erlangen. Um die richtigen Schnitte vorzunehmen, braucht der Dissektor eine sorgfältige Konzentration. Da die cochlea sensorischen Haarzellen in der Basaldrehung so nah am spiralförmigen Limbus sind, ist es schwierig, das Limbusgewebe vollständig zu entfernen, damit die Oberflächenvorbereitung vollständig flach liegen kann, aber konfokale Z-Projektionen können dieses Problem kompensieren. Darüber hinaus ist der Hakenbereich der Cochlea immer noch der schwierigste Teil, der seziert werden kann. Es können Trennungen zwischen OHCs und IHCs der Hook-Region auftreten. Der Hakenbereich weist große anatomische Variationen beim Menschen auf und ist wichtig für das Knochenleitende Hören22,23. Basierend auf der cochlea-Frequenz-Mapping von Müller1 und Viberg und Canlon2berichtet, entspricht der Hakenbereich, beginnend um 4,7 mm von der Spitze, der Empfindlichkeit 48 kHz Töne und höher (Tabelle 1), während auditive funktionelle Beurteilungen des erworbenen Hörverlusts bei Mäusen, einschließlich lärminduzierter, aminoglykosidinduzierter Hörverlust, und altersbedingter Hörverlust werden in der Regel bei 8, 16 und 32 kHz mit auditiver Hirnstammreaktion (ABR)5,6 ,7,9,24 und von 6-45 kHz mit Verzerrungsprodukt otoakustische Emission (DPOAE)25. In Übereinstimmung mit Montgomery et al. wird eine Verzerrung des Epithels nicht häufig beobachtet, wenn die Spirale in 3–4 Stücke19geteilt wird.
Die hier vorgestellte modifizierte Methode beinhaltet die Zerstückerung der Cochlea-Spirale in nur vier Teile (Apex, Mittlere, Basaldrehungen und den Hakenbereich), während die Eaton-Peabody-Technik sechs Stücke18produziert. Die Eaton-Peabody-Technik beginnt mit einem Cochlea-Bisektion, der es vermeidet, tangentiale Schnitte durch das Epithel zu machen, um zunächst die apikale Drehung vom Rest der Spirale zu trennen, wie in dieser modifizierten Technik beschrieben. Durch die Herstellung kleinerer Stücke wurde die Eaton-Peabody-Technik entwickelt, um die Abflachung zu minimieren, die erforderlich ist, um ein großes Stück mit einem Tauchobjektiv zu betrachten. Tatsächlich erleichtern die größeren Teile des Gewebes die Messung der Frequenzzuordnung von der apikalen zur basalen Drehung, in Übereinstimmung mit Montgomery et al.19. Darüber hinaus besteht ein Unterschied zwischen dieser Methode und Montgomery et al.19 darin, dass die hier beschriebene modifizierte Cochlea-Sektionsmethode ein Skalpell für die meisten Schnitte verwendet und nur ein Schritt mit der Schere erfolgt (d.h. die Trennung von Basal- und Hakenbereichen als im dritten Schnitt in Abbildung 2dargestellt, während Montgomery et al.19 eine Schere mit einer silikonelastomerbeschichteten Sezierschale für Oberflächenzubereitungen verwendeten. Um eine Verzerrung des Gewebes zu vermeiden, ist die Trennung der Basilarmembran zur Entfernung des Modiolus von entscheidender Bedeutung.
Dieses Protokoll verwendet einen Zell- und Gewebekleber(Materialtabelle) zur Haftung der Cochlea-Epithelstücke auf dem 10 mm runden Deckelfürschlag für die Immunkennzeichnung oder Immunhistochemie, was die Prozesse bequemer macht und den Verlust von Epithelgewebe während der mehrfachen Abwass von Immunlabeling-Verfahren. Zell- und Gewebeklebstoff ist eine Formulierung von polyphenolischen Proteinen, die an Zellen und Geweben haftet und in vielen gängigen In-vitro-Techniken weit verbreitet ist, einschließlich Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und Immunoassays20. Im Einklang mit der Vorstellung, dass der Zell- und Gewebeklebstoff die Immunreaktionen nicht beeinträchtigt, zeigt die parallele Immunkennzeichnung von Myosin VIIa mit Oberflächenpräparaten keinen Unterschied zwischen Immunreaktionen oder Gleichförmigkeit mit und ohne Zelle und Gewebe. Klebstoff. Vergleicht man diese drei Seziermethoden (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, und die beschriebene modifizierte Methode), sind sich die Absolventen im Labor einig, dass diese modifizierte Methode mit dem Zell- und Gewebekleber leichter zu erlernen und Master.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Herstellung von Oberflächenpräparaten für Erwachsene eine Grundfertigkeit für die Bewertung von Cochlea-Pathologien ist. Das beschriebene modifizierte Protokoll für oberflächenreife Oberflächenpräparate für erwachsene Mäuse vereinfacht dieses schwierige Verfahren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Das beschriebene Forschungsprojekt wurde durch das Stipendium R01 DC009222 vom National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health, unterstützt. Diese Arbeiten wurden im WR-Gebäude des MUSC in renoviertem Raum durchgeführt, der durch den Zuschuss C06 RR014516 unterstützt wurde. Die Tiere wurden in MUSC CRI-Tiereinrichtungen untergebracht, die durch das Stipendium C06 RR015455 aus dem Extramural Research Facilities Program des National Center for Research Resources unterstützt wurden. Die Autoren danken Dr. Jochen Schacht für seine wertvollen Kommentare und Andra Talaska für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
