Summary
מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.
Abstract
עיבוד השמיעה בתוך שבלול תלוי בשלמות של תאי השיער המכניים. במשך החיים, אובדן שמיעה ניתן לרכוש הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, השימוש בתרופות האוטוטוקסינים, זיהומים חיידקיים או נגיפי האוזן, פציעות ראש, ואת תהליך ההזדקנות. אובדן תאים שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של זנים של אובדן שמיעה נרכש. בנוסף, תא השיער הפנימי סינפסה יכול להיפגע על ידי עלבונות קלים. לכן, ההכנות פני השטח של epithelia שבלול, בשילוב עם טכניקות אימונויניום ודימויים קונפוקלית וקד, הם כלי שימושי מאוד לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של רצועת הכלים ותאי שיער חושי, שינויים ברמות החלבונים בתאי השיער והתאים התומכים, התחדשות תאי השיער וקביעת הביטוי הגנטי של הדוח (כלומר, GFP) לאימות התמרה מוצלחת וזיהוי של סוגי תאים שעברו התמרה. שבלול, מבנה בצורת ספירלה גרמי באוזן הפנימית, מחזיק את האיבר החושי קצה השמיעה, האיבר של Corti (OC). תאים שיער חושי התאים התומכים המקיפים ב-OC הם כלולים צינור שבלול ולנוח על קרום בזיאר, מאורגן באופנה tonotopic נושא עם זיהוי תדר גבוה המתרחשים בבסיס ובתדר נמוך בקודקוד. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ואת היכולת לתמרן גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במחקר ביולוגי, כולל במדעי השמיעה. עם זאת, העכבר המבוגר שבלול הוא זעיר, ואת האפיתל שבלול הוא כימוס במבוך הגרמי, הפיכת מיקרו לנתיחה קשה. למרות טכניקות הניתוח פותחו ונעשה שימוש במעבדות רבות, זו שיטה מיקרודיסקציה שונה באמצעות דבק תא ורקמות קל יותר ונוח יותר. ניתן להשתמש בו בכל סוגי שבלול העכבר המבוגר בעקבות decalcification.
Introduction
שבלול מוקדש זיהוי של קול ואחראי לשמיעה. תעלת השבלול מתפתל בצורת ספירלה במבוך הגרמי ומחזיקה את האיבר החושי הסופי של השמיעה, העוגב של קורטי (OC). OC נח על קרום בזיאר, הפיכת האפיתל שבלול, עם אורך של כ 5.7 מ"מ כאשר הסרת מתפתל ב cba/caj עכברים מבוגרים1,2. בגלל OC הוא tonotopically מריחה על הרקמות עם תדרים גבוהים זוהה בבסיס תדרים נמוכים בפיסגה, אפיתל שבלול מחולק לעתים קרובות לשלושה חלקים עבור השוואות אנליטיות: apical, האמצעי, ו בסיס הופך מתאים נמוך, בינוני, וזיהוי תדר גבוה, בהתאמה. בנוסף למערך של תאים תומכים, ה-OC מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים (IHCs) הממוקמת באופן מדעי ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים (OHCs) ממוקמים באופן משני ביחס לספירלה השבלול.
עיבוד שמיעתי נכון תלוי בשלמות תאי השיער החושי בתוך שבלול. נזק או אובדן של תאי שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של אובדן שמיעה נרכש, שנגרמו על ידי הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, שימוש בתרופות אוטוטוקסיות, דלקות אוזניים חיידקי או נגיפי, פציעות ראש, והזדקנות תהליך3. בנוסף, את היושרה והתפקוד של תא השיער הפנימי/מעצבי העצב השמיעה יכול להיות לקוי על ידי העלבונות קל4. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ומניפולציה של גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במדע שמיעה. למרות שבלול העכבר המבוגר הוא זעיר ואת האפיתל שבלול הוא מוקף כמוסה גרמי וכתוצאה מכך מיקרוניתוח קשה מבחינה טכנית, משטח ההכנות של האפיתל בשילוב עם אימונויניום או אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית וקד שימשו באופן נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של הסרט ותאי השיער, שינויים ברמות של חלבונים בתאי שיער חושי ותאים תומכים, והתחדשות תא השיער. ההכנות פני השטח שבלול שימשו גם כדי לקבוע את תבנית הביטוי של גנים הכתב (כלומר, GFP) ולאשר התמרה מוצלחת ולזהות סוגי תאים התמרה. טכניקות אלה שימשו בעבר למחקר של מנגנונים מולקולריים בבסיס אובדן שמיעה המושרה רעש באמצעות מבוגרים cba/J עכברים5,6,7,8,9.
בניגוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות מקטעים פרפין או קריוקטדורים כדי לקבל חלקים החוצה חתך קטן של שבלול המכילים שלושה תאים השיער החיצוני (OHCs) ואחד תא השיער הפנימי (IHC) על כל קטע, משטח שבלול ההכנות לאפשר ויזואליזציה של האורך כולו של OC לספירת תאים שיער חושי וסינפסות סרט ואימונויניום של תאי שיער חושי המתאימים תדרים פונקציונליים ספציפיים. טבלה 1 מראה את המיפוי של תדרי שמיעה כפונקציה של מרחק לאורך הספירלה שבלול ב-cba/J עכבר למבוגרים על פי לימודים מולר1 ו Viberg ו canlon1,2. ההכנות פני השטח שבלול כבר בשימוש נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13.14,15 שיטת הניתוח השבלול המלא תוארה במקור בספר שנערך על ידי הנס אנגלסטרום ב-196616. טכניקה זו הייתה מעודנת ומותאמת למגוון של מינים כמתואר בספרות על ידי מספר מדענים במדעי השמיעה10,11,12,13, 15,17 ועל ידי מעבדות איטון-פיבודי ב מסצ עין ואוזן18. לאחרונה דווח על שיטה נוספת לחיתוך שבלול על-ידי מונטגומרי ואח '19. מיקרודיסקציה של שבלול הוא צעד חיוני וקריטי עבור ההכנות פני השטח של שבלול. עם זאת, מבתר כנימת העכבר הוא אתגר טכני ודורש פרקטיקה ניכרת. כאן, שיטת הכנה לפני השבלול שונה מוצגת לשימוש כנימת העכבר למבוגרים. שיטה זו דורשת decalcification ושימוש בדבק תא ורקמות (כלומר, Cell-Tak) כדי לדבוק פיסות של אפיתל שבלול כדי 10 מ"מ שמיכות עגול מחליק עבור immunolabeling. דבק תא ורקמה שימש באופן נרחב עבור אימונוהיסטוכימיה20. שיטה זו שונה לנתיחה המיקרודיסקציה היא פשוטה יחסית לאלה שדווחו בעבר18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי המחקר מעורבים גברים מבוגרים CBA/J עכברים בגילאי 10 – 12 שבועות ו C57BL/6J עכברים בגילאי 6 – 8 שבועות אושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC). טיפול בבעלי חיים היה תחת פיקוחו של החטיבה למשאבי בעלי חיים במעבדה ב-MUSC.
הערה: עבור ההליכים המוצגים להלן, עכברים מורדם עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) באמצעות זריקות הצפק. לאחר שהחיה כבר לא מגיבה לגירויים כואבים, כגון צביטה בבוהן.
1. הפקת עצמות הרקה
- ערוף את ראשו של העכבר מיד לאחר המוות עם מספריים כירורגית (17 ס מ ארוך) וחותכים את עצם הגולגולת עם מספריים מן ההיבט האחורי קדימה לאורך קו המרכז של הגולגולת לאחר חשיפת עצם הגולגולת על ידי משיכת העור בהמתנה.
- הסר את רקמת המוח באמצעות מלקחיים ולהסיר ידנית את עצמות הזמן עם האגודל ואת האצבע המדד עבור עכברים שלושה חודשים של גיל או מבוגר. השתמש במספריים כירורגיים קטנים (11 ס מ ארוכים) כדי לחתוך את עצם הרקה של עכברים צעירים יותר מאשר בן שלושה חודשים.
- לשים את עצם הרקה לתוך צלחת פטרי (30 מ"מ קוטר) המכיל קרח קר טרי 4% פאראפורמלדהיד (בחצי הקרחון) פתרון מומס פוספט מואגור פוספטים (PBS), pH 7.4.
הערה: הכינו את הפתרון הבולייתי טרי 4% והתאימו את ה-pH ל-7.4 בדיוק לפני תיקון עצמות הזמן, מכיוון שאיזון החומציות הבלתי-מכוון של הפתרון ברמה הגבוהה ביותר יקטין את איכות האימונוולטילינג.
2. קיבוע והפרזיה
- הסר את הסטייבס מהחלון הסגלגל ונקב את קרום החלון העגול עם גודל #5 מלקחיים. תחת מיקרוסקופ לחיתוך סטריאו לעשות חור קטן לתוך קודקוד של שבלול באמצעות מחט של 27 גרם מחובר מזרק 1 mL.
- בעדינות ובאיטיות מסנן את שבלול עם 4% הפתרון הכאואלי דרך החלונות העגולים והסגלגל עד הפתרון שוטף מהחור הקטן בקודקוד. העבר את הכלאה (כנימת שבלול אחת או שתיים לכל בקבוקון) עד 20 מ ל בנפח המכיל 10 מ ל של 4% הפתרון האנגלי.
- בעדינות מתפרעים בבקבוקונים בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h ולהשאיר לילה במקרר (4 ° c) על מסובבי.
הערה: הזמן של קיבעון יכול להיות מותאם בהתאם לנוגדן המשמש. לדוגמה, הגבלת הקיבעון ל-1.5 h תאפשר לחיסולולילינג מוצלחים של מסופי הפוסט-סינפטית באמצעות נוגדן GluA 2.
3. הסרת עצם הרקה
- הסר את הפתרון בכיוון הדור השני ושטוף את הכנימת עם ה-PBS החדשה במשך 5 דקות לכל אחד.
- הוסיפו 20 מ ל של 4% מחומצת החומץ ניתרן (edta) תמיסת מלח (pH 7.4) לבקבוקונים ולשמור במקרר במשך 48 עד 72 שעות על מסובבי עם עצבנות עדינה. שנה את פתרון ה-EDTA מדי יום עד שהקוצ'ליק מתפורר. בדוק אם שבלול הינם מוגרמות על ידי נגיעה בחלק שיווי המידה הגרמי עם מלקחיים כדי להעריך גמישות או פשוט לחתוך חתיכה קטנה מהקצה של החלק של שיווי המידה. אם חיתוך כזה מביא ליצירה מרוסקת, השבלול אינו מדקע.
הערה: פתרון ה-EDTA עלול לשבש את הפעולה החיסונית של נוגדנים ראשוניים בהתאם לריכוז הפתרון. הכן 4% EDTA ב-PBS ולהתאים את ה-pH ל 7.4. לצורך הדקיפיקציה עקבית של עצמות הזמן, פתרון EDTA טרי משמש. - לשנות את הפתרון ל-PBS לניתוח מיקרו לאחר השלמת הdecalcification.
הערה: אם הקוצ'ליק אינו מספיק מסווג, לא ניתן לבצע את החיתוך של הקוצ'ליק.
4. מיקרוחיתוך של אפיתל השבלול
הערה: לאחר decalcification הוא השלם, מיקרוניתוח של אפיתל שבלול עבור immunolabeling צריך להתבצע בהקדם האפשרי. בצלוחית נקייה של 30 מ"מ המכילה את ה-PBS, האוזן הפנימית מכוונת באופן הבא: בהתייחסות לראש צלחת פטרי (מכסה) ולמטה, הסיבוב השבלול וחלונות הסגלגל פונים לפסגה. בהתייחסות לניתוח, החלק השבלול מכוון לכיוון החזית (הרחק מהנתח) והחלק האחורי של שיווי הבמה לעבר העורף (ליד מבתר). הפעולות הבאות מתארות את השלבים בפירוט.
- להחזיק את החלק באמצע הפרוזדור של עצם הרקה עם מלקחיים לחתוך את הפנייה פסגה עם אזמל בזווית 45 ° כפי שמצוין על ידי הקו האדום (איור 1א).
- חותכים אנכית לאורך הקו הקלוש שבין החלון העגול לחלון הסגלגל, כפי שמצוין בקו האדום (איור 1ב) כדי להפריד בין הקולאה לבין החלק של הפרוזדור (איור 1ג).
הערה: זה החלק שבלול מכיל את האמצע, בסיס, חלקים הוק של האפיתל. - מניחים את החלק של שבלול עם לפנות בסיס לכיוון התחתון ולהפוך את האמצע לכיוון העליון של צלחת פטרי וחותכים את הקפסולה הגרמית ואת הקיר הצדדי של הסיבוב האמצעי לקראת הסוף שממנו הוסר הסעיף העליון, כפי שמצוין על ידי הקו האדום (Figu re 1, e).
- המשך חיתוך כדי להפריד לחלוטין את החלק האמצעי מאזורי הבסיס והקרס (איור 1f, g).
הערה: אזור הקרס של שבלול הוא סוף האפיתל שבלול המתאים רגישות לטונים 48 kHz ומעלה בעכברים. - לשים את החלק הבסיס והקרס עם האתר קרום בזיאר מונחה לכיוון החלק התחתון של המנה ולחתוך אנכית מודיולוס את אזור הוו כדי להסיר את המודולוס כפי שמצוין על ידי הקו האדום האנכי (איור 1g).
הערה: מודיולוס הוא הציר המרכזי בצורת חרוט של השבלול המורכב של עצם ספוגית ועצב שבלול, כמו גם גנגליון ספירלה. ייתכן שעדיף לבצע את החיתוך עם מספריים. - חותכים את אזורי הבסיס וההוק כפי שהקו האדום השני מציין באיור 1g כדי להפריד בין החלקים (איור 1h).
הערה: שבלול הופרד כעת לתוך apical, באמצע, בסיס, ומנות וו. השלבים הבאים יהיו החיתוך הסופי של כל אחד מתורות הפרט, באמצעות הפנייה האמצעית כדוגמה. - חותכים את החלקים הגדולים יחסית של כמוסה גרמית ואת רקמת הקיר לרוחב של התור האמצעי כפי שמצוין על ידי הקו האדום (איור 1i).
הערה: הקיר הצדדי של צינור השבלול נוצר על ידי הרצועה הספירלית ואת ואסיקולאריס הניסטריה. - החזיקו את הקיר לרוחב עם מלקחיים כדי ליישר את הקפסולה הגרמית ואת הקיר הצדדי עם החלק התחתון של צלחת פטרי לחתוך את הרקמות האלה מהצד ממברנה בסילאר. ואז לשטח את הדגימה כדי לכוון את המשטח של תא השיער החושי למעלה. קצץ את שאר הקפסולה הגרמית ואת הקיר הצדדי (איור 1j).
- הסר את קרום tectorial באמצעות מלקחיים כדי להפריד לחלוטין את האזור האמצעי (איור 1k).
- חזור על שלבים 4.7-4.9 עבור הניתוח הסופי של התורים או האזורים הנותרים כמוצג באיור 1לערך.
- הכינו שמיכות סיבוב של 10 מ"מ לצורך הדבקה של האפיתל החושי. השתמש בפיפטה כדי להפיץ את 0.5 μL של תא ודבק ברקמות על מרכז הכיסויים העגולים. לאחר ייבוש (3 – 5 דקות ב RT), לשים את הכיסויים ב-PBS בצלחות פטרי.
- מקל את כל ארבעת פיסות האפיתל החושי על שמיכות סיבוב 10 מ"מ בצלחת פטרי. ואז להחזיק קצה אחד של שמיכות כדי להעביר אותו למנה ארבע היטב עבור immunolabeling או אימונוהיסטוכימיה (איור 1m).
הערה: איור 2 ממחיש את מיקום החתכים העיקריים.
5. אימונויוללינג עבור סינולשבלול
הערה: הפרוטוקול עבור אימונואולבלינג עבור סינאושולי שבלול ואחריו במחקר זה תוארה בעבר13. סרטים טרום סינפטיות סומנו עם נוגדן CtBP2 (עכבר נגד carboxyl-מסוף כריכת חלבון 2 IgG1, תיוג התחום B של חלבון פיגומים RIBEYE). מסופי סינפטית פוסט שתויגו עם GluA2 נוגדן (העכבר נגד גלוטמט קולטן 2 IgG2a, תיוג תת יחידות של קולטן אמפא).
- לשטוף את האפיתל החושי עם PBS 3x עבור 5 דקות כל כביסה בצלחת ארבע-טוב ולאחר מכן להוסיף 2 מ ל 2% nonionic הטריסטנט (כלומר, טריטון-X 100) לתוך הקערה עבור 30 דקות ב-RT על מסובבי.
- הסר את הפתרון הגולש nonionic מן התבשיל באמצעות פיפטה ולהוסיף 100 μL של פתרון חסימת המכיל 10% סרום עז רגיל לכל טוב עבור 1 h על מסובבי עם עצבנות עדינה ב RT.
- הסר את פתרון חסימת מכל טוב, לשטוף עם PBS 3x עבור 5 דקות כל לשטוף תחת עצבנות עדינה ב RT.
- הוסף 100 μL של הנוגדנים העיקריים מדולל עם PBS לכל טוב: העכבר anti-GluA2 IgG2a (1:2000), העכבר anti-CtBP2 IgG1 (1:400). מכסים כל מנה ארבע-היטב עם המכסה שלה ומקום לתוך מכולה גדולה מחולל לחות אשר מגן מפני אור. מודטה ב 37 ° c עבור 24 שעות.
הערה: כאופציה, ארנב anti-רירן VIIa (1:400) עבור אימונויניום שיער חושי תאים ניתן להוסיף. - כביסה 3x עם PBS עבור 5 דקות כל לשטוף עם עצבנות עדינה ב RT.
- הוסף 100 μL של נוגדנים משניים אלקסה 594 עז נגד עכבר IgG1a (1:1000), אלקסה 488 עז נגד עכבר IgG2a (1:1000) מדולל עם PBS לכל טוב. מכסים כל מנה ארבע-היטב עם המכסה שלה ומקום לתוך מכולה גדולה מחולל לחות אשר מגן מפני אור. מודטה ב 37 ° c עבור 2 h.
הערה: אם רירן VIIa משמש, להוסיף אלקסה 350 עז אנטי ארנב (1:200). - שטוף 3x עם PBS עבור 5 דקות. לאחר מכן, להעביר את שמיכות סיבוב 10 מ"מ על שקופית עם דגימות על גבי.
- הוסף בקפידה 8 μL של Fluoro-Gel עם מאגר טריס לתוך המרכז של coverslip. ואז להחזיק את הקצה של עוד 10 מ"מ שמיכות עגול עם מלקחיים כדי לעלות על גבי, sandwiching שני שמיכות יחד.
- שימוש לק לציפורניים לאטום את השקופיות, לשים אותם בתיקיה שקופית קרטון, ולאחסן במקרר.
הערה: אם כמה Fluoro-Gel דולף החוצה בין שמיכות במהלך הטעינה, לנקות את הקצוות של שמיכות לפני איטום השקופית עם לק. תמונות confocal וקד צריך להילקח בתוך 7 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
משטח ההכנות של האפיתל שבלול, בשילוב עם אימונויניום והדמיה קונפוקלית וקד, כבר נעשה שימוש נרחב במדע שמיעה לחקירה של פתווגיות שבלול, כגון כימות של הסינפסות של סרט, תאי שיער חושי, וחלבון ביטוי בתאי השיער הסנסוריים5,6,7,8. למרות הניתוח של כנימת העכבר מבוגרים עבור ההכנות פני השטח אינו פשוט, סטודנטים חדשים מוסמכים מסוגלים ללמוד שיטה זו שונה לאחר תרגול עם 10 – 15 אוזניים (איור 1 ואיור 2). עם טכניקה זו, בשילוב עם immunolabeling עבור CtBP2 (סמן עבור סרטים סינפטיות) ו GluA2 (סמן עבור מסופים הפוסט סינפטית), ספירת הסינפסות העצב ihc/השמיעה באמצעות תמונות קונפוקלית וקד תחת התחזיות Z עם 0.25 יקרומטר מרווחי זמן, מבוסס על בגודל של מחיצת העכבר הסינפסות, הוא אפשרי21. הדבר מתאים לתוצאותשפורסמו 4,6,13. ההכנות פני השטח של העכברים cba/J (ללא טיפול) בגיל 10 – 12 שבועות אימונויניום עם CtBP2 (אדום) ו GluA2 (ירוק) הראו כי שני סרטים סינפטיות ומסופים הפוסט סינפטית ממוקמים מתחת גרעיני ihc והם מפנים, המציין סינפסות פונקציונלית (איור 3)6,13.
על-ידי הכנות אימונואולבלינג עם נוגדנים שונים, הערכה של איתות מולקולרי ומבנה בתאי שיער חושי הוא אפשרי. לדוגמה, איור 4 מציג את התוצאות עבור immunolabeling עבור רירן viia וכתמים מנגד עם phalloidin ו 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (dapi). ניסויים אימונואולבלינג מקבילים עם ובלי דבק תא ורקמות באמצעות פתרונות זהים נערכו כדי להעריך אם הדבק המשמש מפריעה החיסונית. ההכנות פני השטח של שבלול היו אימונויניום עם רירן VIIa ומוכתם נגד phalloidin. תמונות confocal וקד נלקחו עם עדשת ההגדלה 63 x תחת תנאים זהים והגדרות פרמטר שווה עבור רווחי לייזר ושפופרת פוטואולטיפייר (PMT) רווחי. לא היה כל הבדל בפעולות חיסוריגיות או באחידות עם ובלי ההדבקה של התא והרקמה (איור 5). באמצעות תיקונים שונים, ההכנות פני השטח סיפקו את הבסיס לסריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תמונות עבור ויזואליזציה של stereocilia שבלול9. C57BL/6J עכברים (ללא טיפול) בגיל 6 – 8 שבועות להראות מאורגן היטב V בצורת סטריאוציליה של OHCs בשלוש שורות (איור 6). בנוסף, ההכנות למשטח השבלול שימשו כדי לקבוע את תבנית הביטוי של גן דו ח (כלומר, GFP) ולאשר התמרה מוצלחת ולזהות סוגי תאים מתתמרים.
איור 1: תיאור השלבים עבור ההכנות לפני השטח של העכבר המבוגר. (א) הקפסולה הגרמית שבלול של עצם הרקה פונה כלפי מעלה. הקו האדום מציין את החיתוך הראשון כדי להפריד את הפנייה האפיסופית. RW = חלון עגול, OW = חלון סגלגל. (ב) הקודקוד מופרד מ שבלול כפי שמצוין על ידי החץ. הקו האדום בין חלון עגול לחלון סגלגל מעיד על החתך השני שנוצר בתוך הקולאה. (ג) החלק של שבלול המכיל את אזורי האמצע, הבסיס והקרס מופרד מהחלק של שיווי המוני. (ד) החלק שבלול ממוקם מול כלפי מעלה. הקו האדום מציין את החתך השלישי, המכוון לקראת הסוף שממנו הוסר הסעיף הרשמי. (ה) החץ מציין את הפער שנותר לאחר השלמת החתך השלישי. (ו) תמונה זו מציגה את האזור האמצעי. (ז) תמונה זו מציגה את אזורי הבסיס וההוק המשולבים. הקו האדום האנכי מציין את החתך בין אזור המודולוס וההוק. החתך בין אזורי הבסיס והקרס מצוין על-ידי הקו האדום האחר. (ח) אזורי הבסיס והקרס מופרדים כפי שמצוין על-ידי החיצים. (i) האזור האמצעי של הקפסולה הגרמית נחתך כפי שמצוין על ידי הקו האדום. (j) התמונה מציגה את האזור האמצעי לאחר הסרת צד אחד של הקפסולה הגרמית. (k) תמונה זו מציגה את האזור האמצעי לאחר סיום הניתוח. (l) כל ארבעת האזורים הם לגזור לחלוטין. (m) שבלול הופך מודבקת 10 מ"מ שמיכות עגול הועבר לצלחת פטרי ארבע עם ארבעה אזורים כפי שצוין. כל התמונות נלקחו תחת מיקרוסקופ לחיתוך סטריאו ב 1.2 x, 2.5 x, ו 0.6 x המאגציות. סרגלי קנה מידה מצוינים בכל תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקום החתכים העיקריים. הקפסולה הגרמית כולה הוסרה. מיקומי החתכים העיקריים מצוינים. 1) המיקום שבו הפנייה האפיסופית נחתכת. 2) האתר שבו הפנייה האמצעית מופרדת. 3) החתך הקריטי להסרת המודולוס. 4) הקו לחלוקת אזורי הבסיס והקרס. סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות Confocal וקד לחשוף את האימונואולבלינג עבור CtBP2 ו GluA2 על פני השטח של העכבר מבוגרים ההכנות. האזורים האפical, האמצעיים והבזליים מתויג כמוצגים. ההגדלה התחתונה של התמונות. צולמו עם עדשת 10x אדום = CtBP2, ירוק = GluA2. סרגל בקנה מידה = 100 μm. תמונות Confocal וקד של 5-, 16-, ו 32-kHz האזורים נלקחו עם עדשת 63 x. תצוגות מוגדלות של האזורים המצוינים על-ידי המלבנים הלבנים במנות הפיסגה, האמצעית והבסיס. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות Confocal וקד לחשוף אימונויניום של תאים שיער חושי של משטח הכנה מאזור 32 kHz. כל התמונות היו מיזוג Z-מחסנית תחזיות. פלואלודין (ירוק) הכתים את מבנה שלוש השורות של הפקולטה ושורה אחת של IHCs. רירן VIIa (אדום) באמצעות שלוש שורות של הפקולטה למדעי השורה ושורה אחת של IHCs. DAPI-גרעיני שיער ויטראז '. תמונות מיזוג ממוזג שוחזרו לתצוגות צד של תאי שיער חושי. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: משטח שבלול ההכנות עם ובלי הדבק תא ורקמה עובדו במקביל, אימונויניום עבור רירן VII (אדום), ו מוכתם נגד phalloidin (ירוק) באמצעות פתרונות זהים. השימוש בתאי וברקמה אינו מפריע לפעולות החיסוריגיות. תמונות confocal וקד נלקחו עם עדשת הגדלה 63 x תחת תנאים זהים הגדרות פרמטר שווה. תמונות נלקחו מאזור kHz 32. אימונוולבילינג עבור רירן VIIa וכתמים עבור phalloidin ב OHCs היה דומה עם וללא הדבק תא ורקמות. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: סריקת המיקרוסקופיה האלקטרונית מציגה שלוש שורות של סטריאוסיליה מ-C57BL/6J. תמונות נלקחו מהאזור האמצעי. (א) תצוגה בעלת הגדלה נמוכה של שלוש שורות של ohcs. (ב) תמונות מוגדלות מציגות שלוש שורות של סטריאוסיליה מאורגנת היטב המופיעות בצורות "V". סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | ||||||||
| מרחק מן הפיסגה (mm) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| מרחק מהפיסגה (%) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| תדרים (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
טבלה 1: מיפוי רגישות לתדר CBA/J שבלול העכבר כפונקציה של מרחק מן הפיסגה לפי מולר1 ו Viberg ו canlon2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח שבלול של פני השטח הכולל בשילוב עם האימונואולבלינג מספק כלי בסיסי לחקירת הפתווגיות באוזן הפנימית ומנגנונים מולקולריים. זה שונה העכבר המבוגר לנתיחה שבלול שיטה באמצעות התא ואת הדבק מפשט את ההליך הזה קשה.
למרות שיטת ההכנה לפני שבלול זו שונה יחסית קלה ונגישה, היא עדיין דורשת תרגול כדי להשיג מיומנות. כדי לבצע את החתכים הנכונים, הבתר צריך ריכוז זהיר. כי תאי שיער שבלול חושי בתור בסיס הם כל כך קרובים לימבוס ספירלה, קשה להסיר באופן מלא את רקמת לימבוס כדי לאפשר הכנה לפני השטח לשכב שטוח לחלוטין, אבל קונפוקלית וקד Z-תחזיות יכול לפצות על בעיה זו. בנוסף, אזור הקרס של שבלול הוא עדיין החלק הקשה ביותר לנתח. הפרדות הצבע בין OHCs לבין רכיבי IHCs של אזור הhook עלולות להתרחש. אזור הקרס מציג וריאציות אנאטומיות גדולות בבני אדם, והוא חשוב לשמיעה של העצם-הולכה22,23. בהתבסס על מיפוי תדר שבלול שדווחו על ידי מולר1 ו-Viberg ו canlon2, אזור הוו, החל סביב 4.7 מ"מ מן הפיסגה, מתאים רגישות 48 kHz גוונים ומעלה (שולחן 1), ואילו פונקציונלי השמיעה הערכות של אובדן שמיעה נרכש עכברים, כולל המושרה רעש, עמינח גלילסייד המושרה אובדן שמיעה, ואובדן שמיעה הקשורות לגיל, הם בדרך כלל נמדד על 8, 16, ו 32 kHz עם תגובת המוח השמיעה התגובה (abr)5,6 ,7,9,24 ו מ 6-45 kHz עם מוצר עיוות הפליטה האקוסטית (dpoae)25. בהסכמה עם מונטגומרי ואח ', עיוות של האפיתל אינו נראה בדרך כלל כאשר הספירלה מחולקת 3 – 4 חתיכות19.
שיטת השינוי המוצגת כאן כרוכה בניתוח ספירלה שבלול לתוך ארבע חתיכות בלבד (איפקס, באמצע, פונה בסיס, ואת אזור הקרס), ואילו הטכניקה איטון-פיבודי מייצרת שש חתיכות18. הטכניקה איטון-פיבודי מתחיל בחיתוך שבלול, אשר מונע ביצוע חתכים באמצעות האפיתל כדי להפריד תחילה את הפנייה פסגה משאר הספירלה, כפי שמתואר בטכניקה זו שונה. על-ידי הפקת חלקים קטנים יותר, טכניקת איטון-פיבודי נועדה למזער את השיטוח הנדרש לצפייה ביצירה גדולה עם מטרת טבילה. למעשה, החלקים הגדולים יותר של רקמות להקל על המדידה של מיפוי תדירות מן האפוס לתור בסיס, בתור עם מונטגומרי ואח '19. בנוסף, הבדל בין שיטה זו לבין מונטגומרי ואח '19 הוא ששיטת הנתיחה שהשתנתה לניתוח שבלול שתוארה כאן מעסיקה אזמל עבור רוב החתכים ורק צעד אחד נעשה עם מספריים (כלומר, הפרדת אזורי הבסיס והקרס כ מומחש בחתך השלישי באיור 2), ואילו מונטגומרי ואח '19 השתמשו במספריים עם מיכל לחיתוך סיליקון מצופה אלסטומר לקראת ההכנות לפני השטח. כדי למנוע עיוות של הרקמה, הניתוק של קרום בזיאר כדי להסיר את המודולוס הוא קריטי.
פרוטוקול זה משתמש בדבק תא ורקמה (טבלה של חומרים) עבור הדבקה של פיסות האפיתל שבלול על הכיסויים 10 מ"מ שמיכות עבור immunolabeling או אימונוהיסטוכימיה, מה שהופך את התהליכים נוח יותר להתחמק אובדן של רקמות אפיתל במהלך שוטף מרובים של נוהלי האימונוולאבילינג. דבק תא ורקמה הוא ניסוח של חלבונים פוליפנונים שדבקים בתאים וברקמות, והשתמשו בו רבות בטכניקות שכיחות בתחומי החוץ, כולל אימונוהיסטוכימיה, היברידיזציה באתרו, וחיסוני20. בקנה אחד עם הרעיון כי דבק התא ורקמות אינו מפריע החיסונית, מקבילים אימונויניום של רירן VIIa עם פני השטח מראה שום הבדל של החיסונית או אחידות עם וללא תא ורקמות דבק. השוואת שלוש שיטות הניתוח (מעבדות איטון-פיבודי, מונטגומרי ואח '19, והשיטה שהשתנתה המתוארת), הסטודנטים לתואר שני במעבדה מסכימים שהשיטה המתוקנת הזאת באמצעות התא והדבקה ברקמה קל יותר ללמוד ו אסטר.
לסיכום, הפקת כל משטח העכבר למבוגרים ההכנות היא מיומנות בסיסית להערכת הפתווגיות שבלול. הפרוטוקול המתואר שונה עבור ההכנות של פני השטח עכברים למבוגרים מפשט הליך זה קשה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
פרויקט המחקר תיאר היה נתמך על ידי גרנט R01 DC009222 מן המכון הלאומי על חירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נערכה בבניין WR ב MUSC בחלל משופץ נתמך על ידי גרנט C06 RR014516. בעלי חיים היו שוכנו במתקני בעלי חיים MUSC, הנתמכת על ידי מענק C06 RR015455 מתוכנית מחקר של אקסטרקיר של המרכז הלאומי למשאבי מחקר. המחברים מודים לד ר ג'צ'ן שכטר על הערותיו היקרות ועל הגהה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
