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Neuroscience

वयस्क माउस में कॉकलियर सतह तैयारी

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60299
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2MOE Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Institute of Life Sciences, Southeast University

Summary

यह लेख एक संशोधित कॉकलियर सतह तैयारकरने की विधि प्रस्तुत करता है जिसमें वयस्क माउस कॉकलेमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए 10 मिमी गोल कवर स्लिप में कॉकलियर एपिथेलिया के टुकड़ों का पालन करने के लिए एक कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के कैकालसिफिकेशन और उपयोग की आवश्यकता होती है।

Abstract

कॉकलिया में श्रवण प्रसंस्करण मेचनोसेंसरी बालों की कोशिकाओं की अखंडता पर निर्भर करता है। जीवन भर में, अत्यधिक शोर के संपर्क, ओटोटॉक्सिक दवाओं के उपयोग, बैक्टीरियल या वायरल कान संक्रमण, सिर की चोटों और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया जैसे कई एटिओलोजी से सुनवाई हानि प्राप्त की जा सकती है। संवेदी बाल कोशिकाओं का नुकसान अधिग्रहीत सुनवाई हानि की किस्मों की एक आम रोग सुविधा है। इसके अतिरिक्त, आंतरिक बाल कोशिका सिनेप्स हल्के अपमान से क्षतिग्रस्त हो सकता है। इसलिए, इम्यूनोलेबलिंग तकनीकों और कॉन्फोकल इमेजरी के संयोजन में कॉकलियर एपिथेलिया की सतह तैयारी, कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, जिसमें रिबन सिनेप्स और संवेदी बाल कोशिकाओं का नुकसान शामिल है, सफल ट्रांसड्यूक्शन के सत्यापन और ट्रांसड्यूड सेल प्रकारों की पहचान के लिए बाल कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं, बाल कोशिका उत्थान और रिपोर्ट जीन अभिव्यक्ति (यानी, जीएफपी) के निर्धारण में प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन। कोचलिया, आंतरिक कान में एक बोनी सर्पिल के आकार की संरचना, श्रवण संवेदी अंत अंग, कोर्टी (ओसी) के अंग रखती है। ओसी में संवेदी बाल कोशिकाओं और आसपास के सहायक कोशिकाओं को कॉकलियर डक्ट में निहित किया जाता है और बेसिलिसर झिल्ली पर आराम किया जाता है, जो आधार में होने वाली उच्च आवृत्ति का पता लगाने और शीर्ष में कम आवृत्ति के साथ एक टोनोटोपिक फैशन में आयोजित किया जाता है। आणविक और आनुवंशिक जानकारी की उपलब्धता और नॉकआउट और नॉकआउट तकनीकों द्वारा जीन में हेरफेर करने की क्षमता के साथ, चूहों व्यापक रूप से जैविक अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है, सुनवाई विज्ञान में भी शामिल है । हालांकि, वयस्क माउस कॉकलेया छोटा है, और कॉकलियर एपिथेलियम को बोनी भूलभुलैया में समझाया जाता है, जिससे माइक्रोडिसेक्शन मुश्किल हो जाता है। यद्यपि विच्छेदन तकनीकों को कई प्रयोगशालाओं में विकसित और उपयोग किया गया है, सेल और ऊतक चिपकने वाला का उपयोग करने वाली यह संशोधित माइक्रोडिसेक्शन विधि आसान और अधिक सुविधाजनक है। यह decalcification के बाद वयस्क माउस कॉकले के सभी प्रकार में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

कॉकलया ध्वनि का पता लगाने और सुनवाई के लिए जिम्मेदार के लिए समर्पित है। कॉकलियर डक्ट बोनी भूलभुलैया में एक सर्पिल आकार में कुंडलित है और श्रवण संवेदी अंत अंग, कोर्टी (ओसी) के अंग रखती है । ओसी बेसिलियर झिल्ली पर टिकी हुई है, जो कॉकलियर एपिथेलियम बना रही है, जिसकी लंबाई लगभग 5.7 मिमी होती है जब वयस्क सीबीए/सीएजे चूहों1,2में अनकॉइल किया जाता है। क्योंकि ओसी को आधार में पाए गए उच्च आवृत्तियों और शीर्ष में कम आवृत्तियों के साथ आयोजित किया जाता है, कॉकलियर एपिथेलियम को अक्सर विश्लेषणात्मक तुलना के लिए तीन भागों में विभाजित किया जाता है: एपिकल, मध्य और बेसल कम करने के लिए संबंधित हो जाता है, मध्य, और उच्च आवृत्ति का पता लगाने, क्रमशः। सहायक कोशिकाओं की एक सरणी के अलावा, ओसी आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) की एक पंक्ति से बना है जो मध्यस्थ सर्पिल के संबंध में पार्श्व रूप से स्थित बाहरी बाल कोशिकाओं (OHCs) की तीन पंक्तियां स्थित हैं।

सही श्रवण प्रसंस्करण कॉकलिया में संवेदी बाल कोशिकाओं की अखंडता पर निर्भर करता है। संवेदी बाल कोशिकाओं के नुकसान या नुकसान अधिग्रहीत सुनवाई हानि की एक आम रोग सुविधा है, अत्यधिक शोर के संपर्क के रूप में कई etiologies की वजह से, ओटोटॉक्सिक दवाओं का उपयोग, जीवाणु या वायरल कान संक्रमण, सिर चोटों, और उंर बढ़ने प्रोसेस3. इसके अतिरिक्त, आंतरिक बाल कोशिका/श्रवण तंत्रिका सिनेप्स की अखंडता और कार्य हल्के अपमान से बिगड़ा जा सकता है4। आणविक और आनुवंशिक जानकारी की उपलब्धता और नॉकआउट और नॉकआउट तकनीकों द्वारा जीन के हेरफेर के साथ, चूहों व्यापक रूप से विज्ञान सुनवाई में इस्तेमाल किया गया है । यद्यपि वयस्क माउस कॉकललिया मामूली है और कॉकलियर एपिथेलियम एक बोनी कैप्सूल से घिरा हुआ है जिसके परिणामस्वरूप तकनीकी रूप से कठिन माइक्रोडिसेक्शन, इम्यूनोलेबलिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के संयोजन में एपिथेलियम की सतह की तैयारी और कॉन्फोकल इमेजरी का उपयोग मोटे तौर पर कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए किया गया है, जिसमें रिबन सिनेप्स और हेयर सेल्स के नुकसान, संवेदी बालों की कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं और बाल कोशिका उत्थान में प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन शामिल हैं। कॉकलियर सतह की तैयारी का उपयोग रिपोर्टर जीन (यानी जीएफपी) की अभिव्यक्ति के पैटर्न को निर्धारित करने और सफल ट्रांसड्यूक्शन की पुष्टि करने और ट्रांसड्यूड सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए भी किया गया है। इन तकनीकों का उपयोग पहले वयस्क सीबीए/जे चूहों5,6,7,8,9का उपयोग करके शोर-प्रेरित सुनवाई हानि में अंतर्निहित आणविक तंत्रों के अध्ययन के लिए किया गया है ।

कॉकलिया के छोटे क्रॉस-सेक्शनल भागों को प्राप्त करने के लिए पैराफिन सेक्शन या क्रायोसेक्शन का उपयोग करने वाले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के विपरीत जिसमें प्रत्येक खंड पर तीन बाहरी बाल कोशिकाएं (OHCs) और एक आंतरिक हेयर सेल (आईएचसी) होती हैं, कॉकलियर सतह की तैयारी की अनुमति देता है संवेदी बाल कोशिकाओं और रिबन सिनेप्स की गिनती और विशिष्ट कार्यात्मक आवृत्तियों के अनुरूप संवेदी बाल कोशिकाओं की इम्यूनोलेबलिंग के लिए ओसी की पूरी लंबाई का दृश्य। तालिका 1 मुलर1 और विबर्ग और कैनलॉन1,2के अध्ययनों के अनुसार वयस्क सीबीए/जे माउस में कॉकलियर सर्पिल की लंबाई के साथ दूरी के एक समारोह के रूप में सुनवाई आवृत्तियों की मैपिंग को दर्शाता है । कॉकलियर सतह की तैयारी का व्यापक रूप से कॉकलियर विकृतियों4,5,6,7,8,9,10 की जांच के लिए उपयोग किया गया है ,11,12,13,14,15. पूरे माउंट कॉकलियर विच्छेदन विधि मूल रूप से 196616में हंस Engstrom द्वारा संपादित एक पुस्तक में वर्णित किया गया था। बाद में इस तकनीक को परिष्कृत किया गया और विभिन्न प्रजातियों के अनुकूल किया गया जैसा कि विज्ञान10,11,12,13श्रवण में कई वैज्ञानिकों द्वारा साहित्य में वर्णित किया गयाथा , 15,17 और मैसाचुसेट्स आई एंड इयर18में ईटन-पीबॉडी प्रयोगशालाओं द्वारा । हाल ही में, मोंटगोमरी एट अल19द्वारा एक और कॉकलियर विच्छेदन विधि की सूचना दी गई थी । कॉकलियर सतह की तैयारी के लिए कॉकललिया का माइक्रोडिसेक्शन एक आवश्यक और महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, माउस कॉकले को विच्छेदन एक तकनीकी चुनौती है और इसके लिए काफी अभ्यास की आवश्यकता होती है। यहां, वयस्क माउस कॉकले में उपयोग के लिए एक संशोधित कॉकलियर सतह तैयारकरने की विधि प्रस्तुत की जाती है। इस विधि के लिए इम्यूनोलेबलिंग के लिए कॉकलियर एपिथेलियम से 10 मिमी गोल कवरस्लिप तक कॉकलियर एपिथेलियम के टुकड़ों का पालन करने के लिए सेल और ऊतक चिपकने वाले (यानी सेल-टाक) के कैजालिफिकेशन और उपयोग की आवश्यकता होती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री20के लिए सेल और टिश्यू चिपकने वाला व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है । यह संशोधित कॉकलियर माइक्रोडिसेक्शन विधि18,19की रिपोर्ट की गई तुलना में अपेक्षाकृत सरल है ।

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Protocol

10-12 सप्ताह की उम्र में पुरुष वयस्क CBA/J चूहों और 6-8 सप्ताह की उम्र में C57BL/6J चूहों से जुड़े सभी अनुसंधान प्रोटोकॉल को दक्षिण कैरोलिना (MUSC) के मेडिकल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया । पशु देखभाल MUSC में प्रयोगशाला पशु संसाधन ों के प्रभाग की देखरेख में किया गया था ।

नोट: नीचे प्रस्तुत प्रक्रियाओं के लिए, चूहों को इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है। चूहों को जानवर के बाद अब दर्दनाक उत्तेजनाओं का जवाब नहीं देता है, जैसे कि एक अंगूठे की चुटकी।

1. लौकिक हड्डियों का निष्कर्षण

  1. माउस को तुरंत सर्जिकल कैंची (17 सेमी लंबा) के साथ पोस्टमॉर्टम करते हैं और खोपड़ी की केंद्र रेखा के साथ पीछे के पहलू से खोपड़ी की हड्डी को पूर्वकाल खींचकर खोपड़ी की हड्डी को उजागर करने के बाद कैंची से खोपड़ी की हड्डी को काट दिया।
  2. संदंश का उपयोग कर मस्तिष्क के ऊतकों को हटा दें और चूहों के लिए अंगूठे और तर्जनी उंगली के साथ लौकिक हड्डियों को मैन्युअल रूप से हटा दें तीन महीने या उससे अधिक उम्र के। तीन महीने से छोटे चूहों की लौकिक हड्डी को काटने के लिए छोटी सर्जिकल कैंची (11 सेमी लंबी) का उपयोग करें।
  3. अस्थायी हड्डी को पेट्री डिश (व्यास में 30 मिमी) में रखें जिसमें बर्फ-ठंडा ताजा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान फॉस्फेट-बफरलव (पीबीएस), पीएच 7.4 में भंग हो गया है।
    नोट: ताजा 4% पीएफए समाधान तैयार करें और लौकिक हड्डियों को ठीक करने से ठीक पहले पीएच को 7.4 पर समायोजित करें, क्योंकि पीएफए समाधान के अनुचित पीएच संतुलन से इम्यूनोलेबलिंग की गुणवत्ता कम हो जाएगी।

2. फिक्सेशन और परफ्यूजन

  1. अंडाकार खिड़की से स्टेप निकालें और आकार #5 संदंश के साथ गोल खिड़की झिल्ली पंचर। एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक 1 mL सिरिंज से जुड़े 27 जी सुई का उपयोग कर कॉकलिया के शीर्ष में एक छोटा छेद बनाते हैं।
  2. धीरे और धीरे-धीरे गोल और अंडाकार खिड़कियों के माध्यम से 4% पीएफए समाधान के साथ कॉकलिया को परफ्यूज करें जब तक कि समाधान शीर्ष पर छोटे छेद से बाहर न हो जाए। कॉकलेआ (एक या दो कॉकले प्रति शीशी) को 20 मीटर वॉल्यूम प्रस्फुटन शीशियों में स्थानांतरित करें जिसमें 4% पीएफए समाधान का 10 मीटर है।
  3. धीरे से 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रस्फुटन शीशियों आंदोलन और एक रोटेटर पर एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में रात भर छोड़ दें ।
    नोट: उपयोग किए गए एंटीबॉडी के आधार पर निर्धारण के समय को समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फिक्सेशन को 1.5 घंटे तक सीमित करने से ग्लूए 2 एंटीबॉडी का उपयोग करते समय पोस्ट सिनैप्टिक टर्मिनलों की सफल इम्यूनोलेबलिंग की अनुमति मिलेगी।

3. लौकिक हड्डी का decalcification

  1. पीएफए समाधान निकालें और प्रत्येक 5 मिन के लिए ताजा पीबीएस 3x के साथ कॉकले को धो लें।
  2. प्रस्फुटन शीशियों में 4% एथिलीनडायमिनेटेटेटेटेटिक एसिड डाइसोडियम नमक (ईडीटीए) समाधान (पीएच 7.4) का 20 मिलील जोड़ें और कोमल आंदोलन के साथ एक रोटेटर पर 48-72 घंटे के लिए फ्रिज में रखें। ईटीए समाधान को दैनिक तब तक बदलें जब तक कि कॉकले को दशमलव न ष्ट न कर दिया जाए। जांच करें कि क्या लोच के लिए आकलन करने के लिए संदंश के साथ बोनी वेस्टिबुलर हिस्से को छूकर कॉकलसी को डिमाल किया जाता है या बस वेस्टिबुलर हिस्से के किनारे से एक छोटा सा टुकड़ा काट देता है। यदि इस तरह की कटौती के परिणामस्वरूप कुचल टुकड़ा होता है, तो कॉकलिया को डिक्शल नहीं किया जाता है।
    नोट: EDTA समाधान समाधान एकाग्रता के आधार पर प्राथमिक एंटीबॉडी की इम्यूनोरिएक्शन में हस्तक्षेप कर सकता है। पीबीएस में 4% EDTA तैयार करें और पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। लौकिक हड्डियों के लगातार decalcification के लिए, ताजा EDTA समाधान का उपयोग किया जाता है।
  3. decalcification पूरा होने के बाद माइक्रोडिसेक्शन के लिए पीबीएस का समाधान बदलें।
    नोट: यदि कॉकले पर्याप्त रूप से डिकाडली नहीं किया जाता है, तो कॉकले का विच्छेदन नहीं किया जा सकता है।

4. कॉकलियर एपिथेलियम का माइक्रोडिसेक्शन

नोट: एक बार कैक्सलसीफिकेशन पूरा हो जाने के बाद, इम्यूनोलेबलिंग के लिए कॉकलियर एपिथेलियम के माइक्रोडिसेक्शन को जितनी जल्दी हो सके प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। पीबीएस युक्त एक साफ 30 मिमी पेट्री डिश में, आंतरिक कान निम्नलिखित तरीके से उन्मुख होता है: पेट्री डिश के शीर्ष (ढक्कन) और नीचे के संदर्भ में, कॉकलियर राउंड और अंडाकार खिड़कियां शीर्ष का सामना करती हैं। अक्षेत्र के संदर्भ में, कॉकलियर भाग सामने की ओर उन्मुख होता है (अक्षेत्र से दूर) और वेस्टिबुलर भाग पीठ (अक्षेत्र के पास) की ओर। निम्नलिखित चरणों का विस्तार से वर्णन करता है।

  1. शंख हड्डी के वेस्टिब्यूलर हिस्से को संदंश के साथ पकड़ें और लाल रेखा(चित्रा 1ए)द्वारा इंगित 45 डिग्री कोण पर स्केलपेल के साथ एपिकल टर्न को काट ें।
  2. गोल खिड़की और अंडाकार खिड़की के बीच बेहोश रेखा के साथ खड़ी कट, जैसा कि लाल रेखा(चित्रा 1बी)द्वारा संकेत दिया गया है कि वेस्टिब्यूलर भाग(चित्रा 1सी)से कॉकलिया को अलग करने के लिए।
    नोट: इस कॉकलियर भाग में एपिथेलियम के मध्य, बेसल और हुक भाग होते हैं।
  3. नीचे की ओर बेसल बारी के साथ कॉकलियर भाग रखें और पेट्री डिश के शीर्ष की ओर मध्य मोड़ और बोनी कैप्सूल और मध्य मोड़ की पार्श्व दीवार को उस अंत की ओर काट दें जहां से एपिकल सेक्शन को हटा दिया गया था, जैसा कि लाल रेखा (फिगु) द्वारा इंगित किया गया था पुनः 1डी, ई)।
  4. बेसल और हुक क्षेत्रों(चित्रा 1एफ, जी)से मध्य भाग को पूरी तरह से अलग करने के लिए काटना जारी रखें।
    नोट: कॉकललिया का हुक क्षेत्र 48 किलोवाट और चूहों में उच्च टन की संवेदनशीलता के अनुरूप कॉकलियर एपिथेलियम का अंत है।
  5. बेसल और हुक भाग को डिश के नीचे की ओर उन्मुख बेसिलर झिल्ली साइट के साथ रखें और ऊर्ध्वाधर लाल रेखा(चित्रा 1ग्राम)द्वारा इंगित मोदीको हटाने के लिए हुक क्षेत्र से मोडिओलस को हटाने के लिए खड़ी रूप से कटौती करें।
    नोट: मोडिओलस कॉकलआ की शंकुके आकार की केंद्रीय धुरी है जिसमें स्पंजी हड्डी और कॉकलियर तंत्रिका के साथ-साथ सर्पिल गैंगलियन शामिल हैं। कैंची के साथ इस कट को अंजाम देना बेहतर हो सकता है।
  6. बेसल और हुक क्षेत्रों को काटें क्योंकि अन्य लाल रेखा हुक भाग(चित्रा 1एच)को अलग करने के लिए चित्रा 1ग्राम में इंगित करती है।
    नोट: कॉकलया को अब एपिकल, मिडिल, बेसल और हुक पोर्शन में अलग कर दिया गया है । अगले कदम एक उदाहरण के रूप में मध्य मोड़ का उपयोग कर, प्रत्येक व्यक्ति बदल जाता है की अंतिम विच्छेदन होगा ।
  7. लाल रेखा(चित्रा 1i)द्वारा इंगित मध्य मोड़ के बोनी कैप्सूल और पार्श्व दीवार ऊतक के अपेक्षाकृत बड़े हिस्से को काट दें।
    नोट: कॉकलियर डक्ट की पार्श्व दीवार सर्पिल स्नायु और स्ट्राइया वैस्कुलरिस द्वारा बनाई जाती है।
  8. पेट्री डिश के नीचे बोनी कैप्सूल और पार्श्व दीवार को संरेखित करने के लिए संदंश के साथ पार्श्व दीवार को पकड़ें और बेसिलर झिल्ली की ओर से इन ऊतकों को काट दें। फिर संवेदी बाल कोशिका सतह की ओर उन्मुख करने के लिए नमूना समतल करें। बोनी कैप्सूल और पार्श्व दीवार(चित्रा 1j)के बाकी दूर ट्रिम ।
  9. मध्य क्षेत्र(चित्रा 1k)को पूरी तरह से अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करके टेक्टोरियाल झिल्ली को हटा दें।
  10. शेष मोड़ों या क्षेत्रों के अंतिम विच्छेदन के लिए चरण 4.7−4.9 दोहराएं जैसा कि चित्र 1एलमें दिखाया गया है।
  11. संवेदी एपिथेलियम के आसंजन के लिए 10 एमएम गोल कवरस्लिप तैयार करें। गोल कवरस्लिप के केंद्र पर कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के हाथ से फैलने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। सूखने के बाद (आरटी में 3-5 मिन), पेट्री व्यंजन में PBS में कवरस्लिप डाल दिया ।
  12. पेट्री डिश में 10 एमएम राउंड कवरस्लिप पर संवेदी एपिथेलियम के सभी चार टुकड़ों को चिपकादें। फिर कवरस्लिप का एक किनारा धारण करने के लिए यह इम्यूनोलेबलिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री(चित्रा 1मीटर)के लिए एक चार अच्छी तरह से पकवान के लिए स्थानांतरित करने के लिए ।
    नोट: चित्रा 2 प्रमुख कटौती के स्थान को दिखाता है।

5. कॉकलियर सिनेप्स के लिए इम्यूनोलेबलिंग

नोट: इस अध्ययन में अपनाई जाने वाली कॉकलियर सिनेप्स के लिए इम्यूनोलेबलिंग के प्रोटोकॉल को पहले13वर्णित किया गया है । प्रेसीनैप्टिक रिबन को सीटीबीपी2 एंटीबॉडी (माउस एंटी-कार्बोसिल-टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन 2 आईजीजी1, रिबआई मचान प्रोटीन के बी डोमेन को लेबल करने) के साथ लेबल किया गया था। पोस्ट सिनैप्टिक टर्मिनलों को ग्लूए2 एंटीबॉडी (माउस एंटी-ग्लूटामेट रिसेप्टर 2 आईजीजी2ए, एम्पा रिसेप्टर की सबयूनिट्स लेबलिंग) के साथ लेबल किया गया था।

  1. एक चार अच्छी तरह से पकवान में 5 मिन प्रत्येक धोने के लिए PBS 3x के साथ संवेदी epithelium धोने और फिर 2% nonionic surfactant (यानी, Triton-X १००) के 2 mL एक रोटेटर पर आरटी पर 30 min के लिए पकवान में जोड़ें ।
  2. एक पिपेट का उपयोग कर पकवान से nonionic surfactant समाधान निकालें और 10% सामान्य बकरी सीरम युक्त समाधान के 100 μL जोड़ने के लिए 1 h के लिए 1 घंटे के लिए आरटी में कोमल आंदोलन के साथ एक रोटेटर पर ।
  3. प्रत्येक कुएं से अवरुद्ध समाधान निकालें, आरटी में कोमल आंदोलन के तहत प्रत्येक धोने के लिए 5 मिन के लिए पीबीएस 3x के साथ धोलें।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के साथ पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें: माउस विरोधी ग्लू2 आईजीजी2ए (1:2,000), माउस एंटी-सीटीबीपी 2 आईजीजी1 (1:400)। प्रत्येक चार-अच्छी तरह से पकवान को अपने ढक्कन के साथ कवर करें और प्रकाश से बचाता है कि एक बड़े humidified कंटेनर में जगह है । 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: एक विकल्प के रूप में, इम्यूनोलेबलिंग संवेदी बाल कोशिकाओं के लिए खरगोश विरोधी मायोसिन VIIa (1:400) जोड़ा जा सकता है।
  5. आरटी में कोमल आंदोलन के साथ प्रत्येक धोने के लिए 5 मिन प्रत्येक धोने के लिए PBS के साथ 3x धोएं ।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा 594 बकरी विरोधी माउस IgG1a (1:1,000), एलेक्सा 488 बकरी विरोधी माउस IgG2a (1:1,000) के 100 μL जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से PBS के साथ पतला। प्रत्येक चार-अच्छी तरह से पकवान को अपने ढक्कन के साथ कवर करें और प्रकाश से बचाता है कि एक बड़े humidified कंटेनर में जगह है । 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: यदि मायोसिन सातिया का उपयोग किया जाता है, तो एलेक्सा 350 बकरी विरोधी खरगोश (1:200) जोड़ें।
  7. 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं। फिर, शीर्ष पर नमूनों के साथ एक स्लाइड पर 10 मिमी गोल कवरस्लिप स्थानांतरित करें।
  8. ध्यान से कवरस्लिप के केंद्र में ट्रिस बफर के साथ फ्लोरो-जेल के 8 μL जोड़ें। फिर शीर्ष पर माउंट करने के लिए संदंश के साथ एक और 10 मिमी गोल कवरस्लिप के किनारे पकड़ो, दो कवरस्लिप को एक साथ सैंडविच करें।
  9. स्लाइडसील करने के लिए नेल पॉलिश का इस्तेमाल करें, उन्हें कार्डबोर्ड स्लाइड फोल्डर में रखें और फ्रिज में स्टोर करें।
    नोट: यदि बढ़ते के दौरान कवरस्लिप के बीच कुछ फ्लोरो-जेल लीक हो जाते हैं, तो नेल पॉलिश के साथ स्लाइड को सील करने से पहले कवरस्लिप के किनारों को साफ करें। कॉन्फोकल छवियों को 7 दिनों के भीतर लेने की आवश्यकता है।

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Representative Results

इम्यूनोलेबलिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग के संयोजन में कॉकलियर एपिथेलियम की सतह तैयारी का उपयोग मोटे तौर पर कॉकलियर विकृतियों की जांच के लिए विज्ञान की सुनवाई में किया गया है, जैसे रिबन सिनेप्स, संवेदी बाल कोशिकाओं का परिमाणीकरण, और संवेदी हेयर सेल्स5,6,7,8में प्रोटीन एक्सप्रेशन . यद्यपि सतह की तैयारी के लिए वयस्क माउस कॉकले का विच्छेदन सरल नहीं है, नए स्नातक छात्र 10-15 कानों(चित्रा 1 और चित्रा 2)के साथ अभ्यास करने के बाद इस संशोधित विधि को सीखने में सक्षम हैं। इस तकनीक के साथ, CtBP2 के लिए इम्यूनोलेबलिंग के संयोजन में (presynaptic रिबन के लिए एक मार्कर) और GluA2 (पोस्ट सिनैप्टिक टर्मिनलों के लिए एक मार्कर), ०.२५ μm अंतराल के साथ जेड अनुमानों के तहत confocal छवियों का उपयोग कर IHC/श्रवण तंत्रिका synapses गिनती माउस रिबन synapses के आकार, संभव है21. यह प्रकाशित परिणाम4,6,13के अनुरूप है . सीबीए/जे चूहों (उपचार के बिना) की सतह की तैयारी 10-12 सप्ताह की उम्र में CtBP2 (लाल) और GluA2 (हरे रंग) के साथ इम्यूनोलेबल से पता चला है कि दोनों presynaptic रिबन और पोस्ट सिनैप्टिक टर्मिनलों IHC नाभिक के नीचे स्थित है और निकटता, संकेत है फंक्शनल सिनेप्स (चित्रा 3)6,13.

विभिन्न एंटीबॉडी के साथ सतह की तैयारी को इम्यूनोलेबलिंग करके, संवेदी बालों की कोशिकाओं में आणविक सिग्नलिंग और संरचना का आकलन संभव है। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 मायोसिन सातिया के लिए इम्यूनोलेबलिंग के परिणामों को दर्शाता है और फालोडिन और 4',6-डिमाडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ प्रतिदागन करता है। समान रूप से उपयोग किए जाने वाले चिपकने वाले चिपकने वाले चिपकने वाले उपकरणों के साथ और बिना समानांतर इम्यूनोलेबलिंग प्रयोग किए गए हैं, यह आकलन करने के लिए किए गए हैं कि क्या इस्तेमाल किया गया चिपकने वाला इम्यूनोरिएक्शन के साथ हस्तक्षेप करता है। कॉकलियर सतह की तैयारी को मायोसिन सातिया के साथ इम्यूनोलेबल किया गया था और फालोडिन के साथ प्रतिदागित किया गया था। कॉन्फोकल छवियों को समान परिस्थितियों में 63x आवर्धन लेंस और लेजर लाभ और फोटोमल्टीक्यूजर ट्यूब (पीएमटी) लाभ के लिए समान पैरामीटर सेटिंग्स के साथ लिया गया था। कोशिका और ऊतक चिपकने वाले(चित्रा 5)के साथ और बिना इम्यूनोप्रतिक्रियाओं या एकरूपता में कोई अंतर नहीं था। विभिन्न फिक्सेटिव का उपयोग करते हुए, सतह की तैयारी ने कॉकलियर स्टीरियोसिलिया9के दृश्य के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियों को स्कैन करने का आधार प्रदान किया है। C57BL/6J चूहों (उपचार के बिना) 6-8 सप्ताह की उम्र में अच्छी तरह से तीन पंक्तियों में OHCs के वी के आकार का स्टीरियोसिलिया(चित्रा 6)दिखाते हैं । इसके अतिरिक्त, कॉकलियर सतह की तैयारी का उपयोग रिपोर्ट जीन (यानी, जीएफपी) की अभिव्यक्ति के पैटर्न को निर्धारित करने और सफल ट्रांसड्यूक्शन की पुष्टि करने और ट्रांसड्यूड सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क माउस सतह की तैयारी के लिए चरणों का चित्रण। (क)लौकिक हड्डी के कॉकलियर बोनी कैप्सूल का सामना करना पड़ता है। लाल रेखा एपिकल टर्न को अलग करने के लिए पहले कट को इंगित करती है। आरडब्ल्यू = गोल खिड़की, OW = अंडाकार खिड़की। (ख)शीर्ष को कॉकलिया से अलग किया जाता है जैसा कि तीर से संकेत मिलता है । गोल खिड़की और अंडाकार खिड़की के बीच लाल रेखा कॉकललिया में बने दूसरे कट को इंगित करती है। (ग)कॉकलियर भाग जिसमें मध्य, बेसल और हुक क्षेत्र होते हैं, वेवेस्टिकुलर भाग से अलग हो जाता है । (ग)कॉकलियर भाग ऊपर स्थित है। लाल रेखा तीसरी कटौती को इंगित करती है, जिसके अंत से एपिकल सेक्शन को हटा दिया गया था। (ई)तीर तीसरे कट के पूरा होने के बाद छोड़े गए अंतर को इंगित करता है। (च)यह छवि मध्य क्षेत्र को दर्शाती है। (छ)यह छवि संयुक्त बेसल और हुक क्षेत्रों को दर्शाती है। ऊर्ध्वाधर लाल रेखा मोडियोलस और हुक क्षेत्र के बीच कटौती को इंगित करती है। बेसल और हुक क्षेत्रों के बीच कट को अन्य लाल रेखा द्वारा इंगित किया जाता है। (ज)बेसल और हुक क्षेत्रों को अलग किया जाता है जैसा कि तीरों द्वारा इंगित किया गया है। (i)बोनी कैप्सूल के मध्य क्षेत्र को लाल रेखा द्वारा इंगित के रूप में काटा जाता है। (ज)बोनी कैप्सूल के एक तरफ निकलने के बाद छवि मध्य क्षेत्र को दिखाती है। (k)यह छवि विच्छेदन के पूरा होने के बाद मध्य क्षेत्र को दर्शाती है। (l)सभी चार क्षेत्र पूरी तरह से विच्छेदित हैं । (मीटर)कॉकलियर ने संकेत के अनुसार चार क्षेत्रों के साथ चार-अच्छी पेट्री डिश में स्थानांतरित 10 मिमी गोल कवरस्लिप से चिपका दिया । सभी छवियों को 1.2 x, 2.5 x, और 0.6 x आवर्धन पर एक स्टीरियो-विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत लिया गया था। प्रत्येक छवि में स्केल बार इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रमुख कटौती का स्थान । पूरे कॉकलियर बोनी कैप्सूल को हटा दिया गया था। बड़ी कटौती के स्थान ों के संकेत दिए गए हैं । 1) वह स्थान जहां एपिकल टर्न काटा जाता है। 2) वह साइट जहां बीच की बारी अलग हो जाती है। 3) संशोधित को हटाने के लिए महत्वपूर्ण कटौती। 4) बेसल और हुक क्षेत्रों को विभाजित करने के लिए रेखा। स्केल बार = 0.5 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कॉन्फोकल छवियां वयस्क माउस सतह की तैयारी पर CtBP2 और GluA2 के लिए इम्यूनोलेबलिंग प्रकट करती हैं। एपिकल, मिडिल और बेसल क्षेत्रों को चिह्नित किया जाता है । कम आवर्धन कॉन्फोकल छवियों को 10x लेंस के साथ लिया गया था। लाल = CtBP2, हरे = GluA2। स्केल बार = 100 माइक्रोन। 5-, 16-और 32-किलोवाट क्षेत्रों की कॉन्फोकल छवियों को 63x लेंस के साथ लिया गया था। शीर्ष, मध्य और आधार भागों में सफेद आयतों द्वारा इंगित क्षेत्रों के बढ़े हुए दृश्य। स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र4: Confocal छवियों ३२-kHz क्षेत्र से एक सतह तैयार करने के संवेदी बाल कोशिकाओं की इम्यूनोलेबलिंग प्रकट करते हैं । सभी छवियों को जेड-स्टैक अनुमानों का विलय कर दिया गया था। फाललोडिन (ग्रीन) ने ओएचसी की तीन पंक्तियों और आईएचसी की एक पंक्ति की संरचना को दाग दिया। मायोसिन सातिया (लाल) ने ओएचसी की तीन पंक्तियों और आईएचसी की एक पंक्ति को इम्यूनोलेबल किया। DAPI-दाग बाल सेल नाभिक। विलय confocal छवियों संवेदी बाल कोशिकाओं के पक्ष विचारों के लिए खंगाला गया । स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कोशिका और ऊतक चिपकने के साथ और बिना कॉकलियर सतह की तैयारी समानांतर रूप से संसाधित की गई थी, मायोसिन सातवीं (लाल) के लिए इम्यूनोलेबल, और समान समाधानों का उपयोग करके फालोलाइडिन (हरे) के साथ प्रतिदागित। सेल और ऊतक चिपकने वाला इस्तेमाल इम्यूनोरिएक्शन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। कॉन्फोकल छवियों को समान परिस्थितियों और समान पैरामीटर सेटिंग्स के तहत 63x आवर्धन लेंस के साथ लिया गया था। छवियां ३२ kHz क्षेत्र से लिया गया । मायोसिन सातिया के लिए इम्यूनोलेबलिंग और OHCs में फालोलाइडिन के लिए धुंधला कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के साथ और बिना समान था। स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी C57BL/6J चूहों से OHC स्टीरियोसिलिया की तीन पंक्तियों से पता चलता है । छवियां मध्य क्षेत्र से ली गई थीं । (क)OHCs की तीन पंक्तियों का एक कम आवर्धन दृश्य । (ख)बढ़ी हुई छवियां अच्छी तरह से संगठित OHC स्टीरियोसिलिया की तीन पंक्तियों को दिखाती हैं जो "वी" आकृतियों में दिखाई देती हैं । स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नाम
शीर्ष से दूरी (मिमी) 0.4 1 2.4 3.3 3.9 4.7 5.7
शीर्ष से दूरी (%) 7.7 18 43 54 68 82 100
आवृत्तियों (kHz) 6 8 16 22 32 48

तालिका 1: मूलर1 और विबर्ग और कैनलॉन2के अनुसार शीर्ष से दूरी के एक समारोह के रूप में CBA/J माउस कॉकलियर आवृत्ति संवेदनशीलता का मानचित्रण ।

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Discussion

इम्यूनोलेबलिंग के संयोजन में पूरे माउंट सतह की तैयारी का कॉकलियर माइक्रोडिसेक्शन आंतरिक कान विकृतियों और आणविक तंत्र की जांच के लिए एक बुनियादी उपकरण प्रदान करता है। कोशिका और ऊतक चिपकने वाला का उपयोग करके यह संशोधित वयस्क माउस कॉकलियर विच्छेदन विधि इस कठिन प्रक्रिया को सरल बनाती है।

यद्यपि यह संशोधित कॉकलियर सतह तैयारकरने की विधि अपेक्षाकृत आसान और सुलभ है, फिर भी प्रवीणता प्राप्त करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है। सही कटौती करने के लिए, अक्षेत्र सावधान एकाग्रता की जरूरत है । क्योंकि बेसल बारी में कॉकलियर संवेदी बाल कोशिकाएं सर्पिल लिम्बस के इतने करीब हैं, सतह की तैयारी को पूरी तरह से सपाट झूठ बोलने की अनुमति देने के लिए लिम्बस ऊतक को पूरी तरह से हटाना मुश्किल है, लेकिन कॉन्फोकल जेड-अनुमान इस मुद्दे की भरपाई कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कॉकलिया का हुक क्षेत्र अभी भी विच्छेदन करने के लिए सबसे कठिन हिस्सा है। हुक क्षेत्र के OHCs और IHCs के बीच अलगाव हो सकता है। हुक क्षेत्र मनुष्यों में बड़ी शारीरिक विविधताओं को प्रदर्शित करता है और22,23की सुनवाई अस्थि चालन के लिए महत्वपूर्ण है । मुलर1 और विबर्ग और कैनलॉन2द्वारा रिपोर्ट किए गए कॉकलियर फ्रीक्वेंसी मैपिंग के आधार पर, हुक क्षेत्र, शीर्ष से लगभग 4.7 मिमी की शुरुआत, 48 किलोवाट टन और उच्च(तालिका 1)के प्रति संवेदनशीलता से मेल खाता है, जबकि श्रवण कार्यात्मक चूहों में अर्जित सुनवाई हानि का आकलन, जिसमें शोर-प्रेरित, aminoglycoside-प्रेरित सुनवाई हानि, और उम्र से संबंधित सुनवाई हानि, आम तौर पर 8, 16 में मापा जाता है, और श्रवण ब्रेनस्टेम प्रतिक्रिया (एबीआर)5,6 के साथ 32 किलोवाट ,7,9,24 और विरूपण उत्पाद otoacoustic उत्सर्जन (डीपीओएई)25के साथ 6-45 kHz से । मोंटगोमरी एट अल के साथ समझौते में, सर्पिल को 3-4 टुकड़ों19में विभाजित किया जाता है, जब एपिथेलियम की विकृति आमतौर पर नहीं देखी जाती है।

यहां प्रस्तुत संशोधित विधि में कॉकलियर सर्पिल को केवल चार टुकड़ों (शीर्ष, मध्य, बेसल टर्न और हुक क्षेत्र) में विच्छेदन करना शामिल है, जबकि ईटन-पीबॉडी तकनीक छह टुकड़े18का उत्पादन करती है। ईटन-पीबॉडी तकनीक एक कॉकलियर बाइसेक्शन के साथ शुरू होती है, जो इस संशोधित तकनीक में वर्णित सर्पिल के बाकी हिस्सों से पहले एपिकल टर्न को अलग करने के लिए एपिथेलियम के माध्यम से स्पर्शरेखा कटौती करने से बचता है। छोटे टुकड़ों का उत्पादन करके, ईटन-Peabody तकनीक को विसर्जन उद्देश्य के साथ एक बड़े टुकड़े को देखने के लिए आवश्यक सपाट को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वास्तव में, ऊतक के बड़े हिस्से मोंटगोमरी एट अल19के अनुरूप, एपिकल से बेसल बारी तक आवृत्ति मानचित्रण के माप की सुविधा प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, इस विधि और मोंटगोमरी एट अल19 के बीच एक अंतर यह है कि संशोधित कॉकलियर विच्छेदन विधि यहां वर्णित सबसे कटौती के लिए एक स्केलपेल को रोजगार और केवल एक कदम कैंची के साथ किया जाता है (यानी, बेसल और हुक क्षेत्रों के अलगाव के रूप में चित्रा 2 में तीसरीकटौती में सचित्र), जबकि मोंटगोमरी एट अल19 सतह की तैयारी के लिए एक सिलिकॉन elastomer-लेपित विच्छेदन पकवान के साथ कैंची का इस्तेमाल किया । ऊतक की विकृति से बचने के लिए, मोडिओलस को हटाने के लिए बेसिलर झिल्ली का वियोग महत्वपूर्ण है।

यह प्रोटोकॉल इम्यूनोलेबलिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए 10 एमएम राउंड कवरस्लिप में कॉकलियर एपिथेलियम के टुकड़ों के आसंजन के लिए एक सेल और ऊतक चिपकने वाला(सामग्री की तालिका)का उपयोग करता है, जो प्रक्रियाओं को अधिक सुविधाजनक बनाता है और नुकसान से बचा जाता है इम्यूनोलेबलिंग प्रक्रियाओं के कई वॉश के दौरान एपिथेलियम ऊतक। कोशिका और ऊतक चिपकने वाला पॉलीफेनॉलिक प्रोटीन का एक निर्माण है जो कोशिकाओं और ऊतकों का पालन करता है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, इन-सीटू संकरण और इम्यूनोअस20सहित कई आम इन-विट्रो तकनीकों में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। इस धारणा के अनुरूप कि कोशिका और ऊतक चिपकने वाला इम्यूनोरिएक्शन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, सतह की तैयारी के साथ मायोसिन VIIa के समानांतर इम्यूनोलेबलिंग कोशिका और ऊतक के साथ और बिना इम्यूनोरिएक्शन या एकरूपता का कोई अंतर नहीं दिखाता है चिपकने वाला. इन तीन विच्छेदन विधियों की तुलना (ईटन-Peabody प्रयोगशालाओं, मोंटगोमरी एट अल19,और संशोधित विधि वर्णित), प्रयोगशाला में स्नातक छात्रों का मानना है कि इस संशोधित विधि सेल और ऊतक चिपकने वाला का उपयोग कर सीखने के लिए आसान है और मास्टर.

संक्षेप में, पूरे माउंट वयस्क माउस सतह की तैयारी का उत्पादन कॉकलियर विकृतियों के मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी कौशल है। वयस्क चूहों की सतह की तैयारी के लिए वर्णित संशोधित प्रोटोकॉल इस कठिन प्रक्रिया को सरल बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वर्णित अनुसंधान परियोजना को राष्ट्रीय बहरापन और अन्य संचार विकारों, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से अनुदान R01 DC009222 द्वारा समर्थित किया गया था । यह काम अनुदान C06 RR014516 द्वारा समर्थित पुनर्निर्मित अंतरिक्ष में MUSC में डब्ल्यूआर बिल्डिंग में आयोजित किया गया था। पशुओं को राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन केंद्र के एक्सट्राम्यूल रिसर्च फैसिलिटीज प्रोग्राम से अनुदान C06 RR015455 द्वारा समर्थित MUSC सीआरआई पशु सुविधाओं में रखे गए थे। लेखक पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग के लिए डॉ जोचेन Schacht और आंद्रा तास्का को उनकी बहुमूल्य टिप्पणियों और आंद्रा तास्का के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm Rund Coverslips Microscopy products for science and industry 260367
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 Thermo Fisher Scientific A-21131
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 Thermo Fisher Scientific A-21125
Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A11012
Carboard Micro Slide Trays Fisher Scientific 12-587-10
Cell-Tak BD Biosciences 354240
Corning Petri Dishes Fisher Scientific 353004
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
Dumont #5 Forceps FST fine science tools 11251-20
EDTA Disodium Salt Sigma-Aldrich E5134
Fluoro-gel with Tris Buffer Electron Microscopy Sciences 17985-10
Four-well Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 627170
Goat Anti-myosin VIIa Antibody Proteus Biosciences 25-6790
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse Anti-CtBP2 Antibody BD Biosciences #612044
Mouse Anti-Glu2R Antibody Millipore MAB397
Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 31872
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Scalpel VWR 100491-038
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15001-08

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References

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Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).

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